CN109529011A - 海洋鱼类低聚肽在制备具有抑制肝癌细胞功效的药品、保健品或食品中的应用 - Google Patents

海洋鱼类低聚肽在制备具有抑制肝癌细胞功效的药品、保健品或食品中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种海洋鱼类低聚肽在制备具有抑制肝癌细胞功效的药品、保健品或食品中的应用，所述海洋鱼类低聚肽中的组氨酸二肽含量为40‑100mg/100g；有机硒含量为1‑3mg/100g。通过药效实验证实，可以显著抑制肝癌细胞生长，能够应用于具有抑制肝癌细胞功效的药品、保健品或食品中。另外，鉴于海洋鱼类低聚肽还具有不含过敏源、安全性高，营养均衡，肽分子量小、吸收利用快，易溶于水等优点，便于与其它原料进行配伍，可以作为肝癌患者理想的功能性药品、保健品或食品或上述产品的配料。

Description

海洋鱼类低聚肽在制备具有抑制肝癌细胞功效的药品、保健 品或食品中的应用
技术领域
本发明涉及海洋鱼类产品的新应用，特别是涉及海洋鱼类低聚肽在制备具有抑制肝癌细胞功效的药品、保健品或食品中的应用。
背景技术
肝癌是病死率最高的恶性肿瘤之一。我国每年约有38.3万人死于肝癌，占全球肝癌死亡病例数的51％，严峻的形势给我国的社会和医疗带来了沉重的负担。目前肝癌的治疗方法主要有：肝切除、肝移植、消融治疗、介入治疗、放射治疗、药物治疗和生物治疗等，大多数治疗方法对患者身体伤害性大。生物治疗主要是通过调节机体自身的生物机能，增强机体自身对肿瘤细胞的防御能力，抑制肿瘤细胞生长，提高患者生存率和降低复发率。生物治疗因其具有副作用小、效果好等优点，在临床上得到了广泛应用。
海洋鱼类资源丰富，营养价值高，味道鲜美，是餐桌上的珍贵佳品。海洋鱼类蛋白经酶法水解等工序制备的低聚肽具有安全性高、营养价值好、吸收利用快、易溶于水等优点。
发明内容
基于此，有必要提供一种海洋鱼类低聚肽在制备具有抑制肝癌细胞功效的药品、保健品或食品中的应用。
一种海洋鱼类低聚肽在制备具有抑制肝癌细胞功效的药品、保健品或食品中的应用，所述海洋鱼类低聚肽中的组氨酸二肽含量为40-100mg/100g；有机硒含量为1-3mg/100g。
在其中一个实施例中，所述海洋鱼类低聚肽中分子量<1000Da的肽的比例大于75％，分子量<5000Da的肽的比例大于90％。
在其中一个实施例中，所述海洋鱼类选自洄游性红肉鱼类。
在其中一个实施例中，所述海洋鱼类为鲣鱼或金枪鱼。
在其中一个实施例中，所述海洋鱼类低聚肽的制备方法包括如下步骤：
(1)将前处理后的海洋鱼搅碎，加入水并调节体系pH至7-8，加入动物蛋白水解酶与风味酶进行酶解；所述酶解结束后，灭酶，然后离心去掉残渣与油脂，得酶解液；
(2)将所述酶解液先进行陶瓷膜过滤，再经有机膜分离系统提纯，收集提纯液，浓缩并干燥，即得。
在其中一个实施例中，步骤(1)中，所述动物蛋白水解酶的用量为所述海洋鱼重量的0.4-0.6％；所述风味酶的用量为所述海洋鱼重量的0.08-0.12％。
在其中一个实施例中，步骤(2)中，所述陶瓷膜过滤采用的陶瓷膜为0.1-0.3μm陶瓷膜。
在其中一个实施例中，步骤(2)中，所述有机膜分离系统采用的分离膜的截留分子量为4000-6000Da。
在其中一个实施例中，步骤(1)中，所述酶解的温度为45-55℃，时间为2-4h。
在其中一个实施例中，步骤(1)中，所述离心采用的滤布为500-700目滤布。
在其中一个实施例中，步骤(1)中，所述灭酶的温度为90-95℃，时间为10-20min。
在其中一个实施例中，步骤(2)中，所述浓缩为真空浓缩。
在其中一个实施例中，步骤(2)中，所述干燥的方法为喷雾干燥。
在其中一个实施例中，步骤(1)中，所述前处理包括去头、去内脏、去鳃、去鳞。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供一种海洋鱼类低聚肽在制备具有抑制肝癌细胞功效的药品、保健品或食品中的应用，所述海洋鱼类低聚肽中的组氨酸二肽含量为40-100mg/100g；有机硒含量为1-3mg/100g。通过药效实验证实，该海洋鱼类低聚肽可以显著抑制肝癌细胞生长，能够应用于具有抑制肝癌细胞功效的药品、保健品或食品中。另外，鉴于海洋鱼类低聚肽还具有不含过敏源、安全性高，营养均衡，肽分子量小、吸收利用快，易溶于水等优点，便于与其它原料进行配伍，可以作为肝癌患者理想的功能性药品、保健品或食品或上述产品的配料。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明的海洋鱼类低聚肽在制备具有抑制肝癌细胞功效的药品、保健品或食品中的应用作进一步详细的说明。
实施例1
本实施例一种海洋鱼类低聚肽的制备方法，以金枪鱼为原料，步骤如下：
(1)经过前处理(去头、去内脏、去鳃、去鳞等)的金枪鱼采用绞肉机绞碎，与水按重量比1:1混匀并调节体系pH至7.5；然后添加0.5％动物蛋白水解酶与0.1％风味酶，在温度50℃条件下酶解3h；酶解结束后升温至90℃-95℃灭酶15分钟，再通过三足离心机(内置600目的布袋)离心去掉残渣与油脂，的酶解液；
(2)所述酶解液先经0.2μm陶瓷膜过滤，再经截留分子量为5000Da的有机膜分离系统进行分离提纯，提纯液进行真空浓缩和喷雾干燥，即得海洋鱼类低聚肽粉。
采用超高压液相色谱与质谱联用方法测定所得海洋鱼类低聚肽粉中的组氨酸二肽含量，为75mg/100g，另测定该海洋鱼类低聚肽粉有机硒含量为2.8mg/100g，分子量<1000Da的肽比例77％，分子量<5000Da的肽比例92％。
实施例2
对实施例1制得的海洋鱼类低聚肽(即金枪鱼低聚肽)进行抑制肝癌细胞生长的功效实验。
效果实验一：
(1)材料：人肝癌细胞HepG2，由中山大学肿瘤中心提供，保存于广东医学实验动物细胞库备用；金枪鱼低聚肽有机硒含量2.8mg/100g，分子量<5000Da的肽占92％，分子量<1000Da的肽占77％，组氨酸二肽为75mg/100g；顺铂注射液(对照品)，江苏豪森药业集团有限公司生产。
(2)实验方法
A、对照品配制方法：取0.05mL 5mg/mL的顺铂注射液，加入24.95mL DMEM完全培养液，配制成10μg/mL药液；取0.5mL 10μg/mL的顺铂溶液，加入9.5mL完全培养液，配制成0.5μg/mL药液。
B、细胞管理与检查方法：细胞培养在广东医学实验动物中心，37℃，待细胞长至80～90％汇合时，弃去原培养液，PBS漂洗后，弃PBS，加入0.25％胰蛋白酶(含EDTA)消化细胞，加适量DMEM完全培养液终止消化，800～1000rpm/min离心5～10min后弃去上清，加入适量DMEM完全培养液，吹打细胞，轻轻混匀，按适当比例接种到培养瓶。对传代细胞观察3d。期间每日检查细胞一次，细胞未见异常，培养液未见异常，该株细胞纳入实验。
C、实验设计分组与加样方案(表1)
表1 96孔板加样表
D、实验方法：用DMEM完全培养液培养HepG2细胞，当细胞达到其对数生长期末细胞趋于融合时，用0.25％胰蛋白酶(含EDTA)消化细胞，HepG2细胞用DMEM完全培养液制成3×104个/mL的细胞悬液；将细胞悬液接种于96孔培养板中，每组设3孔，每孔100μL，置37℃、5％CO2培养箱中培养24h；弃去原培养液，分别加入不同浓度的金枪鱼低聚肽、顺铂注射液和培养液(见表1)，每孔200μL，置CO2培养箱中继续培养48h后在显微镜下观察细胞形态；弃去孔内液体，每孔加入5mg/mL MTT溶液20μL，继续培养4h后弃去上清，每孔加入DMSO 150μL，振荡，甲瓒溶解均匀后，用酶标仪测定每孔的吸光度，测定波长为570nm，参考波长为630nm。
E、数据统计与结果计算
将原始数据以均数加减标准差表示应用SPSS21.0软件单因素方差分析对原始数据进行组间的差异显著性检验，α＝0.05。样品对HepG2细胞生长的抑制率按下列公式进行计算，半数抑制浓度IC50应用SPSS21.0软件计算
(3)、实验结果
金枪鱼低聚肽对HepG2细胞的抑制结果如表2，其半数抑制浓度IC50为10234μg/mL。
表2金枪鱼低聚肽对人肝癌细胞HepG2的抑制效果
注：与阴性对照组比较，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01
效果实验二：
(1)实验材料与方法：实验肝癌细胞为SMMC-7721细胞，由中山大学肿瘤医院提供，保存于广东医学实验动物中心细胞库中备用。SMMC-7721细胞浓度为3×104个/mL，采用96孔板培养，细胞接种数/孔为3000；金枪鱼低聚肽、实验试剂、培养方法与结果计算同效果实验一。
(2)实验分组设计与加样方案(表3)
表3 96孔板加样表
(3)实验3结组果
金枪鱼低聚肽对SMMC-7721细胞的抑制结果如表4，其半数抑制浓度IC50为10205μg/mL。
表4金枪鱼低聚肽对人肝癌细胞SMMC-7721的抑制效果
注：与阴性对照组比较，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01
效果实验三：
(1)实验材料与方法：实验肝癌细胞为SMMC-7721细胞，由中山大学肿瘤医院提供，保存于广东医学实验动物中心细胞库中备用。SMMC-7721细胞浓度为3×104个/mL，采用96孔板培养，细胞接种数/孔为3000；金枪鱼低聚肽、实验试剂、培养方法与结果计算同效果实验一。
(2)实验分组设计与加样方案
联合用药组为浓度为0.5μg/mL的顺铂与金枪鱼低聚肽的组合，实验分组与设计具体分组方案如表5。
表5 96孔板加样表
(3)实验结果(表6)低聚肽
表6金枪鱼低聚肽对人肝癌细胞SMMC-7721的抑制效果
注：与阴性对照组比较，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01
效果实验四：
(1)实验材料与方法：实验肝癌细胞为BEL-7402细胞，由中山大学肿瘤医院提供，保存于广东医学实验动物中心细胞库中备用。BEL-7402细胞浓度为4×104个/mL，采用96孔板培养，细胞接种数/孔为4000；金枪鱼低聚肽组成、实验试剂、培养方法与结果计算同效果实验一。
(2)实验分组设计与加样方案(表7)
表7 96孔板加样表
(3)实组结3果组
金枪鱼低聚肽对BEL-7402细胞的抑制结果如表8，其半数抑制浓度IC50为6042μg/mL。
表8金枪鱼低聚肽对人肝癌细胞BEL-7402的抑制效果
注：与阴性对照组比较，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01
效果实验五：
(1)实验材料与方法：实验肝癌细胞为BEL-7402细胞，由中山大学肿瘤医院提供，保存于广东医学实验动物中心细胞库中备用。BEL-7402细胞浓度为4×104个/mL，采用96孔板培养，细胞接种数/孔为4000；金枪鱼低聚肽组成、实验试剂、培养方法与结果计算同效果实验一。
(2)实验分组设计与加样方案(表9)
表9 96孔板加样表
(3)实验结果(表10)低聚肽
表10金枪鱼低聚肽对人肝癌细胞BEL-7402的抑制效果
注：与阴性对照组比较，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种海洋鱼类低聚肽在制备具有抑制肝癌细胞功效的药品、保健品或食品中的应用，所述海洋鱼类低聚肽中的组氨酸二肽含量为40-100mg/100g；有机硒含量为1-3mg/100g。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述海洋鱼类低聚肽中分子量<1000Da的肽的比例大于75％，分子量<5000Da的肽的比例大于90％。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述海洋鱼类选自洄游性红肉鱼类。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述海洋鱼类为鲣鱼或金枪鱼。
5.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，所述海洋鱼类低聚肽的制备方法包括如下步骤：
(1)将前处理后的海洋鱼搅碎，加入水并调节体系pH至7-8，加入动物蛋白水解酶与风味酶进行酶解；所述酶解结束后，灭酶，然后离心去掉残渣与油脂，得酶解液；
(2)将所述酶解液先进行陶瓷膜过滤，再经有机膜分离系统提纯，收集提纯液，浓缩并干燥，即得。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤(1)中，所述动物蛋白水解酶的用量为所述海洋鱼重量的0.4-0.6％；所述风味酶的用量为所述海洋鱼重量的0.08-0.12％。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤(2)中，所述陶瓷膜过滤采用的陶瓷膜为0.1-0.3μm陶瓷膜。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤(2)中，所述有机膜分离系统采用的分离膜的截留分子量为4000-6000Da。
9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤(1)中，所述酶解的温度为45-55℃，时间为2-4h。
10.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤(1)中，所述离心采用的滤布为500-700目滤布。
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