CN109541066A - 一种中江芍药hplc指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种中江芍药HPLC指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱，步骤如下；a、试剂及仪器的选取；b、中江芍药样品溶液的制备；c、对照品溶液的制备；d、分别精密吸取样品溶液进行HPLC分析；e、将步骤d中获得的中江芍药指纹图谱数据导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，选择不同批次中江芍药的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰，并且计算共有峰的相对保留时间以及相对峰面积。该中江芍药HPLC指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱所提供的中江芍药HPLC指纹图谱的检测方法具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好等优点，能全面，客观地表征中江芍药的质量。

Description

一种中江芍药HPLC指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱

技术领域

本发明涉及于中江芍药加工技术领域，具体为一种中江芍药HPLC指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱。

背景技术

中药指纹图谱是指某些中药材或中药制剂经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示其化学特征的色谱图或光谱图。中药指纹图谱是一种综合的，可量化的鉴定手段，它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药材以及中药制剂半成品质量的真实性、优良性和稳定性，“整体性”和“模糊性”为其显著特点。目前，FDA、WHO、英国草药典、印度草药典、德国药用植物学会、加拿大药用植物学会等均接受指纹图谱的质控方法，中国药品监督管理局也颁布了《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》。在现阶段中药有效成分绝大多数没有明确的情况下，中药指纹图谱对于有效控制和评价中药材或中成药的质量具有重要的意义。中药指纹图谱技术已经成为牵动行业全面进步、带动中药现代化、推动中药走向世界的关键技术之一。

芍药(PaeonialactifloraPall.)为五桠果目芍药科(Paeoniaceae)芍药属(Paeonia L.)多年生宿根草本植物，为中药白芍基源和赤芍的基源之一，其主要活性成分为单贴苷类化合物(芍药苷、芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷、羟基芍药苷等)，此外还含有多酚、没食子鞣质类等活性成分，具有显著的抗氧化、解痉、镇痛、抗炎、保肝、调节免疫等作用。四川中江、安徽亳州、山东菏泽和浙江磐安为药用芍药四大道地产区，中江作为道地产区之一，已有两百多年的种植历史，中江芍药为不可育品种，有红花和白花两种，品质极佳，有效成分含量高，享誉中外。《中华人民共和国药典》(2015年版，一部)规定用白芍和赤芍中含芍药苷的含量(不少于1.6％和1.8％)来控制白芍和赤芍的质量，但此单指标成分的质量控制不能全面的评价药材的优劣。中药指纹图谱是控制天然药物质量的有效方式之一，指纹图谱全面整体地反映了药材的内在质量，能为中药的质量评价和控制提供一个有效的参考方法。全面、系统而又特征地指纹图谱有利于全方位地控制中药质量并与国际接轨。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种中江芍药HPLC指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种中江芍药HPLC指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱，步骤如下；a、试剂及仪器的选取；b、中江芍药样品溶液的制备；c、对照品溶液的制备；d、分别精密吸取样品溶液进行HPLC分析；e、将步骤d中获得的中江芍药指纹图谱数据导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，选择不同批次中江芍药的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰，并且计算共有峰的相对保留时间以及相对峰面积。

优选的，所述步骤a中试剂及仪器的选取为标准品：芍药苷、芍药内酯苷、羟基芍药苷、苯甲酰芍药苷、没食子酸、儿茶素，纯度＞98％，甲醇(HPLC级)、乙腈(HPLC级)；乙醇、磷酸、甲酸、三氟乙酸、冰乙酸等常用试剂均为分析纯；仪器：Agilent Technologies 1260InfinityⅡ高效液相色谱仪(美国Agilent Technologies)，包括G7129A自动进样器，G7111B四元泵，G7116A MCT高容量柱温箱，G7115A DAD检测器。BT124S电子天平、SB–800DTD超声波清洗机、FW80中药粉碎机、DHG-9240A电热恒温鼓风干燥箱、ZORBAX SB-C18色谱柱(5μm，4.6mm×250mm)。

优选的，所述步骤b中的样品制备包括，样品溶液制备和标准溶液配制，所述的样品溶液制备为精密称取中江芍药粉0.05g，置于25mL容量瓶中，加50％乙醇20mL，超声提取30min(超声频率40KHz，超声功率240W)，取出放冷，加50％乙醇定容，摇匀，经0.22μm微孔滤头过滤，取续滤液，即得，所述的准溶液配制为分别精密称取标准品没食子酸、羟基芍药苷、儿茶素、芍药内酯苷、芍药苷和苯甲酰芍药苷适量，以甲醇配成各单一成分的溶液，用移液管精密吸取没食子酸、羟基芍药苷、儿茶素标、芍药苷和苯甲酰芍药苷准品储备液各1.00mL，芍药内酯苷标准品储备液4mL，于10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得没食子酸51μg/mL，羟基芍药苷44μg/mL，儿茶素46μg/mL，芍药内酯苷192μg/mL，芍药苷429μg/mL和苯甲酰芍药苷44μg/mL的混标溶液。

优选的，所述的步骤d中样品溶液HPLC分析的条件为高效液相色谱的色谱条件为：色谱柱ZORBAX SB-C18(5μm，4.6mm×250mm)；流动相A为磷酸水，流动相B为乙腈，梯度洗脱；检测波长为230nm，记录色谱图。

优选的，所述的步骤e中用平均值计算法生成中江芍药的对照指纹图谱；计算各共有峰的相对保留时间、相对峰面积。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：该中江芍药HPLC指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱；通过试验来对中江芍药HPLC指纹图谱条件优化得到中江芍药HPLC指纹图谱色谱条件：Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)；流动相，0.1％磷酸水(A)-乙腈(B)，梯度洗脱：0～5min，10％～15％B，5～20min，15％～20％B，20～40min，20％～60％B，40～45min，60％～90％B，45～50min，90％B，50～55min，90～10％B，55～60min，10％B；检测波长230nm；柱温40℃；进样量10μL；流速1mL/min。通过测定30份中江芍药样品的指纹图谱，共获得20个共有峰，占总峰面积的94.6％，通过与标准品对照指认了6个主要成分，其中4个单萜苷类成分，2个酚酸类成分，均为中江芍药公认有效成分，可作为特征指纹峰。通过方法学考查，各主要共有峰相对保留时间和相对峰面积均基本一致，RSD均小于3％，符合指纹图谱要求。通过系统适应性测试结果表明主要共有峰的塔板数均大于9000，分离度大于1.5，对称因子在0.8～1.2之间，均在《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》的要求内，表明该芍药指纹图谱具有广泛的系统适应性，所提供的中江芍药HPLC指纹图谱，的检测方法具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好等优点，能全面，客观地表征中江芍药的质量。

附图说明

图1为本发明一种中江芍药HPLC指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱的表1线性回归方程及检测限和定量限结果示意图；

图2为本发明一种中江芍药HPLC指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱的图1标准曲线示意图；

图3为本发明一种中江芍药HPLC指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱的图4样品HPLC指纹图谱示意图；

图4为本发明一种中江芍药HPLC指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱的图2空白样品HPLC色谱图示意图；

图5为本发明一种中江芍药HPLC指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱的图3标准样品HPLC色谱图示意图；

图6为本发明一种中江芍药HPLC指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱的表2精密度试验结果(相对保留时间)示意图；

图7为本发明一种中江芍药HPLC指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱的表3精密度试验结果(相对峰面积)示意图；

图8为本发明一种中江芍药HPLC指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱的表4重复性试验结果(相对保留时间)示意图；

图9为本发明一种中江芍药HPLC指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱的表5重复性试验结果(相对峰面积)示意图；

图10为本发明一种中江芍药HPLC指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱的中江芍药样品HPLC指纹图谱示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

请参阅图1-10，本发明提供一种技术方案：一种中江芍药HPLC指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱，步骤如下；a、试剂及仪器的选取；所述步骤a中试剂及仪器的选取为标准品：芍药苷、芍药内酯苷、羟基芍药苷、苯甲酰芍药苷、没食子酸、儿茶素，纯度＞98％，甲醇(HPLC级)、乙腈(HPLC级)；乙醇、磷酸、甲酸、三氟乙酸、冰乙酸等常用试剂均为分析纯；仪器：Agilent Technologies 1260InfinityⅡ高效液相色谱仪(美国AgilentTechnologies)，包括G7129A自动进样器，G7111B四元泵，G7116A MCT高容量柱温箱，G7115ADAD检测器。BT124S电子天平、SB–800DTD超声波清洗机、FW80中药粉碎机、DHG-9240A电热恒温鼓风干燥箱、ZORBAX SB-C18色谱柱(5μm，4.6mm×250mm)；b、中江芍药样品溶液的制备；所述步骤b中的样品制备包括，样品溶液制备和标准溶液配制，所述的样品溶液制备为精密称取中江芍药粉0.05g，置于25mL容量瓶中，加50％乙醇20mL，超声提取30min(超声频率40KHz，超声功率240W)，取出放冷，加50％乙醇定容，摇匀，经0.22μm微孔滤头过滤，取续滤液，即得，所述的准溶液配制为分别精密称取标准品没食子酸、羟基芍药苷、儿茶素、芍药内酯苷、芍药苷和苯甲酰芍药苷适量，以甲醇配成各单一成分的溶液，用移液管精密吸取没食子酸、羟基芍药苷、儿茶素标、芍药苷和苯甲酰芍药苷准品储备液各1.00mL，芍药内酯苷标准品储备液4mL，于10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得没食子酸51μg/mL，羟基芍药苷44μg/mL，儿茶素46μg/mL，芍药内酯苷192μg/mL，芍药苷429μg/mL和苯甲酰芍药苷44μg/mL的混标溶液；c、对照品溶液的制备；d、分别精密吸取样品溶液HPLC分析；所述的步骤d中样品溶液HPLC分析的条件为高效液相色谱的色谱条件为：色谱柱ZORBAX SB-C18(5μm，4.6mm×250mm)；流动相A为磷酸水，流动相B为乙腈，梯度洗脱；检测波长为230nm，记录色谱图；e、将步骤d中获得的中江芍药指纹图谱数据导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，选择不同批次中江芍药的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰，并且计算共有峰的相对保留时间以及想多峰值面积；所述的步骤e中用平均值计算法生成中江芍药的对照指纹图谱；计算各共有峰的相对保留时间、相对峰面积。

进一步的，对中江芍药HPLC指纹图谱条件优化，①不同流动相筛选：甲醇-0.1％磷酸水、乙腈-0.1％磷酸水、乙腈-0.1％乙酸水、乙腈-0.1％甲酸水和乙腈-0.1％三氟乙酸水的筛选；②对检测波长210、230、254、270nm进行筛选；③柱温筛选(25℃、30℃、35℃和40℃)；④梯度洗脱程序优化；⑤流速：0.8、1.0、1.2mL/min；样品中芍药苷类和酚酸类化合物均具有一定的酸性，且含量较高，选择合适的pH调节剂对色谱行为影响较大，通过筛选，甲酸和磷酸酸性适中，但甲酸紫外吸收截止波长较高(230nm)在芍药苷等单萜苷的检测波长下具有紫外吸收，在梯度洗脱中会引起较严重的基线漂移，影响定量。最终选取磷酸作为pH调节剂，能获得最佳的峰形和分离度。通过对甲醇-水和乙腈-水作为流动相进行了比较，发现乙腈-水作为流动相具有更高的分辨率、分离速度更快。在254和270nm处各色谱峰分离度号，但检出峰数较少、灵敏度低；在检测波长为210和230nm时，检出峰较多，基本一致，但210nm检测基线不稳定，不利于准确积分；在230nm检测峰数多，基线平稳，故以230nm作为HPLC指纹图谱检测波长。并对梯度洗脱程序和流速进行进一步优化，得到建立指纹图谱色谱条件：Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)；流动相，0.1％磷酸水(A)-乙腈(B)，梯度洗脱：0～5min，10％～15％B，5～20min，15％～20％B，20～40min，20％～60％B，40～45min，60％～90％B，45～50min，90％B，50～55min，90％～10％B，55～60min，10％B；检测波长230nm；柱温40℃；进样量10μL；流速1mL/min

进一步的，标准曲线的建立；在建立好的芍药六种活性成分HPLC同时测定色谱条件下，分别进样不同体积(1、2、5、8、10、15、20μL)配制好的混标溶液进行测定，每个体积重复进样3次，换算浓度后，以浓度(X，μg/mL)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，制作标准曲线，拟合线性方程，实验结果见图1中的表格和图2。

进一步的，方法学进行考查；分别制30批中江芍药的样品溶液，在选定的HPLC指纹图谱色谱条件下，进样量10μL，进行HPLC分析，依次得到了它们的HPLC谱图。根据30批样品的HPLC色谱图的相关参数，中江芍药所有色谱峰在50分钟内全部出现，所有色谱峰都得到了较好的分离。在芍药中芍药苷是主要活性成分，《药典》中以之为指标成分，对其含量作了明确规定。因此，本发明在中江芍药HPLC指纹图谱研究中，以芍药苷的色谱峰作为其它特征峰的参考峰，参考峰编号为S，其它特征峰依次以阿拉伯数字1，2，3…N进行编号，中江芍药HPLC指纹图谱共检出20个共有峰，结果见图3；空白试验，进样甲醇10μL，注入HPLC，记录色谱图，结果见图4和图5；对照试验，吸取混合标准品溶液10μL，注入HPLC分析，记录色谱图见图2-4，结果见图4和图3。

进一步的，精密度试验，取同一批中江芍药样品，按选定的HPLC指纹图谱色谱条件，连续进样6次，进行测定。记录各共有色谱峰的保留时间和峰面积，以芍药苷为参照，计算出各共有峰的相对保留时间、相对峰面积及它们之间的RSD值。相对保留时间、相对峰面积结果见图6中表格和图7中表格。

进一步的，重复性试验，取同一批中江芍药样品，按选定的HPLC指纹图谱色谱条件，分别进样，进行测定，计算各共有色谱峰相对保留时间和相对峰面积及其RSD值，结果见图8和图9中表格。

进一步的，系统适应性试验，包括理论板数、分离度、灵敏度、拖尾因子等在不同HPLC系统进行验证。通过在岛津LC-20A高效液相色谱仪和Agilent Technologies1260InfinityⅡ高效液相色谱仪上采用不同色谱柱对芍药指纹图谱进行系统性验证，测试结果显示主要共有峰的塔板数均大于9000，分离度大于1.5，对称因子在0.8～1.2之间，均在规定的要求内，表明该芍药指纹图谱具有广泛的系统适应性。

进一步的，中江芍药HPLC指纹图谱，用建立的中江芍药HPLC指纹图谱测定色谱条件测定了30份中江芍药样品，代表指纹图谱见图10，共获得20个共有峰，占总峰面积的94.6％，通过与标准品对照指认了6个主要成分(峰1：没食子酸，峰5：羟基芍药苷，峰6：儿茶素，峰7：芍药内酯苷，峰8：芍药苷和峰18：苯甲酰芍药苷)，其中4个为芍药单萜苷类成分，2个为酚酸类成分，均为中江芍药公认有效成分，可作为中江芍药特征指纹峰。

尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换,凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种中江芍药HPLC指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱，其特征在于：步骤如下；a、试剂及仪器的选取；b、中江芍药样品溶液的制备；c、对照品溶液的制备；d、分别精密吸取样品溶液进行HPLC分析；e、将步骤d中获得的中江芍药指纹图谱数据导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，选择不同批次中江芍药的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰，并且计算共有峰的相对保留时间以及相对峰面积。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤a中试剂及仪器的选取为标准品：芍药苷、芍药内酯苷、羟基芍药苷、苯甲酰芍药苷、没食子酸、儿茶素，纯度＞98％，甲醇(HPLC级)、乙腈(HPLC级)；乙醇、磷酸、甲酸、三氟乙酸、冰乙酸等常用试剂均为分析纯；仪器：Agilent Technologies 1260 InfinityⅡ高效液相色谱仪(美国AgilentTechnologies)，包括G7129A自动进样器，G7111B四元泵，G7116A MCT高容量柱温箱，G7115ADAD检测器。BT124S电子天平、SB–800DTD超声波清洗机、FW80中药粉碎机、DHG-9240A电热恒温鼓风干燥箱、ZORBAX SB-C18色谱柱(5μm，4.6mm×250mm)。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤b中的样品制备包括，样品溶液制备和标准溶液配制，所述的样品溶液制备为精密称取中江芍药粉0.05g，置于25mL容量瓶中，加50％乙醇20mL，超声提取30min(超声频率40KHz，超声功率240W)，取出放冷，加50％乙醇定容，摇匀，经0.22μm微孔滤头过滤，取续滤液，即得，所述的准溶液配制为分别精密称取标准品没食子酸、羟基芍药苷、儿茶素、芍药内酯苷、芍药苷和苯甲酰芍药苷适量，以甲醇配成各单一成分的溶液，用移液管精密吸取没食子酸、羟基芍药苷、儿茶素标、芍药苷和苯甲酰芍药苷准品储备液各1.00mL，芍药内酯苷标准品储备液4mL，于10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得没食子酸51μg/mL，羟基芍药苷44μg/mL，儿茶素46μg/mL，芍药内酯苷192μg/mL，芍药苷429μg/mL和苯甲酰芍药苷44μg/mL的混标溶液。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的步骤d中样品溶液HPLC分析的条件为高效液相色谱的色谱条件为：色谱柱ZORBAX SB-C18(5μm，4.6mm×250mm)；流动相A为磷酸水，流动相B为乙腈，梯度洗脱；检测波长为230nm，记录色谱图。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的步骤e中用平均值计算法生成中江芍药的对照指纹图谱；计算各共有峰的相对保留时间、相对峰面积。