CN109609589B - 一种番茄灰叶斑病菌分生孢子稳定萌发并用于苗期人工接种鉴定的方法 - Google Patents

一种番茄灰叶斑病菌分生孢子稳定萌发并用于苗期人工接种鉴定的方法 Download PDF

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Abstract

一种番茄灰叶斑病菌分生孢子稳定萌发并用于苗期人工接种鉴定的方法，它属于番茄灰叶斑病菌防治领域。本发明要解决番茄灰叶斑病菌孢子萌发效率低、不宜产生孢子的问题。本发明制备灰叶斑病菌孢子悬浮液然后人工接种，将制备的孢子悬浮液在番茄苗期直接喷洒到叶片的正面和背面，避光生长，3～5天后，进行抗灰叶斑病的番茄材料的筛选。本发明将纯化好的番茄灰叶斑病菌菌株S.lycopersici接种在PDA培养基上进行培养8‑12天，然后挑取培养基上的病原菌放入无菌番茄叶片上继续培养1‑2周，该方法能显著提高番茄灰叶斑病菌分生孢子萌发率，建立了一种简单、稳定的提高番茄病原菌分生孢子萌发率的技术体系。

Description

一种番茄灰叶斑病菌分生孢子稳定萌发并用于苗期人工接种 鉴定的方法
技术领域
本发明属于番茄灰叶斑病菌防治领域；具体涉及一种番茄灰叶斑病菌分生孢子稳定萌发并用于苗期人工接种鉴定的方法。
背景技术
番茄灰叶斑病(Tomato Gray Leaf Spot)主要由匍柄霉属(Stemphylium)病菌S.lycopersici和茄匐柄霉Stemphylium solani侵染引起。通过对内蒙古赤峰、山东寿光、及黑龙江哈尔滨等地采集灰叶斑病叶进行分离、纯化。表明哈尔滨本地的的病原菌其主要种类为番茄匐柄霉Stemphylium lycopersici，而不是茄匐柄霉Stemphylium solani。该病害在世界范围内均有发生，而温暖潮湿地区发生严重。近年来番茄灰叶斑病己经成为危害我国多个省份番茄生产的新型病害，对番茄生产造成了严重危害。目前对番茄灰叶斑病的最有效的方法是培育含有抗病基因的抗病品种，以及通过苗期人工接种灰叶斑病菌进行抗病材料的筛选。对番茄灰叶斑病的最有效的方法是培育含有抗病基因的抗病品种，而在世界上已报道的栽培番茄中抗灰叶斑病的抗源较少，种质资源遗传背景较为狭窄，已经很难满足番茄抗灰叶斑育种工作的需要，因此我们急需找到其他的抗番茄灰叶斑病材料并加以研究利用。然而，关于如何保证侵染番茄的灰叶斑病菌分生孢子具有稳定的萌发率，从而用于人工接种病原菌的方法国内外均未报道。而苗期筛选抗病材料关键步骤之一就是对番茄灰叶斑病菌的培养以及孢子繁殖，但是番茄灰叶斑病菌S.lycopersici孢子萌发效率低、不宜产生孢子。
发明内容
本发明目的是针对番茄灰叶斑病菌S.lycopersici孢子萌发效率低、不宜产生孢子这一问题提供了一种番茄灰叶斑病菌分生孢子稳定萌发并用于苗期人工接种鉴定的方法。
本发明通过以下技术方案实现：
一种番茄灰叶斑病菌分生孢子稳定萌发并用于苗期人工接种鉴定的方法，包括如下步骤：
步骤a、制备灰叶斑病菌孢子悬浮液；
步骤b、人工接种：将步骤1制备的孢子悬浮液在番茄苗期直接喷洒到叶片的正面和背面，避光生长，3～5天后，进行抗灰叶斑病的番茄材料的筛选。
本发明所述的一种番茄灰叶斑病菌分生孢子稳定萌发并用于苗期人工接种鉴定的方法，步骤a制备灰叶斑病菌孢子悬浮液的方法包括如下步骤：
步骤a1、处理番茄叶片：选取新鲜的无病斑的番茄叶片，先在自来水冲洗干净，然后在酒精中浸泡5～10s后，放入升汞溶液中处理1min，再用无菌水冲洗3次，待用；
步骤a2、灰叶斑病菌培养基的制备：PDA培养基培养灰叶斑病菌8～12d，得到灰叶斑病菌培养基，待用；
步骤a3、灰叶斑病菌孢子的生长：将步骤a1处理后的番茄叶片移到无菌培养皿中，然后在每片番茄叶片上放一块步骤a2制得的灰叶斑病菌培养基，在25～28℃恒温培养，培养15～20天，得到长满孢子的的番茄叶片，待用；
步骤a4、灰叶斑病菌孢子悬浮液的制备：将步骤a3制得的长满孢子的的番茄叶片，用无菌水洗脱，配置成浓度大于104个孢子/mL的孢子悬浮液。
本发明所述的一种番茄灰叶斑病菌分生孢子稳定萌发并用于苗期人工接种鉴定的方法，步骤a1中酒精浓度为75wt％，升汞溶液的浓度为0.1wt％。
本发明所述的一种番茄灰叶斑病菌分生孢子稳定萌发并用于苗期人工接种鉴定的方法，步骤a2中的PDA培养基为马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂15～20克，蒸馏水1000毫升。
本发明所述的一种番茄灰叶斑病菌分生孢子稳定萌发并用于苗期人工接种鉴定的方法，步骤a3中一个无菌培养皿中放4片番茄叶片，每片番茄叶片上放的步骤a2制得的灰叶斑病菌培养基的尺寸为0.5～1cm，培养基中加入1ml的无菌水，培养基中湿度≧85％。
本发明所述的一种番茄灰叶斑病菌分生孢子稳定萌发并用于苗期人工接种鉴定的方法，步骤a3中培养为12h黑暗交替培养。
本发明所述的一种番茄灰叶斑病菌分生孢子稳定萌发并用于苗期人工接种鉴定的方法，步骤b中的番茄苗期为番茄生长到2-3片真叶时。
本发明所述的一种番茄灰叶斑病菌分生孢子稳定萌发并用于苗期人工接种鉴定的方法，步骤b中的避光生长条件为用黑色塑料薄膜覆盖避光20～30h，温度条件为25～28℃，湿度≧80％。
本发明所述的一种番茄灰叶斑病菌分生孢子稳定萌发并用于苗期人工接种鉴定的方法，步骤b中的筛选为观察感病品种叶片出现灰叶斑病斑，记录病情等级。
本发明的有益效果如下：
本发明所述的一种番茄灰叶斑病菌分生孢子稳定萌发并用于苗期人工接种鉴定的方法，发明了一种寄主培养基，该培养基可以最大限度的促进灰叶斑病菌分生孢子生长、繁殖。
本发明所述的一种番茄灰叶斑病菌分生孢子稳定萌发并用于苗期人工接种鉴定的方法，将纯化好的番茄灰叶斑病菌菌株S.lycopersici接种在PDA培养基上进行培养8-12天，然后挑取培养基上的病原菌放入无菌番茄叶片上继续培养1-2周，该方法能显著提高番茄灰叶斑病菌分生孢子萌发率，建立了一种简单、稳定的提高番茄病原菌分生孢子萌发率的技术体系。其次，由于寄主培养基培养的分生孢子具有较强的侵染能力，避免了病菌在普通培养基上反复扩繁、造成分生孢子侵染能力下降这一现象。同时明确了番茄苗期接种的最佳接种条件和方法，实现了利用孢子悬浮液进行苗期人工接种鉴定番茄材料。
本发明所述的一种番茄灰叶斑病菌分生孢子稳定萌发并用于苗期人工接种鉴定的方法，方法简单，可操作性强，解决了番茄灰叶斑病菌不宜产生分生孢子，分生孢子萌发率较低这一限制因素，为筛选抗灰叶斑病的番茄材料提供了必要条件，以及为其他需要借助接种灰叶斑病菌的试验顺利进行提供了保证。
附图说明
图1为本发明的工艺流程图；
图2为具体实施方式一所述的一种番茄灰叶斑病菌分生孢子稳定萌发并用于苗期人工接种鉴定的方法中寄主培养基的S.lycopersici分生孢子的生长照片；
图3为对比PDA培养基S.lycopersici分生孢子的生长照片；
图4为具体实施方式一所述的一种番茄灰叶斑病菌分生孢子稳定萌发并用于苗期人工接种鉴定的方法中寄主培养基分生孢子接种症状照片；
图5为对比PDA培养基分生孢子接种症状照片。
具体实施方式
具体实施方式一：
一种番茄灰叶斑病菌分生孢子稳定萌发并用于苗期人工接种鉴定的方法，包括如下步骤：
步骤a、制备灰叶斑病菌孢子悬浮液；
步骤b、人工接种：将步骤1制备的孢子悬浮液在番茄苗期直接喷洒到叶片的正面和背面，避光生长，3～5天后，进行抗灰叶斑病的番茄材料的筛选。
本实施方式所述的一种番茄灰叶斑病的筛选方法，步骤a制备灰叶斑病菌孢子悬浮液的方法包括如下步骤：
步骤a1、处理番茄叶片：选取新鲜的无病斑的番茄叶片，先在自来水冲洗干净，然后在酒精中浸泡5～10s后，放入升汞溶液中处理1min，再用无菌水冲洗3次，待用；
步骤a2、灰叶斑病菌培养基的制备：PDA培养基培养灰叶斑病菌8～12d，得到灰叶斑病菌培养基，待用；
步骤a3、灰叶斑病菌孢子的生长：将步骤a1处理后的番茄叶片移到无菌培养皿中，然后在每片番茄叶片上放一块步骤a2制得的灰叶斑病菌培养基，在25～28℃恒温培养，培养15～20天，得到长满孢子的的番茄叶片，待用；
步骤a4、灰叶斑病菌孢子悬浮液的制备：将步骤a3制得的长满孢子的的番茄叶片，用无菌水洗脱，配置成浓度大于104个孢子/mL的孢子悬浮液。
本实施方式所述的一种番茄灰叶斑病的筛选方法，步骤a1中酒精浓度为75wt％，升汞溶液的浓度为0.1wt％。
本实施方式所述的一种番茄灰叶斑病的筛选方法，步骤a2中的PDA培养基为马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂15～20克，蒸馏水1000毫升。
本实施方式所述的一种番茄灰叶斑病的筛选方法，步骤a3中一个无菌培养皿中放4片番茄叶片，每片番茄叶片上放的步骤a2制得的灰叶斑病菌培养基的尺寸为0.5～1cm，培养基中加入1ml的无菌水，培养基中湿度≧85％。
本实施方式所述的一种番茄灰叶斑病的筛选方法，步骤a3中培养为12h黑暗交替培养。
本实施方式所述的一种番茄灰叶斑病的筛选方法，步骤b中的番茄苗期为番茄生长到2-3片真叶时。
本实施方式所述的一种番茄灰叶斑病的筛选方法，步骤b中的避光生长条件为用黑色塑料薄膜覆盖避光20～30h，温度条件为25～28℃，湿度≧80％。
本实施方式所述的一种番茄灰叶斑病的筛选方法，步骤b中的筛选为观察感病品种叶片出现灰叶斑病斑，记录病情等级。
本实施方式所述的一种番茄灰叶斑病的筛选方法，所述的一种番茄灰叶斑病菌分生孢子稳定萌发并用于苗期人工接种鉴定的方法中寄主培养基与对比PDA培养基的S.lycopersici分生孢子的生长状况如表1所示，生长状况照片如图2、图3所示：
表1不同培养基培养的病原菌分生孢子的萌发率(％)
Figure BDA0001913801080000041
Figure BDA0001913801080000051
从表1中能够看出，在寄主番茄叶片上培养灰叶斑病菌分生孢子，可以显著提高灰叶斑病菌的孢子萌发率，在番茄叶片上培养的灰叶斑病菌分生孢子的萌发率稳定在90％以。从图2和图3能够看出，图2为寄主培养基(叶片)分生孢子生长情况，相比较图3PDA培养基，分生孢子繁殖数量明显提高。
图4为具体实施方式一所述的一种番茄灰叶斑病菌分生孢子稳定萌发并用于苗期人工接种鉴定的方法中寄主培养基分生孢子接种症状照片、图5为对比PDA培养基分生孢子接种症状照片，从图4和图5对比能够看出，寄主培养基培养的分生孢子具有较强的侵染能力，避免了病菌在普通培养基上反复扩繁、造成分生孢子侵染能力下降这一现象，寄主培养基培养的灰叶斑病菌接种番茄植株后，相比较PDA培养基，发病症状较为明显。
本实施方式所述的一种番茄灰叶斑病的筛选方法，通过苗期接种番茄灰叶斑病菌人工结合条件，解决了番茄灰叶斑病菌不宜产生分生孢子，分生孢子萌发率较低这一限制因素，实现了利用孢子悬浮液进行苗期人工接种鉴定，从而筛选番茄灰叶斑病抗病材料。
本实施方式所述的一种番茄灰叶斑病的筛选方法，方法简单，可操作性强，为筛选抗灰叶斑病的番茄材料提供了必要条件；以及为其他需要借助接种灰叶斑病菌的试验顺利进行提供了保证；为番茄抗灰叶斑育种工作的进行提供技术支撑。

Claims (8)

1.一种番茄灰叶斑病菌分生孢子稳定萌发并用于苗期人工接种鉴定的方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤a、制备灰叶斑病菌孢子悬浮液；
步骤b、人工接种：将步骤1制备的孢子悬浮液在番茄苗期直接喷洒到叶片的正面和背面，避光生长，3～5天后，进行抗灰叶斑病的番茄材料的筛选；
步骤a制备灰叶斑病菌孢子悬浮液的方法包括如下步骤：
步骤a1、处理番茄叶片：选取新鲜的无病斑的番茄叶片，先在自来水冲洗干净，然后在酒精中浸泡5～10s后，放入升汞溶液中处理1min，再用无菌水冲洗3次，待用；
步骤a2、灰叶斑病菌培养基的制备：PDA培养基培养灰叶斑病菌8～12d，得到灰叶斑病菌培养基，待用；
步骤a3、灰叶斑病菌孢子的生长：将步骤a1处理后的番茄叶片移到无菌培养皿中，然后在每片番茄叶片上放一块步骤a2制得的灰叶斑病菌培养基，在25～28℃恒温培养，培养15～20天，得到长满孢子的的番茄叶片，待用；
步骤a4、灰叶斑病菌孢子悬浮液的制备：将步骤a3制得的长满孢子的番茄叶片，用无菌水洗脱，配置成浓度大于104个孢子/mL的孢子悬浮液。
2.根据权利要求1所述的一种番茄灰叶斑病菌分生孢子稳定萌发并用于苗期人工接种鉴定的方法，其特征在于：步骤a1中酒精浓度为75wt％，升汞溶液的浓度为0.1wt％。
3.根据权利要求1所述的一种番茄灰叶斑病菌分生孢子稳定萌发并用于苗期人工接种鉴定的方法，其特征在于：步骤a2中的PDA培养基为马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂15～20克，蒸馏水1000毫升。
4.根据权利要求1所述的一种番茄灰叶斑病菌分生孢子稳定萌发并用于苗期人工接种鉴定的方法，其特征在于：步骤a3中一个无菌培养皿中放4片番茄叶片，每片番茄叶片上放的步骤a2制得的灰叶斑病菌培养基的尺寸为0.5～1cm，培养基中加入1ml的无菌水，培养基中湿度≧85％。
5.根据权利要求1所述的一种番茄灰叶斑病菌分生孢子稳定萌发并用于苗期人工接种鉴定的方法，其特征在于：步骤a3中培养为12h黑暗交替培养。
6.根据权利要求1所述的一种番茄灰叶斑病菌分生孢子稳定萌发并用于苗期人工接种鉴定的方法，其特征在于：步骤b中的番茄苗期为番茄生长到2-3片真叶时。
7.根据权利要求1所述的一种番茄灰叶斑病菌分生孢子稳定萌发并用于苗期人工接种鉴定的方法，其特征在于：步骤b中的避光生长条件为用黑色塑料薄膜覆盖避光20～30h，温度条件为25～28℃，湿度≧80％。
8.根据权利要求1所述的一种番茄灰叶斑病菌分生孢子稳定萌发并用于苗期人工接种鉴定的方法，其特征在于：步骤b中的筛选为观察感病品种叶片出现灰叶斑病斑，记录病情等级。
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