CN109562110A

CN109562110A - 睡眠改善剂

Info

Publication number: CN109562110A
Application number: CN201780045763.XA
Authority: CN
Inventors: 后藤法; 后藤一法; 中东淳; 佐藤敦哉; 平山洋佑; 堀越萌李; 甲田哲之; 井上正郎; 井上正一郎; 佐藤几太郎; 加藤真奈美
Original assignee: Amino UP Chemical Co Ltd; Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Amino UP Chemical Co Ltd; Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2016-05-26
Filing date: 2017-05-26
Publication date: 2019-04-02
Also published as: TWI733817B; JPWO2017204321A1; WO2017204321A1; EP3466427A1; US20190201395A1; KR102514031B1; TW201808292A; SG10201912843YA; SG11201811368SA; US20230017155A1; EP3466427A4; KR20190028663A; KR20230047198A; JP2022078217A; US11478473B2; US20200246335A1; JP7381000B2

Abstract

本发明是提供热休克蛋白表达诱导剂，具体而言，是提供含有式(I)表示的化合物或其盐的热休克蛋白表达诱导剂：

Description

睡眠改善剂

技术领域

本专利申请是对于日本专利申请第2016-105477号主张优先权，参照该专利申请而将其整体都编入本说明书。

本发明是有关热休克蛋白表达诱导剂、睡眠改善剂、抗胁迫剂及自主神经调节剂。

背景技术

生物具有用以适应饲养环境的各式各样的防御机构。例如，饲养温度若升高5℃至10℃，则会因热变性而使细胞蛋白的立体构造开始变化，已知有借由被称为「分子伴侣(chaperone)」的蛋白质群来将该变化修复的机制。实现分子伴侣机能的代表性蛋白已知有热休克蛋白(Heat shock protein；以下亦称为「HSP」)。在哺乳类，现在报告有十数种HSP。对应其分子量而分类为HSP20家族、HSP40家族、HSP70家族、HSP90家族等。

HSP亦被称为胁迫蛋白(stress protein)，是对应环境胁迫、病态胁迫、心理胁迫等，在生物体内增强表达。在生物体内表达的HSP是扮演「与因受到各种胁迫而使高级结构的一部分产生变化并快要失去原本的生理机能的蛋白质进行特异性结合，利用ATP水解时产生的能量，将结合对象的蛋白质的高级结构恢复到原来的结构，使生理机能恢复」的角色。

如此的HSP有助维持生物体防御或生物体内稳态，只要在生物体内可诱导HSP的表达，即可有效于预防或改善因蛋白质的高级结构的异常所引起的各种疾病或症状、或是与HSP有关联的各种疾病或症状。

在HSP中，尤其是HSP70已被热烈研究，近年来已明了HSP70与睡眠的关系(非专利文献1及2)或与胁迫的关系(非专利文献3及4)，亦了解到胁迫与自主神经障碍之间有密切关联性存在。因此，HSP70的分子伴侣机能被认为有助于从因睡眠不足或日常胁迫、自主神经障碍等所引起的损害中恢复。

因此，已有在进行欲将HSP70表达诱导物质适用于医药品、准医药品(ciuasi-dnig)等的研究，这些物质是被报告例如花姜酮(ZeRumbone)等(专利文献1)。

背景技术文献

专利文献

[专利文献1]WO 2012/043808

非专利文献

[非专利文献1]Doklady Biological Sciences,2013,Vol.449,pp.89-92

[非专利文献2]Doklady Biological Sciences,2015,Vol.461,pp.76-79

[非专利文献3]Exp.Ther.Med.2012,Oct；4(4),627-632

[非专利文献4]J.Biol_Chem.2000,Vol.275,No.27,20822-20828

发明内容

(发明所欲解决的课题)

本发明的目的是提供包含具有优越的HSP表达诱导作用的有效成分的HSP表达诱导剂、睡眠改善剂、抗胁迫剂、自主神经调节剂等。

(解决课题的手段)

本发明者人等为了解决上述课题而进行深入研究，结果发现下述通式(I)表示的含脯胺酸-3-烷基二酮哌嗪或其盐具有优越的HSP表达诱导作用，以此为基础而显示睡眠改善作用、抗胁迫作用、自主神经调整作用等，因而完成本发明。

亦即，本发明是包含以下的方面。

[1]一种热休克蛋白表达诱导剂，其含有式(I)表示的化合物或其盐：

式(I)

[式中，R为低级烷基、苯基或羟基苯基]。

[2]如上述[1]所述的热休克蛋白表达诱导剂，其中，R为异丙基、苯基或羟基苯基。

[3]如上述[1]所述的热休克蛋白表达诱导剂，其中，R为异丙基。

[4]如上述[1]至[3]中任一项所述的热休克蛋白表达诱导剂，其为药物组合物、准医药品组合物或饮食品组合物的形态。

[5]一种睡眠改善剂，其含有式(I)表示的化合物或其盐：

式(I)

[式中，R为低级烷基、苯基或羟基苯基]。

[6]如上述[5]所述的睡眠改善剂，其中，R为异丙基、苯基或羟基苯基。

[7]如上述[5]所述的睡眠改善剂，其中，R为异丙基。

[8]如上述[5]至[7]中任一项所述的睡眠改善剂，其为药物组合物、准医药品组合物或饮食品组合物的形态。

[9]一种自主神经调节剂，其含有式(I)表示的化合物或其盐：

式(I)

[式中，R为低级烷基、苯基或羟基苯基]。

[10]如上述[9]所述的自主神经调节剂，其中，R为异丙基、苯基或羟基苯基。

[11]如上述[9]所述的自主神经调节剂，其中，R为异丙基。

[12]如上述[9]至[11]中任一项所述的自主神经调节剂，其为药物组合物、准医药品组合物或饮食品组合物的形态。

[13]一种抗胁迫剂，其含有式(I)表示的化合物或其盐：

式(I)

[式中，R为低级烷基、苯基或羟基苯基]。

[14]如上述[13]所述的抗胁迫剂，其中，R为异丙基、苯基或羟基苯基。

[15]如上述[13]所述的抗胁迫剂，其中，R为异丙基。

[16]如上述[13]至[15]中任一项所述的抗胁迫剂，其为药物组合物、准医药品组合物或饮食品组合物的形态。

发明的效果

根据本发明，可提供具有下述1种以上作用效果的HSP表达诱导剂、睡眠改善剂、抗胁迫剂、自主神经调节剂等：

(1)诱导HSP70的表达；

(2)在质量上改善睡眠，具体而言为改善睡眠质量、睡眠清醒节律、熟睡感、睡醒感、起床时的疲倦感、白天嗜睡感、作业效率、因睡眠未满足所产生的忧郁心情等中的一者以上；

(3)抗胁迫作用；

(4)自主神经调整作用；

(5)此外，预防或改善因蛋白质的高级结构的异常所引起的各种疾病或症状、或是与HSP有关联的各种疾病或症状。

附图说明

图1为表示由含脯胺酸-3-烷基二酮哌嗪(化合物1)所致的HSP70mRNA表达量的图。

图2为表示由含脯胺酸-3-烷基二酮哌嗪(化合物2)所致的HSP70mRNA表达量的图。

图3为表示由含脯胺酸-3-烷基二酮哌嗪(化合物3)所致的HSP70mRNA表达量的图。

图4为表示阶段推进后的大鼠明期活动量的推移的图。

图5为表示阶段推进后的第1天在明期(12时间)中的大鼠活动量的图。

具体实施方式

本发明的HSP表达诱导剂是含有下述通式(I)表示的含脯胺酸-3-烷基二酮哌嗪或其盐作为有效成分：

通式(I)

[式中，R为低级烷基、苯基或羟基苯基]。

上述式(I)中的「低级烷基」是指直链或支链状的碳原子数1至6的烷基，具体而言可列举甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、新戊基、己基、异己基等。优选为直链或支链状的碳原子数1至4的烷基，可列举例如异丙基。

上述式(I)中的R为低级烷基、苯基或羟基苯基，优选为异丙基、苯基或羟基苯基，特别优选为异丙基。

上述式(I)的含脯胺酸-3-烷基二酮哌嗪中，特别优选可列举下述的化合物1至3(尤其是化合物1)。

(化合物1)

名称：(3S,8aS)-3-异丁基六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮

简称：Cyclo(L-Leu-L-Pro)

(化合物2)

名称：(3S,8aS)-3-苯甲基六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮

简称：Cydo(L-Phe-L-Pro)

(化合物3)

名称：(3S,8aS)-3-(4-羟基苯甲基)六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮

简称：Cyclo(L-Tyr-L-Pro)

上述含脯胺酸-3-烷基二酮哌嗪的盐可列举在医药品或饮食品领域所容许的盐，可列举例如与无机碱所成的盐、与有机碱所成的盐、与碱性氨基酸所成的盐等。

与无机碱所成的盐的优选例可列举例如：钠盐、钾盐等碱金属盐；钙盐、镁盐等碱土金属盐；铵盐等。

与有机碱所成的盐的优选例可列举例如：与烷基胺(三甲胺、三乙胺等)、杂环胺(吡啶、甲基吡啶等)、烷醇胺(乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺等)、二环己胺、N,N’-二苯甲基乙二胺等所成的盐。

与碱性氨基酸所成的盐的优选例可列举例如：与精胺酸、离胺酸、鸟胺酸等所成的盐。

这些盐中优选为碱金属盐或碱土金属盐。优选为钠盐。

本发明使用的含脯胺酸-3-烷基二酮哌嗪或其盐可依照在该领域公知的方法，例如化学合成方法、酶法、微生物发酵法等调制。具体而言，可借由将直链肽进行脱水/环化反应而合成，例如可依照日本特开2003-252896号公报、J.Peptide Sci.,10,737-737(2004)记载的方法调制。

此外，上述化合物1至3为公知化合物，可从例如BACHEM公司购得。

在本发明中，上述含脯胺酸-3-烷基二酮哌嗪或其盐是可作为有效成分而单独使用，亦可使用2种以上。例如上述化合物1至3中可单独使用1种，亦可使用2种或3种。

例如上述化合物1至3中使用2种时，其使用比率并无特别限制，例如使用化合物1及2的2种时，化合物1:化合物2＝10至0.5:3至0.1，优选为6至1:2至0.5；使用化合物1及3的2种时，化合物1:化合物3＝10至0.5:5至0.5，优选为6至1:4至0.7；使用化合物2及3的2种时，化合物2:化合物3＝3至0.1:5至0.5，优选为0.5:4至0.7。

此外，例如使用上述化合物1至3全种类(3种)时，其使用比率并无特别限制，例如化合物1:化合物2:化合物3＝10至0.5:3至0.1:5至0.5，优选为6至1:2至0.5:4至0.7。

上述含脯胺酸-3-烷基二酮哌嗪或其盐具有优越的HSP表达诱导作用。因此，含有该化合物作为有效成分的本发明的HSP表达诱导剂，是有效于预防或改善因蛋白质的高级结构的异常所引起的各种疾病或症状、或是与HSP有关联的各种疾病或症状。

在本发明中，成为表达诱导对象的HSP是包含：HSP20、HSP27、HSP28等HSP20家族蛋白质；HSP40、HSP47等HSP40家族蛋白质；HSP70、HSP72、HSP73等HSP70家族蛋白质；HSP90a、HSP90b等HSP90家族蛋白质。优选为HSP70家族蛋白质，更优选为HSP70。

在本发明中，HSP的表达诱导中包括在生物体内及生物体外的表达，而且优选为在生物体内的表达。此外，诱导HSP表达的生物体内部位优选可列举脑内。

上述含脯胺酸-3-烷基二酮哌嗪或其盐，是以HSP表达诱导作用为基础，显示优越的睡眠改善作用、抗胁迫作用、自主神经调整作用等。

因此，本发明亦提供含有上述含脯胺酸-3-烷基二酮哌嗪或其盐作为有效成分的睡眠改善剂、抗胁迫剂、自主神经调节剂等。

在本发明的「睡眠改善」是指观察到对于睡眠质量、睡眠清醒节律、熟睡感、睡醒感、起床时的疲倦感、白天嗜睡感、作业效率、因睡眠未满足所引起的忧郁心情等中的一者以上的改善效果。

睡眠质量的改善是指：缩短入眠潜伏期(sleep onset latency)，减少中途醒来的次数及时间，入眠后圆滑地过渡至被视为深沉睡眠的慢波睡眠(slow-wave sleep)，增加熟睡时间，借此而获得优质的睡眠。

睡眠觉醒节律的改善是指：改善睡眠觉醒节律的偏离，使就寝起床节律有秩序。睡眠觉醒节律的偏离亦包括因夜间的光环境或就业环境等大变化所产生的使社会时间与生物时钟不一致的社会时差。亦即，也意指在有工作等社会制约的平常日与无制约的假日产生就寝起床节律的偏离、或是由于不规则的睡眠周期等导致生物体的昼夜节律崩壌。

借由改善睡眠质量和/或睡眠觉醒节律，可获得睡得很熟的熟睡感，并可获得舒畅的睡醒感。另外，不会感到白天嗜睡感或起床时疲倦感，而提升白天的作业效率。此外，可减轻因未获得优质睡眠或就寝起床节律偏离所导致的忧郁心情。

改善效果是指：症状或状态的好转；防止或延迟症状或状态的恶化；或是逆转、防止或延迟症状的进展。

本发明的「抗胁迫作用」是指防止哺乳动物(尤其是人类)因胁迫所引起的疲劳、或预防因脑的胁迫所引起的疲劳。此处，疲劳是指在连续给予身体或精神负荷时所见的一时性的身体及精神表达降低的现象。表达的降低是指身体及精神能力的质或量的降低。

本发明的「自主神经调整作用」是指改善因过度胁迫负荷所产生的交感神经与副交感神经的均衡(自主神经的平衡)紊乱、自主神经活动度降低等。例如，消化道的作用主要是由副交感神经所支配，若因胁迫负荷而使交感神经持续紧张，则消化道的作用会被抑制，引起，食欲不振、便秘等胃肠障碍。此外，认为若因胁迫负荷而使副交感神经不能良好发挥机能，并使交换神经的活动持续亢进，则会引起失眠。如上所述，胁迫与自主神经之间有密切关联性存在，亦有不由胁迫负荷所导致的自主神经障碍存在。此外，胁迫负荷不一定会引起自主神经障碍，亦有诱发其他身体症状的情况。

在本发明中，上述含脯胺酸-3-烷基二酮哌嗪或其盐可直接按照原样作为HSP表达诱导剂、睡眠改善剂、抗胁迫剂、自主神经调节剂等(以下亦可简称为「HSP表达诱导剂等」)来利用。此外，在不影响作为目的的作用效果的范围内，亦可与能添加在医药品或准医药品的载体或食品添加物加以组合而使用。

此外，在本发明中，可将上述含脯胺酸-3-烷基二酮哌嗪或其盐作为HSP表达诱导剂等而添加在各种医药品、准医药品、化妆品、饮食品中，以药物组合物、准医药品组合物、饮食品组合物等的形态使用。

上述医药品、准医药品、饮食品只要是通常可使用者即可，并无特别限制，可列举例如锭剂、颗粒剂、胶囊剂、粉末剂、咀嚼锭、点心类(饼干、甜饼干、巧克力点心、薯片(chips)、蛋糕、口香糖、糖果、软糖、日式馒头、羊羹、布丁、果冻、优格、冰淇淋、果子露(sherbet)等)、面包、面类、饭类、谷类食品、饮料(液剂、清凉饮料、碳酸饮料、营养饮料、粉末饮料、果实饮料、乳饮料、果冻饮料等)、汤(粉末、冷冻干燥品)、味噌汤(粉末、冷冻干燥品)等。饮食品还包含机能性表示食品、特定保健用食品、健康食品、营养补助食品(补充品)、治疗用食品等。

本发明的HSP表达诱导剂等的对象并无特别限制，可列举例如：浅眠、起床时感觉睡眠不足、难以入睡、熟睡感不足(无法深睡)、作恶梦、无法消除疲劳等对于睡眠感是主观地感到不满的对象；对于睡眠感虽未主观地感到不满，但感到疲倦感而希望能改善睡眠质量的对象；感到自主神经紊乱的对象；以及在日常生活中感到胁迫的对象等。此外，即使是没有特别问题的对象，也能以维持良好睡眠、预防睡眠障碍、提升睡眠质量、调整自主神经作用、抗胁迫作用等作为目的而在日常中摄取。

此外，本发明所谓的对象特别是指人类，但本发明亦可适用于人类以外的哺乳动物(例如小鼠、大鼠、仓鼠、猴子、牛、马、猪、羊、山羊、狗、猫、豚鼠、兔子等)。

关于本发明的HSP表达诱导剂等，上述含脯胺酸-3-烷基二酮哌嗪或其盐的每天给予(摄取)量并无特别限制，只要对应给予的目的(对象的疾病或症状)、给予形态、对象的性别、体重或年龄等而适当设定即可，例如若为人类成人时，以含脯胺酸-3-烷基二酮哌嗪换算，通常为0.1μg至1.7g，优选为1μg至1.5g，更优选为5μg至1.3g。

此外，上述化合物1的每天给予量，若为人类成人时通常为0.5μg至500mg，优选为1μg至450mg，更优选为10μg至400mg。

上述化合物2的每天给予量，若为人类成人时通常为0.1μg至400mg，优选为2μg至350mg，更优选为5μg至300mg。

上述化合物3的每天给予量，若为人类成人时通常为0.1μg至800mg，优选为2μg至700mg，更优选为5μg至600mg。

本发明的HSP表达诱导剂等的给予时机并无特别限制，优选为1天1次在就寝前给予(摄取)。

此外，本发明提供上述含脯胺酸-3-烷基二酮哌嗪或其盐，是用于作为HSP表达诱导剂、睡眠改善剂、抗胁迫剂、自主神经调节剂等而使用。

另，本发明提供上述含脯胺酸-3-烷基二酮哌嗪或其盐的用途，是用于制造HSP表达诱导剂、睡眠改善剂、抗胁迫剂、自主神经调节剂等。

除此的外，本发明提供一种HSP表达诱导方法、睡眠改善方法、抗胁迫方法、自主神经调整方法等，是包含：将上述含脯胺酸-3-烷基二酮哌嗪或其盐给予对象。

在这些方面中的用语的定义、上述含脯胺酸-3-烷基二酮哌嗪或其盐、其使用形态、对象、给予量、给予时机、各剂中的调配量等是与上文所述者相同。

实例

其次，列举代表性的实例，但是本发明不只限于这些例。此外，除非另有说明，「％」表示「重量％」。

(实例1)HSP70mRNA表达诱导作用的评估

借由测量HSP70的mRNA表达水平来评估化合物1至3的HSP70表达诱导作用。

将白血病细胞株细胞(HL-60细胞)悬浮在添加有10％牛胎儿血清的RPMI 1640培养基中，播种在1.5mL试管(4.5万个/0.9mL)。将在1％DMSO溶液中调制的标本加以添加0.1mL，在37℃静置4小时。在对照组则是添加1％DMSO溶液0.1mL。培养4小时后将细胞以小型冷却离心机(1.000g×5分钟)进行离心分离，使HL-60细胞沈淀。除去上清液后，将细胞溶解在0.25mL的Trizol(赛默飞世尔科技(Themo Fisher Scientific)公司制造)，如方案(protocol)般萃取total RNA。溶解在RNase free水后，以极微量分光亮度计NanoDrop2000/2000c(赛默飞世尔科技公司制造)测量RNA浓度(波长260nm)。将RNA溶液以RNase free水稀释为50ng/mL的浓度，使用ReverTra Ace^(R)qPCR RT Kit(TOYOBO公司制造)合成cDNA。将反转录后的反应液(10μL)以RNase free水稀释成100μL，作为PCR的模板。使用β2微球蛋白(beta 2microglobulin)基因作为补正HSP70基因表达的内部标准基因。在PCR反应中使用的各基因的引物序列是如下所示。

HSP70正向引物：GCATTTCCTAGTATTTCTGTTTGT(序列编号1)

HSP70反向引物：AATAGTCGTAAGATGGCAGTATA(序列编号2)

β2微球蛋白正向引物：TAGCTGTGCTCGCGCTACT(序列编号3)

β2微球蛋白反向引物：AGTGGGGGTGAATTCAGTGT(序列编号4)

表达分析是使用CFX Connect实时PCR分析系统(CFX Connect real time PCRanalysis system)(Bio-rad公司制造)。将反应液10μL的PCR反应液在95℃培养3分钟(初期变性)，然后反复进行55循环的在95℃变性10秒、在57.8℃退火30秒及伸长。最后将从65℃至95℃的范围以每0.2℃进行熔化曲线(melting curve)的测量。使用Bio-Rad CFXManager 3.1来分析HSP70基因及内部标准基因的表达量。

图1至图3是分别表示化合物1、2及3的HSP70mRNA表达诱导能力的相对于对照组的％。从该结果明了，任何一个标本与对照组相比，皆增强HSP70基因的mRNA表达。此外，研究各活性成分的相对于HSP70mRNA表达诱导能力的浓度依赖性时，相对于对照组而使HSP70mRNA表达诱导能力增加至150％的浓度，对于化合物1为0.083mg/mL浓度，对于化合物2为0.045mg/mL浓度，对于化合物3为0.101mg/mL浓度。

(实例2)

将小型活动计(NanoTag^(R)，Kissei Comtec链份有限公司制造)埋植在7周龄雄性Wistar大鼠的腹腔内。然后，经过一周的恢复期后，将体重作为指标，分层随机分派，分派为如表1所示的4群(对照群、化合物A-1群、化合物A-2群、化合物A-3群；各n＝17)，混饵给予受验饲料。在从混饵开始给予至第15天的时间点，将明暗循环推进8小时，之后继续混饵给予受验饲料2周。此外，阶段推进日除外，是将饲养环境的明暗循环设定为12小时周期，明期的照明度设定为约200Lx(185至230LX)。对于由该阶段推进所致的轻度睡眠障碍模型，研究给予受验饲料对于阶段推进后的明期活动量所造成的影响。

此外，以双侧检定(two-sided test)进行检定，检定的显著水平(significancelevel)为5％，以两侧10％作为有倾向差。分析是使用SAS software release9.3(SASInstitute Japan链份有限公司制造)。

[表1]

群(n＝17)	受验饲料
		对照组	MF
化合物A-1	含有0.0005％化合物A的MF(相当于0.62mg/kg BW/天)
		化合物A-2	含有0.005％化合物A的MF(相当于6.25mg/kg BW/天)
化合物A-3	含有0.05％化合物A的MF(相当于62.46mg/kg BW/天)

MF：实验动物用饲料MF(粉末)(Oriental酵母链份有限公司制造)

化合物A：(3S,8aS)-3-异丁基六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮(上述化合物1)

BW：Body Weight(体重)

[结果]

图4为表示阶段推进后的大鼠明期活动量推移的图。横轴表示从阶段推进起的经过日数，纵轴表示明期(12小时)的活动量，关于活动量则是以平均值±标准误差表示。此外，「前3天」是表示3天的事前给予期间的明期活动量的平均值。

由曲线图的形状而显示阶段推进后为活动量上升，随着日数经过，亦回到阶段推进前的活动量水平。

关于由图4可见活动量上升为特别显著的第1天及第2天的明期的活动量，为了确认化合物A的效果，进行邓奈特氏检定与混合模型重复测量法(Dunnett test with Mixedmodel for repeated measures method)。结果，化合物A-3群是显示有比对照群更抑制活动量的倾向(P＝0.0978)，化合物A-2群是比对照群更明显地抑制(P＝0.0481)。由此而暗示化合物A是抑制在第1天至第2天的明期中的由阶段推进所致的睡眠障碍。

图5表示在阶段推进后的第1天在明期(12小时)的大鼠活动量。横轴表示各群，纵轴表示明期(12小时)的活动量，关于活动量则是以平均值±标准误差表示。

借由邓奈特氏检定(Dunnett test)而进行群间比较时，化合物A-3群是有比对照群更抑制活动量的倾向(P＝0.0536)，化合物A-2群是比对照群更明显地抑制活动量(P＝0.016)。由此而暗示化合物A是抑制在第1天的明期(12小时)中的由阶段推进所致的睡眠恶化。

如上所述，图4及图5皆在阶段推进后的活动量最容易混乱的初期的明期显示明显差异，这暗示化合物A有改善睡眠质量。

(实例3)Wada T.et al.，Brain Res Bull.2006；69：388-92.记载的方法

在8周龄雄性Wistar大鼠的脑中埋入EEG用电极，术后予以1周的恢复期。然后，实施2至3天的对于刷子剌激(断眠刺激)的驯化。在试验日，一边监控EEG数据，一边若检测到非快速动眼睡眠(non-REM sleep)就以刷子刺激来妨碍非快速动眼睡眠。验证受验药剂对于妨碍非快速动眼睡眠的影响的效果。

(实例4)Miyazaki K.et al.，PLoS One.2013；8：e55452.记载的方法

将8至15周龄的雄性C3H-HeN小鼠饲养在设置有旋转笼的笼中的纸制地垫，在试验第1天变更为饲养在室温的1.5cm水浸状态，使其负荷胁迫。在该状态下，为了避开水浸而会变成在旋转笼上生活。以旋转笼的转动来监控小鼠的活动状况，评估睡眠，觉醒。就负荷而言，只要在持续7天后来评估，就会变成EEG的评估与由活动量所做的评估成为类似的状况。

(实例5)Sei H.et al.，Life ScL2003；73：53-59.记载的方法

将10至12周龄的雄性Wistar大鼠从12小时暗期/12小时明期的明暗循环变更为4小时暗期，12小时明期的明暗循环，饲养1至7天。对于该动物，事先在腹腔内设置遥测式体温计，而可掌握其体温节律，借由上述明暗循环的变更，可检出体温节律的变调，此外，亦可掌握对于血浆皮质醇(cortisol)浓度或海马BNDF蛋白量的影响。

序列表free text

序列编号1中记载的碱基序列为HSP70正向引物的碱基序列。

序列编号2中记载的碱基序列为HSP70反向引物的碱基序列。

序列编号3中记载的碱基序列为β2微球蛋白正向引物的碱基序列。

序列编号4中记载的碱基序列为β2微球蛋白反向引物的碱基序列。

序列表

<110> 株式会社日本阿明诺化学(AMINO UP CHEMICAL CO., LTD.)

大塚制药株式会社(OTSUKA PHARMACEUTICAL CO., LTD.)

<120> 睡眠改善剂

<130> 673543

<150> JP 2016-105477

<151> 2016-05-26

<160> 4

<170> PatentIn 版本 3.1

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> HSP70正向引物

<400> 1

gcatttccta gtatttctgt ttgt 24

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> HSP70反向引物

<400> 2

aatagtcgta agatggcagt ata 23

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> β2微球蛋白正向引物

<400> 3

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<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> β2微球蛋白反向引物

<400> 4

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Claims

1.一种热休克蛋白表达诱导剂，其含有式(I)表示的化合物或其盐：

式(I)

式中，R为低级烷基、苯基或羟基苯基。

2.如权利要求第1项所述的热休克蛋白表达诱导剂，其中，R为异丙基、苯基或羟基苯基。

3.如权利要求第1项所述的热休克蛋白表达诱导剂，其中，R为异丙基。

4.如权利要求第1项至第3项中任一项所述的热休克蛋白表达诱导剂，其为药物组合物、准医药品(quasi-drug)组合物或饮食品组合物的形态。

5.一种睡眠改善剂，其含有式(I)表示的化合物或其盐：

式(I)

式中，R为低级烷基、苯基或羟基苯基。

6.如权利要求第5项所述的睡眠改善剂，其中，R为异丙基、苯基或羟基苯基。

7.如权利要求第5项所述的睡眠改善剂，其中，R为异丙基。

8.如权利要求第5项至第7项中任一项所述的睡眠改善剂，其为药物组合物、准医药品组合物或饮食品组合物的形态。

9.一种自主神经调节剂，其含有式(I)表示的化合物或其盐：

式(I)

式中，R为低级烷基、苯基或羟基苯基。

10.如权利要求第9项所述的自主神经调节剂，其中，R为异丙基、苯基或羟基苯基。

11.如权利要求第9项所述的自主神经调节剂，其中，R为异丙基。

12.如权利要求第9项至第11项中任一项所述的自主神经调节剂，其为药物组合物、准医药品组合物或饮食品组合物的形态者。

13.一种抗胁迫剂，其含有式(I)表示的化合物或其盐：

式(I)

式中，R为低级烷基、苯基或羟基苯基。

14.如权利要求第13项所述的抗胁迫剂，其中，R为异丙基、苯基或羟基苯基。

15.如权利要求第13项所述的抗胁迫剂，其中，R为异丙基。

16.如权利要求第13项至第15项中任一项所述的抗胁迫剂，其为药物组合物、准医药品组合物或饮食品组合物的形态。