CN110859862A - 一种微生物发酵转化当归改善其有效成分的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种微生物发酵转化当归改善其有效成分的方法，包括以下步骤：1）菌种活化：将地衣芽孢杆菌和扣囊复膜孢酵母菌种分别用LB培养基和麦芽汁琼脂培养基连续活化2~3次；2）菌种扩大培养：将活化的菌种分别接种至特定的种子培养基中培养获得种子液；3）发酵转化：制备当归发酵培养基，将芽孢杆菌和酵母菌种子液按比例接种后进行发酵转化；4）发酵后冷冻干燥处理。本发明采用芽孢杆菌和酵母菌混合发酵对当归进行生物转化，并添加负离子粉、水杨酸、丙氨酸等物质以促进菌种生长代谢，提高转化效率。本发明比转化前当归生药的多糖含量提高了3倍，为当归的深度开发和利用提供了更好的方法。

Description

一种微生物发酵转化当归改善其有效成分的方法

技术领域

本发明涉及药学生物工程技术领域，尤其是涉及一种微生物发酵转化当归改善其有效成分的方法。。

背景技术

我国中药历史悠久，中药资源丰富，为保证广大人民的身体健康起到巨大作用，国际上正越来越意识到中药在治疗和预防疾病中的重要作用。中药炮制是中医临床用药的一大特色，是传统中医药文化的重要组成部分。中药炮制是指在中医药理论的指导下，依据中医辨证施治需要，将药材通过净制、切制、炮炙处理，加工成一定规格饮片的技术，可缓和药性、增强药性或改变药性。中药材经不同方法炮制后，外观发生了改变，在药性、化学成分、药理作用等方面亦有较大变化，可充分发挥药用价值，增强临床疗效。

微生物发酵为中药炮制的重要手段之一，在我国具有几千年的悠久历史。中药的发酵炮制过程实际上是一个生物转化的过程，具有选择性强，反应条件温和，转化效率高，副产物少，有效成分破坏少，毒副作用低，下游处理方便等特点。微生物在自身生长代谢过程中产生丰富的胞内胞外酶，如淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶、果胶酶、脂肪酶等，能够产生酯化、氧化、葡萄糖基化、异构化、甲基化、乙酰化等多种反应，分解转化原料中特定的底物生成新的活性成分，同时产生丰富的次级代谢产物。通过微生物的生长代谢和生命活动来炮制中药，可以比一般的物理或化学的炮制手段更大幅度地改变药性，提高疗效，降低毒副作用， 扩大适应症，产生新的功效，提高有效成分的提取率和吸收利用率。

传统的中药发酵法是将净制或处理后的药物，置于一定的温度和湿度环境中，由于霉菌和酶的催化分解作用，使药物发泡、生衣的一种加工炮制方法。中药六神曲、半夏曲、红曲、建神曲、淡豆豉、沉香曲等都是通过发酵炮制而成的药物。但是传统的中药发酵仅是利用天然菌种进行发酵，菌种不纯，且操作方法原始粗放，劳动强度大，生产力低下，同时也不能根据需要将各种微生物组合接种在一起，从而限制了微生物的作用。因此，应用现代生物技术发酵转化中药已成为中药现代化的研究热点。

现代中药发酵是在传统中药炮制发酵技术的基础上，结合现代生物工程技术、微生物发酵理论、现代制药工程等理论形成的新型中药制药新技术。利用现代生物技术发酵中药，将对扩大中药治疗范围、改进剂型、创制新药方面提供新的技术手段，为中药吸收现代科技成果提供新途径，对中药的发展具有广阔的前景。根据反应体系的状态，现代中药发酵技术分为固体发酵和液体发酵两类。固体发酵不经灭菌体系开放，易于控制温度、湿度、酸碱度、通气等培养条件，药材有效成分转化率较高，但开放的体系也造成了发酵菌种的混杂，不利于发酵效果最大化，对产品的卫生质量也有潜在的威胁。固体发酵在大规模工业生产上存在较大困难，从而限制了固体发酵的应用。液体发酵，主体是将菌种加入培养基中，进行充分混合后在适宜温度下进行发酵，产品包括菌丝体与发酵液两部分。液体深层发酵生产自动化程度较高，物质传递率高，继承性好，能够提高发酵中药的均一性，理论上能够提高发酵炮制中药的产量，有利于实现大规模工业化生产。

当归又名为秦归、云归等，为伞形科植物当归[Angelica sinensis (Oliv.)Diels]的干燥根，其产地主要分布在甘肃、陕西、湖北、云南、四川等地，其中中国甘肃岷县所产当归品质最好。当归入肝、心、脾经，最早记载于《神农本草经》，被称为“血家之圣药”。当归具有补血活血、调经止痛、润肠通便的作用，在血虚萎黄、眩晕心悸、月经不调、经闭痛经、虚寒腹痛、风湿痹痛、肠燥便秘等病症中均有广泛应用。当归是中药组方中使用频率最高的一味中药，历来素有“十方九归”的说法。现代药理研究表明，当归的化学成分主要包括挥发油和水溶性部分，挥发油中主要含藁苯内酯、当归酮等40多种成分；水溶性部分主要含有阿魏酸、当归多糖、氨基酸等成分；此外还含有钙、钠、铜、铁、锰、锌等多种微量元素和尿嘧啶、腺嘌呤、维生素E、青霉菌属的代谢产物及香豆素类等成分。其中当归多糖是重要的功效成分，具有丰富的生物活性，通过激活补体，对机体免疫系统、造血系统发挥作用，还具有抗肿瘤、抗放射性损伤和促进胃溃疡愈合等活性，在医疗、保健食品行业具有广阔的应用前景。当归虽然使用历史悠久，但目前一般仍是以原药材和初级加工品供应市场为主，当归中的有效成分并没有得到充分利用，因此有必要采用微生物方法改善和提高当归中主要成分的提取率，修饰其中主要活性成分，提高其生物利用度。但是，目前国内外关于当归生物转化方面的研究仍处于起步阶段，在发酵转化工艺方面还有待进一步改善。。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用微生物发酵转化法来提高当归有效成分——当归多糖的含量的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种微生物发酵转化当归改善其有效成分的方法，包括以下步骤：

一种微生物发酵转化当归改善其有效成分的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）菌种活化：将冻存的芽孢杆菌菌种复苏，接种于LB培养基斜面，在30℃下静置培养24~48h；将冻存的酵母菌菌种复苏，接种于麦芽汁琼脂培养基斜面，在28~30℃下静置培养48~72h；芽孢杆菌和酵母菌均连续活化2~3次；

2）菌种扩大培养：将活化的芽孢杆菌以1%~3%的接种量接种至芽孢杆菌种子培养基中，在30℃、150r/min振荡培养18~24h得芽孢杆菌种子液；将活化的扣囊复膜孢酵母以3%~5%的接种量接种至酵母种子培养基中，在30℃、180r/min振荡培养30~36h得酵母种子液；

3）发酵转化：将当归生药粉末与蒸馏水按照1:5~1:10（g/mL）的料液比混合得当归基质，再添加负离子粉45~55mg/L，水杨酸70~80μmol/L，葡萄糖酸钙7~8g/L，丙氨酸2~5g/L，L-脯氨酸500~700mg/L，柠檬酸钠1~2g/L，油酸1~2g/L，初始pH调节至6.6~7.0，经灭菌处理后制成当归发酵培养基；将芽孢杆菌和酵母菌种子液接入当归发酵培养基进行发酵转化，发酵温度为28~32℃，搅拌转速为180~220r/min，发酵转化时间为46~50h；

4）发酵后的处理：发酵结束后将发酵产物经快速预冻结后，在真空条件下冷冻干燥，粉碎，得当归发酵物冻干粉。

步骤1）中，所述芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis），ACCC10236；酵母菌为扣囊复膜孢酵母（Saccharomycopsis fibuligera），CICC 31168。

步骤2）中，所述芽孢杆菌种子培养基的配方为：葡萄糖15g/L，玉米浆28g/L，酵母浸膏7g/L，MgSO₄ 0.7g/L，NH₄Cl 5g/L，K₂HPO₄ 5g/L，KH₂PO₄ 2g/L，鱼类肠液0.1g/L，pH 7.0~7.2。

步骤2）中，所述酵母种子培养基的配方为：葡萄糖20g/L，胰蛋白胨20g/L，酵母浸膏10g/L，生物素 0.4mg/L，甘油10g/L，（NH₄）₂HPO₄ 0.5g/L，pH 6.4~6.6。

步骤2）中，所述芽孢杆菌和酵母菌种子液的细胞密度为1×10⁸~1×10⁹cfu/ml。

步骤3）中，所述中当归生药粉末的制备方法为：取干燥的当归生药用高速万能粉碎机粉碎，过100目标准筛。

步骤3）中，芽孢杆菌与酵母菌种子液的接种比例为1:1，总接种量为10%。

步骤3）中，添加的水杨酸、丙氨酸和L-脯氨酸采用0.22μm滤膜过滤除菌，当归基质及其它添加成分采用115℃灭菌处理15~20min。

本发明具有的优点是：

1）本发明利用地衣芽孢杆菌和扣囊复膜孢酵母两种益生菌混合发酵对当归进行生物转化，比单独芽孢杆菌或单独酵母菌发酵转化效果更好，当归多糖含量更高；本发明在当归发酵培养基中添加了负离子粉、水杨酸、葡萄糖酸钙、丙氨酸、L-脯氨酸、柠檬酸钠及油酸，能够刺激芽孢杆菌和酵母菌的生长代谢，增强细胞活力，提高其对当归的转化效率，从而提高当归多糖含量。

2）本发明的操作流程简单，液体发酵易于控制，微生物转化对当归有效成分的提取具有较大提高作用，比未经发酵转化的当归生药中多糖含量提高了3倍。本发明的研究思路和结果为开发利用中药材功能成分提供借鉴，为传统中药材的深度开发和利用提供更好的方法和平台。

具体实施方式

在本发明的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

所用菌种：地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis），ACCC10236；扣囊复膜孢酵母（Saccharomycopsis fibuligera），CICC 31168。

一种微生物发酵转化当归改善其有效成分的方法，包括以下步骤：

1）菌种活化：将冻存的芽孢杆菌菌种复苏，接种于LB培养基斜面，在30℃下静置培养24~48h；将冻存的酵母菌菌种复苏，接种于麦芽汁琼脂培养基斜面，在30℃下静置培养48~72h；芽孢杆菌和酵母菌均连续活化2~3次。

2）菌种扩大培养：将活化的芽孢杆菌以2%的接种量接种至芽孢杆菌种子培养基（配方为：葡萄糖15g/L，玉米浆28g/L，酵母浸膏7g/L，MgSO₄ 0.7g/L，NH₄Cl 5g/L，K₂HPO₄5g/L，KH₂PO₄ 2g/L，鱼类肠液0.1g/L，pH 7.0）中，在30℃、150r/min振荡培养18~24h得芽孢杆菌种子液；将活化的扣囊复膜孢酵母以4%的接种量接种至酵母种子培养基（葡萄糖20g/L，胰蛋白胨20g/L，酵母浸膏10g/L，生物素 0.4mg/L，甘油10g/L，（NH₄）₂HPO₄ 0.5g/L，pH6.5）中，在30℃、180r/min振荡培养30~36h得酵母种子液；芽孢杆菌和酵母菌种子液的细胞密度为1×10⁸~1×10⁹cfu/ml。

3）发酵转化：将当归生药粉末与蒸馏水按照1:8（g/mL）的料液比混合得当归基质，再添加负离子粉50mg/L，水杨酸75μmol/L，葡萄糖酸钙7.5g/L，丙氨酸3.5g/L，L-脯氨酸600mg/L，柠檬酸钠1.5g/L，油酸1.5g/L，初始pH调节至6.8，水杨酸、丙氨酸和L-脯氨酸采用0.22μm滤膜过滤除菌，当归基质及其它添加成分采用115℃灭菌处理15min，制成当归发酵培养基；将芽孢杆菌和酵母菌种子液按照接种比例为1:1，总接种量为10%接入当归发酵培养基进行发酵转化，发酵温度为30℃，搅拌转速为200r/min，发酵转化时间为48h；当归生药粉末的制备方法为：取干燥的当归生药用高速万能粉碎机粉碎，过100目标准筛。

4）发酵后的处理：发酵结束后将发酵产物经快速预冻结后，在真空条件下冷冻干燥，粉碎，得当归发酵物冻干粉。

当归多糖的含量测定

标准曲线的建立：精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖50mg，蒸馏水定容至100mL的容量瓶中，得到浓度为0.5mg/mL的葡萄糖对照品。精密量取葡萄糖对照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL，分别置于50mL的容量瓶中，蒸馏水定容，摇匀。各精密吸取2.0mL置干净的试管中，各管加入5%的苯酚1.0mL混匀，迅速加入浓硫酸6.0mL摇匀，室温下静置10min后，放入90℃水浴中加热20min，取出冷却，在490nm处测定吸光度，以葡萄糖浓度为横坐标，以吸光度A为纵坐标，绘制得到标准曲线。

提取与测定：取当归发酵物冻干粉约0.5g，精密称定，加水200mL，加热回流1h，放冷，转移至250mL容量瓶中，用少量水分次洗涤容器，洗液并入同一容量瓶中，加水至刻度，摇匀，滤过。精密吸取续滤液2mL，置15mL离心管中，精密加入无水乙醇10mL，涡旋混匀，冷藏1h，取出，4000r/min离心15min，弃去上清液，沉淀加85%乙醇洗涤2次，每次8mL，离心，弃去上清液，沉淀加热水溶解，转移至10mL容量瓶中，放冷，加水至刻度，摇匀，备用。精密吸取供试品溶液2.0mL，置25mL具塞试管中，加入5%的苯酚1.0mL， 摇匀，再精密加入浓硫酸6.0mL摇匀，室温下静置10min后，放入90℃水浴中加热20min，取出冷却，在490nm处测定吸光度，通过回归方程计算供试品溶液中当归多糖含量。

实施例2 不同接种比例对发酵转化效果的影响

按照实施例1中的方法进行发酵转化试验，接种时芽孢杆菌与酵母菌的接种比例分别为10:0、9:1、7:3、5:5、3:7、1:9、0:10，总接种量为10%，发酵结束后测定当归多糖的含量，考察不同接种比例对发酵转化后当归多糖含量的影响，结果如表1所示。

从表1可以看出，混合菌种发酵转化后当归多糖的含量明显高于单独芽孢杆菌或酵母菌发酵，且当芽孢杆菌与酵母菌的接种比例为5:5（即1:1）时，当归多糖含量达到最高，因此选取1:1作为芽孢杆菌与酵母菌的最佳接种比例。

实施例3 不同总接种量对发酵转化效果的影响

按照实施例1中的方法进行发酵转化试验，接种时芽孢杆菌与酵母菌的接种比例为1:1，总接种量分别为2%、4%、6%、8%、10%、12%，发酵结束后测定当归多糖的含量，考察不同总接种量对发酵转化后当归多糖含量的影响，结果如表2所示。

从表2可以看出，随着总接种量的增加，当归多糖的含量呈上升趋势，当总接种量达到10%时，当归多糖的含量达到最大值，因此选取10%作为最佳接种量。

实施例4 不同发酵时间对发酵转化效果的影响

按照实施例1中的方法进行发酵转化试验，发酵时间分别为24h、36h、48h、60h、72h，发酵结束后测定当归多糖的含量，考察不同发酵时间对发酵转化后当归多糖含量的影响，结果如表3所示。

从表3可以看出，随着发酵时间的增加，当归多糖的含量也相应的上升，其中以48h对当归多糖含量的提高影响最为显著，而48h后当归多糖含量基本趋于平缓，变化不大。发酵时间对菌体发酵转化当归的作用效果较明显，时间过短菌体发酵作用可能不会很好的体现出来，时间过久会提高发酵成本。因此，选取48h为最佳发酵时间。

实施例5 不同水杨酸浓度对发酵转化效果的影响

按照实施例1中的方法进行发酵转化试验，添加的水杨酸浓度分别为0、25μmol/L、50μmol/L、75μmol/L、100μmol/L、125μmol/L，发酵结束后测定当归多糖的含量，考察不同水杨酸浓度对当归多糖含量的影响，结果如表4所示。

从表4可以看出，与不添加水杨酸相比，添加25~125μmol/L的水杨酸后，当归多糖含量均有不同程度提高，其中当水杨酸浓度为75μmol/L时，当归多糖含量达到最大，因此，选取75μmol/L作为水杨酸的最佳添加浓度。水杨酸其化学本质是酚类物质，是一种重要的细胞信号分子，可以诱导许多植物或微生物的生理反应。有研究表明水杨酸对微生物的影响是多方面和复杂的，在一定浓度范围内，水杨酸对微生物的生长代谢具有促进作用，因此本发明通过添加适宜浓度的水杨酸，来促进地衣芽孢杆菌和扣囊复膜孢酵母的生长代谢，提高其对当归的转化能力，从而达到提高当归多糖含量的目的。

实施例6 不同负离子粉浓度对发酵转化效果的影响

按照实施例1中的方法进行发酵转化试验，添加的负离子粉浓度分别为0、10mg/L、30mg/L、50mg/L、70mg/L、90mg/L，发酵结束后测定当归多糖的含量，考察不同负离子粉浓度对发酵转化后当归多糖含量的影响，结果如表5所示。

从表5可以看出，随着负离子粉浓度的提高，当归多糖含量呈先升高后降低的趋势，当负离子粉浓度为50mg/L时，当归多糖含量达到最大，继续提高负离子粉浓度至90mg/L，当归多糖含量反而低于未添加负离子粉时，因此，选取50mg/L作为负离子粉的最佳添加浓度。负离子粉离子粉是以含硼为特征的铝、钠、铁、锂环状结构的硅酸盐物质，具有永久性的自发电极，受到环境的影响会持久释放羟基负离子，还能发射远红外线，提高水的溶解力、渗透力，因此在发酵时添加负离子粉可以有效增加发酵液中的溶氧，促进芽孢杆菌和酵母菌生长，增强细胞代谢能力，提高其对当归的发酵转化效果。但负离子粉也有着较强的氧化还原的作用，能破坏微生物的细胞膜或细胞原生质活性酶的活性，因此负离子粉浓度过高时会不利于芽孢杆菌和酵母菌的生长代谢，反而影响其对当归的发酵转化效果。

实施例7 不同处理方法对当归多糖含量的影响

当归生药：用高速万能粉碎机粉碎，过100目标准筛；

炭炒当归：取当归生药100g，用中火炒至外部呈微黑色时喷少许清水，灭尽火星后取出晾干；

清炒当归：取当归生药100g，用文火将其炒至全部呈黄色，最后出锅晾干；

酒炙当归：取当归生药100g，加黄酒40mL，拌匀静置1h焖透，待黄酒被吸尽后置锅内，用文火炒干至颜色微发黄时取出放凉；

发酵当归：实施例1中获得当归发酵物冻干粉；

将炮制处理后的当归充分干燥，同样用高速万能粉碎机粉碎，过100目标准筛。

分别取当归生药、炭炒当归、清炒当归、酒炙当归粉末约0.5g，精密称定，加水200mL，加热回流1h，放冷，转移至250mL容量瓶中，用少量水分次洗涤容器，洗液并入同一容量瓶中，加水至刻度，摇匀，滤过。精密吸取续滤液2mL，置15mL离心管中，精密加入无水乙醇10mL，涡旋混匀，冷藏1h，取出，4000r/min离心15min，弃去上清液，沉淀加85%乙醇洗涤2次，每次8mL，离心，弃去上清液，沉淀加热水溶解，转移至10mL容量瓶中，放冷，加水至刻度，摇匀，备用。精密吸取供试品溶液2.0mL，置25mL具塞试管中，加入5%的苯酚1.0mL，摇匀，再精密加入浓硫酸6.0mL摇匀，室温下静置10min后，放入90℃水浴中加热20min，取出冷却，在490nm处测定吸光度，通过回归方程计算供试品溶液中当归多糖含量。结果如表6所示。

从表6可以看出，在常规的当归炮制处理方法中，酒炙后当归多糖含量最高，为26.58%，是当归生药（13.25%）的2倍，而采用本发明的方法获得的发酵当归，其多糖含量高达41.74%，是当归生药的3.15倍，增幅显著。本发明采用的微生物发酵转化法对中药材当归的有效成分当归多糖含量具有极大的提高作用，比常规的当归炮制方法效果更好，为当归的进一步开发利用提供了新途径。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种微生物发酵转化当归改善其有效成分的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）菌种活化：将冻存的芽孢杆菌菌种复苏，接种于LB培养基斜面，在30℃下静置培养24~48h；将冻存的酵母菌菌种复苏，接种于麦芽汁琼脂培养基斜面，在28~30℃下静置培养48~72h；芽孢杆菌和酵母菌均连续活化2~3次；

2）菌种扩大培养：将活化的芽孢杆菌以1%~3%的接种量接种至芽孢杆菌种子培养基中，在30℃、150r/min振荡培养18~24h得芽孢杆菌种子液；将活化的扣囊复膜孢酵母以3%~5%的接种量接种至酵母种子培养基中，在30℃、180r/min振荡培养30~36h得酵母种子液；

3）发酵转化：将当归生药粉末与蒸馏水按照1:5~1:10（g/mL）的料液比混合得当归基质，再添加负离子粉45~55mg/L，水杨酸70~80μmol/L，葡萄糖酸钙7~8g/L，丙氨酸2~5g/L，L-脯氨酸500~700mg/L，柠檬酸钠1~2g/L，油酸1~2g/L，初始pH调节至6.6~7.0，经灭菌处理后制成当归发酵培养基；将芽孢杆菌和酵母菌种子液接入当归发酵培养基进行发酵转化，发酵温度为28~32℃，搅拌转速为180~220r/min，发酵转化时间为46~50h；

4）发酵后的处理：发酵结束后将发酵产物经快速预冻结后，在真空条件下冷冻干燥，粉碎，得当归发酵物冻干粉。

2.根据权利要求1所述的一种微生物发酵转化当归改善其有效成分的方法，其特征在于，步骤1）中，所述芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis），ACCC10236；酵母菌为扣囊复膜孢酵母（Saccharomycopsis fibuligera），CICC 31168。

3.根据权利要求1所述的一种微生物发酵转化当归改善其有效成分的方法，其特征在于，步骤2）中，所述芽孢杆菌种子培养基的配方为：葡萄糖15g/L，玉米浆28g/L，酵母浸膏7g/L，MgSO₄ 0.7g/L，NH₄Cl 5g/L，K₂HPO₄ 5g/L，KH₂PO₄ 2g/L，鱼类肠液0.1g/L，pH 7.0~7.2。

4.根据权利要求1所述的一种微生物发酵转化当归改善其有效成分的方法，其特征在于，步骤2）中，所述酵母种子培养基的配方为：葡萄糖20g/L，胰蛋白胨20g/L，酵母浸膏10g/L，生物素 0.4mg/L，甘油10g/L，（NH₄）₂HPO₄ 0.5g/L，pH 6.4~6.6。

5.根据权利要求1所述的一种微生物发酵转化当归改善其有效成分的方法，其特征在于，步骤2）中，所述芽孢杆菌和酵母菌种子液的细胞密度为1×10⁸~1×10⁹cfu/ml。

6.根据权利要求1所述的一种微生物发酵转化当归改善其有效成分的方法，其特征在于，步骤3）中，所述中当归生药粉末的制备方法为：取干燥的当归生药用高速万能粉碎机粉碎，过100目标准筛。

7.根据权利要求1所述的一种微生物发酵转化当归改善其有效成分的方法，其特征在于，步骤3）中，芽孢杆菌与酵母菌种子液的接种比例为1:1，总接种量为10%。

8.根据权利要求1所述的一种微生物发酵转化当归改善其有效成分的方法，其特征在于，步骤3）中，添加的水杨酸、丙氨酸和L-脯氨酸采用0.22μm滤膜过滤除菌，当归基质及其它添加成分采用115℃灭菌处理15~20min。