JPWO2006090555A1 - Akt活性化剤 - Google Patents
Akt活性化剤 Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2006090555A1 JPWO2006090555A1 JP2007504648A JP2007504648A JPWO2006090555A1 JP WO2006090555 A1 JPWO2006090555 A1 JP WO2006090555A1 JP 2007504648 A JP2007504648 A JP 2007504648A JP 2007504648 A JP2007504648 A JP 2007504648A JP WO2006090555 A1 JPWO2006090555 A1 JP WO2006090555A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- ile
- leu
- gdnf
- akt
- creb
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000012190 activator Substances 0.000 title claims abstract description 33
- AZLASBBHHSLQDB-GUBZILKMSA-N Leu-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C AZLASBBHHSLQDB-GUBZILKMSA-N 0.000 claims abstract description 230
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 49
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims abstract description 15
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 11
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims abstract description 10
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 32
- 102100034051 Heat shock protein HSP 90-alpha Human genes 0.000 claims description 27
- 101001016865 Homo sapiens Heat shock protein HSP 90-alpha Proteins 0.000 claims description 27
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 21
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 claims description 13
- 208000020431 spinal cord injury Diseases 0.000 claims description 11
- 230000037361 pathway Effects 0.000 claims description 10
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 claims description 9
- 206010012289 Dementia Diseases 0.000 claims description 7
- 208000029028 brain injury Diseases 0.000 claims description 7
- 206010008118 cerebral infarction Diseases 0.000 claims description 7
- 208000026106 cerebrovascular disease Diseases 0.000 claims description 7
- 208000003906 hydrocephalus Diseases 0.000 claims description 7
- 201000000980 schizophrenia Diseases 0.000 claims description 7
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 2
- 102000034615 Glial cell line-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 149
- 108091010837 Glial cell line-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 148
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 88
- 108091008611 Protein Kinase B Proteins 0.000 description 86
- 108010045171 Cyclic AMP Response Element-Binding Protein Proteins 0.000 description 65
- 102000005636 Cyclic AMP Response Element-Binding Protein Human genes 0.000 description 64
- 102000012215 HSC70 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 63
- 108010036652 HSC70 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 63
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 48
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 41
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 37
- 108010057466 NF-kappa B Proteins 0.000 description 36
- 102000003945 NF-kappa B Human genes 0.000 description 36
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 35
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 33
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 33
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 32
- 101100507655 Canis lupus familiaris HSPA1 gene Proteins 0.000 description 30
- 101000579425 Homo sapiens Proto-oncogene tyrosine-protein kinase receptor Ret Proteins 0.000 description 29
- 102100028286 Proto-oncogene tyrosine-protein kinase receptor Ret Human genes 0.000 description 28
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 28
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 27
- 210000004295 hippocampal neuron Anatomy 0.000 description 27
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 26
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 26
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 25
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 25
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 21
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 20
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 17
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 16
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 15
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 14
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 14
- 108091007960 PI3Ks Proteins 0.000 description 14
- QJJXYPPXXYFBGM-LFZNUXCKSA-N Tacrolimus Chemical compound C1C[C@@H](O)[C@H](OC)C[C@@H]1\C=C(/C)[C@@H]1[C@H](C)[C@@H](O)CC(=O)[C@H](CC=C)/C=C(C)/C[C@H](C)C[C@H](OC)[C@H]([C@H](C[C@H]2C)OC)O[C@@]2(O)C(=O)C(=O)N2CCCC[C@H]2C(=O)O1 QJJXYPPXXYFBGM-LFZNUXCKSA-N 0.000 description 14
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 14
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 14
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 13
- UETNIIAIRMUTSM-UHFFFAOYSA-N Jacareubin Natural products CC1(C)OC2=CC3Oc4c(O)c(O)ccc4C(=O)C3C(=C2C=C1)O UETNIIAIRMUTSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 230000009471 action Effects 0.000 description 13
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 13
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 13
- NCEXYHBECQHGNR-QZQOTICOSA-N sulfasalazine Chemical compound C1=C(O)C(C(=O)O)=CC(\N=N\C=2C=CC(=CC=2)S(=O)(=O)NC=2N=CC=CC=2)=C1 NCEXYHBECQHGNR-QZQOTICOSA-N 0.000 description 13
- 229960001940 sulfasalazine Drugs 0.000 description 13
- NCEXYHBECQHGNR-UHFFFAOYSA-N sulfasalazine Natural products C1=C(O)C(C(=O)O)=CC(N=NC=2C=CC(=CC=2)S(=O)(=O)NC=2N=CC=CC=2)=C1 NCEXYHBECQHGNR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- QJJXYPPXXYFBGM-SHYZHZOCSA-N tacrolimus Natural products CO[C@H]1C[C@H](CC[C@@H]1O)C=C(C)[C@H]2OC(=O)[C@H]3CCCCN3C(=O)C(=O)[C@@]4(O)O[C@@H]([C@H](C[C@H]4C)OC)[C@@H](C[C@H](C)CC(=C[C@@H](CC=C)C(=O)C[C@H](O)[C@H]2C)C)OC QJJXYPPXXYFBGM-SHYZHZOCSA-N 0.000 description 13
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 12
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 12
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 12
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 12
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 12
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 11
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 11
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 11
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 11
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 11
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 11
- 108091006112 ATPases Proteins 0.000 description 10
- 102000057290 Adenosine Triphosphatases Human genes 0.000 description 10
- 108010016648 Immunophilins Proteins 0.000 description 10
- 102000000521 Immunophilins Human genes 0.000 description 10
- 102000038030 PI3Ks Human genes 0.000 description 10
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 10
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 10
- 108091005601 modified peptides Proteins 0.000 description 10
- 230000000324 neuroprotective effect Effects 0.000 description 10
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 9
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 9
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 9
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 9
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 9
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 9
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 9
- 229960001967 tacrolimus Drugs 0.000 description 9
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 8
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- -1 GCF: GC factor Proteins 0.000 description 8
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 8
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 8
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 8
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 8
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 229960001484 edetic acid Drugs 0.000 description 8
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 8
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 229930105110 Cyclosporin A Natural products 0.000 description 7
- PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N Cyclosporin A Chemical compound CC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N 0.000 description 7
- 108010036949 Cyclosporine Proteins 0.000 description 7
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 7
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 7
- 229960001265 ciclosporin Drugs 0.000 description 7
- 238000011161 development Methods 0.000 description 7
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 7
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 7
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 7
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 7
- 238000011160 research Methods 0.000 description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010003721 Calcium-Calmodulin-Dependent Protein Kinase Type 2 Proteins 0.000 description 6
- 102000004657 Calcium-Calmodulin-Dependent Protein Kinase Type 2 Human genes 0.000 description 6
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 6
- JRZJKWGQFNTSRN-UHFFFAOYSA-N Geldanamycin Natural products C1C(C)CC(OC)C(O)C(C)C=C(C)C(OC(N)=O)C(OC)CCC=C(C)C(=O)NC2=CC(=O)C(OC)=C1C2=O JRZJKWGQFNTSRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- BBIXOODYWPFNDT-CIUDSAMLSA-N Ile-Pro Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O BBIXOODYWPFNDT-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 6
- 102000007072 Nerve Growth Factors Human genes 0.000 description 6
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 6
- 102000003993 Phosphatidylinositol 3-kinases Human genes 0.000 description 6
- 108090000430 Phosphatidylinositol 3-kinases Proteins 0.000 description 6
- ZKQOUHVVXABNDG-IUCAKERBSA-N Pro-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 ZKQOUHVVXABNDG-IUCAKERBSA-N 0.000 description 6
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 6
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N chlorobutanol Chemical compound CC(C)(O)C(Cl)(Cl)Cl OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 206010013663 drug dependence Diseases 0.000 description 6
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 6
- QTQAWLPCGQOSGP-GBTDJJJQSA-N geldanamycin Chemical compound N1C(=O)\C(C)=C/C=C\[C@@H](OC)[C@H](OC(N)=O)\C(C)=C/[C@@H](C)[C@@H](O)[C@H](OC)C[C@@H](C)CC2=C(OC)C(=O)C=C1C2=O QTQAWLPCGQOSGP-GBTDJJJQSA-N 0.000 description 6
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 6
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 6
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 108010090894 prolylleucine Proteins 0.000 description 6
- 208000011117 substance-related disease Diseases 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 5
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 5
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 5
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 5
- 239000012828 PI3K inhibitor Substances 0.000 description 5
- 101710111747 Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase FKBP12 Proteins 0.000 description 5
- 235000013373 food additive Nutrition 0.000 description 5
- 239000002778 food additive Substances 0.000 description 5
- 210000001320 hippocampus Anatomy 0.000 description 5
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 5
- 238000012900 molecular simulation Methods 0.000 description 5
- 230000017128 negative regulation of NF-kappaB transcription factor activity Effects 0.000 description 5
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 5
- 229940043441 phosphoinositide 3-kinase inhibitor Drugs 0.000 description 5
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 5
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 5
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 5
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 5
- 230000007730 Akt signaling Effects 0.000 description 4
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910000013 Ammonium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 4
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 4
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 4
- 102100035130 Forkhead box protein K1 Human genes 0.000 description 4
- 101710088032 Forkhead box protein K1 Proteins 0.000 description 4
- 108010027992 HSP70 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 4
- 101000997829 Homo sapiens Glial cell line-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 4
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 4
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 4
- 238000000134 MTT assay Methods 0.000 description 4
- 231100000002 MTT assay Toxicity 0.000 description 4
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 4
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 108010027179 Tacrolimus Binding Proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000018679 Tacrolimus Binding Proteins Human genes 0.000 description 4
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 4
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 4
- 102000004586 YY1 Transcription Factor Human genes 0.000 description 4
- 108010042669 YY1 Transcription Factor Proteins 0.000 description 4
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 4
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 4
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 description 4
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 4
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 4
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 4
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 4
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 4
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 4
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 4
- VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N dopamine Chemical compound NCCC1=CC=C(O)C(O)=C1 VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 230000036541 health Effects 0.000 description 4
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 4
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 4
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 4
- 230000016273 neuron death Effects 0.000 description 4
- 239000003900 neurotrophic factor Substances 0.000 description 4
- 230000005937 nuclear translocation Effects 0.000 description 4
- WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N pentobarbital Chemical compound CCCC(C)C1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 4
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 4
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 4
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- 108010067247 tacrolimus binding protein 4 Proteins 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- FAWLNURBQMTKEB-URDPEVQOSA-N 213546-53-3 Chemical compound N([C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(O)=O)C(C)C)C(C)C)C(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)N)C(C)C FAWLNURBQMTKEB-URDPEVQOSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 3
- 102000004631 Calcineurin Human genes 0.000 description 3
- 108010042955 Calcineurin Proteins 0.000 description 3
- IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N Cyclic adenosine monophosphate Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H]2N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 3
- 108010007457 Extracellular Signal-Regulated MAP Kinases Proteins 0.000 description 3
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000018932 HSP70 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 3
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 3
- 108010020382 Hepatocyte Nuclear Factor 1-alpha Proteins 0.000 description 3
- 102100022057 Hepatocyte nuclear factor 1-alpha Human genes 0.000 description 3
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N Leupeptin Natural products CC(C)CC(NC(C)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000997828 Mus musculus Glial cell line-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 3
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010001648 Proto-Oncogene Proteins c-ret Proteins 0.000 description 3
- 102000000813 Proto-Oncogene Proteins c-ret Human genes 0.000 description 3
- 102100033810 RAC-alpha serine/threonine-protein kinase Human genes 0.000 description 3
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100022972 Transcription factor AP-2-alpha Human genes 0.000 description 3
- 101710189834 Transcription factor AP-2-alpha Proteins 0.000 description 3
- IVOMOUWHDPKRLL-UHFFFAOYSA-N UNPD107823 Natural products O1C2COP(O)(=O)OC2C(O)C1N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 IVOMOUWHDPKRLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- GGKQIOFASHYUJZ-UHFFFAOYSA-N ametoctradin Chemical compound NC1=C(CCCCCCCC)C(CC)=NC2=NC=NN21 GGKQIOFASHYUJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 3
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 229940077737 brain-derived neurotrophic factor Drugs 0.000 description 3
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 3
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 229960004926 chlorobutanol Drugs 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 3
- 229940095074 cyclic amp Drugs 0.000 description 3
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 3
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 3
- 239000003481 heat shock protein 90 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 230000000971 hippocampal effect Effects 0.000 description 3
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 3
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N leupeptin Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 3
- 108010052968 leupeptin Proteins 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 3
- 229960001252 methamphetamine Drugs 0.000 description 3
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 3
- 210000002161 motor neuron Anatomy 0.000 description 3
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 3
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000004031 neuronal differentiation Effects 0.000 description 3
- FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N pepstatin A Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CC(C)C FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N 0.000 description 3
- 230000004911 positive regulation of CREB transcription factor activity Effects 0.000 description 3
- 230000034190 positive regulation of NF-kappaB transcription factor activity Effects 0.000 description 3
- 238000005381 potential energy Methods 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 3
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 3
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 3
- 108091008598 receptor tyrosine kinases Proteins 0.000 description 3
- 102000027426 receptor tyrosine kinases Human genes 0.000 description 3
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 3
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 3
- 230000003584 silencer Effects 0.000 description 3
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 description 3
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 3
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VBICKXHEKHSIBG-UHFFFAOYSA-N 1-monostearoylglycerol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)CO VBICKXHEKHSIBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KISWVXRQTGLFGD-UHFFFAOYSA-N 2-[[2-[[6-amino-2-[[2-[[2-[[5-amino-2-[[2-[[1-[2-[[6-amino-2-[(2,5-diamino-5-oxopentanoyl)amino]hexanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)p Chemical compound C1CCN(C(=O)C(CCCN=C(N)N)NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(N)CCC(N)=O)C1C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(=O)NC(CC(C)C)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 KISWVXRQTGLFGD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WDEHKPUUQDUYGZ-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-1,3-thiazole 2H-tetrazole Chemical compound C=1N=NNN=1.CC1=NC=CS1 WDEHKPUUQDUYGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- ZAINTDRBUHCDPZ-UHFFFAOYSA-M Alexa Fluor 546 Chemical compound [H+].[Na+].CC1CC(C)(C)NC(C(=C2OC3=C(C4=NC(C)(C)CC(C)C4=CC3=3)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)=C1C=C2C=3C(C(=C(Cl)C=1Cl)C(O)=O)=C(Cl)C=1SCC(=O)NCCCCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O ZAINTDRBUHCDPZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 2
- CJLHTKGWEUGORV-UHFFFAOYSA-N Artemin Chemical compound C1CC2(C)C(O)CCC(=C)C2(O)C2C1C(C)C(=O)O2 CJLHTKGWEUGORV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 2
- 101100016370 Danio rerio hsp90a.1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100285708 Dictyostelium discoideum hspD gene Proteins 0.000 description 2
- 102100023227 E3 SUMO-protein ligase EGR2 Human genes 0.000 description 2
- 101150059401 EGR2 gene Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N Fumaric acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 2
- 101001049692 Homo sapiens E3 SUMO-protein ligase EGR2 Proteins 0.000 description 2
- 108060006678 I-kappa-B kinase Proteins 0.000 description 2
- 102000001284 I-kappa-B kinase Human genes 0.000 description 2
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 101100444898 Mus musculus Egr1 gene Proteins 0.000 description 2
- 102000047918 Myelin Basic Human genes 0.000 description 2
- 101710107068 Myelin basic protein Proteins 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 2
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 2
- 108090000742 Neurotrophin 3 Proteins 0.000 description 2
- 102100021584 Neurturin Human genes 0.000 description 2
- 108010015406 Neurturin Proteins 0.000 description 2
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 2
- 102100020739 Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase FKBP4 Human genes 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N Progesterone Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H](C(=O)C)[C@@]1(C)CC2 RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 2
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 2
- 101150077555 Ret gene Proteins 0.000 description 2
- 101100071627 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) swo1 gene Proteins 0.000 description 2
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 235000010724 Wisteria floribunda Nutrition 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 2
- VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N alprazolam Chemical compound C12=CC(Cl)=CC=C2N2C(C)=NN=C2CN=C1C1=CC=CC=C1 VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 229960000686 benzalkonium chloride Drugs 0.000 description 2
- CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N benzyl(dimethyl)azanium;chloride Chemical compound [Cl-].C[NH+](C)CC1=CC=CC=C1 CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 2
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 2
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 2
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 2
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 2
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 210000003710 cerebral cortex Anatomy 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- ZPUCINDJVBIVPJ-LJISPDSOSA-N cocaine Chemical compound O([C@H]1C[C@@H]2CC[C@@H](N2C)[C@H]1C(=O)OC)C(=O)C1=CC=CC=C1 ZPUCINDJVBIVPJ-LJISPDSOSA-N 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 description 2
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 229960003638 dopamine Drugs 0.000 description 2
- 210000005064 dopaminergic neuron Anatomy 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 229920001971 elastomer Polymers 0.000 description 2
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 2
- 239000003257 excitatory amino acid Substances 0.000 description 2
- 230000002461 excitatory amino acid Effects 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 2
- 239000010408 film Substances 0.000 description 2
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 2
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 2
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N methylparaben Chemical compound COC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BQJCRHHNABKAKU-KBQPJGBKSA-N morphine Chemical compound O([C@H]1[C@H](C=C[C@H]23)O)C4=C5[C@@]12CCN(C)[C@@H]3CC5=CC=C4O BQJCRHHNABKAKU-KBQPJGBKSA-N 0.000 description 2
- 206010051747 multiple endocrine neoplasia Diseases 0.000 description 2
- VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N n'-amino-n-iminomethanimidamide Chemical compound N\N=C\N=N VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 210000001577 neostriatum Anatomy 0.000 description 2
- 239000000765 neuroimmunophilin Substances 0.000 description 2
- 230000006576 neuronal survival Effects 0.000 description 2
- 230000004112 neuroprotection Effects 0.000 description 2
- 239000004090 neuroprotective agent Substances 0.000 description 2
- 230000000508 neurotrophic effect Effects 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 210000004248 oligodendroglia Anatomy 0.000 description 2
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 229960001412 pentobarbital Drugs 0.000 description 2
- 229950000964 pepstatin Drugs 0.000 description 2
- 108010091212 pepstatin Proteins 0.000 description 2
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 2
- 235000020030 perry Nutrition 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- WVDDGKGOMKODPV-ZQBYOMGUSA-N phenyl(114C)methanol Chemical compound O[14CH2]C1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-ZQBYOMGUSA-N 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 2
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 2
- 210000002243 primary neuron Anatomy 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- RUOKEQAAGRXIBM-GFCCVEGCSA-N rasagiline Chemical compound C1=CC=C2[C@H](NCC#C)CCC2=C1 RUOKEQAAGRXIBM-GFCCVEGCSA-N 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N renifolin D Natural products CC(=C)[C@@H]1Cc2c(O)c(O)ccc2[C@H]1CC(=O)c3ccc(O)cc3O BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 2
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 2
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 2
- 235000010356 sorbitol Nutrition 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 2
- 230000002889 sympathetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001228 trophic effect Effects 0.000 description 2
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LNAZSHAWQACDHT-XIYTZBAFSA-N (2r,3r,4s,5r,6s)-4,5-dimethoxy-2-(methoxymethyl)-3-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,4,5-trimethoxy-6-(methoxymethyl)oxan-2-yl]oxy-6-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4,5,6-trimethoxy-2-(methoxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxane Chemical compound CO[C@@H]1[C@@H](OC)[C@H](OC)[C@@H](COC)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](OC)[C@@H](OC)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OC)[C@H](OC)O[C@@H]2COC)OC)O[C@@H]1COC LNAZSHAWQACDHT-XIYTZBAFSA-N 0.000 description 1
- LOGFVTREOLYCPF-KXNHARMFSA-N (2s,3r)-2-[[(2r)-1-[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-hydroxybutanoic acid Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)CCCCN LOGFVTREOLYCPF-KXNHARMFSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- WIHIUTUAHOZVLE-UHFFFAOYSA-N 1,3-diethoxypropan-2-ol Chemical compound CCOCC(O)COCC WIHIUTUAHOZVLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-2,4-dioxo-1,3-diazinane-5-carboximidamide Chemical compound CN1CC(C(N)=N)C(=O)NC1=O IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.NCC(O)=O IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- YCLSOMLVSHPPFV-UHFFFAOYSA-N 3-(2-carboxyethyldisulfanyl)propanoic acid Chemical compound OC(=O)CCSSCCC(O)=O YCLSOMLVSHPPFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 244000215068 Acacia senegal Species 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 description 1
- 102100026376 Artemin Human genes 0.000 description 1
- 101710205806 Artemin Proteins 0.000 description 1
- 206010003210 Arteriosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 241000416162 Astragalus gummifer Species 0.000 description 1
- 102100027954 BAG family molecular chaperone regulator 3 Human genes 0.000 description 1
- 101710089791 BAG family molecular chaperone regulator 3 Proteins 0.000 description 1
- WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N Bromine atom Chemical compound [Br] WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010008120 Cerebral ischaemia Diseases 0.000 description 1
- 241000252506 Characiformes Species 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 206010010539 Congenital megacolon Diseases 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 description 1
- 101100125027 Dictyostelium discoideum mhsp70 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100037832 Docking protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 101000944251 Emericella nidulans (strain FGSC A4 / ATCC 38163 / CBS 112.46 / NRRL 194 / M139) Calcium/calmodulin-dependent protein kinase cmkA Proteins 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 102000007665 Extracellular Signal-Regulated MAP Kinases Human genes 0.000 description 1
- 201000006850 Familial medullary thyroid carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 1
- PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N Fluorine Chemical compound FF PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091092584 GDNA Proteins 0.000 description 1
- 241000699694 Gerbillinae Species 0.000 description 1
- 108010001589 Glial Cell Line-Derived Neurotrophic Factors Proteins 0.000 description 1
- 229920000084 Gum arabic Polymers 0.000 description 1
- 101150031823 HSP70 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000042775 Heat shock protein 70 family Human genes 0.000 description 1
- 108091082017 Heat shock protein 70 family Proteins 0.000 description 1
- 208000004592 Hirschsprung disease Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000805172 Homo sapiens Docking protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001056180 Homo sapiens Induced myeloid leukemia cell differentiation protein Mcl-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000979342 Homo sapiens Nuclear factor NF-kappa-B p105 subunit Proteins 0.000 description 1
- 101001059454 Homo sapiens Serine/threonine-protein kinase MARK2 Proteins 0.000 description 1
- AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N Hydroxylamine Chemical compound ON AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000003777 Interleukin-1 beta Human genes 0.000 description 1
- 108090000193 Interleukin-1 beta Proteins 0.000 description 1
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 102000005431 Molecular Chaperones Human genes 0.000 description 1
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 description 1
- 206010073148 Multiple endocrine neoplasia type 2A Diseases 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 102000014415 Muscarinic acetylcholine receptor Human genes 0.000 description 1
- 108050003473 Muscarinic acetylcholine receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000055324 Myelin Proteolipid Human genes 0.000 description 1
- 101710094913 Myelin proteolipid protein Proteins 0.000 description 1
- 239000012580 N-2 Supplement Substances 0.000 description 1
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000018745 NF-KappaB Inhibitor alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010052419 NF-KappaB Inhibitor alpha Proteins 0.000 description 1
- 206010028851 Necrosis Diseases 0.000 description 1
- 102000004230 Neurotrophin 3 Human genes 0.000 description 1
- 102000008299 Nitric Oxide Synthase Human genes 0.000 description 1
- 108010021487 Nitric Oxide Synthase Proteins 0.000 description 1
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100023050 Nuclear factor NF-kappa-B p105 subunit Human genes 0.000 description 1
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102100036660 Persephin Human genes 0.000 description 1
- ZPHBZEQOLSRPAK-UHFFFAOYSA-N Phosphoramidon Natural products C=1NC2=CC=CC=C2C=1CC(C(O)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NP(O)(=O)OC1OC(C)C(O)C(O)C1O ZPHBZEQOLSRPAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N Propanedioic acid Natural products OC(=O)CC(O)=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108090000315 Protein Kinase C Proteins 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 102100037314 Protein kinase C gamma type Human genes 0.000 description 1
- 101710144823 Protein kinase C gamma type Proteins 0.000 description 1
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 108700020978 Proto-Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 102000052575 Proto-Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 244000184734 Pyrus japonica Species 0.000 description 1
- 108090000873 Receptor Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 102000004278 Receptor Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 201000003604 Renal agenesis Diseases 0.000 description 1
- 206010064655 Renal aplasia Diseases 0.000 description 1
- 206010063837 Reperfusion injury Diseases 0.000 description 1
- 108091027981 Response element Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 108060006706 SRC Proteins 0.000 description 1
- 102000001332 SRC Human genes 0.000 description 1
- 102100028904 Serine/threonine-protein kinase MARK2 Human genes 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 108010085012 Steroid Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000007451 Steroid Receptors Human genes 0.000 description 1
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N Sulfurous acid Chemical compound OS(O)=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N Tartaric acid Natural products [H+].[H+].[O-]C(=O)C(O)C(O)C([O-])=O FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001615 Tragacanth Polymers 0.000 description 1
- 102000046299 Transforming Growth Factor beta1 Human genes 0.000 description 1
- 101800002279 Transforming growth factor beta-1 Proteins 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 235000010489 acacia gum Nutrition 0.000 description 1
- 239000000205 acacia gum Substances 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 235000011054 acetic acid Nutrition 0.000 description 1
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 210000001943 adrenal medulla Anatomy 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 description 1
- 150000003973 alkyl amines Chemical class 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 230000006229 amino acid addition Effects 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002424 anti-apoptotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003356 anti-rheumatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003435 antirheumatic agent Substances 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 208000011775 arteriosclerosis disease Diseases 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000035578 autophosphorylation Effects 0.000 description 1
- 230000003542 behavioural effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 125000003236 benzoyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 1
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 1
- GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N bromine Substances BrBr GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052794 bromium Inorganic materials 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000010216 calcium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 1
- 229960003920 cocaine Drugs 0.000 description 1
- 239000002475 cognitive enhancer Substances 0.000 description 1
- 238000007398 colorimetric assay Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000366 copper(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000006059 cover glass Substances 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 230000030609 dephosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000010454 developmental mechanism Effects 0.000 description 1
- UGMCXQCYOVCMTB-UHFFFAOYSA-K dihydroxy(stearato)aluminium Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)O[Al](O)O UGMCXQCYOVCMTB-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 101150052825 dnaK gene Proteins 0.000 description 1
- 230000004771 dopaminergic neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 230000003291 dopaminomimetic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 230000000857 drug effect Effects 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 210000003981 ectoderm Anatomy 0.000 description 1
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 210000005216 enteric neuron Anatomy 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 125000001301 ethoxy group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])O* 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 231100000318 excitotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003492 excitotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 125000002485 formyl group Chemical group [H]C(*)=O 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000001530 fumaric acid Substances 0.000 description 1
- 235000011087 fumaric acid Nutrition 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 101150082979 gdnf gene Proteins 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 229940075507 glyceryl monostearate Drugs 0.000 description 1
- 238000001631 haemodialysis Methods 0.000 description 1
- 150000004820 halides Chemical class 0.000 description 1
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 description 1
- 230000000322 hemodialysis Effects 0.000 description 1
- 102000052654 human GDNF Human genes 0.000 description 1
- 102000050427 human RET Human genes 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 125000002768 hydroxyalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229920003063 hydroxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 229940031574 hydroxymethyl cellulose Drugs 0.000 description 1
- 125000004029 hydroxymethyl group Chemical group [H]OC([H])([H])* 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 1
- 230000001861 immunosuppressant effect Effects 0.000 description 1
- 229940124589 immunosuppressive drug Drugs 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000006882 induction of apoptosis Effects 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 230000030214 innervation Effects 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 230000031146 intracellular signal transduction Effects 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N iodine Chemical compound II PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000012947 ischemia reperfusion injury Diseases 0.000 description 1
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 230000029795 kidney development Effects 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N maleic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N 0.000 description 1
- 239000011976 maleic acid Substances 0.000 description 1
- 125000000346 malonyl group Chemical group C(CC(=O)*)(=O)* 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 238000000816 matrix-assisted laser desorption--ionisation Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 208000023356 medullary thyroid gland carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000001259 mesencephalon Anatomy 0.000 description 1
- 210000003716 mesoderm Anatomy 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000004292 methyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 1
- 235000010270 methyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010981 methylcellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229960002216 methylparaben Drugs 0.000 description 1
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 235000020124 milk-based beverage Nutrition 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 1
- 238000002715 modification method Methods 0.000 description 1
- 230000009149 molecular binding Effects 0.000 description 1
- 238000000329 molecular dynamics simulation Methods 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 239000001788 mono and diglycerides of fatty acids Substances 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 229960005181 morphine Drugs 0.000 description 1
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 125000004123 n-propyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 230000032405 negative regulation of neuron apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000944 nerve tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000001982 neural crest cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001178 neural stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000276 neural tube Anatomy 0.000 description 1
- 201000011519 neuroendocrine tumor Diseases 0.000 description 1
- 230000004766 neurogenesis Effects 0.000 description 1
- 229940032018 neurotrophin 3 Drugs 0.000 description 1
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000001009 nucleus accumben Anatomy 0.000 description 1
- 235000003170 nutritional factors Nutrition 0.000 description 1
- 230000009965 odorless effect Effects 0.000 description 1
- 210000000535 oligodendrocyte precursor cell Anatomy 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000005305 organ development Effects 0.000 description 1
- 230000000849 parathyroid Effects 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 1
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 238000000955 peptide mass fingerprinting Methods 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000578 peripheral nerve Anatomy 0.000 description 1
- 108010070453 persephin Proteins 0.000 description 1
- 229960003742 phenol Drugs 0.000 description 1
- 208000028591 pheochromocytoma Diseases 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- BWSDNRQVTFZQQD-AYVHNPTNSA-N phosphoramidon Chemical compound O([P@@](O)(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CC=1[C]2C=CC=CC2=NC=1)C(O)=O)[C@H]1O[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O BWSDNRQVTFZQQD-AYVHNPTNSA-N 0.000 description 1
- 108010072906 phosphoramidon Proteins 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 229960003387 progesterone Drugs 0.000 description 1
- 239000000186 progesterone Substances 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 210000004129 prosencephalon Anatomy 0.000 description 1
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000003380 quartz crystal microbalance Methods 0.000 description 1
- 229960000245 rasagiline Drugs 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 230000025915 regulation of apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 108091008025 regulatory factors Proteins 0.000 description 1
- 102000037983 regulatory factors Human genes 0.000 description 1
- 230000008844 regulatory mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- UQDJGEHQDNVPGU-UHFFFAOYSA-N serine phosphoethanolamine Chemical compound [NH3+]CCOP([O-])(=O)OCC([NH3+])C([O-])=O UQDJGEHQDNVPGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 235000010413 sodium alginate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000661 sodium alginate Substances 0.000 description 1
- 229940005550 sodium alginate Drugs 0.000 description 1
- AKHNMLFCWUSKQB-UHFFFAOYSA-L sodium thiosulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=S AKHNMLFCWUSKQB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000019345 sodium thiosulphate Nutrition 0.000 description 1
- AFIQQQWSAQPUQO-UHFFFAOYSA-N sodium;3-acetyl-6-methylpyran-3-ide-2,4-dione;hydrate Chemical compound O.[Na+].CC(=O)[C-]1C(=O)C=C(C)OC1=O AFIQQQWSAQPUQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000014214 soft drink Nutrition 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 description 1
- 210000002023 somite Anatomy 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000000547 structure data Methods 0.000 description 1
- 210000003523 substantia nigra Anatomy 0.000 description 1
- FDDDEECHVMSUSB-UHFFFAOYSA-N sulfanilamide Chemical compound NC1=CC=C(S(N)(=O)=O)C=C1 FDDDEECHVMSUSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000475 sulfinyl group Chemical group [*:2]S([*:1])=O 0.000 description 1
- 229940124530 sulfonamide Drugs 0.000 description 1
- 235000011149 sulphuric acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 239000011975 tartaric acid Substances 0.000 description 1
- 235000002906 tartaric acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000009967 tasteless effect Effects 0.000 description 1
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 1
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000001269 time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 235000010487 tragacanth Nutrition 0.000 description 1
- 239000000196 tragacanth Substances 0.000 description 1
- 229940116362 tragacanth Drugs 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 229940099456 transforming growth factor beta 1 Drugs 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 230000000472 traumatic effect Effects 0.000 description 1
- IHIXIJGXTJIKRB-UHFFFAOYSA-N trisodium vanadate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-][V]([O-])([O-])=O IHIXIJGXTJIKRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- A61K38/05—Dipeptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
- A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
- A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
- A23L33/18—Peptides; Protein hydrolysates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
- A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
- A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Neurology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Psychology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Psychiatry (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Leu-Ileの新たな用途を提供する。(a)〜(c)のいずれかの化合物を有効成分として含有するAkt活性化剤:(a)Leu及びIleからなるペプチド;(b)Leu及びIleからなるペプチドの修飾体;(c)薬学的に許容可能な、(a)又は(b)の塩。
Description
本発明はAkt活性化剤に関する。本発明のAkt活性化剤はAktの活性化を介して、Aktが関与する疾患の治療や予防に利用できる。
近年、日本の将来を担う若年層において薬物乱用者が増え、薬物依存症が大きな社会問題となりつつある。そのため、薬物依存形成機構の解明および治療法の開発は緊急を要する課題である。これまでの研究では、glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF)が薬物依存を抑制することが報告されている(Green-Sadan et al., 2003; Messer, 2000(非特許文献1及び2))。しかし、GDNFは高分子タンパク質であり、血液脳関門を通過できずに血中のプロテアーゼによって分解されてしまうため、末梢からの投与では治療効果を得ることが困難である。そこで、我々はGDNFを産生誘導する低分子量の疎水性ジペプチドLeu-Ile (Nitta et al., 2004(非特許文献3))を用いて薬物依存に対する治療効果を検討した。
国内で最も多く乱用されている覚醒剤メタンフェタミンを投与したマウスに対してLeu-Ileを投与したところ、Leu-Ileはメタンフェタミンによって引き起こされる場所嗜好性および運動量の増加を抑制し、すでに形成されてしまった場所嗜好性や運動量の増加に対しても抑制効果のあることが示された(Nitta et al., 2003(非特許文献4))。これらの研究によって、Leu-Ileが薬物依存の治療薬となる可能性が示唆された。しかし、Leu-Ileが生体内でどのタンパク質と結合し、どの様なシグナル経路を介してGDNFを産生誘導しているのかはまだ解明されていない。
GDNFは薬物依存のみでなく、胎児中胚葉由来ドーパミン作動性神経を始め運動神経細胞、海馬神経細胞、大脳皮質神経細胞などに対して保護作用を持ち(Houenou et al., 1996; Lin et al., 1993; Trupp et al., 1997; Wang et al., 1997(非特許文献5〜8))、パーキンソン病や脊髄損傷の治療薬としての応用も期待されている。厚生労働省の調査によると、日本国内のみでも、パーキンソン病の患者数は14万1千人(平成14年度患者調査)、脊髄損傷の患者数は10万人(平成13年身体障害児・身体障害者実態調査)となっており、多くの人々が、現在の医療技術では治療困難な神経変性疾患を抱えている。
文部科学省では、これらの疾患や動脈硬化症などの生活習慣病に対して再生医療を用いた新しい治療法の実用化を目指すため、平成15年度より「再生医療の実現化プロジェクト」に着手した。再生医療が実現すれば、これまでの医療を根本的に変革する革新的医療技術となりうる。その中で、「幹細胞」を用いた再生医療を実現させるためには、細胞増殖や分化調節に関する機構の解明が必要である。初期神経発生にも深く関わりを持つGDNFなどの神経栄養因子は、神経幹細胞の増殖、分化に於いても重要な制御因子となると考えられている(Lee et al., 2005; Riaz et al., 2004; Roussa and Krieglstein., 2004; Tzeng et al., 2004; Yoo et al., 2003(非特許文献9〜13))。
国内で最も多く乱用されている覚醒剤メタンフェタミンを投与したマウスに対してLeu-Ileを投与したところ、Leu-Ileはメタンフェタミンによって引き起こされる場所嗜好性および運動量の増加を抑制し、すでに形成されてしまった場所嗜好性や運動量の増加に対しても抑制効果のあることが示された(Nitta et al., 2003(非特許文献4))。これらの研究によって、Leu-Ileが薬物依存の治療薬となる可能性が示唆された。しかし、Leu-Ileが生体内でどのタンパク質と結合し、どの様なシグナル経路を介してGDNFを産生誘導しているのかはまだ解明されていない。
GDNFは薬物依存のみでなく、胎児中胚葉由来ドーパミン作動性神経を始め運動神経細胞、海馬神経細胞、大脳皮質神経細胞などに対して保護作用を持ち(Houenou et al., 1996; Lin et al., 1993; Trupp et al., 1997; Wang et al., 1997(非特許文献5〜8))、パーキンソン病や脊髄損傷の治療薬としての応用も期待されている。厚生労働省の調査によると、日本国内のみでも、パーキンソン病の患者数は14万1千人(平成14年度患者調査)、脊髄損傷の患者数は10万人(平成13年身体障害児・身体障害者実態調査)となっており、多くの人々が、現在の医療技術では治療困難な神経変性疾患を抱えている。
文部科学省では、これらの疾患や動脈硬化症などの生活習慣病に対して再生医療を用いた新しい治療法の実用化を目指すため、平成15年度より「再生医療の実現化プロジェクト」に着手した。再生医療が実現すれば、これまでの医療を根本的に変革する革新的医療技術となりうる。その中で、「幹細胞」を用いた再生医療を実現させるためには、細胞増殖や分化調節に関する機構の解明が必要である。初期神経発生にも深く関わりを持つGDNFなどの神経栄養因子は、神経幹細胞の増殖、分化に於いても重要な制御因子となると考えられている(Lee et al., 2005; Riaz et al., 2004; Roussa and Krieglstein., 2004; Tzeng et al., 2004; Yoo et al., 2003(非特許文献9〜13))。
Green-Sadan T, Kinor N, Roth-Deri I, Geffen-Aricha R, Schindler CJ, Yadid G: Transplantation of glial cell line-derived neurotrophic factor-expressing cells into the striatum and nucleus accumbens attenuates acquisition of cocaine self-administration in rats. Eur J Neurosci, 18: 2093-2098 (2003)
Messer CJ, Eisch AJ, Carlezon WA Jr, Whisler K, Shen L, Wolf DH, Westphal H, Collins F, Russell DS, Nestler EJ: Role for GDNF in biochemical and behavioral adaptations to drugs of abuse. Neuron, 26: 247-257 (2000)
Nitta A, Nishioka H, Fukumitsu H, Furukawa Y, Sugiura H, Shen L, Furukawa S: Hydrophobic dipeptide Leu-Ile protects against neuronal death by inducing brain-derived neurotrophic factor and glial cell line-derived neurotrophic factor synthesis. J Neurosci Res, 78: 250-258 (2004)
Nitta A, Yamada Y, Nakajima A, Noda Y, Yamada K, Nabeshima T: Candidate genes or compounds for therapeutic tools against methamphetamine and/or morphine-induced dependence. Folia Pharmacologica Japonica, 122: 81-83 (2003)
Houenou LJ, Oppenheim RW, Li L, Lo AC, Prevette D: Regulation of spinal motoneuron survival by GDNF during development and following injury. Cell Tissue Res, 286: 219-223 (1996)
Lin LF, Doherty DH, Lile JD, Bektesh S, Collins F: GDNF: a glial cell line-derived neurotrophic factor for midbrain dopaminergic neurons. Science, 260: 1130-1132 (1993)
Trupp M, Belluardo N, Funakoshi H, Ibanez CF: Complementary and overlapping expression of glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF), c-ret proto-oncogene, and GDNF receptor-alpha indicates multiple mechanisms of trophic actions in the adult rat CNS. J Neurosci, 17: 3554-3567 (1997)
Wang Y, Lin SZ, Chiou AL, Williams LR, Hoffer BJ: Glial cell line-derived neurotrophic factor protects against ischemia-induced injury in the cerebral cortex. J Neurosci, 17: 4341-4348 (1997)
Lee CS, Tee LY, Dusenbery S, Takata T, Golden JP, Pierchala BA, Gottlieb DI, Johnson EM Jr, Choi DW, Snider JB: Neurotrophin and GDNF family ligands promote survival and alter excitotoxic vulnerability of neurons derived from murine embryonic stem cells. Exp Neurol, 191: 65-76 (2005)
Riaz SS, Theofilopoulos S, Jauniaux E, Stern GM, Bradford HF: The differentiation potential of human foetal neuronal progenitor cells in vitro. Brain Res Dev Brain Res, 153: 39-51 (2004)
Roussa E, Krieglstein K: GDNF promotes neuronal differentiation and dopaminergic development of mouse mesencephalic neurospheres. Neurosci Lett, 361: 52-55 (2004)
Tzeng SF, Tsai MJ, Hung SC, Cheng H: Neuronal morphological change of size-sieved stem cells induced by neurotrophic stimuli. Neurosci Lett, 367: 23-28 (2004)
Yoo YM, Kim YJ, Lee U, Paik DJ, Yoo HT, Park CW, Kim YB, Lee SG, Kim WK, Yoo CJ: Neurotrophic factor in the treatment of Parkinson disease. Neurosurg Focus, 15: 1 (2003)
GDNFは神経保護作用を有し、神経変性疾患治療への応用が期待される。しかし、GDNFは、末梢投与では血液脳関門を通過できず、血中のプロテアーゼによって分解されてしまうため、脳への作用は期待できない。そのため、経口投与によって、脳または神経組織内でGDNFの産生量を効果的に増やせるような薬の開発が望まれる。そのような化合物を探索する中で、本発明者らはLeu-Ileを見出した(既報)。しかしながら、Leu-IleがどのようにしてGDNFを産生誘導するのかについては全く分かっていない。
そこで本発明は、その作用点及び作用機序を明らかにすることでLeu-Ileの新たな用途を提供することを目的とする。
そこで本発明は、その作用点及び作用機序を明らかにすることでLeu-Ileの新たな用途を提供することを目的とする。
本発明者らはLeu-IleのGDNF産生調節機構を解明することを目的として研究を行い、以下の知見を得るに至った。
(1)Leu-Ileは細胞膜透過性である。
(2)FITC標識したLeu-Ileとマウス脳ホモジナイズ液を反応させたところ、70KDの大きさのタンパク質が結合した。
(3)Leu-Ile結合タンパク質の質量分析を行った結果、Hsc70が同定された。
(4)水晶発振子バイオセンサーを用いてHsc70およびHsc70と相同性の高いHsp70とLeu-Ileの結合活性について検討したところ、Hsc70はKd = 1.83×10-8 M、Hsp70はKd = 1.24×10-8 Mの強さでLeu-Ileと特異的に結合した。
(5)分子シミュレーションを用いてHsc70とLeu-Ileの結合部位を予測し、相互ポテンシャルエネルギーを計算した結果、ATPaseドメインには-119.044 kCal、基質結合ドメインには-76.711 kCal、C末端ドメインには-64.337 kCalの強さでLeu-Ileが結合し、Hsc70はATPaseドメインと結合する可能性が高いことが示唆された。
(6)Leu-Ileを作用させた培養海馬神経細胞では、NF-κBが核内に移行し、活性化された。
(7)Leu-Ileを作用させた培養海馬神経細胞では、神経細胞死が抑制され、GDNFの産生が誘導されたが、NF-κB 阻害剤のsulfasalazineとLeu-Ileを同時に作用させた細胞群では、Leu-Ileの効果が抑制された。
(8)Leu-Ileを作用させた培養海馬神経細胞では、コントロール群に比べCREBのリン酸化の程度が増加した。
(9)CREBアンチセンスオリゴヌクレオチドを培養海馬神経細胞に作用させると、Leu-IleのGDNF産生誘導効果が抑制された。
(10)Leu-Ileを作用させた培養海馬神経細胞では、Aktのリン酸化の程度が増加したが、CaMKII、PKC-? およびERKについては変化がなかった。
(11)PI3K阻害剤のLY294002とLeu-Ileを同時に作用させた細胞では、Leu-Ileによって誘導されたAktおよびCREBのリン酸化は抑制されなかった。一方、Hsp90の阻害剤であるgeldanamycinとLeu-Ileを同時に作用させた細胞ではLeu-Ileによって誘導されたAktおよびCREBのリン酸化を抑制した。
(1)Leu-Ileは細胞膜透過性である。
(2)FITC標識したLeu-Ileとマウス脳ホモジナイズ液を反応させたところ、70KDの大きさのタンパク質が結合した。
(3)Leu-Ile結合タンパク質の質量分析を行った結果、Hsc70が同定された。
(4)水晶発振子バイオセンサーを用いてHsc70およびHsc70と相同性の高いHsp70とLeu-Ileの結合活性について検討したところ、Hsc70はKd = 1.83×10-8 M、Hsp70はKd = 1.24×10-8 Mの強さでLeu-Ileと特異的に結合した。
(5)分子シミュレーションを用いてHsc70とLeu-Ileの結合部位を予測し、相互ポテンシャルエネルギーを計算した結果、ATPaseドメインには-119.044 kCal、基質結合ドメインには-76.711 kCal、C末端ドメインには-64.337 kCalの強さでLeu-Ileが結合し、Hsc70はATPaseドメインと結合する可能性が高いことが示唆された。
(6)Leu-Ileを作用させた培養海馬神経細胞では、NF-κBが核内に移行し、活性化された。
(7)Leu-Ileを作用させた培養海馬神経細胞では、神経細胞死が抑制され、GDNFの産生が誘導されたが、NF-κB 阻害剤のsulfasalazineとLeu-Ileを同時に作用させた細胞群では、Leu-Ileの効果が抑制された。
(8)Leu-Ileを作用させた培養海馬神経細胞では、コントロール群に比べCREBのリン酸化の程度が増加した。
(9)CREBアンチセンスオリゴヌクレオチドを培養海馬神経細胞に作用させると、Leu-IleのGDNF産生誘導効果が抑制された。
(10)Leu-Ileを作用させた培養海馬神経細胞では、Aktのリン酸化の程度が増加したが、CaMKII、PKC-? およびERKについては変化がなかった。
(11)PI3K阻害剤のLY294002とLeu-Ileを同時に作用させた細胞では、Leu-Ileによって誘導されたAktおよびCREBのリン酸化は抑制されなかった。一方、Hsp90の阻害剤であるgeldanamycinとLeu-Ileを同時に作用させた細胞ではLeu-Ileによって誘導されたAktおよびCREBのリン酸化を抑制した。
以上の知見からLeu-IleがHsc70に結合し、Hsp90/Aktの経路(Hsp90が結合することによってAktが活性化される経路)を介してNF-κBおよびCREBを活性化し、GDNFの産生を誘導すると考えられた。Hsp90/Aktのシグナル経路によってLeu-IleがGDNFを産生誘導することが分かり、GDNFの発現調節を担う新たなターゲット遺伝子としてHsc70およびHsp90/Aktを特定することができた。
以上のように、Hsp90/Aktを介したシグナル経路によってLeu-IleがGDNFを産生誘導することが明かとなった。即ち、Leu-IleはAktを活性化する作用を有し、この作用が発揮される結果、GDNFの産生が誘導されることが判明した。
本発明者らは、Leu-IleがAkt活性化作用を有する点に注目した。Aktを活性化できるということは、Aktが関与する種々のシグナル経路を調節できることを意味する。従って、Aktが関与するグナル経路を調節することで治療効果や予防効果が得られる疾患に対してLeu-Ileが有効であるといえる。
本発明は、以上の知見及び考察に基づき完成されたものであって、以下の構成を提供する。
本発明は(a)〜(c)のいずれかの化合物を有効成分として含有するAkt活性化剤である。
(a)Leu及びIleからなるペプチド;
(b)Leu及びIleからなるペプチドの修飾体;
(c)薬学的に許容可能な、(a)又は(b)の塩。
本発明の一態様では、有効成分としてのペプチドがLeu−Ileであることを特徴とする。
本発明のAkt活性化剤は好ましくは、 パーキンソン病、脊髄損傷、薬物依存、アルツハイマー病、水頭症、脳損傷、脳梗塞、 痴呆症、リューマチ症、又は統合失調症の治療又は予防に使用される。
本発明の他の態様は、上記Akt活性化剤を含有する食品を提供する。
本発明は更に他の態様として、上記Akt活性化剤を生体に投与するステップを含む、パーキンソン病、脊髄損傷、薬物依存、アルツハイマー病、水頭症、脳損傷、脳梗塞、痴呆症、リューマチ症、又は統合失調症の予防又は治療方法を提供する。
尚、本明細書中では必要に応じて以下の略号を使用する。
AP2: activator protein 2、CEB: cytoplasmic extraction buffer、CREB: cAMP response element binding protein、CsA: cyclosporin A、DMEM: Dulbecco’s modified Eagle’s medium、DTT: dithiothreitol、EDTA: ethylenediamine tetracetic acid、egr-1: early growth response-1、egr-2: earlygrowth response-2、F12HAM: Ham’s nutrient mixture F12、FBS: fetal bovine serum、FGF: fibloblast growth factor、FITC: Fluorescein isothiocyanate isomer 1、FK506: tacrolimus、FKBP: FK506 binding protein、GCF: GC factor、GDNF: glial cell line-derived neurotrophic factor、GFR-α?: GDNF family receptor-α、IL-1β: interleukin-1beta、MALDI: Matrix-assisted laser desorption/ ionization、MNF: myocyte nuclear factor、MRE: metal response element、MS: Mass spectrometry、MTT: methyl thiazol tetrazolium、NCBI: National Center for Biotechnology Information、NEB: nuclear extraction buffer、NF-κB: nuclear factor-kappa B、NRSE: neural-restrictive silencer elements、ODN: oligodeoxynucleotide、PBS: phosphate buffer saline、PDB: protein data bank、PDVF: polyvinylidene fluoride、PI3K: phosphatidylinositol-3 kinase、PMSF: phenylmethansulfonylfluoride、RCSB: Research Collaboratory for Structural Bioinformatics、SDS: sodium dodecyl sulfate、Six2: sine oculis-related homeobox 2 homolog、SP1: trans-acting transcription factor 1、TBS: Tris buffer saline、TFA: trifluoroacetic acid、TNF-α: tumore necrosis factor-alpha、TOF: time of flight-time of flight、Tyr: tyrosine、USF: Up-stream stimulatory factor、YY1: yin yang-1。
本発明者らは、Leu-IleがAkt活性化作用を有する点に注目した。Aktを活性化できるということは、Aktが関与する種々のシグナル経路を調節できることを意味する。従って、Aktが関与するグナル経路を調節することで治療効果や予防効果が得られる疾患に対してLeu-Ileが有効であるといえる。
本発明は、以上の知見及び考察に基づき完成されたものであって、以下の構成を提供する。
本発明は(a)〜(c)のいずれかの化合物を有効成分として含有するAkt活性化剤である。
(a)Leu及びIleからなるペプチド;
(b)Leu及びIleからなるペプチドの修飾体;
(c)薬学的に許容可能な、(a)又は(b)の塩。
本発明の一態様では、有効成分としてのペプチドがLeu−Ileであることを特徴とする。
本発明のAkt活性化剤は好ましくは、 パーキンソン病、脊髄損傷、薬物依存、アルツハイマー病、水頭症、脳損傷、脳梗塞、 痴呆症、リューマチ症、又は統合失調症の治療又は予防に使用される。
本発明の他の態様は、上記Akt活性化剤を含有する食品を提供する。
本発明は更に他の態様として、上記Akt活性化剤を生体に投与するステップを含む、パーキンソン病、脊髄損傷、薬物依存、アルツハイマー病、水頭症、脳損傷、脳梗塞、痴呆症、リューマチ症、又は統合失調症の予防又は治療方法を提供する。
尚、本明細書中では必要に応じて以下の略号を使用する。
AP2: activator protein 2、CEB: cytoplasmic extraction buffer、CREB: cAMP response element binding protein、CsA: cyclosporin A、DMEM: Dulbecco’s modified Eagle’s medium、DTT: dithiothreitol、EDTA: ethylenediamine tetracetic acid、egr-1: early growth response-1、egr-2: earlygrowth response-2、F12HAM: Ham’s nutrient mixture F12、FBS: fetal bovine serum、FGF: fibloblast growth factor、FITC: Fluorescein isothiocyanate isomer 1、FK506: tacrolimus、FKBP: FK506 binding protein、GCF: GC factor、GDNF: glial cell line-derived neurotrophic factor、GFR-α?: GDNF family receptor-α、IL-1β: interleukin-1beta、MALDI: Matrix-assisted laser desorption/ ionization、MNF: myocyte nuclear factor、MRE: metal response element、MS: Mass spectrometry、MTT: methyl thiazol tetrazolium、NCBI: National Center for Biotechnology Information、NEB: nuclear extraction buffer、NF-κB: nuclear factor-kappa B、NRSE: neural-restrictive silencer elements、ODN: oligodeoxynucleotide、PBS: phosphate buffer saline、PDB: protein data bank、PDVF: polyvinylidene fluoride、PI3K: phosphatidylinositol-3 kinase、PMSF: phenylmethansulfonylfluoride、RCSB: Research Collaboratory for Structural Bioinformatics、SDS: sodium dodecyl sulfate、Six2: sine oculis-related homeobox 2 homolog、SP1: trans-acting transcription factor 1、TBS: Tris buffer saline、TFA: trifluoroacetic acid、TNF-α: tumore necrosis factor-alpha、TOF: time of flight-time of flight、Tyr: tyrosine、USF: Up-stream stimulatory factor、YY1: yin yang-1。
本明細書では慣例の標記法に従い左端がアミノ末端、右端がカルボキシ末端となるようにペプチドを表記する。また、アミノ酸残基がL形の場合には、L形である旨の表示を省略することがある。また、特に記載のない限り本明細書では、ジペプチドをはじめ様々な長さのペプチドを含む用語として「ペプチド」を使用する。
本発明の第1の局面はAkt活性化剤に関する。本明細書において「Akt活性化剤」とは、Aktを活性化する作用を有する物質のことをいう。AktはProtein Kinase B (PKB)とも呼ばれるセリン/スレオニンキナーゼであって、PI3キナーゼ経路で活性化される。Aktは細胞周期、インスリン代謝などの様々な現象に関与していることが報告されている。
Aktの活性化によって、Aktを介したシグナル経路が上方調節される。例えばAktの活性化によってNF-κBやCREBが活性化される。このことからAkt活性化剤を、NF-κBやCREBの活性化剤として捉えることもできる。一方、NF-κBやCREBの活性化はBDNFの産生誘導を促す。従って、Akt活性化剤を、BDNFの産生誘導剤として捉えることもできる。
Aktの活性化によって、Aktを介したシグナル経路が上方調節される。例えばAktの活性化によってNF-κBやCREBが活性化される。このことからAkt活性化剤を、NF-κBやCREBの活性化剤として捉えることもできる。一方、NF-κBやCREBの活性化はBDNFの産生誘導を促す。従って、Akt活性化剤を、BDNFの産生誘導剤として捉えることもできる。
本発明のAkt活性化剤は、Aktの活性調節を通して、Aktが関与する疾患の治療、予防に効果を発揮することができる。従って、「Aktの調節によって予防効果又は治療効果が得られる疾患」に対して本発明のAkt活性化剤が適用され得る。「Aktの調節によって予防効果又は治療効果が得られる疾患」を「Atk活性の異常によって特徴づけられる疾患」と言い換えることができる。即ち、本発明の対象となる疾患(対象疾患)には、Akt活性が正常範囲から逸脱した結果として引き起こされる疾患が含まれる。例えば、パーキンソン病、脊髄損傷、アルツハイマー病、水頭症、脳損傷、脳梗塞、痴呆症、リューマチ症、又は統合失調症等がこのような疾患に該当する。
本発明者らの研究によって、以下に詳述する本発明の有効成分がAktを介してGDNFの産生を誘導することが明らかとなった。この事実から、本発明のAkt活性化剤によればAktを介したGDNAの産生誘導を引き起こすことができる。従って、GDNFの産生誘導によって予防効果又は治療効果が得られる疾患は、本発明の好適な対象疾患の一つである。例えば、パーキンソン病、脊髄損傷、アルツハイマー病、水頭症、脳損傷、脳梗塞、痴呆症、リューマチ症、又は統合失調症等がこのような疾患に該当する。
尚、AKt又はGDNFと疾患との関連についていくつかの報告(Tas SW, Remans PH, Reedquist KA, Tak PP. Signal transduction pathways and transcription factors as therapeutic targets in inflammatory disease: towards innovative antirheumatic therapy. Curr Pharm Des. 2005;11(4):581-611.、Rickle A, Bogdanovic N, Volkman I, Winblad B, Ravid R, Cowburn RF. Akt activity in Alzheimer's disease and other neurodegenerative disorders. Neuroreport. 2004 Apr 29;15(6):955-9.)がある。
尚、本明細書において用語「疾患」は、疾病、病気、又は病態など、正常でない状態を表す言葉と交換可能に用いられる。
尚、AKt又はGDNFと疾患との関連についていくつかの報告(Tas SW, Remans PH, Reedquist KA, Tak PP. Signal transduction pathways and transcription factors as therapeutic targets in inflammatory disease: towards innovative antirheumatic therapy. Curr Pharm Des. 2005;11(4):581-611.、Rickle A, Bogdanovic N, Volkman I, Winblad B, Ravid R, Cowburn RF. Akt activity in Alzheimer's disease and other neurodegenerative disorders. Neuroreport. 2004 Apr 29;15(6):955-9.)がある。
尚、本明細書において用語「疾患」は、疾病、病気、又は病態など、正常でない状態を表す言葉と交換可能に用いられる。
本発明のAkt活性化剤はその一態様において、Leu及びIleからなるペプチド(ジペプチド)を有効成分として含む。Leu(ロイシン)は別名2−アミノイソカプロン酸と呼ばれ、そのL形は以下の化学式で表される。
一方、Ile(イソロイシン)は別名2−アミノ−3−メチル−n−吉草酸と呼ばれ、そのL形は以下の化学式で表される。
本発明のペプチドでは好ましくはこれら二つのアミノ酸残基がN末端側からC末端側に向かってロイシン、イソロイシンの順に連結されている。
本発明において各アミノ酸残基はいずれもL形であることが好ましいが、アミノ酸残基の一部又は全部がD形であってもよい。
本発明において各アミノ酸残基はいずれもL形であることが好ましいが、アミノ酸残基の一部又は全部がD形であってもよい。
一般に、ある化合物の一部に修飾を施して得られる化合物が修飾前の化合物と同様の性質や特性を有する場合がある。即ち、修飾が化合物の特定の性質等に影響を及ぼさない場合がある。このことを考慮すれば、上記ペプチドに修飾を施して得られる修飾体であっても、Akt活性化作用を維持する限りにおいて、本発明における有効成分として使用され得る。
そこで、本発明のAkt活性化剤は他の態様において、上記ペプチドの修飾体(以下、「ペプチド修飾体」という)を有効成分とする。本発明における「ペプチド修飾体」とは、LeuとIleからなる基本構造(ジペプチド)に対して、その一部(複数箇所であってもよい)を他の原子団等で置換すること、或いは他の分子を付加すること等の修飾を施すことによって、少なくとも一部において前記基本構造と相違する構造の化合物をいう。
当業者であれば、周知ないし慣用の手段を用いてLeuとIleからなるジペプチドを基本とした置換体などの修飾体をデザインすることができる。また、かかるデザインに基づき、周知ないし慣用の手段を用いて目的の修飾体を調製し、その性質や作用を調べることも当業者には容易と考えられる。
そこで、本発明のAkt活性化剤は他の態様において、上記ペプチドの修飾体(以下、「ペプチド修飾体」という)を有効成分とする。本発明における「ペプチド修飾体」とは、LeuとIleからなる基本構造(ジペプチド)に対して、その一部(複数箇所であってもよい)を他の原子団等で置換すること、或いは他の分子を付加すること等の修飾を施すことによって、少なくとも一部において前記基本構造と相違する構造の化合物をいう。
当業者であれば、周知ないし慣用の手段を用いてLeuとIleからなるジペプチドを基本とした置換体などの修飾体をデザインすることができる。また、かかるデザインに基づき、周知ないし慣用の手段を用いて目的の修飾体を調製し、その性質や作用を調べることも当業者には容易と考えられる。
本発明におけるペプチド修飾体の代表例としては、各アミノ酸残基において側鎖の一部(原子又は原子団)が他の原子又は原子団で置換されたペプチド誘導体を挙げることができる。このようなペプチド誘導体は、最終生成物として当該ペプチド誘導体が得られるように設計された任意の製造工程によって調製することができる。したがって、目的のペプチド誘導体が、あるペプチドにおいて一部(例えば側鎖の一部である原子団)が特定の原子団によって見かけ上置換されたものである場合には、当該目的のペプチド誘導体はこの見かけ上基本となるペプチドを出発材料として当該特定の原子団を用いた置換反応によって製造されたものであっても、或いは例えば他の構造のペプチドを出発材料として適当な置換反応等(場合によって複数工程であってもよい)によって製造されたものであってもよい。したがって例えばLeu-Ileからなるジペプチドの誘導体の場合、Leu-Ileからなるジペプチドが出発材料として用いられていなくともよい。
ここでの他の原子又は原子団としては、ヒドロキシル基、ハロゲン(フッ素、塩素、臭素、ヨウ素等)、アルキル基(メチル基、エチル基、n−プロピル基、イソプロピル基等)、ヒドロキシアルキル基(ヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基等)、アルコキシ基(メトキシ基、エトキシ基等)、アシル基(ホルミル基、アセチル基、マロニル基、ベンゾイル基等)等を例示することができる。
ここでの他の原子又は原子団としては、ヒドロキシル基、ハロゲン(フッ素、塩素、臭素、ヨウ素等)、アルキル基(メチル基、エチル基、n−プロピル基、イソプロピル基等)、ヒドロキシアルキル基(ヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基等)、アルコキシ基(メトキシ基、エトキシ基等)、アシル基(ホルミル基、アセチル基、マロニル基、ベンゾイル基等)等を例示することができる。
尚、本発明のペプチド修飾体には、構成アミノ酸残基内の官能基が適当な保護基によって保護されているものも含まれる。このような目的に使用される保護基としては、アシル基、アルキル基、単糖、オリゴ糖、多糖等を用いることができる。このような保護基は、保護基を結合させるペプチド部位や使用する保護基の種類などに応じて、アミド結合、エステル結合、ウレタン結合、尿素結合等によって連結される。
アミノ酸を付加(連結)することによって本発明のペプチド修飾体を形成することも可能である。但し、溶解性や生体内利用率の面からアミノ酸の付加数はあまり多くないことが好ましいと考えられる。具体的には付加するアミノ酸の数としては例えば1〜9個、好ましくは1〜5個、更に好ましくは1〜3個、最も好ましくは1個又は2個である。尚、基本となるペプチド(又はペプチド修飾体)の両側においてアミノ酸の付加が行なわれていてもよい。
本発明のペプチド修飾体の更なる例としては、糖鎖の付加による修飾が施されているものを挙げることができる。また、N末端又はC末端が他の原子等で置換されることによってアルキルアミン、アルキルアミド、スルフィニル、スルフォニルアミド、ハライド、アミド、アミノアルコール、エステル、アミノアルデヒド等に分類される各種ペプチド誘導体も本発明のペプチド修飾体に含まれる。
尚、以上で説明した各種の修飾方法を組み合わせることによって構成されるペプチド誘導体を本発明のペプチド修飾体としてもよい。
本発明のAkt活性化剤は更に他の態様において、上記ペプチド又は上記ペプチド修飾体の塩を有効成分とする。本発明の塩は薬学的に許容可能な限りその種類は特に限定されず、塩酸、リン酸、硫酸、硝酸、ホウ酸等との塩(無機酸塩)や、ギ酸、酢酸、乳酸、フマル酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸等との塩(有機酸塩)をその例として挙げることができる。これらの塩の調製は慣用手段によって行なうことができる。
本発明のAkt活性化剤に含有されるペプチド、ペプチド修飾体、或いはこれらいずれかの塩(以下、これらをまとめて「ペプチド等」という)は典型的には直鎖状であるが、環状構造を有する化合物の使用を排除するものではない。即ち、アミノ酸残基の側鎖同士の連結などによって部分的又は全体的に環状構造を形成するペプチド等を、本発明のAkt活性化剤の有効成分として使用することもできる。
本発明におけるペプチド等は、公知のペプチド合成法(例えば固相合成法、液相合成法)によって製造することができる。但し、本発明のペプチド等が天然に存在する場合には、抽出、精製などの操作によってそれを調製することもできる。本発明のペプチド等の取得源としては例えば、動物細胞(ヒトを含む)、植物細胞、体液(血液、尿等)等が考えられる。
遺伝子工学的手法を用いて本発明のペプチド等を調製してもよい。即ち、本発明のペプチド等をコードする核酸を適当な宿主細胞に導入し、形質転換体内で発現されたペプチド等を回収することにより本発明のペプチド等を調製することもできる。回収されたペプチド等は必要に応じて精製される。回収されたペプチド等を適当な置換反応に供し、所望のペプチド修飾体に変換することもできる。
本発明におけるペプチド等の中で例えばLeu-Ile等は市販されており、国産化学株式会社(KOKUSAN CHEMICAL Co.,Ltd. 東京、日本)より入手することができる。
遺伝子工学的手法を用いて本発明のペプチド等を調製してもよい。即ち、本発明のペプチド等をコードする核酸を適当な宿主細胞に導入し、形質転換体内で発現されたペプチド等を回収することにより本発明のペプチド等を調製することもできる。回収されたペプチド等は必要に応じて精製される。回収されたペプチド等を適当な置換反応に供し、所望のペプチド修飾体に変換することもできる。
本発明におけるペプチド等の中で例えばLeu-Ile等は市販されており、国産化学株式会社(KOKUSAN CHEMICAL Co.,Ltd. 東京、日本)より入手することができる。
本発明のAkt活性化剤は、特定の疾患に対する薬剤として利用可能であることは勿論のこと、例えば特定の疾患への罹患リスクを軽減するための食品(食品添加物)として、或いは特定の疾患の発症機構や進展機構を研究するための研究用試薬としても利用可能である。即ち、本発明のAkt活性調節剤は薬剤、食品(食品添加物)、研究用試薬などの形態で提供され得る。
薬剤として提供される場合の製剤化は常法に従って行うことができる。製剤化する場合には、製剤上許容される他の成分(例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水など)を含有させることができる。賦形剤としては乳糖、デンプン、ソルビトール、D-マンニトール、白糖等を用いることができる。崩壊剤としてはデンプン、カルボキシメチルセルロース、炭酸カルシウム等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。乳化剤としてはアラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、トラガント等を用いることができる。懸濁剤としてはモノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸アルミニウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム等を用いることができる。無痛化剤としてはベンジルアルコール、クロロブタノール、ソルビトール等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、ジエチリン亜硫酸塩、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としては塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等と用いることができる。
製剤化する場合の剤型も特に限定されず、例えば錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、注射剤、外用剤、及び座剤などとして調製できる。
このように製剤化した本発明の薬剤はその形態に応じて経口投与又は非経口投与(静脈内、動脈内、皮下、筋肉、腹腔内注射など)によって患者に適用され得る。
本発明の薬剤中における有効成分(ペプチド等)の含量は一般に剤型によって異なるが、所望の投与量を達成できるように例えば約0.001重量%〜約90重量%とする。
このように製剤化した本発明の薬剤はその形態に応じて経口投与又は非経口投与(静脈内、動脈内、皮下、筋肉、腹腔内注射など)によって患者に適用され得る。
本発明の薬剤中における有効成分(ペプチド等)の含量は一般に剤型によって異なるが、所望の投与量を達成できるように例えば約0.001重量%〜約90重量%とする。
本発明の他の局面では以上の薬剤を使用した対象疾患(パーキンソン病、脊髄損傷、アルツハイマー病、水頭症、脳損傷、脳梗塞、痴呆症、リューマチ症、又は統合失調症等)に対する予防方法又は治療方法(以下、これら二つの方法をまとめて「治療方法等」という)が提供される。本発明の治療方法等は、上記のペプチド、ペプチド修飾体、又はこれらいずれかの塩を有効成分として含む薬剤を生体に投与するステップを含む。投与経路は特に限定されず例えば経口、静脈内、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、経皮、経粘膜などを挙げることができる。
薬剤の投与量は症状、患者の年齢、性別、及び体重などによって異なるが、当業者であれば適宜適当な投与量を設定することが可能である。例えば、Leu-Ileを有効成分として含む薬剤を使用する場合には、成人(体重約60kg)を対象として一日当たりの有効成分量が約0.1〜約1000mg、好ましくは約1mg〜約100mgとなるよう投与量を設定することができる。投与スケジュールとしては例えば一日一回〜数回、二日に一回、或いは三日に一回などを採用できる。投与スケジュールの設定においては、患者の病状や薬剤の効果持続時間などを考慮することができる。
本発明の更なる一態様では、本発明のAkt活性剤を含有した食品(又は食品添加物)が提供される。ここでの食品として牛乳や清涼飲料水等を例示できる。食品添加物の場合は粉末、顆粒末、タブレット等の形状で提供することができる。このような食品又は食品添加物としてAkt活性化剤を利用する場合の添加量は、治療的又は予防的効果が期待できる量とする。添加量は、対象となる者の病状、健康状態、年齢、性別、体重などを考慮して定めることができる。
Leu-Ileは高い溶解度を有し、また無味無臭である。また、Leu-Ileは生体内において定常的に存在する物質であることからその安全性も高いといえる。このように、食品に添加する物質として好ましい特性ないし特徴をLeu-Ileは備える。
Leu-Ileは高い溶解度を有し、また無味無臭である。また、Leu-Ileは生体内において定常的に存在する物質であることからその安全性も高いといえる。このように、食品に添加する物質として好ましい特性ないし特徴をLeu-Ileは備える。
本発明の一態様では、本発明のAkt活性化剤が研究用試薬として提供される。この場合、予め標識化などの修飾を施しておいてもよい。また、Akt活性化剤を使用する際に必要な各種の試薬、又は反応用容器などを組み合わせたキットの形態で提供することもできる。
1.マウス脳内におけるLeu-Ile結合タンパク質の同定
1−1 目的
臓器移植後の拒絶反応予防薬として用いられているcyclosporin A(CsA)やタクロリムス(FK506)は、内因性イムノフィリンと結合し、免疫抑制作用を示すイムノフィリンリガンドである。CsAやタクロリムスは免疫抑制作用のみでなく、様々な病態モデルにおける神経変性を抑制することが報告され、神経保護薬としての有用性についても研究が進められてきた(Ogawa et al., 1993; Sharkey and Butcher., 1994; Shiga et al., 1992; 田中と小川., 2004)。しかし、神経変性疾患の患者にとっては、これらの薬剤は神経保護作用を有していても同時に免疫機能を抑制してしまうため、大きな問題点が残る。そのため、神経保護作用のみを有する非免疫抑制性イムノフィリンリガンドについての研究が行われるようになった(Gold., 2000; Gold and Nutt., 2002; Herdegan et al., 2000; Snyder et al., 1998)。
Leu-Ileは非免疫抑制性イムノフィリンリガンドを探索する中で発見されたペプチドである。Leu-Ileはタクロリムスのイムノフィリン結合部位の構造と類似しており、タクロリムスと同様にGDNFの産生を誘導することが示されている。しかし、タクロリムスの結合タンパク質であるFK506 binding protein12(FKBP12)とは結合しない事が分かっており、Leu-Ileがタクロリムスとは異なる作用でGDNFを産生誘導している可能性が示唆されている(Nitta et al., 2002; 2004)。
そこで以下ではLeu-Ileがどのような仕組みでGDNFの産生を誘導しているのかを調べるため、マウス脳ホモジナイズ液を用いてLeu-Ile の脳内結合タンパク質の同定を行った。
1−1 目的
臓器移植後の拒絶反応予防薬として用いられているcyclosporin A(CsA)やタクロリムス(FK506)は、内因性イムノフィリンと結合し、免疫抑制作用を示すイムノフィリンリガンドである。CsAやタクロリムスは免疫抑制作用のみでなく、様々な病態モデルにおける神経変性を抑制することが報告され、神経保護薬としての有用性についても研究が進められてきた(Ogawa et al., 1993; Sharkey and Butcher., 1994; Shiga et al., 1992; 田中と小川., 2004)。しかし、神経変性疾患の患者にとっては、これらの薬剤は神経保護作用を有していても同時に免疫機能を抑制してしまうため、大きな問題点が残る。そのため、神経保護作用のみを有する非免疫抑制性イムノフィリンリガンドについての研究が行われるようになった(Gold., 2000; Gold and Nutt., 2002; Herdegan et al., 2000; Snyder et al., 1998)。
Leu-Ileは非免疫抑制性イムノフィリンリガンドを探索する中で発見されたペプチドである。Leu-Ileはタクロリムスのイムノフィリン結合部位の構造と類似しており、タクロリムスと同様にGDNFの産生を誘導することが示されている。しかし、タクロリムスの結合タンパク質であるFK506 binding protein12(FKBP12)とは結合しない事が分かっており、Leu-Ileがタクロリムスとは異なる作用でGDNFを産生誘導している可能性が示唆されている(Nitta et al., 2002; 2004)。
そこで以下ではLeu-Ileがどのような仕組みでGDNFの産生を誘導しているのかを調べるため、マウス脳ホモジナイズ液を用いてLeu-Ile の脳内結合タンパク質の同定を行った。
1−2 実験材料および方法
1−2−1 動物
実験には、7週齢のICR雄性マウス(日本SLC、静岡)を使用した。なお、本研究は名古屋大学医学部動物実験指針およびPrinciples of Laboratory Animal Care(National Institutes of Health Publication 85-23, 1985)に基づいて行った。
1−2−1 動物
実験には、7週齢のICR雄性マウス(日本SLC、静岡)を使用した。なお、本研究は名古屋大学医学部動物実験指針およびPrinciples of Laboratory Animal Care(National Institutes of Health Publication 85-23, 1985)に基づいて行った。
1−2−2 Leu-Ileが細胞膜を透過することの証明実験
FITCで標識したLeu-Ilを培養神経細胞の培養上清に0〜1.5μg/mlの濃度になるように加え、10〜20分後に上清を取り除き、生理的緩衝液で洗浄し、細胞をラバーポリスマンで剥離回収した。遠心後、その上清中の蛍光(励起波長 485nm、蛍光波長518nm)強度を蛍光測定用プレートリーダーで測定した。実験毎に、FITC標識Leu-IleおよびFITCの検量線を作成した。
FITCで標識したLeu-Ilを培養神経細胞の培養上清に0〜1.5μg/mlの濃度になるように加え、10〜20分後に上清を取り除き、生理的緩衝液で洗浄し、細胞をラバーポリスマンで剥離回収した。遠心後、その上清中の蛍光(励起波長 485nm、蛍光波長518nm)強度を蛍光測定用プレートリーダーで測定した。実験毎に、FITC標識Leu-IleおよびFITCの検量線を作成した。
1−2−3 fluorescein isothiocyanate(FITC)標識したLeu-Ileとマウス脳内タンパク質との結合実験
ペントバルビタールによる麻酔下で7週齢のICR雄性マウスから全脳を摘出し、ホモジナイズバッファー((0.25M NaCl, 5mM ethylenediamine tetracetic acid(EDTA), 1% TritonX-100, 0.25% dehydroacetic acid sodium salt monohydrate, 1mM phenylmethansulfonylfluoride(PMSF), 1μg/ml leupeptin, 1μg/ml aprotinin, 5μg/ml pepstatinA)を含む20mM Tris-HCl (pH7.4))を加え、30秒間ホモジナイザー(heat systems, NY, USA)でホモジナイズした。この液を4℃10,000gで1時間遠心し、上清を回収したものを脳ホモジナイズ液として実験に用いた。NまたはC末端側にFITCを結合させたLeu-Ile(Thermo Electron Corporation, Ulm, Germany)(10 mg/ ml)と脳ホモジナイズ液(総タンパク質量6 mg/ ml)を4℃または37℃で3時間反応させたのちサンプルバッファー(125 mM Tris-HCl, pH 6.8, 10% 2-mercaptoethanol, 4% sodium dodecyl sulfate (SDS), 10% sucrose, 0.004% bromophenol blue)を同用量加え95℃で5分間煮沸し、30 μgのタンパク質を10%ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動を行った。蛍光バンドの検出にはFluorImager595(Molecular Dynamics, CA, USA)を用いた。
ペントバルビタールによる麻酔下で7週齢のICR雄性マウスから全脳を摘出し、ホモジナイズバッファー((0.25M NaCl, 5mM ethylenediamine tetracetic acid(EDTA), 1% TritonX-100, 0.25% dehydroacetic acid sodium salt monohydrate, 1mM phenylmethansulfonylfluoride(PMSF), 1μg/ml leupeptin, 1μg/ml aprotinin, 5μg/ml pepstatinA)を含む20mM Tris-HCl (pH7.4))を加え、30秒間ホモジナイザー(heat systems, NY, USA)でホモジナイズした。この液を4℃10,000gで1時間遠心し、上清を回収したものを脳ホモジナイズ液として実験に用いた。NまたはC末端側にFITCを結合させたLeu-Ile(Thermo Electron Corporation, Ulm, Germany)(10 mg/ ml)と脳ホモジナイズ液(総タンパク質量6 mg/ ml)を4℃または37℃で3時間反応させたのちサンプルバッファー(125 mM Tris-HCl, pH 6.8, 10% 2-mercaptoethanol, 4% sodium dodecyl sulfate (SDS), 10% sucrose, 0.004% bromophenol blue)を同用量加え95℃で5分間煮沸し、30 μgのタンパク質を10%ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動を行った。蛍光バンドの検出にはFluorImager595(Molecular Dynamics, CA, USA)を用いた。
1−2−4 Affigel-10によるLeu-Ile結合タンパク質の精製
アガロースビーズAffigel-10(BIO・RAD, CA, USA)を30 mlシリンジ(テルモ、東京)に充填し(直径22 mm、高さ26.5 mm)これをカラムとした。カラムに100 ml の0.1 M 炭酸水素ナトリウム溶液(pH 8.5)を流してビーズを洗浄し、0.1 M 炭酸水素ナトリウム溶液(pH 8.5)に溶解したLeu-Ile(国産化学、東京)(30 mg/ ml)とビーズを4℃で3時間反応させた。0.1 M リン酸緩衝液 (pH 7.4) でビーズを洗浄し、ビーズに結合しなかったLeu-Ileを除去した後に、2―2−2と同様の脳ホモジナイズ液(6 mg/ ml)20 mlをカラムに加え、Leu-Ileを結合したビーズと4℃で一晩反応させた。100 mlの0.1 M リン酸緩衝液 (pH 7.4)でビーズを洗浄した後、Leu-Ileに結合したタンパク質を0.17 M glycine-HCl溶液(pH 3)で溶出した。コントロールとしてLeu-Ileを結合させていないビーズを用い、同様の操作を行った。これを5-20% グラジュエントゲル(BIO・RAD)を用いて電気泳動し、銀染色「第一」キット(第一化学薬品、東京)を用いて銀染色を行った。
アガロースビーズAffigel-10(BIO・RAD, CA, USA)を30 mlシリンジ(テルモ、東京)に充填し(直径22 mm、高さ26.5 mm)これをカラムとした。カラムに100 ml の0.1 M 炭酸水素ナトリウム溶液(pH 8.5)を流してビーズを洗浄し、0.1 M 炭酸水素ナトリウム溶液(pH 8.5)に溶解したLeu-Ile(国産化学、東京)(30 mg/ ml)とビーズを4℃で3時間反応させた。0.1 M リン酸緩衝液 (pH 7.4) でビーズを洗浄し、ビーズに結合しなかったLeu-Ileを除去した後に、2―2−2と同様の脳ホモジナイズ液(6 mg/ ml)20 mlをカラムに加え、Leu-Ileを結合したビーズと4℃で一晩反応させた。100 mlの0.1 M リン酸緩衝液 (pH 7.4)でビーズを洗浄した後、Leu-Ileに結合したタンパク質を0.17 M glycine-HCl溶液(pH 3)で溶出した。コントロールとしてLeu-Ileを結合させていないビーズを用い、同様の操作を行った。これを5-20% グラジュエントゲル(BIO・RAD)を用いて電気泳動し、銀染色「第一」キット(第一化学薬品、東京)を用いて銀染色を行った。
1−2−5 Leu-Ile結合タンパク質のtrypsin処理と質量分析
1−2−4で銀染色したゲルを蒸留水で10分間3回洗い、外科用メスを用いて目的のタンパク質を含むゲル片を切りだした。ゲル片に100 μlの脱色液(18.5 mg/ ml NaCl, 18.5 mg/ ml CuSO4, 18.5 mg/ ml Na2S2O3)を5分間反応させ、ゲル片が透明になるまで蒸留水で洗浄した。acetonitrileによって脱水した後、ゲル片を真空遠心機で5分間乾燥させた。30 μlの10 mM dithiothreitol溶液をゲル片に浸透させ、室温で30 分間反応させた後、dithiothreitol溶液を取り除き、100 mM iodoacetamideを30 μl 加えてアルミホイルで遮光し、室温で30 分間アルキル化した。再度ゲル片にacetonitrileを加えて脱水、乾燥させ、10 μlのtrypsin(0.01 μg/ ul)(Promega, WI, USA)を浸透させた後、100 mM炭酸水素アンモニウム液を100 μl加えて37℃で一晩反応させた。(1)5 % acetonitrile、0.1 % trifluoroacetic acid(TFA)を含む100 mM炭酸水素アンモニウム液、(2)50% acetonitrile、0.1 % TFAを含む100 mM炭酸水素アンモニウム液、(3)80 % acetonitrile、0.1 % TFAを含む100 mM炭酸水素アンモニウム液を順次加え、ゲル片からペプチド断片を溶出した。溶出物を乾燥させ、5 % acetonitrile、0.1 % ギ酸、0.1 % TFAを含む水溶液に溶かし、質量分析装置Q-Tof2(Micromass, Manchester, UK)を用いてペプチド断片の配列を分析した。分析結果はマスコットサーチ(Matrix Science, MA, USA)を用いてNational Center for Biotechnology Information(NCBInr: http://www.ncbi. nlm.nih.gov/ Entrez/)のデータベース検索を行った(Perkins et al., 1999)。スコア計算はMowseアルゴリズムに基づいて行い、スコアが44以上のとき、統計学的に危険率5%以下の信頼性があることを示す(Pappin et al., 1993)。
1−2−4で銀染色したゲルを蒸留水で10分間3回洗い、外科用メスを用いて目的のタンパク質を含むゲル片を切りだした。ゲル片に100 μlの脱色液(18.5 mg/ ml NaCl, 18.5 mg/ ml CuSO4, 18.5 mg/ ml Na2S2O3)を5分間反応させ、ゲル片が透明になるまで蒸留水で洗浄した。acetonitrileによって脱水した後、ゲル片を真空遠心機で5分間乾燥させた。30 μlの10 mM dithiothreitol溶液をゲル片に浸透させ、室温で30 分間反応させた後、dithiothreitol溶液を取り除き、100 mM iodoacetamideを30 μl 加えてアルミホイルで遮光し、室温で30 分間アルキル化した。再度ゲル片にacetonitrileを加えて脱水、乾燥させ、10 μlのtrypsin(0.01 μg/ ul)(Promega, WI, USA)を浸透させた後、100 mM炭酸水素アンモニウム液を100 μl加えて37℃で一晩反応させた。(1)5 % acetonitrile、0.1 % trifluoroacetic acid(TFA)を含む100 mM炭酸水素アンモニウム液、(2)50% acetonitrile、0.1 % TFAを含む100 mM炭酸水素アンモニウム液、(3)80 % acetonitrile、0.1 % TFAを含む100 mM炭酸水素アンモニウム液を順次加え、ゲル片からペプチド断片を溶出した。溶出物を乾燥させ、5 % acetonitrile、0.1 % ギ酸、0.1 % TFAを含む水溶液に溶かし、質量分析装置Q-Tof2(Micromass, Manchester, UK)を用いてペプチド断片の配列を分析した。分析結果はマスコットサーチ(Matrix Science, MA, USA)を用いてNational Center for Biotechnology Information(NCBInr: http://www.ncbi. nlm.nih.gov/ Entrez/)のデータベース検索を行った(Perkins et al., 1999)。スコア計算はMowseアルゴリズムに基づいて行い、スコアが44以上のとき、統計学的に危険率5%以下の信頼性があることを示す(Pappin et al., 1993)。
1−2−6 ウエスタンブロッティング
質量分析に用いたサンプルに等容量のサンプルバッファーを加え95℃で5分間煮沸し、5-20% グラジュエントゲル(BIO・RAD)を用いて電気泳動を行った。
ポリアクリルアミドゲルからsemi-dry transfer法によりpolyvinylidene fluoride(PDVF)膜(Millipore, MA, USA)へタンパク質を転写した後、膜をブロッキングバッファー(KPL, MD, USA)中で、穏やかに攪拌しながら2時間室温でブロッキングした。
次に、PDVF膜をブロッキングバッファーで1000倍に希釈した一次抗体(rat anti-Hsc70 antibodyまたはrabbit anti-Hsp70 antibody(Stressgen, BC, Canada))と4℃で一晩反応させた。Tris buffer saline(TBS)(10 mM Tris-HCl, 137 mM NaCl, 0.1% Tween-20)にて15分間3回洗浄した後、2次抗体(peroxidase labeled goat anti-rat IgG (H+L) antibody またはperoxidase labeled goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody(Kirkegaard & Perry Laboratries, MD, USA))と室温で2時間反応させた。その後TBSで3回洗浄し、ECLTM(Amersham Pharmacia Biotec, UK)を1分間反応させた。FPM100(富士写真フィルム、東京)現像機を用いてhyperfilm(Amersham Bioscience, NA, UK)に現像した。Hyperfilmに現像されたバンドの強度解析にはATTO Densito Graph(アトー、東京)を用いた。
質量分析に用いたサンプルに等容量のサンプルバッファーを加え95℃で5分間煮沸し、5-20% グラジュエントゲル(BIO・RAD)を用いて電気泳動を行った。
ポリアクリルアミドゲルからsemi-dry transfer法によりpolyvinylidene fluoride(PDVF)膜(Millipore, MA, USA)へタンパク質を転写した後、膜をブロッキングバッファー(KPL, MD, USA)中で、穏やかに攪拌しながら2時間室温でブロッキングした。
次に、PDVF膜をブロッキングバッファーで1000倍に希釈した一次抗体(rat anti-Hsc70 antibodyまたはrabbit anti-Hsp70 antibody(Stressgen, BC, Canada))と4℃で一晩反応させた。Tris buffer saline(TBS)(10 mM Tris-HCl, 137 mM NaCl, 0.1% Tween-20)にて15分間3回洗浄した後、2次抗体(peroxidase labeled goat anti-rat IgG (H+L) antibody またはperoxidase labeled goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody(Kirkegaard & Perry Laboratries, MD, USA))と室温で2時間反応させた。その後TBSで3回洗浄し、ECLTM(Amersham Pharmacia Biotec, UK)を1分間反応させた。FPM100(富士写真フィルム、東京)現像機を用いてhyperfilm(Amersham Bioscience, NA, UK)に現像した。Hyperfilmに現像されたバンドの強度解析にはATTO Densito Graph(アトー、東京)を用いた。
1−2−7 水晶発振子バイオセンサーによるheat shock cognate protein 70(Hsc70)およびheat shock protein 70(Hsp70)とLeu-Ileの結合力の検討
水晶発振子マイクロバランス法は分子の結合・解離、重合・分解によって変化する水晶発振子の絶対重量の増減を振動数の変化でとらえることにより、蛍光物質などで標識することなく分子反応をナノグラムレベルで定量することができる(Motomiya et al., 2003; 岡畑と古澤., 2004; Sauerbrey., 1959)。水晶体センサーチップ(イニシアム、東京)をピランハ溶液(7.5 % H2O2, 25 % H2SO4)で5分間2回洗浄後、5mM 3,3-dithiodipropionic acid 溶液を100 μlセンサーチップにのせて室温で30分間静置した。蒸留水で洗浄後、1-(3-dimethylaminopropyl-3-ethylcarbodiimide hydrochloride(100 mg/ ml)とN-hydroxysuccinimide(100 mg/ ml)の等量混合液100 μlをセンサーチップにのせて室温で30分間静置し、蒸留水で洗浄した。
Leu-Ile、Pro-Leu(国産化学)またはIle-Pro(国産化学)(10 μg/ ml)を含む100 μlのリン酸緩衝液をセンサーチップにのせて室温で約1時間反応させ、ジペプチドをセンサーチップに固定化した。Pro-LeuおよびIle-ProはLeu-Ileと同じ疎水性ジペプチドであるがGDNF産生誘導作用を示さないこと(Nitta et al., 2004)から、これらをネガティブコントロールとして用いた。
ジペプチドを固定化したセンサーチップをAFFINIX Q(イニシアム、東京)にセットし、リン酸緩衝液中で振動数を安定化させた後、Hsp70(Stressgen)(1.79, 3.57, 7.14, 14.3, 28.6 nM)またはHsc70(Stressgen)(1.79, 3.57, 7.14, 14.3, 28.6 nM)を含むリン酸緩衝液を逐次添加した。周波数変化はAFFINIX Q User Analysis(イニシアム)でモニターし、Hsp70またはHsc70とジペプチドの結合の程度を可視化した。周波数から濃度−結合飽和曲線を求め、解離定数(Kd値)を算出した。
水晶発振子マイクロバランス法は分子の結合・解離、重合・分解によって変化する水晶発振子の絶対重量の増減を振動数の変化でとらえることにより、蛍光物質などで標識することなく分子反応をナノグラムレベルで定量することができる(Motomiya et al., 2003; 岡畑と古澤., 2004; Sauerbrey., 1959)。水晶体センサーチップ(イニシアム、東京)をピランハ溶液(7.5 % H2O2, 25 % H2SO4)で5分間2回洗浄後、5mM 3,3-dithiodipropionic acid 溶液を100 μlセンサーチップにのせて室温で30分間静置した。蒸留水で洗浄後、1-(3-dimethylaminopropyl-3-ethylcarbodiimide hydrochloride(100 mg/ ml)とN-hydroxysuccinimide(100 mg/ ml)の等量混合液100 μlをセンサーチップにのせて室温で30分間静置し、蒸留水で洗浄した。
Leu-Ile、Pro-Leu(国産化学)またはIle-Pro(国産化学)(10 μg/ ml)を含む100 μlのリン酸緩衝液をセンサーチップにのせて室温で約1時間反応させ、ジペプチドをセンサーチップに固定化した。Pro-LeuおよびIle-ProはLeu-Ileと同じ疎水性ジペプチドであるがGDNF産生誘導作用を示さないこと(Nitta et al., 2004)から、これらをネガティブコントロールとして用いた。
ジペプチドを固定化したセンサーチップをAFFINIX Q(イニシアム、東京)にセットし、リン酸緩衝液中で振動数を安定化させた後、Hsp70(Stressgen)(1.79, 3.57, 7.14, 14.3, 28.6 nM)またはHsc70(Stressgen)(1.79, 3.57, 7.14, 14.3, 28.6 nM)を含むリン酸緩衝液を逐次添加した。周波数変化はAFFINIX Q User Analysis(イニシアム)でモニターし、Hsp70またはHsc70とジペプチドの結合の程度を可視化した。周波数から濃度−結合飽和曲線を求め、解離定数(Kd値)を算出した。
1−2−8 分子シミュレーションを用いたHsc70とLeu-Ileの結合部位の予測
Hsc70はN末端側から44KDのATPaseドメイン、18KDの基質結合ドメインおよび10KDのC末端ドメインに分けられ、それぞれの立体構造が既に明らかとなっているため、分子シュミレーションソフトウェアー(MOE; Chemical Computing GroupQuebec, Canada)を用いることによってLeu-IleがHsc70のどの部位に結合しているのかを予測することができる。Research Collaboratory for Structural Bioinformatics(SCSB)のデータベースサイトであるprotein data bank(PDB)(http://pdbbeta.rcsb.org/pdb/Welcome. do)から得られたそれぞれのドメインの3次元構造データ(3HSC(Flaherty et al.,1990)、7HSC(Morshauser et al., 1999)および1UOD(Chou et al., 2003))を利用し、MOE(分子力場:MMFF94x、カットオフ:9.5 nm)を用いてHsc70とLeu-Ileの結合部位の解析を行った。
Hsc70はN末端側から44KDのATPaseドメイン、18KDの基質結合ドメインおよび10KDのC末端ドメインに分けられ、それぞれの立体構造が既に明らかとなっているため、分子シュミレーションソフトウェアー(MOE; Chemical Computing GroupQuebec, Canada)を用いることによってLeu-IleがHsc70のどの部位に結合しているのかを予測することができる。Research Collaboratory for Structural Bioinformatics(SCSB)のデータベースサイトであるprotein data bank(PDB)(http://pdbbeta.rcsb.org/pdb/Welcome. do)から得られたそれぞれのドメインの3次元構造データ(3HSC(Flaherty et al.,1990)、7HSC(Morshauser et al., 1999)および1UOD(Chou et al., 2003))を利用し、MOE(分子力場:MMFF94x、カットオフ:9.5 nm)を用いてHsc70とLeu-Ileの結合部位の解析を行った。
1−3 結果
1−3−1 Leu-Ileの膜透過性
FITC標識Leu-Ileが細胞膜を透過することを証明した。図1Aに示すようにFITC標識Leu-Ileの濃度の上昇に伴って細胞内FITCの蛍光強度も増加した。また、時間経過との関係についても検討したところ、FITC標識Leu-Ileが細胞内に取り込まれるのは非常に早く、培養細胞への添加後120分で飽和状態となり、それ以上の取り込みは観察されなくなった(図1B)。FITCそのものも細胞膜を透過するが、FITC標識Leu-Ileのほうが、より透過しやすい。FITC標識Leu-Ileの膜透過性が、FITCでなくLeu-Ileに起因するものかどうかを検討するために、過剰量のLeu-IleをFITC標識Leu-IleまたはFITCと同時に培養上清に添加した。FITC標識Leu-Ileを用いた場合には、Leu-Ileの用量依存的に細胞内に取り込まれるFITCの蛍光強度は減少し、細胞膜通過性が抑制された(図1C)が、FITCと過剰量のLeu-Ileを同時に添加した場合には、FITCの細胞内取り込みは抑制されなかった。これらの結果から、Leu-Ileが細胞膜透過性を持つことが示された。
1−3−1 Leu-Ileの膜透過性
FITC標識Leu-Ileが細胞膜を透過することを証明した。図1Aに示すようにFITC標識Leu-Ileの濃度の上昇に伴って細胞内FITCの蛍光強度も増加した。また、時間経過との関係についても検討したところ、FITC標識Leu-Ileが細胞内に取り込まれるのは非常に早く、培養細胞への添加後120分で飽和状態となり、それ以上の取り込みは観察されなくなった(図1B)。FITCそのものも細胞膜を透過するが、FITC標識Leu-Ileのほうが、より透過しやすい。FITC標識Leu-Ileの膜透過性が、FITCでなくLeu-Ileに起因するものかどうかを検討するために、過剰量のLeu-IleをFITC標識Leu-IleまたはFITCと同時に培養上清に添加した。FITC標識Leu-Ileを用いた場合には、Leu-Ileの用量依存的に細胞内に取り込まれるFITCの蛍光強度は減少し、細胞膜通過性が抑制された(図1C)が、FITCと過剰量のLeu-Ileを同時に添加した場合には、FITCの細胞内取り込みは抑制されなかった。これらの結果から、Leu-Ileが細胞膜透過性を持つことが示された。
1−3−2 FITC標識したLeu-Ileによる脳内結合タンパク質の検討
NまたはC末端にFITC標識したLeu-Ileとマウス脳ホモジナイズ液を反応させたものを電気泳動し、蛍光スキャナーによって画像を得た(図2A)。C末端側にFITC標識したLeu-Ileに比べて、N末端側に標識したLeu-Ileの方がより多くのタンパク質と結合していたが、NおよびC末端側にFITC標識したLeu-Ile両方に70KDの大きさのタンパク質が結合した。また、それぞれの結合は4℃と37℃の温度差の影響をほとんど受けなかった。
NまたはC末端にFITC標識したLeu-Ileとマウス脳ホモジナイズ液を反応させたものを電気泳動し、蛍光スキャナーによって画像を得た(図2A)。C末端側にFITC標識したLeu-Ileに比べて、N末端側に標識したLeu-Ileの方がより多くのタンパク質と結合していたが、NおよびC末端側にFITC標識したLeu-Ile両方に70KDの大きさのタンパク質が結合した。また、それぞれの結合は4℃と37℃の温度差の影響をほとんど受けなかった。
1−3−3 Leu-Ile結合タンパク質の同定
アガロースビーズAffigel-10によって精製した溶出液を電気泳動し、銀染色した結果、1−3−1で行った実験と同様に70KDの大きさにバンドが認められた(図2B)。これがLeu-Ileと特異的に結合しているタンパク質であると考え、trypsinによって消化した後、Matrix- assisted laser desorption/ ionization- time of flight/time of flight-Mass spectrometry(MALDI-TOF/TOF-MS)を用いてタンパク質の質量分析を行った。マスコットサーチを用いてNCBInrのデータベースを検索したところ10本のペプチド鎖がheat shock cognate protein 70(Hsc70)の配列と一致し、スコアが496であったことから、Hsc70がLeu-Ileの結合タンパク質である可能性が極めて高いと考えられた(図11)。Hsc70の抗体を用いてAffigel-10によって精製した溶出液のウエスタンブロッティングを行った結果、Hsc70と考えられるバンドが検出された(図2C)。一方、Hsc70と81%の相同性を有するHsp70についてもウエスタンブロットを行ったが、バンドは検出されなかった(データ示さず)。Hsc70は恒常的に発現しているタンパク質であるが、Hsp70は熱や虚血などのストレスに暴露されたときに発現誘導されることが知られており(Dworniczak and Mirault., 1987)、今回実験に用いた脳が非ストレス下であったため、Hsp70とLeu-Ileとの結合が観察できなかったと考えられる。
アガロースビーズAffigel-10によって精製した溶出液を電気泳動し、銀染色した結果、1−3−1で行った実験と同様に70KDの大きさにバンドが認められた(図2B)。これがLeu-Ileと特異的に結合しているタンパク質であると考え、trypsinによって消化した後、Matrix- assisted laser desorption/ ionization- time of flight/time of flight-Mass spectrometry(MALDI-TOF/TOF-MS)を用いてタンパク質の質量分析を行った。マスコットサーチを用いてNCBInrのデータベースを検索したところ10本のペプチド鎖がheat shock cognate protein 70(Hsc70)の配列と一致し、スコアが496であったことから、Hsc70がLeu-Ileの結合タンパク質である可能性が極めて高いと考えられた(図11)。Hsc70の抗体を用いてAffigel-10によって精製した溶出液のウエスタンブロッティングを行った結果、Hsc70と考えられるバンドが検出された(図2C)。一方、Hsc70と81%の相同性を有するHsp70についてもウエスタンブロットを行ったが、バンドは検出されなかった(データ示さず)。Hsc70は恒常的に発現しているタンパク質であるが、Hsp70は熱や虚血などのストレスに暴露されたときに発現誘導されることが知られており(Dworniczak and Mirault., 1987)、今回実験に用いた脳が非ストレス下であったため、Hsp70とLeu-Ileとの結合が観察できなかったと考えられる。
1−3−4 水晶発振子バイオセンサーによるHsc70およびHsp70とLeu-Ileの結合力の検討
Hsc70およびHsp70とLeu-Ileの結合活性について水晶発振子バイオセンサーを用いて測定した。Leu-Ile、Pro-LeuまたはIle-Proを結合させた水晶発振子にHsc70またはHsp70を反応させると、Leu-Ileを結合させたもののみ振動数が減少した(図3A)。95℃で5分間インキュベートして熱変性させたHsc70およびHsp70を加えても、振動数が減少しなかったことから、熱変性させたHsc70およびHsp70はLeu-Ileと結合しないことが分かった(図3A)。Hsc70またはHsp70とLeu-Ileの解離定数を求めた結果、Hsc70はKd = 1.83×10-8 M、Hsp70はKd = 1.24×10-8 Mの強さでLeu-Ileと結合する事が分かった(図3B)。水晶発振子バイオセンサーによる実験ではHsc70のみでなくHsp70もLeu-Ileと結合することが示された。
Hsc70およびHsp70とLeu-Ileの結合活性について水晶発振子バイオセンサーを用いて測定した。Leu-Ile、Pro-LeuまたはIle-Proを結合させた水晶発振子にHsc70またはHsp70を反応させると、Leu-Ileを結合させたもののみ振動数が減少した(図3A)。95℃で5分間インキュベートして熱変性させたHsc70およびHsp70を加えても、振動数が減少しなかったことから、熱変性させたHsc70およびHsp70はLeu-Ileと結合しないことが分かった(図3A)。Hsc70またはHsp70とLeu-Ileの解離定数を求めた結果、Hsc70はKd = 1.83×10-8 M、Hsp70はKd = 1.24×10-8 Mの強さでLeu-Ileと結合する事が分かった(図3B)。水晶発振子バイオセンサーによる実験ではHsc70のみでなくHsp70もLeu-Ileと結合することが示された。
1−3−5 分子シミュレーションを用いたHsc70とLeu-Ileの結合部位の予測
Hsc70はN末端側から44KDのATPaseドメイン、18KDの基質結合ドメインおよび10KDのC末端ドメインに分けられ、それぞれの立体構造が既に明らかとなっている(Chou et al., 2003; Flaherty et al.,1990; Morshauser et al., 1999)。Leu-Ileがどのドメインに結合しているのかを分子シミュレーションソフトウェアー(MOE)を用いて解析し、相互ポテンシャルエネルギーを計算した結果、ATPaseドメインには-119.044 kCal、基質結合ドメインには-76.711 kCal、C末端ドメインには-64.337 kCalの強さでLeu-Ileが結合することが示された(図4)。
Hsc70はN末端側から44KDのATPaseドメイン、18KDの基質結合ドメインおよび10KDのC末端ドメインに分けられ、それぞれの立体構造が既に明らかとなっている(Chou et al., 2003; Flaherty et al.,1990; Morshauser et al., 1999)。Leu-Ileがどのドメインに結合しているのかを分子シミュレーションソフトウェアー(MOE)を用いて解析し、相互ポテンシャルエネルギーを計算した結果、ATPaseドメインには-119.044 kCal、基質結合ドメインには-76.711 kCal、C末端ドメインには-64.337 kCalの強さでLeu-Ileが結合することが示された(図4)。
1−4 考察
FITCを結合したLeu-Ileと脳ホモジナイズ液を反応させた実験では、70KDのタンパク質がLeu-Ileと特異的に結合することが示された。この時、反応温度を4℃から37℃に変化させても結合の程度に差がなかったことから、これらの結合は温度の影響を受けやすい酵素的な反応ではないと考えられる。Leu-Ileと特異的に結合する70KDのタンパク質の質量分析を行ったところHsc70が同定され、水晶発振子バイオセンサーによる実験ではHsc70のみでなくHsp70もLeu-Ileと特異的に結合する可能性が示唆された。
タクロリムスはFKBP12に結合する事でカルシニューリンの脱リン酸化作用を抑制し、interleukin2の産生を抑制することで免疫抑制作用を発現すると考えられている(Griffith et al., 1995; Schreiber et al., 1991)。Leu-Ileはタクロリムスの部分構造の類似体として得られたが、FKBP12には結合せず、カルシニューリン阻害活性を持たない事からも、Leu-Ileは免疫活性を抑制することなく、神経保護作用を誘導することが示唆されている(Nitta et al., 2004)。
また、タクロリムスの神経保護作用に関する重要な因子はFKBP52(Hsp56)であることが示唆されいる(Gold et al., 1999)。本研究ではHsc70およびHsp70とLeu-Ileが結合することが示されたが、FKBP52とHsc70およびHsp70はHsp90と共にステロイド受容体に結合し、複合体を形成しているという報告があることから(Bagchi et al., 1991; McLaughlin et al., 2002)、タクロリムスとLeu-Ileはこれらの複合体に何らかの作用をおよぼすことによって神経保護作用を誘導している可能性が考えられる。
Hsc70とHsp70はヒートショックプロテイン70ファミリーに属し、81%のアミノ酸相同配列を有していることから、タンパク質のミスホールディングや凝集を防ぐ類似した機能を持ち(Dworniczak and Mirault., 1987; Young et al., 2003)、結合したタンパク質はATPのエネルギーを用いてHsp90に受け渡されるという報告がある(Bagchi et al., 1991; McLaughlin et al., 2002)。分子シミュレーションを用いた解析ではLeu-IleがHsc70のATPaseドメインに強く結合する可能性が示されたことから、ATPのエネルギーを用いたHsc70とHsp90間のタンパク質受け渡しにLeu-Ileが関与している可能性が示唆された。Hsp90は細胞周期、細胞増殖およびアポトーシスに関わる細胞内シグナルを調節する働きをもつので(Zhang and Burrows et al., 2004)、Leu-IleはHsp90を介したシグナル経路によってGDNFの産生誘導作用や神経保護作用を発現していると考えられる。
また、免疫細胞においては、Hsp70がIκB kinaseの活性を抑制する機能を有し、NF-κBの活性を抑えることによって、tumor necrosis factor-α(TNF-α)の転写を抑制するという報告がなされている(Beere et al., 2004; Feinstein et al., 1996; Yoo et al., 2000)。このことから、Leu-IleがHsc70およびHsp70の作用を抑制し、GDNFの転写因子でもあるNF-κBを活性化することによってGDNFを産生誘導している可能性が考えられた。そこで、以下では、Hsc70が調節しているシグナル経路とGDNFの転写因子に焦点をしぼり、GDNFの産生を誘導しているシグナルとHsc70との関係について検討を行った。
FITCを結合したLeu-Ileと脳ホモジナイズ液を反応させた実験では、70KDのタンパク質がLeu-Ileと特異的に結合することが示された。この時、反応温度を4℃から37℃に変化させても結合の程度に差がなかったことから、これらの結合は温度の影響を受けやすい酵素的な反応ではないと考えられる。Leu-Ileと特異的に結合する70KDのタンパク質の質量分析を行ったところHsc70が同定され、水晶発振子バイオセンサーによる実験ではHsc70のみでなくHsp70もLeu-Ileと特異的に結合する可能性が示唆された。
タクロリムスはFKBP12に結合する事でカルシニューリンの脱リン酸化作用を抑制し、interleukin2の産生を抑制することで免疫抑制作用を発現すると考えられている(Griffith et al., 1995; Schreiber et al., 1991)。Leu-Ileはタクロリムスの部分構造の類似体として得られたが、FKBP12には結合せず、カルシニューリン阻害活性を持たない事からも、Leu-Ileは免疫活性を抑制することなく、神経保護作用を誘導することが示唆されている(Nitta et al., 2004)。
また、タクロリムスの神経保護作用に関する重要な因子はFKBP52(Hsp56)であることが示唆されいる(Gold et al., 1999)。本研究ではHsc70およびHsp70とLeu-Ileが結合することが示されたが、FKBP52とHsc70およびHsp70はHsp90と共にステロイド受容体に結合し、複合体を形成しているという報告があることから(Bagchi et al., 1991; McLaughlin et al., 2002)、タクロリムスとLeu-Ileはこれらの複合体に何らかの作用をおよぼすことによって神経保護作用を誘導している可能性が考えられる。
Hsc70とHsp70はヒートショックプロテイン70ファミリーに属し、81%のアミノ酸相同配列を有していることから、タンパク質のミスホールディングや凝集を防ぐ類似した機能を持ち(Dworniczak and Mirault., 1987; Young et al., 2003)、結合したタンパク質はATPのエネルギーを用いてHsp90に受け渡されるという報告がある(Bagchi et al., 1991; McLaughlin et al., 2002)。分子シミュレーションを用いた解析ではLeu-IleがHsc70のATPaseドメインに強く結合する可能性が示されたことから、ATPのエネルギーを用いたHsc70とHsp90間のタンパク質受け渡しにLeu-Ileが関与している可能性が示唆された。Hsp90は細胞周期、細胞増殖およびアポトーシスに関わる細胞内シグナルを調節する働きをもつので(Zhang and Burrows et al., 2004)、Leu-IleはHsp90を介したシグナル経路によってGDNFの産生誘導作用や神経保護作用を発現していると考えられる。
また、免疫細胞においては、Hsp70がIκB kinaseの活性を抑制する機能を有し、NF-κBの活性を抑えることによって、tumor necrosis factor-α(TNF-α)の転写を抑制するという報告がなされている(Beere et al., 2004; Feinstein et al., 1996; Yoo et al., 2000)。このことから、Leu-IleがHsc70およびHsp70の作用を抑制し、GDNFの転写因子でもあるNF-κBを活性化することによってGDNFを産生誘導している可能性が考えられた。そこで、以下では、Hsc70が調節しているシグナル経路とGDNFの転写因子に焦点をしぼり、GDNFの産生を誘導しているシグナルとHsc70との関係について検討を行った。
2.ラット培養海馬神経細胞におけるLeu-IleのGDNF産生誘導作用
2−1 目的
GDNFは胎児黒質ドーパミン神経に対する栄養因子としてラットグリア細胞(B49)から得られ、黒質ドーパミン神経の変性によって起こるパーキンソン病の治療薬への応用が期待された(Lin et al., 1993)。その後、GNDFは脊髄運動神経や交感神経に対しても強力な生存効果を持つことが明らかとなり(Henderson et al., 1994)、発生段階に於いては、GDNFが神経冠細胞の腎臓、腸神経系への遊走制御や器官形成に重要な役割を果たしていることが明らかとなった(Moore et al., 1996; Pichel et al,. 1996; Sanchez et al., 1996.)。
ホモ二量体の分泌タンパク質であるGDNFは、細胞膜上のGDNF family receptor-α(GFRα1)に結合後、受容体RETと複合体を形成し、細胞内にシグナルを伝達する。リガンドであるGDNFは1993年に神経栄養因子としてみいだされた(Lin et al., 1993)。しかし、その受容体であるRETは癌遺伝子として1985年に発見され(Takahashi et al,. 1985)、古くからRETの突然変異がひき起こす疾患やRETの細胞内シグナル経路についての詳細な研究が行われてきた。RETの突然変異による疾患には多発性内分泌腺腫症、家族性甲状腺髄様癌があり、その病理的変化としては甲状腺,副甲状腺および副腎髄質での腫瘍性病変、または神経冠細胞由来の外胚葉に異常が認められる(Airaksinen et al., 1999; Mulligan et al., 1994; Romeo et al., 1994; Santoro et al., 1990)。この様にRET遺伝子が癌原遺伝子であることは、GDNF/RETのシグナルが細胞の生存、増殖および分化に強く関わっている事を裏付けるものであろう。
RETは膜貫通型チロシンキナーゼ受容体で、細胞内ドメインの長さが異なる3種のアイソフォーム(RET9、RET43、RET51)が細胞内にシグナルを伝えている(Lorenzo et al., 1995; Myers et al., 1995; Takahashi et al.,1989)。リガンドであるGDNF、neurturin、artemin、persephinがRETに結合すると、RETは二量体を形成し、チロシン残基(Tyr)を自己リン酸化することで細胞内シグナルを活性化する(Grimm et al., 2001; Schlessinger, 2000)。GDNFによりRETを刺激するとRETのTyr905、Tyr1015、Tyr1062およびTyr1096を自己リン酸化させるが(Coulpier et al., 2002; Ichihara et al., 2004)、この4つのチロシン残基のうち、Tyr1062がphosphatidylinositol-3 kinase (PI3K)/Akt経路を活性化することによって、GDNF/RETの神経保護作用が発現すると考えられている(Besset et al., 2000; Coulpier et al., 2002; Encinas et al., 2001; Hayashi et al., 2000; Kobayashi and Matsuoka., 2000; Takahashi., 2001)。
これまでの研究によってGDNF/RETによって活性化される細胞内シグナル経路についての解明は進んでいるが、GDNFの産生を促す転写調節機構についてはまだよく分かっていない。GDNFの産生を誘導する物質としては、TNF-α、interleukin-1? (IL-1? )などの炎症性サイトカイン、fibloblast growth factor(FGF)などの栄養因子、興奮性アミノ酸などが報告されている(Marco et al., 2002; Taylor et al., 2003; Verity et al., 1999)。また、GDNFは脊髄損傷など障害を受けることによってもすばやく誘導されることが分かっている(Satake et al., 2000)。しかし、GDNFの発現調節パターンはグリア細胞または神経細胞によって異なり、例えば、IL-1? を膠芽細胞腫であるU-87MGに作用させるとGDNFの産生が促進されるが、IL-1? を神経芽腫であるSK-N-ASに作用させるとGDNFの産生を抑制することが報告されている(Verity et al., 1999)。このようなGDNFの複雑な発現パターンはそのプロモーター領域によって調節されていると考えられている(Tanaka et al., 2001)。
GDNFのプロモーター領域にはNF-κB、CREB、trans-acting transcription factor 1(SP1)、sine oculis-related homeobox 2 homolog(Six2)などの転写調節因子結合部位や転写を抑制するサイレンサーneural-restrictive silencer elements(NRSE)結合部位が存在し(Brodbeck et al., 2004; Tanaka et al., 2000; Woodbury et al., 1998)、これらの因子が複雑に影響しあうことで転写調節を行っている(図12)。例えば、恒常的なGDNFの発現にはSP1が、発生段階での神経管や体節などにおけるGDNF発現誘導にはSix2が、障害やサイトカインによるGDNFの誘導にはNF-κB が関わる事が知られている(Baecker et al., 1999; Brodbeck et al., 2004; Grimm et al., 1998; Maruyama et al., 2004; Tanaka et al., 2001)。Leu-IleによるGDNFの産生誘導効果は、これらの転写調節因子のいずれかが活性化することによって発現すると考えられる。
上記1.ではHsp70およびHsc70がLeu-Ileの結合タンパク質である事を示したが、以下では、Leu-IleがHsp70およびHsc70が結合した後、どの様なシグナルを介してGDNFの産生を誘導するのかを調べるため、特に障害やサイトカインとの関係が深く、Hsp70を発現誘導することによって活性が抑制されるNF-κB(Yoo et al., 2000)、および、神経保護作用とつながりが深いCREBに焦点をしぼって検討した。
2−1 目的
GDNFは胎児黒質ドーパミン神経に対する栄養因子としてラットグリア細胞(B49)から得られ、黒質ドーパミン神経の変性によって起こるパーキンソン病の治療薬への応用が期待された(Lin et al., 1993)。その後、GNDFは脊髄運動神経や交感神経に対しても強力な生存効果を持つことが明らかとなり(Henderson et al., 1994)、発生段階に於いては、GDNFが神経冠細胞の腎臓、腸神経系への遊走制御や器官形成に重要な役割を果たしていることが明らかとなった(Moore et al., 1996; Pichel et al,. 1996; Sanchez et al., 1996.)。
ホモ二量体の分泌タンパク質であるGDNFは、細胞膜上のGDNF family receptor-α(GFRα1)に結合後、受容体RETと複合体を形成し、細胞内にシグナルを伝達する。リガンドであるGDNFは1993年に神経栄養因子としてみいだされた(Lin et al., 1993)。しかし、その受容体であるRETは癌遺伝子として1985年に発見され(Takahashi et al,. 1985)、古くからRETの突然変異がひき起こす疾患やRETの細胞内シグナル経路についての詳細な研究が行われてきた。RETの突然変異による疾患には多発性内分泌腺腫症、家族性甲状腺髄様癌があり、その病理的変化としては甲状腺,副甲状腺および副腎髄質での腫瘍性病変、または神経冠細胞由来の外胚葉に異常が認められる(Airaksinen et al., 1999; Mulligan et al., 1994; Romeo et al., 1994; Santoro et al., 1990)。この様にRET遺伝子が癌原遺伝子であることは、GDNF/RETのシグナルが細胞の生存、増殖および分化に強く関わっている事を裏付けるものであろう。
RETは膜貫通型チロシンキナーゼ受容体で、細胞内ドメインの長さが異なる3種のアイソフォーム(RET9、RET43、RET51)が細胞内にシグナルを伝えている(Lorenzo et al., 1995; Myers et al., 1995; Takahashi et al.,1989)。リガンドであるGDNF、neurturin、artemin、persephinがRETに結合すると、RETは二量体を形成し、チロシン残基(Tyr)を自己リン酸化することで細胞内シグナルを活性化する(Grimm et al., 2001; Schlessinger, 2000)。GDNFによりRETを刺激するとRETのTyr905、Tyr1015、Tyr1062およびTyr1096を自己リン酸化させるが(Coulpier et al., 2002; Ichihara et al., 2004)、この4つのチロシン残基のうち、Tyr1062がphosphatidylinositol-3 kinase (PI3K)/Akt経路を活性化することによって、GDNF/RETの神経保護作用が発現すると考えられている(Besset et al., 2000; Coulpier et al., 2002; Encinas et al., 2001; Hayashi et al., 2000; Kobayashi and Matsuoka., 2000; Takahashi., 2001)。
これまでの研究によってGDNF/RETによって活性化される細胞内シグナル経路についての解明は進んでいるが、GDNFの産生を促す転写調節機構についてはまだよく分かっていない。GDNFの産生を誘導する物質としては、TNF-α、interleukin-1? (IL-1? )などの炎症性サイトカイン、fibloblast growth factor(FGF)などの栄養因子、興奮性アミノ酸などが報告されている(Marco et al., 2002; Taylor et al., 2003; Verity et al., 1999)。また、GDNFは脊髄損傷など障害を受けることによってもすばやく誘導されることが分かっている(Satake et al., 2000)。しかし、GDNFの発現調節パターンはグリア細胞または神経細胞によって異なり、例えば、IL-1? を膠芽細胞腫であるU-87MGに作用させるとGDNFの産生が促進されるが、IL-1? を神経芽腫であるSK-N-ASに作用させるとGDNFの産生を抑制することが報告されている(Verity et al., 1999)。このようなGDNFの複雑な発現パターンはそのプロモーター領域によって調節されていると考えられている(Tanaka et al., 2001)。
GDNFのプロモーター領域にはNF-κB、CREB、trans-acting transcription factor 1(SP1)、sine oculis-related homeobox 2 homolog(Six2)などの転写調節因子結合部位や転写を抑制するサイレンサーneural-restrictive silencer elements(NRSE)結合部位が存在し(Brodbeck et al., 2004; Tanaka et al., 2000; Woodbury et al., 1998)、これらの因子が複雑に影響しあうことで転写調節を行っている(図12)。例えば、恒常的なGDNFの発現にはSP1が、発生段階での神経管や体節などにおけるGDNF発現誘導にはSix2が、障害やサイトカインによるGDNFの誘導にはNF-κB が関わる事が知られている(Baecker et al., 1999; Brodbeck et al., 2004; Grimm et al., 1998; Maruyama et al., 2004; Tanaka et al., 2001)。Leu-IleによるGDNFの産生誘導効果は、これらの転写調節因子のいずれかが活性化することによって発現すると考えられる。
上記1.ではHsp70およびHsc70がLeu-Ileの結合タンパク質である事を示したが、以下では、Leu-IleがHsp70およびHsc70が結合した後、どの様なシグナルを介してGDNFの産生を誘導するのかを調べるため、特に障害やサイトカインとの関係が深く、Hsp70を発現誘導することによって活性が抑制されるNF-κB(Yoo et al., 2000)、および、神経保護作用とつながりが深いCREBに焦点をしぼって検討した。
2−2 実験材料および方法
2−2−1 動物
実験には、Wistar系STラット妊娠17日目(日本SLC)を使用した。なお、本研究は名古屋大学医学部動物実験指針およびPrinciples of Laboratory Animal Care(National Institutes of Health Publication 85-23, 1985)に基づいて行った。
2−2−1 動物
実験には、Wistar系STラット妊娠17日目(日本SLC)を使用した。なお、本研究は名古屋大学医学部動物実験指針およびPrinciples of Laboratory Animal Care(National Institutes of Health Publication 85-23, 1985)に基づいて行った。
2−2−2 ラット海馬神経細胞培養方法
ペントバルビタールによる麻酔下でWistar系STラットから妊娠17日目の胎仔を取り出し、氷冷したL15倍地(シグマ アルドリッチ ジャパン、東京)中で海馬を取り出した。trypsin(Invitrogen, NY, USA)を37℃で15分間作用させた後、海馬に牛胎児血清(fetal bovine serum: FBS)を加えて反応を停止し、phosphate buffer saline(PBS)(1.3 mmol/l NaCl, 81 mmol/l Na2HPO4, 26.8 mmol/l KCl, 14.7 mmol/l KH2PO4)(pH 7.4)を海馬の入った容器に加えて穏やかに震とうし、PBSを取り除いた。これに10% FBSを含むDulbecco’s modified Eagle’s medium/ Ham’s nutrient mixture F12 (DMEM/ F12HAM)(シグマ アルドリッチ ジャパン)を10 ml加え、10回ピペッティングをくりかえすことで細胞を解離させ、96穴プレートまたは6 cmシャーレ(NALGE NUNC International, 東京)を用いてそれぞれ250,000 cells/ cm2の細胞密度で培養を開始した。37℃、5% CO2で1日間培養した後、N2サプリメント(Invitrogen)を含むDMEM/ F12HAM無血清培地に換え、さらに1日培養した細胞を免疫染色、ウエスタンブロッティング、またはmethyl thiazol tetrazolium(MTT)アッセイの実験に用いた。
ペントバルビタールによる麻酔下でWistar系STラットから妊娠17日目の胎仔を取り出し、氷冷したL15倍地(シグマ アルドリッチ ジャパン、東京)中で海馬を取り出した。trypsin(Invitrogen, NY, USA)を37℃で15分間作用させた後、海馬に牛胎児血清(fetal bovine serum: FBS)を加えて反応を停止し、phosphate buffer saline(PBS)(1.3 mmol/l NaCl, 81 mmol/l Na2HPO4, 26.8 mmol/l KCl, 14.7 mmol/l KH2PO4)(pH 7.4)を海馬の入った容器に加えて穏やかに震とうし、PBSを取り除いた。これに10% FBSを含むDulbecco’s modified Eagle’s medium/ Ham’s nutrient mixture F12 (DMEM/ F12HAM)(シグマ アルドリッチ ジャパン)を10 ml加え、10回ピペッティングをくりかえすことで細胞を解離させ、96穴プレートまたは6 cmシャーレ(NALGE NUNC International, 東京)を用いてそれぞれ250,000 cells/ cm2の細胞密度で培養を開始した。37℃、5% CO2で1日間培養した後、N2サプリメント(Invitrogen)を含むDMEM/ F12HAM無血清培地に換え、さらに1日培養した細胞を免疫染色、ウエスタンブロッティング、またはmethyl thiazol tetrazolium(MTT)アッセイの実験に用いた。
2−2−3 培養海馬神経細胞を用いたNF-κB免疫組織染色
2−2−2で培養した海馬神経細胞にLeu-Ile (10 μg/ml)、TNF-α (100 ng/ml)(大日本製薬(大阪)より恵与)またはGDNF(50 ng/ml)(Amgen, CA, USAより恵与)を2時間作用させた。細胞を-20℃のメタノールで20分間固定し、4℃のPBSで15分間3回洗浄した。2%牛胎児血清アルブミン(bovin serum albumin: BSA)、10%FBSを含むPBS溶液で細胞を37℃ 1時間インキュベーションし、PBSで1000倍に希釈したrabbit anti p65/ NF-κB antibody(Lockland, PA, USA)を加え4℃で一晩作用させた。ネガティブコントロールはPBSのみを細胞に加えて4℃中で一晩放置した。細胞をPBSで15分間3回洗浄した後、PBSで1000倍希釈したAlexa Fluor 546 goat anti-rabbit IgG(H+L)(Molecular Probes, OR, USA)を3時間反応させ、PBSで15分間3回洗浄した。染色した細胞はカバーガラスで封入し、蛍光顕微鏡axioscop 2 plus(Zeiss, NY, USA)で観察した(Zhu et al., 2004)。
2−2−2で培養した海馬神経細胞にLeu-Ile (10 μg/ml)、TNF-α (100 ng/ml)(大日本製薬(大阪)より恵与)またはGDNF(50 ng/ml)(Amgen, CA, USAより恵与)を2時間作用させた。細胞を-20℃のメタノールで20分間固定し、4℃のPBSで15分間3回洗浄した。2%牛胎児血清アルブミン(bovin serum albumin: BSA)、10%FBSを含むPBS溶液で細胞を37℃ 1時間インキュベーションし、PBSで1000倍に希釈したrabbit anti p65/ NF-κB antibody(Lockland, PA, USA)を加え4℃で一晩作用させた。ネガティブコントロールはPBSのみを細胞に加えて4℃中で一晩放置した。細胞をPBSで15分間3回洗浄した後、PBSで1000倍希釈したAlexa Fluor 546 goat anti-rabbit IgG(H+L)(Molecular Probes, OR, USA)を3時間反応させ、PBSで15分間3回洗浄した。染色した細胞はカバーガラスで封入し、蛍光顕微鏡axioscop 2 plus(Zeiss, NY, USA)で観察した(Zhu et al., 2004)。
2−2−4 培養海馬神経細胞からの細胞核の単離
6 cmシャーレで培養した海馬神経細胞にLeu-Ile(10 μg/ml)を30分間作用させ、培養上清を取り除いた後、培養海馬神経細胞をPBSで洗い、cytoplasmic extraction buffer(CEB)(10 mM Tris-HCl (pH 7.9), 60 mM KCl, l mM EDTA, 1 mM dithiothreitol(DTT))と5分間氷上で反応させた。プロテアーゼ阻害剤(1 μg/ml leupeptin, 1 μg/ml pepstatin, 20 μg/ml phosphoramidon, 0.2 mg/ml EDTA, 2 μg/ml aprotinin, 0.5 mM PMSF)を含む0.4% Nonidet P-40/CEB 300 μlに5分間馴染ませた後、ラバーポリスマンで穏やかに細胞を剥ぎ取り回収し、1,000gで5分間遠心した。遠心して得られた沈殿物をプロテアーゼ阻害剤を含むCEBで洗浄し、nuclear extraction buffer(NEB)(20 mM Tris-HCl (pH 7.9), 0.4 M NaCl, 1.5 mM MgCl2, 1.5 mM EDTA, 1 mM DTT, 25% glycerol)を加え充分に撹拌した後、10分間氷上に放置した。この溶液を5分間16,000gで遠心し、上清を核抽出液として回収した(Yoo et al., 2000)。
6 cmシャーレで培養した海馬神経細胞にLeu-Ile(10 μg/ml)を30分間作用させ、培養上清を取り除いた後、培養海馬神経細胞をPBSで洗い、cytoplasmic extraction buffer(CEB)(10 mM Tris-HCl (pH 7.9), 60 mM KCl, l mM EDTA, 1 mM dithiothreitol(DTT))と5分間氷上で反応させた。プロテアーゼ阻害剤(1 μg/ml leupeptin, 1 μg/ml pepstatin, 20 μg/ml phosphoramidon, 0.2 mg/ml EDTA, 2 μg/ml aprotinin, 0.5 mM PMSF)を含む0.4% Nonidet P-40/CEB 300 μlに5分間馴染ませた後、ラバーポリスマンで穏やかに細胞を剥ぎ取り回収し、1,000gで5分間遠心した。遠心して得られた沈殿物をプロテアーゼ阻害剤を含むCEBで洗浄し、nuclear extraction buffer(NEB)(20 mM Tris-HCl (pH 7.9), 0.4 M NaCl, 1.5 mM MgCl2, 1.5 mM EDTA, 1 mM DTT, 25% glycerol)を加え充分に撹拌した後、10分間氷上に放置した。この溶液を5分間16,000gで遠心し、上清を核抽出液として回収した(Yoo et al., 2000)。
2−2−5 CREBアンチセンスオリゴヌクレオチド添加による培養海馬神経細胞のCREB発現抑制
CREBの開始コドン領域に対応するCREBアンチセンスオリゴヌクレオチド(5'-GCT CCA GAG TCC ATG GTC AT- 3':配列番号1)またはCREBセンスオリゴヌクレオチド(5'-AT GAC CAT GGA CTC TGG AGC-3':配列番号2)を1 μgずつ6cmシャーレに培養した海馬神経細胞に加え、Lipofectamine Plus transfection reagent (Invitrogen)を用いて遺伝子導入した(Gonzalez et al., 1989; Sato-Bigbee and DeVries., 1996)。CREBアンチセンスオリゴヌクレオチドを遺伝子導入した細胞にLeu-Ile(10 μg/ ml)を加え24時間培養したものを(Afshari et al., 2001; Johnson et al., 2000)、GDNFのウエスタンブロッティングのサンプルとして用いた。
CREBの開始コドン領域に対応するCREBアンチセンスオリゴヌクレオチド(5'-GCT CCA GAG TCC ATG GTC AT- 3':配列番号1)またはCREBセンスオリゴヌクレオチド(5'-AT GAC CAT GGA CTC TGG AGC-3':配列番号2)を1 μgずつ6cmシャーレに培養した海馬神経細胞に加え、Lipofectamine Plus transfection reagent (Invitrogen)を用いて遺伝子導入した(Gonzalez et al., 1989; Sato-Bigbee and DeVries., 1996)。CREBアンチセンスオリゴヌクレオチドを遺伝子導入した細胞にLeu-Ile(10 μg/ ml)を加え24時間培養したものを(Afshari et al., 2001; Johnson et al., 2000)、GDNFのウエスタンブロッティングのサンプルとして用いた。
2−2−6 培養海馬神経細胞からのサンプル調製とウエスタンブロッティング
Akt、CaMKII、ERKおよびPKC-? のウエスタンブロッティングにはLeu-Ile(10 μg/ ml)を10、20または30分間作用させた培養海馬神経細胞を用い、GDNFのウエスタンブロッティングにはLeu-Ile(10 μg/ ml)を1日作用させた細胞を用いた。また、PI3Kの阻害剤であるLY294002(30 μM)(シグマ アルドリッチ ジャパン)またはHsp90の複合体形成を阻害するgeldanamycin(10 μM)(シグマ アルドリッチ ジャパン)とLeu-Ileを同時に30分間作用させた細胞を用いてAktおよびCREBのウエスタンブロッティングを行った。Leu-Ileを作用させた培養海馬神経細胞の培養上清を取り除き、細胞をPBSで洗い、precipitation buffer(20 mM Tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 1 mM sodium orthovanadate, 2 mM EDTA, 50 mM NaF, 1% Nonidet P-40, 1 mM PMSF, 20 μg/ml aprotinin, 20 μg/ml leupeptin, , 20 μg/ml pepstatin)を300 μl加え、セルスクレイパーを用いて回収した。ホモジナイザーで30秒間細胞を破砕した後、4℃10,000gで1時間遠心し、その上清をウエスタンブロッティングのサンプルとした。
サンプルのタンパク質量はDC Protein Assey Kit II(BIO-RAD, CA, USA)で測定した。希釈したサンプルと等容量のサンプルバッファーを加え95℃で5分間煮沸し、10%ポリアクリルアミドゲルで電気泳動を行った。
ポリアクリルアミドゲルからsemi-dry transfer法によりPDVF膜へタンパク質を転写した後、膜をブロッキングバッファー(KPL, MD, USA)中で、穏やかに攪拌しながら2時間室温でブロッキングした。
次に、PDVF膜をブロッキングバッファーで1000倍に希釈した一次抗体(mouse monoclonal anti-GDNF antibody(R&D systems, MN, USA)、rabbit anti- phospho- CaMKII antibody(Promega, WI, USA)、rabbit anti-NF-κB antibody(Lockland)、mouse monoclonal anti-CREB antibody(Santa Cruz Biotechnology, CA, USA)、rabbit anti- phospho-CREB antibody(Cell Signaling Technology, MA, USA)、rabbit anti- phospho- Akt (Ser2448)(Cell Signaling Technology)、anti-Akt antibody(Cell Signaling Technology)、anti- phospho-PKC-? antibody(Cell Signaling Technology)、mouse monoclonal anti- phospho-ERK antibody(Cell Signaling Technology)、rat anti-Hsc70 antibodyまたはanti-Hsp90 antibody(Stressgen))と4℃で一晩反応させた。TBS(10 mM Tris-HCl, 137 mM NaCl, 0.1% Tween-20)にて15分間3回洗浄した後、2次抗体(peroxidase labeled goat anti-mouse IgG (H+L) antibody またはperoxidase labeled goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody(Kirkegaard & Perry Laboratries, MD, USA))と室温で2時間反応させた。その後TBSで3回洗浄し、ECLTM(Amersham Pharmacia Biotec, UK)を1分間反応させた。FPM100(富士写真フィルム、東京)現像機を用いてhyperfilm(Amersham Bioscience, NA, UK)に現像した。Hyperfilmに現像されたバンドの強度解析にはATTO Densito Graph(アトー、東京)を用いた。
Akt、CaMKII、ERKおよびPKC-? のウエスタンブロッティングにはLeu-Ile(10 μg/ ml)を10、20または30分間作用させた培養海馬神経細胞を用い、GDNFのウエスタンブロッティングにはLeu-Ile(10 μg/ ml)を1日作用させた細胞を用いた。また、PI3Kの阻害剤であるLY294002(30 μM)(シグマ アルドリッチ ジャパン)またはHsp90の複合体形成を阻害するgeldanamycin(10 μM)(シグマ アルドリッチ ジャパン)とLeu-Ileを同時に30分間作用させた細胞を用いてAktおよびCREBのウエスタンブロッティングを行った。Leu-Ileを作用させた培養海馬神経細胞の培養上清を取り除き、細胞をPBSで洗い、precipitation buffer(20 mM Tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 1 mM sodium orthovanadate, 2 mM EDTA, 50 mM NaF, 1% Nonidet P-40, 1 mM PMSF, 20 μg/ml aprotinin, 20 μg/ml leupeptin, , 20 μg/ml pepstatin)を300 μl加え、セルスクレイパーを用いて回収した。ホモジナイザーで30秒間細胞を破砕した後、4℃10,000gで1時間遠心し、その上清をウエスタンブロッティングのサンプルとした。
サンプルのタンパク質量はDC Protein Assey Kit II(BIO-RAD, CA, USA)で測定した。希釈したサンプルと等容量のサンプルバッファーを加え95℃で5分間煮沸し、10%ポリアクリルアミドゲルで電気泳動を行った。
ポリアクリルアミドゲルからsemi-dry transfer法によりPDVF膜へタンパク質を転写した後、膜をブロッキングバッファー(KPL, MD, USA)中で、穏やかに攪拌しながら2時間室温でブロッキングした。
次に、PDVF膜をブロッキングバッファーで1000倍に希釈した一次抗体(mouse monoclonal anti-GDNF antibody(R&D systems, MN, USA)、rabbit anti- phospho- CaMKII antibody(Promega, WI, USA)、rabbit anti-NF-κB antibody(Lockland)、mouse monoclonal anti-CREB antibody(Santa Cruz Biotechnology, CA, USA)、rabbit anti- phospho-CREB antibody(Cell Signaling Technology, MA, USA)、rabbit anti- phospho- Akt (Ser2448)(Cell Signaling Technology)、anti-Akt antibody(Cell Signaling Technology)、anti- phospho-PKC-? antibody(Cell Signaling Technology)、mouse monoclonal anti- phospho-ERK antibody(Cell Signaling Technology)、rat anti-Hsc70 antibodyまたはanti-Hsp90 antibody(Stressgen))と4℃で一晩反応させた。TBS(10 mM Tris-HCl, 137 mM NaCl, 0.1% Tween-20)にて15分間3回洗浄した後、2次抗体(peroxidase labeled goat anti-mouse IgG (H+L) antibody またはperoxidase labeled goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody(Kirkegaard & Perry Laboratries, MD, USA))と室温で2時間反応させた。その後TBSで3回洗浄し、ECLTM(Amersham Pharmacia Biotec, UK)を1分間反応させた。FPM100(富士写真フィルム、東京)現像機を用いてhyperfilm(Amersham Bioscience, NA, UK)に現像した。Hyperfilmに現像されたバンドの強度解析にはATTO Densito Graph(アトー、東京)を用いた。
2−2−7 MTTアッセイ
MTTアッセイは生存細胞のミトコンドリアによって黄色のMTTが還元されてできた紫色のformazan生成物の結晶を可溶化し、発色量を測定する方法である。ミトコンドリアのMTT還元力は生存細胞数に比例するため、生成物の吸光度を測定する事で細胞生存率を測定することができ、培養実験系における生存細胞数の計数に汎用されている(Liptay et al., 1999; Uludag and Sefton., 1990)。
DMEM/ F12HAMに溶解したLeu-Ile(10 μg/ ml)およびNF-κBの阻害剤sulfasalazine(100 μM)(シグマ アルドリッチ ジャパン)を96穴プレートで培養した培養海馬神経細胞に加えて3日間培養した。10 μlのMTT溶液(シグマ アルドリッチ ジャパン)(10 mg/ ml)を加えて37℃で1時間インキュベーションした後、上清を取り除いた。MTTが還元されてできた紫色のformazan生成物の結晶をpH 4.7の50% dimethylformamide, 20% SDSを200 ul加えて可溶化し、570 nmの波長のマイクロプレートリーダー(Model 450, BIO・RAD)で吸光度を測定した。発色量は生存細胞数に比例するためコントロール細胞の吸光度を100%として生存率を求めた。
MTTアッセイは生存細胞のミトコンドリアによって黄色のMTTが還元されてできた紫色のformazan生成物の結晶を可溶化し、発色量を測定する方法である。ミトコンドリアのMTT還元力は生存細胞数に比例するため、生成物の吸光度を測定する事で細胞生存率を測定することができ、培養実験系における生存細胞数の計数に汎用されている(Liptay et al., 1999; Uludag and Sefton., 1990)。
DMEM/ F12HAMに溶解したLeu-Ile(10 μg/ ml)およびNF-κBの阻害剤sulfasalazine(100 μM)(シグマ アルドリッチ ジャパン)を96穴プレートで培養した培養海馬神経細胞に加えて3日間培養した。10 μlのMTT溶液(シグマ アルドリッチ ジャパン)(10 mg/ ml)を加えて37℃で1時間インキュベーションした後、上清を取り除いた。MTTが還元されてできた紫色のformazan生成物の結晶をpH 4.7の50% dimethylformamide, 20% SDSを200 ul加えて可溶化し、570 nmの波長のマイクロプレートリーダー(Model 450, BIO・RAD)で吸光度を測定した。発色量は生存細胞数に比例するためコントロール細胞の吸光度を100%として生存率を求めた。
2−2−8 GDNF mRNAの定量
GDNF mRNAの定量には、iCycler System(Bio-Rad 社)を利用したリアルタイムRT-PCR法を用いた。培養神経細胞からのmRNAの抽出にはRNeasy(登録商標) Mini Kit(Quiagen社)を用いた。mRNA 1μgからcDNAへの逆転写を行い、その際には、オリゴプライマーとSuperscriptII RT(Life Technologies)を用いた。20μlの反応生成物の中から1μlをPCRに使用した。PCR反応にはPlatinum(登録商標) Quantitative PCR SuperMix-UDG (Invitrogen)を用いた。コントロールとして、リボゾームmRNAの定量(TaqMan Ribosaomal RNA Control Reagents; Applied Biosystem)も同時に行い、サンプル間のばらつきを補正した。GDNFの検出には、フォワードおよびリバースプライマーとして、それぞれ5'-AGCTGCCAGCCCAGAGAATT-3'(bp 288-307)(配列番号3)及び5'-GCACCCCCGATTTTTGC-3'(bp 354-370)(配列番号4)を用い、検出のためのプローブにはdye probe being 5'-CAGAGGGAAAGGTCGCAGAGGCC-3'(bp 309-331)(配列番号5)を用いた。
GDNF mRNAの定量には、iCycler System(Bio-Rad 社)を利用したリアルタイムRT-PCR法を用いた。培養神経細胞からのmRNAの抽出にはRNeasy(登録商標) Mini Kit(Quiagen社)を用いた。mRNA 1μgからcDNAへの逆転写を行い、その際には、オリゴプライマーとSuperscriptII RT(Life Technologies)を用いた。20μlの反応生成物の中から1μlをPCRに使用した。PCR反応にはPlatinum(登録商標) Quantitative PCR SuperMix-UDG (Invitrogen)を用いた。コントロールとして、リボゾームmRNAの定量(TaqMan Ribosaomal RNA Control Reagents; Applied Biosystem)も同時に行い、サンプル間のばらつきを補正した。GDNFの検出には、フォワードおよびリバースプライマーとして、それぞれ5'-AGCTGCCAGCCCAGAGAATT-3'(bp 288-307)(配列番号3)及び5'-GCACCCCCGATTTTTGC-3'(bp 354-370)(配列番号4)を用い、検出のためのプローブにはdye probe being 5'-CAGAGGGAAAGGTCGCAGAGGCC-3'(bp 309-331)(配列番号5)を用いた。
2−2−9 統計解析
結果は全て平均値と標準誤差によって示した。統計解析には一元配置分散分析を行い、有意差が認められた場合、さらScheffeの多重比較検定を行った。なお、危険率が5%以下で差がある場合を有意な差があるとした。
結果は全て平均値と標準誤差によって示した。統計解析には一元配置分散分析を行い、有意差が認められた場合、さらScheffeの多重比較検定を行った。なお、危険率が5%以下で差がある場合を有意な差があるとした。
2−3 結果
2−3−1 Leu-IleによるNF-κBの核内移行
培養海馬初代神経細胞に、Leu-Ile、TNF-αまたはGDNFを作用させ、抗NF-κB抗体で免疫染色を行い、蛍光顕微鏡で細胞数を計測したところ、単位面積0.66mm2中に4500個の細胞があり、そのうち、細胞核が染まっていない細胞はコントロール群で7.9±1.31%、Leu-Ileを作用させた群で3.1±0.83%、TNF-αを作用させた群で2.1 ±0.54%、GDNFを作用させた群で2.4±0.59%であった。コントロール群に比べLeu-Ile、TNF-αおよびGDNFを作用させた細胞では、細胞核が染まっていない細胞数が有意に減少した(図5A)。免疫染色では、コントロールにおいても多くの細胞でNF-κBの核移行が観察されたが、これまで報告されているとおりポジティブコントロールのTNF-αおよびGDNFがNF-κBの核内移行を促進し、Leu-IleもNF-κB核内移行を促進することが示された(Hayashi et al., 2000; Yoo et al., 2000; Zhu et al., 2004)。
また、細胞から核のみを単離し、核内のNF-κBの量をウエスタンブロッティングで検討したところ、Leu-Ileを作用させた細胞で核内に存在するNF-κBの量がコントロールに比べて196±16%に増加した(図5B)。
2−3−1 Leu-IleによるNF-κBの核内移行
培養海馬初代神経細胞に、Leu-Ile、TNF-αまたはGDNFを作用させ、抗NF-κB抗体で免疫染色を行い、蛍光顕微鏡で細胞数を計測したところ、単位面積0.66mm2中に4500個の細胞があり、そのうち、細胞核が染まっていない細胞はコントロール群で7.9±1.31%、Leu-Ileを作用させた群で3.1±0.83%、TNF-αを作用させた群で2.1 ±0.54%、GDNFを作用させた群で2.4±0.59%であった。コントロール群に比べLeu-Ile、TNF-αおよびGDNFを作用させた細胞では、細胞核が染まっていない細胞数が有意に減少した(図5A)。免疫染色では、コントロールにおいても多くの細胞でNF-κBの核移行が観察されたが、これまで報告されているとおりポジティブコントロールのTNF-αおよびGDNFがNF-κBの核内移行を促進し、Leu-IleもNF-κB核内移行を促進することが示された(Hayashi et al., 2000; Yoo et al., 2000; Zhu et al., 2004)。
また、細胞から核のみを単離し、核内のNF-κBの量をウエスタンブロッティングで検討したところ、Leu-Ileを作用させた細胞で核内に存在するNF-κBの量がコントロールに比べて196±16%に増加した(図5B)。
2−3−2 Leu-Ileの細胞死抑制およびGDNF産生誘導におよぼすNF-κB阻害剤の作用
培養神経細胞は培養開始後、経時的に細胞死をおこし、3日目には培養開始時の58.6±2.7 %に細胞数が減少する。MTTアッセイを行った結果、コントロールに比べ、Leu-Ile(10 μg/ml)を加えた群は細胞数が119±1.4%に増加した。NF-κBの阻害剤であるsulfasalazine(100 μM)をLeu-Ileと同時に作用させた細胞群とコントロール群とでは生存細胞数の差はなく、Leu-Ileの効果が有意に抑制されていた(図6A)。また、GDNFのウエスタンブロッティングを行った結果、コントロールに比べ、Leu-Ile(10 μg/ml)を作用させた細胞ではGDNFの発現量が188±13%に増加したが、sulfasalazine(100 μM)とLeu-Ile(10 μg/ml)を一緒に作用させた細胞ではGDNFの発現量は増加しなかった。sulfasalazineのみを作用させた細胞ではGDNFの発現量にコントロールとの差は無かった(図6B)。sulfasalazineがLeu-Ileの神経保護作用およびGDNF産生誘導作用も抑制したことから、Leu-Ileの神経保護作用とGDNF産生誘導作用はNF-κBを介している可能性が示唆された。
培養神経細胞は培養開始後、経時的に細胞死をおこし、3日目には培養開始時の58.6±2.7 %に細胞数が減少する。MTTアッセイを行った結果、コントロールに比べ、Leu-Ile(10 μg/ml)を加えた群は細胞数が119±1.4%に増加した。NF-κBの阻害剤であるsulfasalazine(100 μM)をLeu-Ileと同時に作用させた細胞群とコントロール群とでは生存細胞数の差はなく、Leu-Ileの効果が有意に抑制されていた(図6A)。また、GDNFのウエスタンブロッティングを行った結果、コントロールに比べ、Leu-Ile(10 μg/ml)を作用させた細胞ではGDNFの発現量が188±13%に増加したが、sulfasalazine(100 μM)とLeu-Ile(10 μg/ml)を一緒に作用させた細胞ではGDNFの発現量は増加しなかった。sulfasalazineのみを作用させた細胞ではGDNFの発現量にコントロールとの差は無かった(図6B)。sulfasalazineがLeu-Ileの神経保護作用およびGDNF産生誘導作用も抑制したことから、Leu-Ileの神経保護作用とGDNF産生誘導作用はNF-κBを介している可能性が示唆された。
2−3−3 Leu-IleによるCREBリン酸化作用とGDNF産生誘導作用
培養海馬神経細胞にLeu-Ileを作用させ、ウエスタンブロッティング法を用いてCREBのリン酸化の程度を検討したところ、30分間Leu-Ileを作用させた細胞ではコントロールの細胞に比べて164±14%にCREBのリン酸化が誘導された(図7A)。
CREBアンチセンスオリゴヌクレオチドを培養海馬神経細胞に作用させることによって、CREBの発現量は63±13%に低下する(図7B)。この細胞にLeu-Ileを作用させた後、GDNFのウエスタンブロッティングを行った。コントロールに比べCREBアンチセンスオリゴヌクレオチドのみを作用させた細胞ではGDNFの発現量が72±10%に減少した。また、Leu-Ile(10 μg/ml)のみを作用させた細胞ではコントロールに比べGDNFの発現量が188±13%に増加したが、CREBアンチセンスオリゴヌクレオチドとLeu-Ileを一緒に作用させた細胞では、Leu-Ileのみを作用させた細胞に比べ69±9.2%に減少した。CREBセンスオリゴヌクレオチドを作用させた細胞はコントロールに比べCREBのリン酸化の程度に差は無かった(図7C)。CREBアンチセンスオリゴヌクレオチドを作用させ、CREBの発現を低下させた細胞ではGDNF産生誘導作用が抑制されたことから、Leu-IleのGDNF産生誘導作用にCREBが関与している可能性が示唆された。
Leu-Ile、Pro-Leu又はIle-Pro(10μg/ml)を培養神経細胞に添加した場合の24時間後のGDNF蛋白の発現増加について検討したところ、Leu-IleのみがGDNF蛋白の発現を増加させた(図8A)。さらに、リアルタイムRT-PCR法を用いることによって、Leu-Ileを添加してから12又は18時間後にGDNF mRNAの発現が増加していることを見出した(図8B)。これらの実験結果は、我々の以前の報告(Nitta et al., 2004)と一致している。
培養海馬神経細胞にLeu-Ileを作用させ、ウエスタンブロッティング法を用いてCREBのリン酸化の程度を検討したところ、30分間Leu-Ileを作用させた細胞ではコントロールの細胞に比べて164±14%にCREBのリン酸化が誘導された(図7A)。
CREBアンチセンスオリゴヌクレオチドを培養海馬神経細胞に作用させることによって、CREBの発現量は63±13%に低下する(図7B)。この細胞にLeu-Ileを作用させた後、GDNFのウエスタンブロッティングを行った。コントロールに比べCREBアンチセンスオリゴヌクレオチドのみを作用させた細胞ではGDNFの発現量が72±10%に減少した。また、Leu-Ile(10 μg/ml)のみを作用させた細胞ではコントロールに比べGDNFの発現量が188±13%に増加したが、CREBアンチセンスオリゴヌクレオチドとLeu-Ileを一緒に作用させた細胞では、Leu-Ileのみを作用させた細胞に比べ69±9.2%に減少した。CREBセンスオリゴヌクレオチドを作用させた細胞はコントロールに比べCREBのリン酸化の程度に差は無かった(図7C)。CREBアンチセンスオリゴヌクレオチドを作用させ、CREBの発現を低下させた細胞ではGDNF産生誘導作用が抑制されたことから、Leu-IleのGDNF産生誘導作用にCREBが関与している可能性が示唆された。
Leu-Ile、Pro-Leu又はIle-Pro(10μg/ml)を培養神経細胞に添加した場合の24時間後のGDNF蛋白の発現増加について検討したところ、Leu-IleのみがGDNF蛋白の発現を増加させた(図8A)。さらに、リアルタイムRT-PCR法を用いることによって、Leu-Ileを添加してから12又は18時間後にGDNF mRNAの発現が増加していることを見出した(図8B)。これらの実験結果は、我々の以前の報告(Nitta et al., 2004)と一致している。
2−3−4 Hsp90/Aktを介したLeu-IleのCREBリン酸化作用とGDNF産生誘導作用
CREBの転写因子を活性化している分子を明らかにするためLeu-Ileを作用させた培養海馬神経細胞を用いてAkt、CaMKII、PKC-? およびERKのリン酸化の程度を調べた結果、Aktのリン酸化の程度は154±8.6%に増加したが、CaMKII、PKC-? およびERKについては今回の実験条件下でリン酸化の程度は増加しなかった(図9A)。PI3Kの阻害剤であるLY294002(30 μM)とLeu-Ileを同時に30分間作用させた細胞ではLeu-Ileによって誘導されたAktのリン酸化は抑制されなかったが、Hsp90の複合体形成を阻害するgeldanamycin(10 μM)とLeu-Ileを同時に作用させた細胞ではLeu-Ileによって誘導されたAktのリン酸化を52±7.5%に抑制した(図9B)。また、LY294002とLeu-Ileを同時に30分間作用させた細胞ではLeu-Ileによって誘導されたCREBのリン酸化は抑制されなかったが、geldanamycinとLeu-Ileを同時に30分間作用させた細胞では50±8.2%に抑制された(図9C)。
CREBの転写因子を活性化している分子を明らかにするためLeu-Ileを作用させた培養海馬神経細胞を用いてAkt、CaMKII、PKC-? およびERKのリン酸化の程度を調べた結果、Aktのリン酸化の程度は154±8.6%に増加したが、CaMKII、PKC-? およびERKについては今回の実験条件下でリン酸化の程度は増加しなかった(図9A)。PI3Kの阻害剤であるLY294002(30 μM)とLeu-Ileを同時に30分間作用させた細胞ではLeu-Ileによって誘導されたAktのリン酸化は抑制されなかったが、Hsp90の複合体形成を阻害するgeldanamycin(10 μM)とLeu-Ileを同時に作用させた細胞ではLeu-Ileによって誘導されたAktのリン酸化を52±7.5%に抑制した(図9B)。また、LY294002とLeu-Ileを同時に30分間作用させた細胞ではLeu-Ileによって誘導されたCREBのリン酸化は抑制されなかったが、geldanamycinとLeu-Ileを同時に30分間作用させた細胞では50±8.2%に抑制された(図9C)。
2−4 考察
本研究では、培養海馬初代神経細胞の生存に対するLeu-Ileの効果をMTTアッセイによって計測し、GDNFの発現量に対するLeu-Ileの効果をウエスタンブロッティング法を用いて検討した。生存細胞数を直接計数で検討し、GDNFの発現量を酵素免疫測定法を用いて検討した既報(Nitta et al., 2004)と同様にLeu-Ileは細胞死抑制作用およびGDNF産生誘導作用を有することが確認できた。
GDNFのプロモーター領域に結合配列を有する転写因子NF-κBおよびCREBの活性化がLeu-Ileを作用させた細胞で観察された。また、NF-κB阻害剤のsulfasalazineまたはCREBのアンチセンスオリゴヌクレオチドを作用させた細胞ではLeu-IleによるGDNFの産生誘導効果が観察されなくなったことから、Leu-IleはNF-κBおよびCREBを介してGDNFの産生を誘導していると考えられた。
これまでの研究で、TNF-αやFK960などがNF-κBまたはCREBを介してGDNFを誘導することが報告されているが(Koyama et al., 2004; Maruyama et al., 2004)、GDNFが活性化するシグナル経路上にもPI3K/Aktを介したNF-κBの活性化およびERKを介したCREBの活性化が観察される(Feng et al., 1999; Hayashi et al., 2000)。培養海馬神経細胞はGDNF、GFR-αおよびRETを共に発現しているため、誘導されたGDNFがRETに作用し、PI3K/AktおよびERKを介してNF-κBやCREBを活性化し、さらにGDNFの産生を誘導する正のフィードバック制御が働いている可能性も考えられる(Lenhard et al., 1998; 2002)。
そこで、CREBを活性化することが報告されている(Shaywitz and Greenberg., 1999; Wang et al., 1999)ERK、Akt、CaMKおよびPKCがLeu-Ileによって活性化されるかを調べた。この結果、Leu-Ileを加えてからCREBの活性化が観察される30分以内にはAktのリン酸化のみが観察された。さらに、Leu-Ileによって誘導されるAktのリン酸化がPI3Kを介しているかを調べるため、Leu-IleとPI3Kの阻害剤LY294002を同時に細胞に作用させたところ、Leu-Ileが誘導するAktのリン酸化は抑制されなかった。ヒト神経芽腫であるTGW細胞および初期神経外胚葉癌細胞であるSK-N-MCにおけるGDNF/ RETのシグナルはERKを介してCREBのリン酸化を促進し、PI3Kを介してAktのリン酸化を促進することが報告されている(Hayashi et al., 2000)。本研究ではLeu-Ileを作用させてもERKがリン酸化されないこと、および、PI3Kを介さずAktがリン酸化されていることから、Leu-Ileを短時間作用させた時に観察されるCREBのリン酸化はGDNF/RETのシグナルとは異なる経路を介して活性化されていると考えられた。
Aktのリン酸化を調節している因子にはPI3Kの他にHsp90も報告されており、Hsp90/ Aktのシグナル経路がCREBのリン酸化を調節していることも報告されている(Doong et al., 2003; Du and Montminy., 1998)。Hsp90の複合体形成を阻害するgeldanamycinを用いてAktおよびCREBのリン酸化の程度を調べた結果、Leu-Ileが誘導するAktのリン酸化およびCREBのリン酸化が抑制されたことから、Hsp90/Aktのシグナル経路を介してCREBを活性化し、GDNFを産生誘導していると考えられた。
Hsp90とHsc70は複合体を形成し、タンパク質の受け渡しや、活性の調節を行っている事が知られており(Bagchi et al., 1991; McLaughlin et al., 2002)、Leu-IleがHsc70とHsp90の結合能を変化させている可能性が考えられた。本研究では、Leu-Ileを作用させた時にHsp90とHsc70との相互作用がどの様に変化するのかを示す事はできなかった。しかし、Hsp90とHsc70が複合体を形成し、種々のタンパク質の受け渡しや活性調節を行っているという報告があることから、Leu-Ileがこれらの複合体の性質を変化させ、Hsp90がAktを活性化すると考えられる(図10)。
本研究では、培養海馬初代神経細胞の生存に対するLeu-Ileの効果をMTTアッセイによって計測し、GDNFの発現量に対するLeu-Ileの効果をウエスタンブロッティング法を用いて検討した。生存細胞数を直接計数で検討し、GDNFの発現量を酵素免疫測定法を用いて検討した既報(Nitta et al., 2004)と同様にLeu-Ileは細胞死抑制作用およびGDNF産生誘導作用を有することが確認できた。
GDNFのプロモーター領域に結合配列を有する転写因子NF-κBおよびCREBの活性化がLeu-Ileを作用させた細胞で観察された。また、NF-κB阻害剤のsulfasalazineまたはCREBのアンチセンスオリゴヌクレオチドを作用させた細胞ではLeu-IleによるGDNFの産生誘導効果が観察されなくなったことから、Leu-IleはNF-κBおよびCREBを介してGDNFの産生を誘導していると考えられた。
これまでの研究で、TNF-αやFK960などがNF-κBまたはCREBを介してGDNFを誘導することが報告されているが(Koyama et al., 2004; Maruyama et al., 2004)、GDNFが活性化するシグナル経路上にもPI3K/Aktを介したNF-κBの活性化およびERKを介したCREBの活性化が観察される(Feng et al., 1999; Hayashi et al., 2000)。培養海馬神経細胞はGDNF、GFR-αおよびRETを共に発現しているため、誘導されたGDNFがRETに作用し、PI3K/AktおよびERKを介してNF-κBやCREBを活性化し、さらにGDNFの産生を誘導する正のフィードバック制御が働いている可能性も考えられる(Lenhard et al., 1998; 2002)。
そこで、CREBを活性化することが報告されている(Shaywitz and Greenberg., 1999; Wang et al., 1999)ERK、Akt、CaMKおよびPKCがLeu-Ileによって活性化されるかを調べた。この結果、Leu-Ileを加えてからCREBの活性化が観察される30分以内にはAktのリン酸化のみが観察された。さらに、Leu-Ileによって誘導されるAktのリン酸化がPI3Kを介しているかを調べるため、Leu-IleとPI3Kの阻害剤LY294002を同時に細胞に作用させたところ、Leu-Ileが誘導するAktのリン酸化は抑制されなかった。ヒト神経芽腫であるTGW細胞および初期神経外胚葉癌細胞であるSK-N-MCにおけるGDNF/ RETのシグナルはERKを介してCREBのリン酸化を促進し、PI3Kを介してAktのリン酸化を促進することが報告されている(Hayashi et al., 2000)。本研究ではLeu-Ileを作用させてもERKがリン酸化されないこと、および、PI3Kを介さずAktがリン酸化されていることから、Leu-Ileを短時間作用させた時に観察されるCREBのリン酸化はGDNF/RETのシグナルとは異なる経路を介して活性化されていると考えられた。
Aktのリン酸化を調節している因子にはPI3Kの他にHsp90も報告されており、Hsp90/ Aktのシグナル経路がCREBのリン酸化を調節していることも報告されている(Doong et al., 2003; Du and Montminy., 1998)。Hsp90の複合体形成を阻害するgeldanamycinを用いてAktおよびCREBのリン酸化の程度を調べた結果、Leu-Ileが誘導するAktのリン酸化およびCREBのリン酸化が抑制されたことから、Hsp90/Aktのシグナル経路を介してCREBを活性化し、GDNFを産生誘導していると考えられた。
Hsp90とHsc70は複合体を形成し、タンパク質の受け渡しや、活性の調節を行っている事が知られており(Bagchi et al., 1991; McLaughlin et al., 2002)、Leu-IleがHsc70とHsp90の結合能を変化させている可能性が考えられた。本研究では、Leu-Ileを作用させた時にHsp90とHsc70との相互作用がどの様に変化するのかを示す事はできなかった。しかし、Hsp90とHsc70が複合体を形成し、種々のタンパク質の受け渡しや活性調節を行っているという報告があることから、Leu-Ileがこれらの複合体の性質を変化させ、Hsp90がAktを活性化すると考えられる(図10)。
3.まとめ
以上の結果から以下の知見が得られた。
(1)Leu-Ileは細胞膜透過性である。
(2)FITC標識したLeu-Ileとマウス脳ホモジナイズ液を反応させたところ、70KDの大きさのタンパク質が結合した。
(3)Leu-Ile結合タンパク質の質量分析を行った結果、Hsc70が同定された。
(4)水晶発振子バイオセンサーを用いてHsc70およびHsc70と相同性の高いHsp70とLeu-Ileの結合活性について検討したところ、Hsc70はKd = 1.83×10-8 M、Hsp70はKd = 1.24×10-8 Mの強さでLeu-Ileと特異的に結合した。
(5)分子シミュレーションを用いてHsc70とLeu-Ileの結合部位を予測し、相互ポテンシャルエネルギーを計算した結果、ATPaseドメインには-119.044 kCal、基質結合ドメインには-76.711 kCal、C末端ドメインには-64.337 kCalの強さでLeu-Ileが結合し、Hsc70はATPaseドメインと結合する可能性が高いことが示唆された。
(6)Leu-Ileを作用させた培養海馬神経細胞では、NF-κBが核内に移行し、活性化された。
(7)Leu-Ileを作用させた培養海馬神経細胞では、神経細胞死が抑制され、GDNFの産生が誘導されたが、NF-κB 阻害剤のsulfasalazineとLeu-Ileを同時に作用させた細胞群では、Leu-Ileの効果が抑制された。
(8)Leu-Ileを作用させた培養海馬神経細胞では、コントロール群に比べCREBのリン酸化の程度が増加した。
(9)CREBアンチセンスオリゴヌクレオチドを培養海馬神経細胞に作用させると、Leu-IleのGDNF産生誘導効果が抑制された。
(10)Leu-Ileを作用させた培養海馬神経細胞では、Aktのリン酸化の程度が増加したが、CaMKII、PKC-? およびERKについては変化がなかった。
(11)PI3K阻害剤のLY294002とLeu-Ileを同時に作用させた細胞では、Leu-Ileによって誘導されたAktおよびCREBのリン酸化は抑制されなかった。一方、Hsp90の阻害剤であるgeldanamycinとLeu-Ileを同時に作用させた細胞ではLeu-Ileによって誘導されたAktおよびCREBのリン酸化を抑制した。
以上の結果から以下の知見が得られた。
(1)Leu-Ileは細胞膜透過性である。
(2)FITC標識したLeu-Ileとマウス脳ホモジナイズ液を反応させたところ、70KDの大きさのタンパク質が結合した。
(3)Leu-Ile結合タンパク質の質量分析を行った結果、Hsc70が同定された。
(4)水晶発振子バイオセンサーを用いてHsc70およびHsc70と相同性の高いHsp70とLeu-Ileの結合活性について検討したところ、Hsc70はKd = 1.83×10-8 M、Hsp70はKd = 1.24×10-8 Mの強さでLeu-Ileと特異的に結合した。
(5)分子シミュレーションを用いてHsc70とLeu-Ileの結合部位を予測し、相互ポテンシャルエネルギーを計算した結果、ATPaseドメインには-119.044 kCal、基質結合ドメインには-76.711 kCal、C末端ドメインには-64.337 kCalの強さでLeu-Ileが結合し、Hsc70はATPaseドメインと結合する可能性が高いことが示唆された。
(6)Leu-Ileを作用させた培養海馬神経細胞では、NF-κBが核内に移行し、活性化された。
(7)Leu-Ileを作用させた培養海馬神経細胞では、神経細胞死が抑制され、GDNFの産生が誘導されたが、NF-κB 阻害剤のsulfasalazineとLeu-Ileを同時に作用させた細胞群では、Leu-Ileの効果が抑制された。
(8)Leu-Ileを作用させた培養海馬神経細胞では、コントロール群に比べCREBのリン酸化の程度が増加した。
(9)CREBアンチセンスオリゴヌクレオチドを培養海馬神経細胞に作用させると、Leu-IleのGDNF産生誘導効果が抑制された。
(10)Leu-Ileを作用させた培養海馬神経細胞では、Aktのリン酸化の程度が増加したが、CaMKII、PKC-? およびERKについては変化がなかった。
(11)PI3K阻害剤のLY294002とLeu-Ileを同時に作用させた細胞では、Leu-Ileによって誘導されたAktおよびCREBのリン酸化は抑制されなかった。一方、Hsp90の阻害剤であるgeldanamycinとLeu-Ileを同時に作用させた細胞ではLeu-Ileによって誘導されたAktおよびCREBのリン酸化を抑制した。
以上の知見からLeu-IleがHsc70に結合し、Hsp90/Aktの経路を介してNF-κBおよびCREBを活性化し、GDNFの産生を誘導すると考えられた。Hsp90/Aktのシグナル経路によってLeu-IleがGDNFを産生誘導することが分かり、GDNFの発現調節を担う新たなターゲット遺伝子としてHsc70およびHsp90/Aktを特定することができた。
引用文献
Afshari FS, Chu AK, Sato-Bigbee C: Effect of cyclic AMP on the expression of myelin basic protein species and myelin proteolipid protein in committed oligodendrocytes: differential involvement of the transcription factor CREB. J Neurosci Res, 66: 37-45 (2001)
Airaksinen MS, Titievsky A, Saarma M: GDNF family neurotrophic factor signaling: four masters, one servant? Mol Cell Neurosci, 13: 313-325 (1999)
Baecker PA, Lee WH, Verity AN, Eglen RM, Johnson RM: Characterization of a promoter for the human glial cell line-derived neurotrophic factor gene. Brain Res Mol Brain Res, 69: 209-222 (1999)
Bagchi MK, Tsai SY, Tsai MJ, O'Malley BW: Progesterone enhances target gene transcription by receptor free of heat shock proteins hsp90, hsp56, and hsp70. Mol Cell Biol, 11: 4998-5004 (1991)
Beere HM: "The stress of dying": the role of heat shock proteins in the regulation of apoptosis. J Cell Sci, 117: 2641-2651 (2004)
Besset V, Scott RP, Ibanez CF: Signaling complexes and protein-protein interactions involved in the activation of the Ras and phosphatidylinositol 3-kinase pathways by the c-Ret receptor tyrosine kinase. J Biol Chem, 275: 39159-39166 (2000)
Brodbeck S, Besenbeck B, Englert C: The transcription factor Six2 activates expression of the GDNF gene as well as its own promoter. Mech Dev, 121: 1211-1222 (2004)
Chou CC, Forouhar F, Yeh YH, Shr HL, Wang C, Hsiao CD: Crystal structure of the C-terminal 10-kDa subdomain of Hsc70. J Biol Chem, 278: 30311-30316 (2003)
Coulpier M, Anders J, Ibanez CF: Coordinated activation of autophosphorylation sites in the RET receptor tyrosine kinase: importance of tyrosine 1062 for GDNF mediated neuronal differentiation and survival. J Biol Chem, 277: 1991-1999 (2002)
Doong H, Rizzo K, Fang S, Kulpa V, Weissman AM, Kohn EC: CAIR-1/BAG-3 abrogates heat shock protein-70 chaperone complex-mediated protein degradation: accumulation of poly-ubiquitinated Hsp90 client proteins. J Biol Chem, 278: 28490-28500 (2003)
Du K, Montminy M: CREB is a regulatory target for the protein kinase Akt/PKB. J Biol Chem, 273: 32377-32379 (1998)
Dworniczak B, Mirault ME: Structure and expression of a human gene coding for a 71 kd heat shock 'cognate' protein. Nucleic Acids Res, 15: 5181-5197 (1987)
Encinas M, Tansey MG, Tsui-Pierchala BA, Comella JX, Milbrandt J, Johnson EM Jr: c-Src is required for glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) family ligand-mediated neuronal survival via a phosphatidylinositol-3 kinase (PI3K)- dependent pathway. J Neurosci, 21: 1464-1472 (2001)
Feinstein DL, Galea E, Aquino DA, Li GC, Xu H, Reis DJ: Heat shock protein 70 suppresses astroglial-inducible nitric-oxide synthase expression by decreasing NFkappaB activation. J Biol Chem, 271: 17724-17732 (1996)
Feng L, Wang CY, Jiang H, Oho C, Dugich-Djordjevic M, Mei L, Lu B: Differential signaling of glial cell line-derived neurothrophic factor and brain-derived neurotrophic factor in cultured ventral mesencephalic neurons. Neuroscience, 93: 265-273 (1999)
Flaherty KM, DeLuca-Flaherty C, McKay DB: Three-dimensional structure of the ATPase fragment of a 70K heat-shock cognate protein. Nature, 346: 623-628 (1990)
Gold BG, Densmore V, Shou W, Matzuk MM, Gordon HS: Immunophilin FK506-binding protein 52 (not FK506-binding protein 12) mediates the neurotrophic action of FK506. J Pharmacol Exp Ther, 289: 1202-1210 (1999)
Gold BG: Neuroimmunophilin ligands: evaluation of their therapeutic potential for the treatment of neurological disorders. Expert Opin Investig Drugs, 9: 2331-2342 (2000)
Gold BG, Nutt JG: Neuroimmunophilin ligands in the treatment of Parkinson's disease. Curr Opin Pharmacol, 2: 82-86 (2002)
Gonzalez GA, Yamamoto KK, Fischer WH, Karr D, Menzel P, Biggs W, Vale WW, Montminy MR: A cluster of phosphorylation sites on the cyclic AMP-regulated nuclear factor CREB predicted by its sequence. Nature, 337: 749-752 (1989)
Griffith JP, Kim JL, Kim EE, Sintchak MD, Thomson JA, Fitzgibbon MJ, Fleming MA, Caron PR, Hsiao K, Navia MA: X-ray structure of calcineurin inhibited by the immunophilin-immunosuppressant FKBP12-FK506 complex. Cell, 82: 507-522 (1995)
Grimm L, Holinski-Feder E, Teodoridis J, Scheffer B, Schindelhauer D, Meitinger T, Ueffing M: Analysis of the human GDNF gene reveals an inducible promoter, three exons, a triplet repeat within the 3'-UTR and alternative splice products. Hum Mol Genet, 7: 1873-1886 (1998)
Grimm J, Sachs M, Britsch S, Di Cesare S, Schwarz-Romond T, Alitalo K, Birchmeier W: Novel p62dok family members, dok-4 and dok-5, are substrates of the c-Ret receptor tyrosine kinase and mediate neuronal differentiation. J Cell Biol, 154: 345-354 (2001)
Hayashi H, Ichihara M, Iwashita T, Murakami H, Shimono Y, Kawai K, Kurokawa K, Murakumo Y, Imai T, Funahashi H, Nakao A, Takahashi M: Characterization of intracellular signals via tyrosine 1062 in RET activated by glial cell line-derived neurotrophic factor. Oncogene, 19: 4469-4475 (2000)
Herdegan T, Fischer G, Bold BG: Immunophilin ligands as a novel treatment of neurological disorders. Trends Pharmacol Sci, 21: 3-5 (2000)
Henderson CE, Phillips HS, Pollock RA, Davies AM, Lemeulle C, Armanini M, Simmons LC, Moffet B, Vandlen RA, Rosenthal A: GDNF: a potent survival factor for motoneurons present in peripheral nerve and muscle. Science, 266: 1062-1064 (1994)
Ichihara M, Murakumo Y, Takahashi M: RET and neuroendocrine tumors. Cancer Lett, 204: 197-211 (2004)
Johnson JR, Chu AK, Sato-Bigbee C: Possible role of CREB in the stimulation of oligodendrocyte precursor cell proliferation by neurotrophin-3. J Neurochem, 74: 1409-1417 (2000)
Kobayashi M, Matsuoka I: Enhancement of sympathetic neuron survival by synergistic action of NT3 and GDNF. Neuroreport, 11: 2541-2545 (2000)
Koyama Y, Egawa H, Osakada M, Baba A, Matsuda T: Increase by FK960, a novel cognitive enhancer, in glial cell line-derived neurotrophic factor production in cultured rat astrocytes. Biochem Pharmacol, 68: 275-282 (2004)
Lenhard T, Schober A, Suter-Crazzolara C, Unsicker K: Fibroblast growth factor-2 requires glial-cell-line-derived neurotrophic factor for exerting its neuroprotective actions on glutamate-lesioned hippocampal neurons. Mol Cell Neurosci, 20: 181-197 (2002)
Lenhard T, Suter-Crazzolara C: Developmental expression of GDNF, neurturin and their receptors in rat hippocampus. Neuroreport, 9: 2927-2931 (1998)
Liptay S, Bachem M, Hacker G, Adler G, Debatin KM, Schmid RM: Inhibition of nuclear factor kappa B and induction of apoptosis in T-lymphocytes by sulfasalazine. Br J Pharmacol, 128: 1361-1369 (1999)
Lorenzo MJ, Eng C, Mulligan LM, Stonehouse TJ, Healey CS, Ponder BA, Smith DP: Multiple mRNA isoforms of the human RET proto-oncogene generated by alternate splicing. Oncogene, 10: 1377-1383 (1995)
Marco S, Canudas AM, Canals JM, Gavalda N, Perez-Navarro E, Alberch J: Excitatory amino acids differentially regulate the expression of GDNF, neurturin, and their receptors in the adult rat striatum. Exp Neurol, 174: 243-252 (2002)
Maruyama W, Nitta A, Shamoto-Nagai M, Hirata Y, Akao Y, Yodim M, Furukawa S, Nabeshima T, Naoi M: N-Propargyl-1 (R)-aminoindan, rasagiline, increases glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) in neuroblastoma SH-SY5Y cells through activation of NF-kappaB transcription factor. Neurochem Int, 44: 393-400 (2004)
McLaughlin SH, Smith HW, Jackson SE: Stimulation of the weak ATPase activity of human hsp90 by a client protein. J Mol Biol, 315: 787-798 (2002)
Moore MW, Klein RD, Farinas I, Sauer H, Armanini M, Phillips H, Reichardt LF, Ryan AM, Carver-Moore K, Rosenthal A: Renal and neuronal abnormalities in mice lacking GDNF. Nature, 382: 76-79 (1996)
Motomiya Y, Ando Y, Haraoka K, Sun X, Iwamoto H, Uchimura T, Maruyama I: Circulating level of α2-macroglobulin-β2-microglobulin complex in hemodialysis patients. Kidney International, 64: 2244-2252 (2003)
Morshauser RC, Hu W, Wang H, Pang Y, Flynn GC, Zuiderweg ER: High-resolution solution structure of the 18 kDa substrate-binding domain of the mammalian chaperone protein Hsc70. J Mol Biol, 289: 1387-1403 (1999)
Mulligan LM, Eng C, Healey CS, Clayton D, Kwok JB, Gardner E, Ponder MA, Frilling A, Jackson CE, Lehnert H, Neumann H, Thibodeau SN, Ponder B: Specific mutations of the RET proto-oncogene are related to disease phenotype in MEN 2A and FMTC. Nat Genet, 6: 70-74 (1994)
Myers SM, Eng C, Ponder BA, Mulligan LM: Characterization of RET proto-oncogene 3' splicing variants and polyadenylation sites: a novel C-terminus for RET. Oncogene, 11: 2039-2045 (1995)
Nitta A, Murai R, Maruyama K, Furukawa S: FK506 protects dopaminergic degeneration through induction of GDNF in rodent brain. In: Mizuno Y and Fisher A, editors. Mapping the progress of Alzheimer’s and Parkinson’s disease. New York, NY: Kluwer Academic/Plenum Publishers, 463-467 (2002)
Nitta A, Nishioka H, Fukumitsu H, Furukawa Y, Sugiura H, Shen L, Furukawa S (2004) Hydrophobic dipeptide Leu-Ile protects against neuronal death by inducing brain-derived neurotrophic factor and glial cell line-derived neurotrophic factor synthesis. J Neurosci Res 78:250-258
Ogawa N, Tanaka K, Kondo Y, Asanuma M, Mizukawa K, Mori A: The preventive effect of cyclosporin A, an immunosuppressant, on the late onset reduction of muscarinic acetylcholine receptors in gerbil hippocampus after transient forebrain ischemia. Neurosci Lett, 152: 173-176 (1993)
岡畑 恵雄、古澤 宏幸: 水晶発振子マイクロバランス法 蛋白質核酸酵素49: 1754-1758 (2004)
Pappin DJ, Hojrup P, Bleasby AJ: Rapid identification of proteins by peptide-mass fingerprinting. Curr Biol, 3: 327-332 (1993)
Perkins DN, Pappin DJ, Creasy DM, Cottrell JS: Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data. Electrophoresis, 20: 3551-3567 (1999)
Pichel JG, Shen L, Sheng HZ, Granholm AC, Drago J, Grinberg A, Lee EJ, Huang SP, Saarma M, Hoffer BJ, Sariola H, Westphal H: Defects in enteric innervation and kidney development in mice lacking GDNF. Nature, 382: 73-76 (1996)
Romeo G, Ronchetto P, Luo Y, Barone V, Seri M, Ceccherini I, Pasini B, Bocciardi R, Lerone M, Kaariainen H, Martucciello G: Point mutations affecting the tyrosine kinase domain of the RET proto-oncogene in Hirschsprung's disease. Nature, 367: 377-378 (1994)
Sanchez MP, Silos-Santiago I, Frisen J, He B, Lira SA, Barbacid M: Renal agenesis and the absence of enteric neurons in mice lacking GDNF. Nature, 382: 70-73 (1996)
Santoro M, Rosati R, Grieco M, Berlingieri MT, D'Amato GL, de Franciscis V, Fusco A: The ret proto-oncogene is consistently expressed in human pheochromocytomas and thyroid medullary carcinomas. Oncogene, 5: 1595-1598 (1990)
Satake K, Matsuyama Y, Kamiya M, Kawakami H, Iwata H, Adachi K, Kiuchi K: Up-regulation of glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) following traumatic spinal cord injury. Neuroreport, 11: 3877-3881 (2000)
Sato-Bigbee C, DeVries GH: Treatment of oligodendrocytes with antisense oligodeoxynucleotide directed against CREB mRNA: effect on the cyclic AMP-dependent induction of myelin basic protein expression. J Neurosci Res, 46: 98-107 (1996)
Sauerbrey GZ: Use of quartz crystal vibrator for weighting thin films on a micro- balance. J Physics, 155: 206?222 (1959)
Schlessinger J: Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell, 103: 211-225 (2000)
Schreiber SL: Chemistry and biology of the immunophilins and their immunosuppressive ligands. Science, 251: 283-287 (1991)
Sharkey J, Butcher SP: Immunophilins mediate the neuroprotective effects of FK506 in focal cerebral ischaemia. Nature, 371: 336-339 (1994)
Shaywitz AJ, Greenberg ME: CREB: a stimulus-induced transcription factor activated by a diverse array of extracellular signals. Annu Rev Biochem, 68: 821-861 (1999)
Shiga Y, Onodera H, Matsuo Y, Kogure K: Cyclosporin A protects against ischemia-reperfusion injury in the brain. Brain Res, 595: 145-148 (1992)
Snyder SH, Sabatini DM, Lai MM, Steiner JP, Hamilton GS, Suzdak PD: Neural actions of immunophilin ligands. Trends Pharmacol Sci, 19: 21-26 (1998)
Takahashi M: The GDNF/RET signaling pathway and human diseases. Cytokine Growth Factor Rev, 12: 361-373 (2001)
Takahashi M, Buma Y, Hiai H: Isolation of ret proto-oncogene cDNA with an amino- terminal signal sequence. Oncogene, 4: 805-806 (1989)
Takahashi M, Ritz J, Cooper GM: Activation of a novel human transforming gene, ret, by DNA rearrangement. Cell, 42: 581-588 (1985)
Tanaka M, Ito S, Kiuchi K: Novel alternative promoters of mouse glial cell line-derived neurotrophic factor gene. Biochim Biophys Acta, 1494: 63-74 (2000)
Tanaka M, Ito S, Kiuchi K: The 5'-untranslated region of the mouse glial cell line-derived neurotrophic factor gene regulates expression at both the transcriptional and translational levels. Brain Res Mol Brain Res, 91: 81-95 (2001)
Tanaka M, Ito S, Matsushita N, Mori N, Kiuchi K: Promoter analysis and characteristics of the 5'-untranslated region of the mouse glial cell line-derived neurotrophic factor gene. Brain Res Mol Brain Res, 85: 91-102 (2000)
田中 健一、小川 紀雄: イムノフィリンリガンド−免疫抑制薬から神経保護薬へ− 日本神経精神薬理学雑誌 24: 71-74 (2004)
Taylor S, Srinivasan B, Wordinger RJ, Roque RS: Glutamate stimulates neurotrophin expression in cultured Muller cells. Brain Res Mol Brain Res, 111: 189-197 (2003)
Uludag H, Sefton MV: Colorimetric assay for cellular activity in microcapsules. Biomaterials, 11: 708-712 (1990)
Verity AN, Wyatt TL, Lee W, Hajos B, Baecker PA, Eglen RM, Johnson RM: Differential regulation of glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) expression in human neuroblastoma and glioblastoma cell lines. J Neurosci Res, 55: 187-197 (1999)
Wang JM, Chao JR, Chen W, Kuo ML, Yen JJ, Yang-Yen HF: The antiapoptotic gene mcl-1 is up-regulated by the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt signaling pathway through a transcription factor complex containing CREB. Mol Cell Biol, 197: 6195-206 (1999)
Woodbury D, Schaar DG, Ramakrishnan L, Black IB: Novel structure of the human GDNF gene. Brain Res, 803: 95-104 (1998)
Yoo CG, Lee S, Lee CT, Kim YW, Han SK, Shim YS: Anti-inflammatory effect of heat shock protein induction is related to stabilization of I kappa B alpha through preventing I kappa B kinase activation in respiratory epithelial cells. J Immunol, 164: 5416-5423 (2000)
Young JC, Barral JM, Ulrich Hartl F: More than folding: localized functions of cytosolic chaperones. Trends Biochem Sci, 28: 541-547 (2003)
Zhang H, Burrows F: Targeting multiple signal transduction pathways through inhibition of Hsp90. J Mol Med, 82: 488-499 (2004)
Zhu Y, Culmsee C, Klumpp S, Krieglstein J: Neuroprotection by transforming growth factor-beta1 involves activation of nuclear factor-kappaB through phosphatidylinositol- 3-OH kinase/Akt and mitogen-activated protein kinase-extracellular-signal regulated kinase1,2 signaling pathways. Neuroscience, 123: 897-906 (2004).
Afshari FS, Chu AK, Sato-Bigbee C: Effect of cyclic AMP on the expression of myelin basic protein species and myelin proteolipid protein in committed oligodendrocytes: differential involvement of the transcription factor CREB. J Neurosci Res, 66: 37-45 (2001)
Airaksinen MS, Titievsky A, Saarma M: GDNF family neurotrophic factor signaling: four masters, one servant? Mol Cell Neurosci, 13: 313-325 (1999)
Baecker PA, Lee WH, Verity AN, Eglen RM, Johnson RM: Characterization of a promoter for the human glial cell line-derived neurotrophic factor gene. Brain Res Mol Brain Res, 69: 209-222 (1999)
Bagchi MK, Tsai SY, Tsai MJ, O'Malley BW: Progesterone enhances target gene transcription by receptor free of heat shock proteins hsp90, hsp56, and hsp70. Mol Cell Biol, 11: 4998-5004 (1991)
Beere HM: "The stress of dying": the role of heat shock proteins in the regulation of apoptosis. J Cell Sci, 117: 2641-2651 (2004)
Besset V, Scott RP, Ibanez CF: Signaling complexes and protein-protein interactions involved in the activation of the Ras and phosphatidylinositol 3-kinase pathways by the c-Ret receptor tyrosine kinase. J Biol Chem, 275: 39159-39166 (2000)
Brodbeck S, Besenbeck B, Englert C: The transcription factor Six2 activates expression of the GDNF gene as well as its own promoter. Mech Dev, 121: 1211-1222 (2004)
Chou CC, Forouhar F, Yeh YH, Shr HL, Wang C, Hsiao CD: Crystal structure of the C-terminal 10-kDa subdomain of Hsc70. J Biol Chem, 278: 30311-30316 (2003)
Coulpier M, Anders J, Ibanez CF: Coordinated activation of autophosphorylation sites in the RET receptor tyrosine kinase: importance of tyrosine 1062 for GDNF mediated neuronal differentiation and survival. J Biol Chem, 277: 1991-1999 (2002)
Doong H, Rizzo K, Fang S, Kulpa V, Weissman AM, Kohn EC: CAIR-1/BAG-3 abrogates heat shock protein-70 chaperone complex-mediated protein degradation: accumulation of poly-ubiquitinated Hsp90 client proteins. J Biol Chem, 278: 28490-28500 (2003)
Du K, Montminy M: CREB is a regulatory target for the protein kinase Akt/PKB. J Biol Chem, 273: 32377-32379 (1998)
Dworniczak B, Mirault ME: Structure and expression of a human gene coding for a 71 kd heat shock 'cognate' protein. Nucleic Acids Res, 15: 5181-5197 (1987)
Encinas M, Tansey MG, Tsui-Pierchala BA, Comella JX, Milbrandt J, Johnson EM Jr: c-Src is required for glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) family ligand-mediated neuronal survival via a phosphatidylinositol-3 kinase (PI3K)- dependent pathway. J Neurosci, 21: 1464-1472 (2001)
Feinstein DL, Galea E, Aquino DA, Li GC, Xu H, Reis DJ: Heat shock protein 70 suppresses astroglial-inducible nitric-oxide synthase expression by decreasing NFkappaB activation. J Biol Chem, 271: 17724-17732 (1996)
Feng L, Wang CY, Jiang H, Oho C, Dugich-Djordjevic M, Mei L, Lu B: Differential signaling of glial cell line-derived neurothrophic factor and brain-derived neurotrophic factor in cultured ventral mesencephalic neurons. Neuroscience, 93: 265-273 (1999)
Flaherty KM, DeLuca-Flaherty C, McKay DB: Three-dimensional structure of the ATPase fragment of a 70K heat-shock cognate protein. Nature, 346: 623-628 (1990)
Gold BG, Densmore V, Shou W, Matzuk MM, Gordon HS: Immunophilin FK506-binding protein 52 (not FK506-binding protein 12) mediates the neurotrophic action of FK506. J Pharmacol Exp Ther, 289: 1202-1210 (1999)
Gold BG: Neuroimmunophilin ligands: evaluation of their therapeutic potential for the treatment of neurological disorders. Expert Opin Investig Drugs, 9: 2331-2342 (2000)
Gold BG, Nutt JG: Neuroimmunophilin ligands in the treatment of Parkinson's disease. Curr Opin Pharmacol, 2: 82-86 (2002)
Gonzalez GA, Yamamoto KK, Fischer WH, Karr D, Menzel P, Biggs W, Vale WW, Montminy MR: A cluster of phosphorylation sites on the cyclic AMP-regulated nuclear factor CREB predicted by its sequence. Nature, 337: 749-752 (1989)
Griffith JP, Kim JL, Kim EE, Sintchak MD, Thomson JA, Fitzgibbon MJ, Fleming MA, Caron PR, Hsiao K, Navia MA: X-ray structure of calcineurin inhibited by the immunophilin-immunosuppressant FKBP12-FK506 complex. Cell, 82: 507-522 (1995)
Grimm L, Holinski-Feder E, Teodoridis J, Scheffer B, Schindelhauer D, Meitinger T, Ueffing M: Analysis of the human GDNF gene reveals an inducible promoter, three exons, a triplet repeat within the 3'-UTR and alternative splice products. Hum Mol Genet, 7: 1873-1886 (1998)
Grimm J, Sachs M, Britsch S, Di Cesare S, Schwarz-Romond T, Alitalo K, Birchmeier W: Novel p62dok family members, dok-4 and dok-5, are substrates of the c-Ret receptor tyrosine kinase and mediate neuronal differentiation. J Cell Biol, 154: 345-354 (2001)
Hayashi H, Ichihara M, Iwashita T, Murakami H, Shimono Y, Kawai K, Kurokawa K, Murakumo Y, Imai T, Funahashi H, Nakao A, Takahashi M: Characterization of intracellular signals via tyrosine 1062 in RET activated by glial cell line-derived neurotrophic factor. Oncogene, 19: 4469-4475 (2000)
Herdegan T, Fischer G, Bold BG: Immunophilin ligands as a novel treatment of neurological disorders. Trends Pharmacol Sci, 21: 3-5 (2000)
Henderson CE, Phillips HS, Pollock RA, Davies AM, Lemeulle C, Armanini M, Simmons LC, Moffet B, Vandlen RA, Rosenthal A: GDNF: a potent survival factor for motoneurons present in peripheral nerve and muscle. Science, 266: 1062-1064 (1994)
Ichihara M, Murakumo Y, Takahashi M: RET and neuroendocrine tumors. Cancer Lett, 204: 197-211 (2004)
Johnson JR, Chu AK, Sato-Bigbee C: Possible role of CREB in the stimulation of oligodendrocyte precursor cell proliferation by neurotrophin-3. J Neurochem, 74: 1409-1417 (2000)
Kobayashi M, Matsuoka I: Enhancement of sympathetic neuron survival by synergistic action of NT3 and GDNF. Neuroreport, 11: 2541-2545 (2000)
Koyama Y, Egawa H, Osakada M, Baba A, Matsuda T: Increase by FK960, a novel cognitive enhancer, in glial cell line-derived neurotrophic factor production in cultured rat astrocytes. Biochem Pharmacol, 68: 275-282 (2004)
Lenhard T, Schober A, Suter-Crazzolara C, Unsicker K: Fibroblast growth factor-2 requires glial-cell-line-derived neurotrophic factor for exerting its neuroprotective actions on glutamate-lesioned hippocampal neurons. Mol Cell Neurosci, 20: 181-197 (2002)
Lenhard T, Suter-Crazzolara C: Developmental expression of GDNF, neurturin and their receptors in rat hippocampus. Neuroreport, 9: 2927-2931 (1998)
Liptay S, Bachem M, Hacker G, Adler G, Debatin KM, Schmid RM: Inhibition of nuclear factor kappa B and induction of apoptosis in T-lymphocytes by sulfasalazine. Br J Pharmacol, 128: 1361-1369 (1999)
Lorenzo MJ, Eng C, Mulligan LM, Stonehouse TJ, Healey CS, Ponder BA, Smith DP: Multiple mRNA isoforms of the human RET proto-oncogene generated by alternate splicing. Oncogene, 10: 1377-1383 (1995)
Marco S, Canudas AM, Canals JM, Gavalda N, Perez-Navarro E, Alberch J: Excitatory amino acids differentially regulate the expression of GDNF, neurturin, and their receptors in the adult rat striatum. Exp Neurol, 174: 243-252 (2002)
Maruyama W, Nitta A, Shamoto-Nagai M, Hirata Y, Akao Y, Yodim M, Furukawa S, Nabeshima T, Naoi M: N-Propargyl-1 (R)-aminoindan, rasagiline, increases glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) in neuroblastoma SH-SY5Y cells through activation of NF-kappaB transcription factor. Neurochem Int, 44: 393-400 (2004)
McLaughlin SH, Smith HW, Jackson SE: Stimulation of the weak ATPase activity of human hsp90 by a client protein. J Mol Biol, 315: 787-798 (2002)
Moore MW, Klein RD, Farinas I, Sauer H, Armanini M, Phillips H, Reichardt LF, Ryan AM, Carver-Moore K, Rosenthal A: Renal and neuronal abnormalities in mice lacking GDNF. Nature, 382: 76-79 (1996)
Motomiya Y, Ando Y, Haraoka K, Sun X, Iwamoto H, Uchimura T, Maruyama I: Circulating level of α2-macroglobulin-β2-microglobulin complex in hemodialysis patients. Kidney International, 64: 2244-2252 (2003)
Morshauser RC, Hu W, Wang H, Pang Y, Flynn GC, Zuiderweg ER: High-resolution solution structure of the 18 kDa substrate-binding domain of the mammalian chaperone protein Hsc70. J Mol Biol, 289: 1387-1403 (1999)
Mulligan LM, Eng C, Healey CS, Clayton D, Kwok JB, Gardner E, Ponder MA, Frilling A, Jackson CE, Lehnert H, Neumann H, Thibodeau SN, Ponder B: Specific mutations of the RET proto-oncogene are related to disease phenotype in MEN 2A and FMTC. Nat Genet, 6: 70-74 (1994)
Myers SM, Eng C, Ponder BA, Mulligan LM: Characterization of RET proto-oncogene 3' splicing variants and polyadenylation sites: a novel C-terminus for RET. Oncogene, 11: 2039-2045 (1995)
Nitta A, Murai R, Maruyama K, Furukawa S: FK506 protects dopaminergic degeneration through induction of GDNF in rodent brain. In: Mizuno Y and Fisher A, editors. Mapping the progress of Alzheimer’s and Parkinson’s disease. New York, NY: Kluwer Academic/Plenum Publishers, 463-467 (2002)
Nitta A, Nishioka H, Fukumitsu H, Furukawa Y, Sugiura H, Shen L, Furukawa S (2004) Hydrophobic dipeptide Leu-Ile protects against neuronal death by inducing brain-derived neurotrophic factor and glial cell line-derived neurotrophic factor synthesis. J Neurosci Res 78:250-258
Ogawa N, Tanaka K, Kondo Y, Asanuma M, Mizukawa K, Mori A: The preventive effect of cyclosporin A, an immunosuppressant, on the late onset reduction of muscarinic acetylcholine receptors in gerbil hippocampus after transient forebrain ischemia. Neurosci Lett, 152: 173-176 (1993)
岡畑 恵雄、古澤 宏幸: 水晶発振子マイクロバランス法 蛋白質核酸酵素49: 1754-1758 (2004)
Pappin DJ, Hojrup P, Bleasby AJ: Rapid identification of proteins by peptide-mass fingerprinting. Curr Biol, 3: 327-332 (1993)
Perkins DN, Pappin DJ, Creasy DM, Cottrell JS: Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data. Electrophoresis, 20: 3551-3567 (1999)
Pichel JG, Shen L, Sheng HZ, Granholm AC, Drago J, Grinberg A, Lee EJ, Huang SP, Saarma M, Hoffer BJ, Sariola H, Westphal H: Defects in enteric innervation and kidney development in mice lacking GDNF. Nature, 382: 73-76 (1996)
Romeo G, Ronchetto P, Luo Y, Barone V, Seri M, Ceccherini I, Pasini B, Bocciardi R, Lerone M, Kaariainen H, Martucciello G: Point mutations affecting the tyrosine kinase domain of the RET proto-oncogene in Hirschsprung's disease. Nature, 367: 377-378 (1994)
Sanchez MP, Silos-Santiago I, Frisen J, He B, Lira SA, Barbacid M: Renal agenesis and the absence of enteric neurons in mice lacking GDNF. Nature, 382: 70-73 (1996)
Santoro M, Rosati R, Grieco M, Berlingieri MT, D'Amato GL, de Franciscis V, Fusco A: The ret proto-oncogene is consistently expressed in human pheochromocytomas and thyroid medullary carcinomas. Oncogene, 5: 1595-1598 (1990)
Satake K, Matsuyama Y, Kamiya M, Kawakami H, Iwata H, Adachi K, Kiuchi K: Up-regulation of glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) following traumatic spinal cord injury. Neuroreport, 11: 3877-3881 (2000)
Sato-Bigbee C, DeVries GH: Treatment of oligodendrocytes with antisense oligodeoxynucleotide directed against CREB mRNA: effect on the cyclic AMP-dependent induction of myelin basic protein expression. J Neurosci Res, 46: 98-107 (1996)
Sauerbrey GZ: Use of quartz crystal vibrator for weighting thin films on a micro- balance. J Physics, 155: 206?222 (1959)
Schlessinger J: Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell, 103: 211-225 (2000)
Schreiber SL: Chemistry and biology of the immunophilins and their immunosuppressive ligands. Science, 251: 283-287 (1991)
Sharkey J, Butcher SP: Immunophilins mediate the neuroprotective effects of FK506 in focal cerebral ischaemia. Nature, 371: 336-339 (1994)
Shaywitz AJ, Greenberg ME: CREB: a stimulus-induced transcription factor activated by a diverse array of extracellular signals. Annu Rev Biochem, 68: 821-861 (1999)
Shiga Y, Onodera H, Matsuo Y, Kogure K: Cyclosporin A protects against ischemia-reperfusion injury in the brain. Brain Res, 595: 145-148 (1992)
Snyder SH, Sabatini DM, Lai MM, Steiner JP, Hamilton GS, Suzdak PD: Neural actions of immunophilin ligands. Trends Pharmacol Sci, 19: 21-26 (1998)
Takahashi M: The GDNF/RET signaling pathway and human diseases. Cytokine Growth Factor Rev, 12: 361-373 (2001)
Takahashi M, Buma Y, Hiai H: Isolation of ret proto-oncogene cDNA with an amino- terminal signal sequence. Oncogene, 4: 805-806 (1989)
Takahashi M, Ritz J, Cooper GM: Activation of a novel human transforming gene, ret, by DNA rearrangement. Cell, 42: 581-588 (1985)
Tanaka M, Ito S, Kiuchi K: Novel alternative promoters of mouse glial cell line-derived neurotrophic factor gene. Biochim Biophys Acta, 1494: 63-74 (2000)
Tanaka M, Ito S, Kiuchi K: The 5'-untranslated region of the mouse glial cell line-derived neurotrophic factor gene regulates expression at both the transcriptional and translational levels. Brain Res Mol Brain Res, 91: 81-95 (2001)
Tanaka M, Ito S, Matsushita N, Mori N, Kiuchi K: Promoter analysis and characteristics of the 5'-untranslated region of the mouse glial cell line-derived neurotrophic factor gene. Brain Res Mol Brain Res, 85: 91-102 (2000)
田中 健一、小川 紀雄: イムノフィリンリガンド−免疫抑制薬から神経保護薬へ− 日本神経精神薬理学雑誌 24: 71-74 (2004)
Taylor S, Srinivasan B, Wordinger RJ, Roque RS: Glutamate stimulates neurotrophin expression in cultured Muller cells. Brain Res Mol Brain Res, 111: 189-197 (2003)
Uludag H, Sefton MV: Colorimetric assay for cellular activity in microcapsules. Biomaterials, 11: 708-712 (1990)
Verity AN, Wyatt TL, Lee W, Hajos B, Baecker PA, Eglen RM, Johnson RM: Differential regulation of glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) expression in human neuroblastoma and glioblastoma cell lines. J Neurosci Res, 55: 187-197 (1999)
Wang JM, Chao JR, Chen W, Kuo ML, Yen JJ, Yang-Yen HF: The antiapoptotic gene mcl-1 is up-regulated by the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt signaling pathway through a transcription factor complex containing CREB. Mol Cell Biol, 197: 6195-206 (1999)
Woodbury D, Schaar DG, Ramakrishnan L, Black IB: Novel structure of the human GDNF gene. Brain Res, 803: 95-104 (1998)
Yoo CG, Lee S, Lee CT, Kim YW, Han SK, Shim YS: Anti-inflammatory effect of heat shock protein induction is related to stabilization of I kappa B alpha through preventing I kappa B kinase activation in respiratory epithelial cells. J Immunol, 164: 5416-5423 (2000)
Young JC, Barral JM, Ulrich Hartl F: More than folding: localized functions of cytosolic chaperones. Trends Biochem Sci, 28: 541-547 (2003)
Zhang H, Burrows F: Targeting multiple signal transduction pathways through inhibition of Hsp90. J Mol Med, 82: 488-499 (2004)
Zhu Y, Culmsee C, Klumpp S, Krieglstein J: Neuroprotection by transforming growth factor-beta1 involves activation of nuclear factor-kappaB through phosphatidylinositol- 3-OH kinase/Akt and mitogen-activated protein kinase-extracellular-signal regulated kinase1,2 signaling pathways. Neuroscience, 123: 897-906 (2004).
本発明のAkt活性化剤は、Aktの調節によって予防効果又は治療効果が得られる疾患に対する薬剤又は食品として、或いは当該疾患の発症機構や進展機構などを研究するための試薬として利用され得る。本発明の有効成分は基本構造がジペプチドという非常に単純なものであるため、その調製が容易であるという利点を有する。
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
Claims (6)
- (a)〜(c)のいずれかの化合物を有効成分として含有するAkt活性化剤:
(a)Leu及びIleからなるペプチド;
(b)Leu及びIleからなるペプチドの修飾体;
(c)薬学的に許容可能な、(a)又は(b)の塩。 - 前記ペプチドがLeu−Ileである、請求項1に記載のAkt活性化剤。
- Hsp90の結合によってAktが活性化される経路を介してAktを活性化することを特徴とする、請求項1又は2に記載のAkt活性化剤。
- パーキンソン病、脊髄損傷、アルツハイマー病、水頭症、脳損傷、脳梗塞、痴呆症、リューマチ症、又は統合失調症の治療又は予防に使用されることを特徴とする、請求項1〜3のいずれかに記載のAkt活性化剤。
- 請求項1〜3のいずれかに記載のAkt活性化剤を含有する食品。
- 以下のステップを含む、パーキンソン病、脊髄損傷、アルツハイマー病、水頭症、脳損傷、脳梗塞、痴呆症、リューマチ症、又は統合失調症の予防又は治療方法:
(A)請求項1〜3のいずれかに記載のAkt活性化剤を生体に投与するステップ。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2005051829 | 2005-02-25 | ||
JP2005051829 | 2005-02-25 | ||
PCT/JP2006/301326 WO2006090555A1 (ja) | 2005-02-25 | 2006-01-27 | Akt活性化剤 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2006090555A1 true JPWO2006090555A1 (ja) | 2008-07-24 |
Family
ID=36927200
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2007504648A Pending JPWO2006090555A1 (ja) | 2005-02-25 | 2006-01-27 | Akt活性化剤 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPWO2006090555A1 (ja) |
WO (1) | WO2006090555A1 (ja) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20100087383A1 (en) * | 2006-10-23 | 2010-04-08 | National University Corporation Nagoya University | Intracerebral oxidation inhibitor and use thereof |
WO2009093671A1 (ja) * | 2008-01-24 | 2009-07-30 | Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. | 抗うつ・抗不安剤 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH02138952A (ja) * | 1988-08-26 | 1990-05-28 | Morishita Pharmaceut Co Ltd | L−ロイシンのジペプチドを含有する栄養輸液組成物 |
-
2006
- 2006-01-27 WO PCT/JP2006/301326 patent/WO2006090555A1/ja not_active Application Discontinuation
- 2006-01-27 JP JP2007504648A patent/JPWO2006090555A1/ja active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2006090555A1 (ja) | 2006-08-31 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Elkouzi et al. | Emerging therapies in Parkinson disease—repurposed drugs and new approaches | |
Jiang et al. | Casein kinase 1α: biological mechanisms and theranostic potential | |
Bota et al. | Mitochondrial Lon protease in human disease and aging: Including an etiologic classification of Lon-related diseases and disorders | |
Bergold | Treatment of traumatic brain injury with anti-inflammatory drugs | |
Roy et al. | HMG-CoA reductase inhibitors bind to PPARα to upregulate neurotrophin expression in the brain and improve memory in mice | |
Zhou et al. | CaMKKβ-dependent activation of AMP-activated protein kinase is critical to suppressive effects of hydrogen sulfide on neuroinflammation | |
Wilkaniec et al. | Inhibition of cyclin-dependent kinase 5 affects early neuroinflammatory signalling in murine model of amyloid beta toxicity | |
Li et al. | Neuropeptide VGF C-terminal peptide TLQP-62 alleviates lipopolysaccharide-induced memory deficits and anxiety-like and depression-like behaviors in mice: the role of BDNF/TrkB signaling | |
US8148330B2 (en) | Modulation of synaptic maintenance | |
US9480658B2 (en) | Modulation of synaptic maintenance | |
Sanchez et al. | eIF3f: a central regulator of the antagonism atrophy/hypertrophy in skeletal muscle | |
Yousuf et al. | Pharmacological manipulation of translation as a therapeutic target for chronic pain | |
Li et al. | Bisphenol A disrupts glucose transport and neurophysiological role of IR/IRS/AKT/GSK3β axis in the brain of male mice | |
Di Cesare Mannelli et al. | Antidepressant-like effect of artemin in mice: a mechanism for acetyl-L-carnitine activity on depression | |
Ma et al. | Rosiglitazone improves learning and memory ability in rats with type 2 diabetes through the insulin signaling pathway | |
Suryawan et al. | Amino acid-and insulin-induced activation of mTORC1 in neonatal piglet skeletal muscle involves sestrin2-GATOR2, Rag A/C-mTOR, and RHEB-mTOR complex formation | |
Sato et al. | Donepezil prevents RANK-induced bone loss via inhibition of osteoclast differentiation by downregulating acetylcholinesterase | |
Dukay et al. | Neuroinflammatory processes are augmented in mice overexpressing human heat-shock protein B1 following ethanol-induced brain injury | |
Verhulst et al. | Role of the AMP-activated protein kinase (AMPK) signaling pathway in the orexigenic effects of endogenous ghrelin | |
Singh et al. | ALCAR promote adult hippocampal neurogenesis by regulating cell-survival and cell death-related signals in rat model of Parkinson's disease like-phenotypes | |
Li et al. | Orexin 2 receptor in the nucleus accumbens is critical for the modulation of acute stress-induced anxiety | |
Shi et al. | Neuron-restrictive silencer factor in periaqueductal gray contributes to remifentanil-induced postoperative hyperalgesia via repression of the mu-opioid receptor | |
Liu et al. | Deubiquitinase USP18 regulates reactive astrogliosis by stabilizing SOX9 | |
Barger et al. | Molecular mechanisms of cytokine-induced neuroprotection: NFκB and neuroplasticity | |
Liu et al. | The molecular mechanism of Scutellaria baicalensis Georgi stems and leaves flavonoids in promoting neurogenesis and improving memory impairment by the PI3K-AKT-CREB signaling pathway in rats |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20081222 |
|
RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20090123 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110802 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20111125 |