CN109528726B - 一种叶酸制剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一种叶酸制剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种叶酸制剂及其制备方法和应用，属于微生物技术领域以及医药技术领域。本发明的叶酸制备方法通过将植物乳杆菌接种于含有氨基苯甲酸(PABA)、乳酸钠的发酵培养基中发酵以及控制植物乳杆菌在低生长速率，大大提高了植物乳杆菌生产叶酸的能力，将发酵生产叶酸的产量由0.8μg/mL提升至2.7μg/mL；本发明的叶酸制剂同时含有叶酸和不低于1×1011CFU/L的活性植物乳杆菌，既具有补充人体叶酸的作用，也有益于人体肠道健康；将本发明的叶酸制剂于室温(25℃)下放置8个月，其含有的活性植物乳杆菌仍可以存活75％以上。

Description

一种叶酸制剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种叶酸制剂及其制备方法和应用，属于微生物技术领域以及医药技术领域。
背景技术
叶酸(folate)属于水溶性维生素B族，是具有蝶酰谷氨酸分子结构的一类化合物的总称，又名蝶酰谷氨酸，维生素Bc、维生素M、维生素B11，其母体蝶酰谷氨酸的化学名称为N-[4-[(2-氨基-4-羟基-6-蝶啶基)甲氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酸。
叶酸的重要生理功能是作为一碳化合物的载体参加代谢，其衍生物四氢叶酸以辅酶形式为一碳单位(包括甲酸基、甲醛和甲基)的载体，对甲基的转移和甲酸基及甲醛的利用都有重要作用。
由于人体内的叶酸几乎完全依赖于食物摄入，因此，当叶酸摄入量不足或利用率降低时，人体内便会出现叶酸缺乏的状况。研究表明，人体缺乏叶酸会引发婴儿的核巨红细胞性贫血、孕妇的巨红细胞性贫血、新生儿的神经系统异常和老年期痴呆症等疾病，因此，叶酸具有十分重要的药用价值和开发前景。
目前，市场上常见的叶酸补剂为酵母片(成分主要为干酵母、蔗糖、碳酸钙以及硬脂酸镁)，其具有制备简单、成本低廉等优势，但是，长期服用或过量服用酵母片会导致人体肠道内菌群失调，造成人体腹泻等问题，因此，急需找到另一种可替代酵母片的低成本叶酸补剂。
辛运的是，目前，已经有研究发现，部分益生菌也具有发酵生产叶酸的能力，若是能够通过益生菌制备叶酸补剂，无疑能够解决酵母片造成人体腹泻的问题。
然而，益生菌生产叶酸的能力有限，一般只能达到1μg/mL，不能够满足工业化生产的要求，因此，找到一种能够提高益生菌生产叶酸的能力的方法至关重要。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种利用植物乳杆菌生产叶酸的方法以及一种同时含有叶酸和植物乳杆菌的叶酸制剂。本发明的叶酸制备方法通过将植物乳杆菌接种于含有氨基苯甲酸(PABA)、乳酸钠的发酵培养基中发酵以及控制植物乳杆菌在低生长速率，大大提高了植物乳杆菌生产叶酸的能力，将发酵生产叶酸的产量由0.8μg/mL提升至2.7μg/mL；本发明的叶酸制剂同时含有叶酸和不低于1×1011CFU/L的活性植物乳杆菌，既具有补充人体叶酸的作用，也有益于人体肠道健康；将本发明的叶酸制剂于室温(25℃)下放置8个月，其含有的活性植物乳杆菌仍可以存活75％以上。
本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种叶酸制剂，所述叶酸制剂的成分包含植物乳杆菌、叶酸、麦芽糊精、低聚果糖、果胶、乳清蛋白、甘油、卵磷脂以及碳酸钙。
在本发明的一种实施方式中，所述叶酸制剂的成分包含不低于1×1011CFU/L植物乳杆菌、0.02～0.08g/L叶酸、5～12g/L麦芽糊精、5～15g/L低聚果糖、3～8g/L果胶、5～15g/L乳清蛋白、8～20g/L甘油、3～8g/L卵磷脂以及2～5g/L碳酸钙。
在本发明的一种实施方式中，所述叶酸制剂的成分包含1×1012CFU/L植物乳杆菌、0.04g/L叶酸、8g/L麦芽糊精、10g/L低聚果糖、5g/L果胶、10g/L乳清蛋白、12g/L甘油、5g/L卵磷脂以及3g/L碳酸钙。
在本发明的一种实施方式中，所述方法为将植物乳杆菌接种于添加了氨基苯甲酸(PABA)以及乳酸钠的发酵培养基中，于温度28～35℃、pH 6～8的条件下发酵培养8～20h，整个发酵期间，需间歇性的在发酵体系中添加葡萄糖溶液以维持发酵体系中的葡萄糖浓度在5～15g/L，得到发酵液；将发酵液进行离心，得到沉淀和上清液；将沉淀用水进行清洗后再次离心，得到植物乳杆菌菌体；将上清液通过0.45μm的滤膜过滤后干燥，得到叶酸；将植物乳杆菌菌体、叶酸、麦芽糊精、低聚果糖、果胶、乳清蛋白、甘油、卵磷脂以及碳酸钙加入水中，于80～150r/min转速下搅拌5～10min，得到叶酸制剂。
在本发明的一种实施方式中，所述方法为将植物乳杆菌接种于添加了氨基苯甲酸(PABA)以及乳酸钠的发酵培养基中，于温度30℃、pH 7的条件下发酵培养14h，整个发酵期间，需间歇性的在发酵体系中添加葡萄糖溶液以维持发酵体系中的葡萄糖浓度在8g/L，得到发酵液；将发酵液进行离心，得到沉淀和上清液；将沉淀用水进行清洗后再次离心，得到植物乳杆菌菌体；将上清液通过0.45μm的滤膜过滤后干燥，得到叶酸；将植物乳杆菌菌体、叶酸、麦芽糊精、低聚果糖、果胶、乳清蛋白、甘油、卵磷脂以及碳酸钙加入水中，于120r/min转速下搅拌10min，得到叶酸制剂。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的成分包含15～25g/L葡萄糖、3～10g/L酵母浸膏、3～10g/L玉米浆、2～7g/L氨基苯甲酸(PABA)、1～3g/L硫酸铵、1～3g/L无水硫酸镁、1～3g/L硫酸钙、1～3g/L硫酸镁、0.5～1g/L谷酰胺、1～2g/L谷氨酸以及1～5g/L乳酸钠。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的成分包含20g/L葡萄糖、6g/L酵母浸膏、4g/L玉米浆、3g/L氨基苯甲酸(PABA)、2g/L硫酸铵、1g/L无水硫酸镁、1.5g/L硫酸钙、1.5g/L硫酸锰、0.8g/L谷酰胺、1.5g/L谷氨酸以及3g/L乳酸钠。
本发明提供了应用上述制备方法制备得到的叶酸制剂。
本发明提供了含有上述叶酸制剂以及上述制备得到的叶酸制剂的产品。
在本发明的一种实施方式中，所述产品包含食品、药品以及保健品。
本发明提供了上述叶酸制剂以及上述制备得到的叶酸制剂在制备治疗缺乏叶酸导致的疾病的药物方面的应用。
有益效果：
(1)本发明的叶酸制备方法通过将植物乳杆菌接种于含有氨基苯甲酸(PABA)、乳酸钠的发酵培养基中发酵以及控制植物乳杆菌在低生长速率，大大提高了植物乳杆菌生产叶酸的能力，将发酵生产叶酸的产量由0.8μg/mL提升至2.7μg/mL；
(2)本发明的叶酸制剂同时含有叶酸和不低于1×1011CFU/L的活性植物乳杆菌，既具有补充人体叶酸的作用，也有益于人体肠道健康；
(3)将本发明的叶酸制剂于室温(25℃)下放置8个月，其含有的活性植物乳杆菌仍可以存活75％以上。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步的阐述。
下述实施例中涉及的植物乳杆菌购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。
下述实施例中涉及的检测方法如下：
叶酸产量检测方法：
(1)将发酵液在3000r/min的转速下离心15分钟，取上清液，通过0.45μm的有机滤膜进行过滤，得到待测样品；
(2)对待测样品进行高效液相色谱分析，对照叶酸纯品的高效液相色谱标准曲线，计算叶酸含量；
HPLC色谱条件：固定相：CLCODS-C18柱，4.6mm×250mm；流动相：甲醇：水(Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液，pH 7.6)＝10：90；流速：1.5mL/min；柱温：25℃；检测波长：280nm；进样量：20μL。
活菌数检测方法：
采用国标《GB 4789.35-2016食品安全国家标准食品微生物学检测乳酸菌检测》。
下述实施例中涉及的培养基如下：
种子培养基：35g/L葡萄糖、12g/L酵母浸膏、2g/L硫酸铵、1.5g/L无水硫酸镁、1.5g/L磷酸二氢钾。
发酵培养基：20g/L葡萄糖、6g/L酵母浸膏、4g/L玉米浆、2g/L硫酸铵、1g/L无水硫酸镁、1.5g/L硫酸钙、1.5g/L硫酸锰、0.8g/L谷酰胺以及1.5g/L谷氨酸。
实施例1：叶酸的制备
具体步骤如下：
(1)吸取0.3mL种子培养基放入从中国工业微生物菌种保藏管理中心购买到的植物乳杆菌菌种管中，轻轻振荡，得到菌悬液；
(2)将50mL种子培养基装于250mL摇瓶中，吸取0.3mL菌悬液接种于种子培养基中，于温度35℃的条件下培养24h，得到一级种子液；
(4)将2.3L种子培养基装于5L种子罐中，将全部一级种子液接种于种子培养基中，于温度35℃的条件下培养24h，得到二级种子液；
(5)将6.5L添加了3g/L氨基苯甲酸(PABA)以及3g/L乳酸钠的发酵培养基装于10L发酵罐中，于温度30℃、pH 7的条件下发酵培养14h，整个发酵期间，需间歇性的在发酵体系中添加葡萄糖溶液以维持发酵体系中的葡萄糖浓度在8g/L，得到发酵液。
检测发酵液中的叶酸含量，检测结果为：2.7μg/mL。
实施例2：叶酸的制备
具体步骤如下：
(1)吸取0.3mL种子培养基放入从中国工业微生物菌种保藏管理中心购买到的植物乳杆菌菌种管中，轻轻振荡，得到菌悬液；
(2)将50mL种子培养基装于250mL摇瓶中，吸取0.3mL菌悬液接种于种子培养基中，于温度35℃的条件下培养24h，得到一级种子液；
(4)将2.3L种子培养基装于5L种子罐中，将全部一级种子液接种于种子培养基中，于温度35℃的条件下培养24h，得到二级种子液；
(5)将6.5L添加了2g/L氨基苯甲酸(PABA)以及1g/L乳酸钠的发酵培养基装于10L发酵罐中，于温度30℃、pH 7的条件下发酵培养14h，整个发酵期间，需间歇性的在发酵体系中添加葡萄糖溶液以维持发酵体系中的葡萄糖浓度在5g/L，得到发酵液。
检测发酵液中的叶酸含量，检测结果为：1.8μg/mL。
实施例3：叶酸的制备
具体步骤如下：
(1)吸取0.3mL种子培养基放入从中国工业微生物菌种保藏管理中心购买到的植物乳杆菌菌种管中，轻轻振荡，得到菌悬液；
(2)将50mL种子培养基装于250mL摇瓶中，吸取0.3mL菌悬液接种于种子培养基中，于温度35℃的条件下培养24h，得到一级种子液；
(4)将2.3L种子培养基装于5L种子罐中，将全部一级种子液接种于种子培养基中，于温度35℃的条件下培养24h，得到二级种子液；
(5)将6.5L添加了7g/L氨基苯甲酸(PABA)以及5g/L乳酸钠的发酵培养基装于10L发酵罐中，于温度30℃、pH 7的条件下发酵培养14h，整个发酵期间，需间歇性的在发酵体系中添加葡萄糖溶液以维持发酵体系中的葡萄糖浓度在15g/L，得到发酵液。
检测发酵液中的叶酸含量，检测结果为：2.1μg/mL。
实施例4：叶酸的制备
具体步骤如下：
(1)吸取0.3mL种子培养基放入从中国工业微生物菌种保藏管理中心购买到的植物乳杆菌菌种管中，轻轻振荡，得到菌悬液；
(2)将50mL种子培养基装于250mL摇瓶中，吸取0.3mL菌悬液接种于种子培养基中，于温度35℃的条件下培养24h，得到一级种子液；
(4)将2.3L种子培养基装于5L种子罐中，将全部一级种子液接种于种子培养基中，于温度35℃的条件下培养24h，得到二级种子液；
(5)将6.5L添加了4g/L氨基苯甲酸(PABA)以及2g/L乳酸钠的发酵培养基装于10L发酵罐中，于温度30℃、pH 7的条件下发酵培养14h，整个发酵期间，需间歇性的在发酵体系中添加葡萄糖溶液以维持发酵体系中的葡萄糖浓度在10g/L，得到发酵液。
检测发酵液中的叶酸含量，检测结果为：2.5μg/mL。
实施例5：叶酸的制备
具体步骤如下：
(1)吸取0.3mL种子培养基放入从中国工业微生物菌种保藏管理中心购买到的植物乳杆菌菌种管中，轻轻振荡，得到菌悬液；
(2)将50mL种子培养基装于250mL摇瓶中，吸取0.3mL菌悬液接种于种子培养基中，于温度35℃的条件下培养24h，得到一级种子液；
(4)将2.3L种子培养基装于5L种子罐中，将全部一级种子液接种于种子培养基中，于温度35℃的条件下培养24h，得到二级种子液；
(5)将6.5L发酵培养基装于10L发酵罐中，于温度30℃、pH 7的条件下发酵培养14h，整个发酵期间，需间歇性的在发酵体系中添加葡萄糖溶液以维持发酵体系中的葡萄糖浓度在8g/L，得到发酵液。
检测发酵液中的叶酸含量，检测结果为：1.3μg/mL。
实施例6：叶酸的制备
具体步骤如下：
(1)吸取0.3mL种子培养基放入从中国工业微生物菌种保藏管理中心购买到的植物乳杆菌菌种管中，轻轻振荡，得到菌悬液；
(2)将50mL种子培养基装于250mL摇瓶中，吸取0.3mL菌悬液接种于种子培养基中，于温度35℃的条件下培养24h，得到一级种子液；
(4)将2.3L种子培养基装于5L种子罐中，将全部一级种子液接种于种子培养基中，于温度35℃的条件下培养24h，得到二级种子液；
(5)将6.5L含有40g/L葡萄糖且添加了3g/L氨基苯甲酸(PABA)以及3g/L乳酸钠的发酵培养基装于10L发酵罐中，于温度30℃、pH 7的条件下发酵培养14h，得到发酵液。
检测发酵液中的叶酸含量，检测结果为：1.9μg/mL。
对比例1：叶酸的制备
具体步骤如下：
(1)吸取0.3mL种子培养基放入从中国工业微生物菌种保藏管理中心购买到的植物乳杆菌菌种管中，轻轻振荡，得到菌悬液；
(2)将50mL种子培养基装于250mL摇瓶中，吸取0.3mL菌悬液接种于种子培养基中，于温度35℃的条件下培养24h，得到一级种子液；
(4)将2.3L种子培养基装于5L种子罐中，将全部一级种子液接种于种子培养基中，于温度35℃的条件下培养24h，得到二级种子液；
(5)将6.5L含有40g/L葡萄糖的发酵培养基装于10L发酵罐中，于温度30℃、pH 7的条件下发酵培养14h，得到发酵液。
检测发酵液中的叶酸含量，检测结果为：0.8μg/mL。
实施例7：叶酸制剂的制备
具体步骤如下：
将实施例1得到的发酵液进行离心，得到沉淀和上清液；将沉淀用水进行清洗后再次离心，得到植物乳杆菌菌体；将上清液通过0.45μm的滤膜过滤后干燥，得到叶酸；将植物乳杆菌菌体、叶酸、麦芽糊精、低聚果糖、果胶、乳清蛋白、甘油、卵磷脂以及碳酸钙分别按照表1-2的配方加入水中，于120r/min转速下搅拌10min，得到叶酸制剂。
将得到的叶酸制剂于室温(25℃)下放置8个月，间隔2个月检测植物乳杆菌活菌数，检测结果见表3-4。
表1叶酸制剂的配方
Figure BDA0001879458010000061
Figure BDA0001879458010000071
表2叶酸制剂的配方
Figure BDA0001879458010000072
表3叶酸制剂中植物乳杆菌活菌数变化
Figure BDA0001879458010000073
Figure BDA0001879458010000081
表4叶酸制剂中植物乳杆菌活菌数变化
Figure BDA0001879458010000082
由表3-4可知，本发明的配方可使得叶酸制剂于室温(25℃)下放置8个月后，仍含有75％以上的活性植物乳杆菌，效果较好。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (7)

1.一种叶酸制剂的制备方法，其特征在于，所述方法为将植物乳杆菌接种于添加了对氨基苯甲酸以及乳酸钠的发酵培养基中，于温度28~35℃、pH 6~8的条件下发酵培养14 h，整个发酵期间，需间歇性地在发酵体系中添加葡萄糖溶液以维持发酵体系中的葡萄糖浓度在5~15 g/L，得到发酵液；将发酵液进行离心，得到沉淀和上清液；将沉淀用水进行清洗后再次离心，得到植物乳杆菌菌体；将上清液通过0.45µm的滤膜过滤后干燥，得到叶酸；将植物乳杆菌菌体、叶酸、麦芽糊精、低聚果糖、果胶、乳清蛋白、甘油、卵磷脂以及碳酸钙加入水中，于80~150 r/min转速下搅拌5~10 min，得到叶酸制剂；
所述发酵培养基的成分包含20 g/L葡萄糖、6 g/L酵母浸膏、4 g/L玉米浆、3 g/L对氨基苯甲酸、2 g/L硫酸铵、1 g/L无水硫酸镁、1.5 g/L硫酸钙、1.5 g/L硫酸锰、0.8 g/L谷酰胺、1.5 g/L谷氨酸以及3 g/L乳酸钠。
2.如权利要求1所述的一种叶酸制剂的制备方法，其特征在于，所述方法为将植物乳杆菌接种于添加了对氨基苯甲酸以及乳酸钠的发酵培养基中，于温度30℃、pH 7的条件下发酵培养14 h，整个发酵期间，需间歇性的在发酵体系中添加葡萄糖溶液以维持发酵体系中的葡萄糖浓度在8 g/L，得到发酵液；将发酵液进行离心，得到沉淀和上清液；将沉淀用水进行清洗后再次离心，得到植物乳杆菌菌体；将上清液通过0.45µm的滤膜过滤后干燥，得到叶酸；将植物乳杆菌菌体、叶酸、麦芽糊精、低聚果糖、果胶、乳清蛋白、甘油、卵磷脂以及碳酸钙加入水中，于120 r/min转速下搅拌10 min，得到叶酸制剂。
3.应用权利要求1或2所述的制备方法制备得到的叶酸制剂。
4.如权利要求3所述的叶酸制剂，其特征在于，所述叶酸制剂的成分包含不低于1×1011CFU/L植物乳杆菌、0.02~0.08 g/L叶酸、5~12 g/L麦芽糊精、5~15 g/L低聚果糖、3~8 g/L果胶、5~15 g/L乳清蛋白、8~20 g/L甘油、3~8 g/L卵磷脂以及2~5 g/L碳酸钙。
5.如权利要求4所述的叶酸制剂，其特征在于，所述叶酸制剂的成分包含1×1012 CFU/L植物乳杆菌、0.04 g/L叶酸、8 g/L麦芽糊精、10 g/L低聚果糖、5 g/L果胶、10 g/L乳清蛋白、12 g/L甘油、5 g/L卵磷脂以及3 g/L碳酸钙。
6.含有权利要求3-5任一项所述的叶酸制剂的产品。
7.权利要求3-5任一项所述的叶酸制剂在制备治疗缺乏叶酸导致的疾病的药物方面的应用。
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