CN102212564A - 一种发酵生产γ-氨基丁酸的方法及其发酵培养基 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种发酵生产γ-氨基丁酸的方法，其包括步骤：将米糠、谷氨酸及奶粉按比例混合，其余以水补足，以制作培养基；然后，将乳酸菌液接种至冷却后的培养基，并于均匀混合后，在30-42℃下发酵4小时以上。由此方法及其培养基所得到的发酵物的γ-氨基丁酸含量远高于米糠原料，可以直接作为食品添加物。

Description

一种发酵生产γ-氨基丁酸的方法及其发酵培养基

技术领域

本发明涉及一种γ-氨基丁酸的生产方法，尤其指以发酵方式处理米糠原料，使其γ-氨基丁酸含量远高于米糠原料中的含量。

背景技术

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)属于非蛋白质氨基酸，极易溶于水中，但不溶于醇、醚及苯，分子量103.12，化学式为NH₂(CH₂)₃COOH或(C₄H₉NO₂)，属于耐高温型，不易受热破坏。GABA为抑制中枢神经系统的传递物质，具有许多生理功能，例如有降血压功能、增进脑机能代谢作用、增强记忆力、有效抑制焦虑与失眠可达镇静效果，预防帕金森氏症、改善更年期障碍、预防动脉硬化、活化肾机能、促进酒精代谢、防止肥胖等诸多功能(引用文献3、5和6)。

米糠(麸皮)为稻谷碾制后的副产品，一般多废弃或仅作为饲料用途，利用率颇低。米糠虽然仅占谷粒的5-8％，却含有重要的营养成分及生理活性物质，美国农业部研究报告显示，稻米中约64％的营养素都存在米糠中，内含丰富的油脂、植物性活性物质，包括维生素B群、生育酚(α-tocopherol)、生育三烯酚(Tocotrienols)、植物甾醇(Phytosterols)、谷维醇(γ-oryzanol)、植酸(Phytic acid)、肌醇六磷酸(Inositol hexaphosphate)等(引用文献1)。米糠中另含有GABA，但其含量仅约28.1mg/100g。

在植物体中GABA的含量很低，必须经过化学合成或生物法处理才得以提高GABA含量(引用文献7、9和10)。化学合成法是利用邻苯二甲酰亚胺钾(Phthalimide Potassium)和4-氯丁腈(4-Chlorobutyronitrile)在强烈条件下反应，再以浓硫酸(Sulfuric Acid)水解后得到产物，或是利用吡咯烷酮(Pyrrolidone)经氢氧化钙(Calcium Hydroxide)、碳酸氢铵(Ammonium AcidCarbonate)水解、开环制得GABA。化学法虽反应较快速、产率高，但是制备过程中除去有毒物质较为复杂，安全性较差且所耗成本较高(引用文献4和8)；生物合成法主要利用酶催化将氨基丁酸前体转换合成，由谷氨酸脱羧酶直接且不可逆的脱去谷氨酸的α-羧基来合成GABA，或者利用GABA转氨酶和琥珀半醛酸脱氢酶将GABA转换为琥珀酸而消耗GABA(引用文献2和8)。另外研究发现，乳酸菌(Lactic acid bacteria)具有谷氨酸脱羧酶的活性，可以通过发酵过程产生GABA；此外大肠杆菌(Escherichia coli)、红曲霉(Monascus)、米曲菌(Aspergillus oryzae)和根霉(Rhizopus spp.)亦有生产GABA的功能；然而考虑安全性较高的微生物，多使用具有保健功效的益生菌如乳酸菌来进行发酵，如台湾专利第200811288号、日本专利特开第2000-210075号、日本专利第3426157号、日本专利第2704493号。这些专利的发酵方法有的使用酪蛋白(casein)、消化蛋白质(peptone)等高价成分，若考虑到成本则生产性欠佳；或有的使用12.5-18％的盐，对于现今社会低盐饮食的趋势，并不利于推广。

引用文献：

1.Raghuram TC和Rukminic，Nutritional significance of rice bran oil.(1995)Indian Jouranal of Medical Research.，102：241-244.

2.Shelp B.J.，Bown A.W.，和Mclean M.D.(1999).Metabolism and functions ofgamma-aminobutyric acid.Trends Plant Sci.4(11)：446-452.

3.冈田忠司，2001。GABA富化コナの胚芽生理机能，36(6)：7-9。

4.林少琴、吴若红、邹开煌、程开，2004。米胚芽中γ-氨基丁酸的分离提取及鉴定。食品科学，25(1)：76-78。

5.茅原纮、杉浦友美，2001。近年のGABA生理机能研究(脑机能改善作用、高血压作用を中心に)，36(6)：4-6。

6.许建军、江波、许时婴，2003。γ-氨基丁酸(gaba)一种新型的功能食品因子。食品科技，24(1)：40-42。

7.陈怡伶，2003。发芽糙米对糖尿病症患者血糖值及血清胆固醇浓度的影响。静宜大学食品营养所。

8.陈海军、林亲彔、李丽辉，2006。食品原料中GABA的富集研究进展。现代食品科技，22(1)：196-198。

9.萧凤岐，2004。积极开发GABA食品。中国酿造，12：22-24。

10.白松、林向阳、阮榕生、郑丹丹、刘玉环、何承云，2005。γ-氨基丁酸的分布与制备。现代食品科技。21(2)：202-205。

发明内容

鉴于目前生产GABA技术的缺点，因此本发明解决的首要问题是，降低GABA生产中的高成本、高盐分及复杂的制备过程。

本发明要解决的另一问题是，提高米糠的GABA的含量，以便提高米糠的利用价值。

为解决上述问题，本发明提供一种GABA的生产方法，即发酵处理米糠以生产GABA的方法，其包括步骤：

制备培养基：将米糠、谷氨酸及奶粉按比例混合，其余以水补足，并调节pH值；

将乳酸菌液接种至冷却后的培养基；

将均匀混合的乳酸菌液与培养基在30-42℃下发酵4小时以上。

经如上方法所得到的米糠发酵产物的GABA含量最高可达2501mg/100g以上，远高于米糠原料的GABA含量(28.1mg/100g)；而本发明最终发酵产物再经过真空冷冻干燥处理，可保留其营养价值，其亦有具保健功能性的膳食纤维、多酚类化合物及肌醇六磷酸等抗癌及抗氧化物质，可以直接作为食品添加物。

本发明如上述的GABA生产方法，由于仅使用碾米后副产物的米糠为原料，且培养基中的其它成分及乳酸菌粉亦是为商业所大量应用，故其成本很低。再者，整个步骤中并未使用任何盐分，对于作为成品应用于食品时，亦有低盐分的保证。最后，本发明在原料前处理及整个发酵过程中，其操作简单不繁杂，亦可提高其产率。

本发明如上述的GABA生产方法，其中米糠添加比例为培养基总体积的0.1-15％；谷氨酸(glutamic acid)添加比例为培养基总体积的0.1-0.5％；奶粉添加比例为培养基总体积的0.1-5％。乳酸菌液由嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)和保加利亚乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus)调配而成，乳酸菌液的接种量为培养基总体积的1-5％(v/v)；即本发明如上述的GABA生产方法中所应用的培养基包括：培养基总体积0.1-15％的米糠、0.1-0.5％的谷氨酸、0.1-5％的奶粉及1-5％的乳酸菌液，其余为水。

本发明如上述的GABA生产方法，其中培养基的pH值调节至6.5，而优选食品级的pH调节剂如碳酸钾或柠檬酸来进行调节。

本发明如上述的GABA生产方法，其中米糠优选为稳定米糠；谷氨酸优选为食品级；奶粉优选为脱脂奶粉。

本发明如上述的GABA生产方法，其中为减少发酵产物的营养流失，且保有其中的乳酸菌活性；还可以在发酵完成后进行真空冷冻干燥的步骤。

以下以优选的实施例详细说明本发明的进一步技术特征，而非限制本发明的范围。

具体实施方式

实施例1：发酵生产γ-氨基丁酸的方法

本发明的发酵生产γ-氨基丁酸(GABA)的方法包括步骤：制备培养基：将米糠、谷氨酸及奶粉按比例混合，其余以水补足，并调节pH值；将乳酸菌液接种至冷却后的培养基；均匀混合的乳酸菌液与培养基在30-42℃下发酵4小时以上。

利用前述的方法，本实施例的培养基，选用稳定米糠(stabilized rice bran)，其添加比例为培养基总体积的11.1％；食品级谷氨酸，其添加比例为培养基总体积的0.378％；脱脂奶粉，其添加比例为培养基总体积的1％。

上述步骤中所接种的乳酸菌液，在本实施例中是由商用型制作酸奶的代号YC-380菌粉所调配而成的，该菌粉是由嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)和保加利亚乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus)所组合而成的；乳酸菌液的调配是利用每包规格50U的菌粉，将一包菌粉溶入经90℃、30分钟加热过的10％脱脂奶水中，利用磁力搅拌使菌粉完全溶解后，再加入培养基中。乳酸菌液的接种量在本实施例中为培养基总体积的2.5％(v/v)。

本实施例利用上述步骤，将米糠、谷氨酸及奶粉按比例混合后先扣除要加入的乳酸菌液量，其余比例以水补足；并利用碳酸钾或柠檬酸等食品级pH调节剂调节培养基的pH值至6.5后进行灭菌，待冷却后接种2.5％(v/v)乳酸菌液；并待乳酸菌液与培养基混合均匀后在40℃下发酵4小时以上；随后进行真空冷冻干燥处理，便成为富含GABA的米糠发酵产物。

实施例2：GABA含量分析

(1)取实施例1的米糠发酵产物均质后精确秤量0.5～2g的样品，置入50mL离心管中，加入25％酒精30mL，在室温下萃取30分钟，再在4℃下以1000×g离心10分钟，收集上层澄清液至浓缩瓶中，再将沉淀物重复上述步骤2-3次，将所收集的上层澄清液，在35℃下通过减压浓缩机浓缩至完全干燥。

(2)再以0.5mL的0.02N盐酸溶液震荡润洗浓缩瓶，将洗出液转移至10mL离心管，再重复步骤一次，合并洗出液低温高速离心10分钟(4℃，17000×g)，取上层澄清液至样品瓶，备用。

(3)标准品的配制(GABA标准品)：精确秤量GABA标准药品0.05g置于烧杯，用0.02N盐酸溶解转并移至50mL定量瓶中再进行定容，则为所需浓度1000mg/L。

(4)标准操作液：取标准原液1、2、3及4mL于20mL定量瓶，用0.02N盐酸进行定容，即为50、100、150及200mg/L。

(5)测量样品的配制

取20μL上层澄清液样品与980μL 0.02N HCl混合均匀成1mL后，由此再取出10μL混合液于试管中加入70μL Vial 1(AccQ Fluor硼酸盐)缓冲溶液，再加入20μL Vial 2A(将AccQ Fluor衍生试剂粉末加入到1mL的10mM AccQFluor中)试剂，震荡10秒，室温静置1分钟，再置于55℃水浴10分钟，水浴后用流水冷却至室温。再将配制的测量样品以0.20μm样品过滤膜过滤至样品瓶，进行HPLC分析。

(6)HPLC分析条件

A.层析柱：3.9×150mm Nova-pak C18

(Part No.WAT086344，Waters)。

B.保护柱：Nova-pak C18

(Part No.WAT044380，Waters)。

C.标准品：GABA标准品，购自sigma。

D.流动相比例：A液为醋酸钠缓冲溶液(取WAT052890 AccQ Tag洗脱液A 100mL，加去离子水定量至1000mL)，B液为60％乙腈(取乙腈600mL，加去离子水定量至1000mL)。

A液与B液的比例：

E.柱恒温器温度：37℃。

F.荧光检测器条件：λex＝250nm，λem＝395nm。

G.流速：1mL/min。

H.注入量：20μL。

(7)比对测量样品HPLC图谱中GABA成分，通过标准曲线的直线方程式计算出测量样品中GABA含量，代入下列公式，求出样品GABA含量，最终单位以mg/100g干重表示。

于重样品中GABA含量(mg/100g)＝(测量样品中GABA含量×100)/样品重量×(100-样品水分％)×10。

经本实施例分析得知实施例1的米糠发酵产物，其GABA含量为1611.1mg/100g，相较于米糠原料的GABA含量28.1mg/100g，足足超过50倍以上，显示通过本发明的方法确实可以大幅提升米糠的GABA含量。

实施例1虽在24小时的发酵时间内产生数十倍于米糠原料的GABA含量，但利用本发明的方法进行不同发酵时间(4、8、12、24及48小时)所获得的GABA含量比较(如表1)可知，发酵4小时后GABA含量即有增加(不排除4小时以下的时间GABA即有增加)，且随着发酵时间的延长，GABA含量有明显增加的趋势，经换算每小时GABA增加速率，得知发酵4小时延长至8小时后，GABA每小时可增加123.6mg；发酵8小时延长至12小时后，每小时增加49.7mg；再延长一倍发酵时间至24小时后，每小时可增加71.1mg；经发酵48小时后GABA含量可达2500.9mg/100g，较发酵24小时的GABA产量高，但每小时仅增加37.1mg/100g。由此可推知，GABA含量虽可随发酵时间而增加，但其增加速率并未相对增加且有趋缓的现象。因此，本发明在产业的应用时，可根据最终产品的特性、价值及所需的GABA含量，而选择以适当的发酵时间操作。

表1

发酵时间(小时)	GABA含量(mg/100g，干重)
		4	64.3
8	558.7
		12	757.6
24	1611.1
		48	2500.9

实施例3：米糠GABA产品的应用

本实施例试着以实施例1的米糠发酵产物进行食品加工，以验证制成食品后的GABA含量。本实施例将实施例1的米糠发酵产物应用于天使蛋糕的烘焙，其配方比例如表2。

表2

材料名称	烘焙百分比(％)	重量(g)
			蛋白	46.2	784
塔塔粉	0.6	10
			食盐	0.35	6
细砂糖	30.2	512
			蓬莱米粉	17	288

GABA发酵物	5.7	96
			焦糖香料	少许	～
合计	100	1696

方法步骤：

步骤1：将蛋白倒入缸中，用网状搅拌器中速打发至湿性发泡，手指勾起成一细长尖峰即可。

步骤2：先将蛋白量2/3糖、2/3盐及塔塔粉一起倒入已发泡的蛋白中，继续用中速打至湿性发泡。

步骤3：将米粉、GABA发酵物及剩余的原料过筛后倒入步骤2的发泡蛋白中，用慢速搅拌均匀即可。

步骤4：倒入模型中以200℃进行烘烤20-30分钟。

经GABA含量测试结果，每30g蛋糕中约含有25-29mg GABA。

以上实施例仅为说明本发明的优选实施方式，并非用以限制本发明的范围，任何本领域的技术人员，在参照本发明如上揭露的技术说明后，在不悖离本发明技术实质的情况下的进行变化、改进都是可能的。因此，本发明的范围如本发明的权利要求所限定。

Claims (10)

1.一种发酵生产γ-氨基丁酸的方法，该方法包括步骤：

将米糠、谷氨酸及奶粉按比例混合，其余以水补足，并调节pH值以制备培养基；

将乳酸菌液接种至冷却后的培养基；

将均匀混合的乳酸菌液与培养基在30-42℃下发酵4小时以上。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述米糠添加比例为培养基总体积的0.1-15％；谷氨酸添加比例为培养基总体积的0.1-0.5％；奶粉添加比例为培养基总体积的0.1-5％。

3.如权利要求1所述的方法，其中调节培养基的pH值至6.5。

4.如权利要求3所述的方法，其中以食品级的碳酸钾或柠檬酸为pH调节剂以调节培养基的pH值。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述米糠为稳定米糠。

6.如权利要求1所述的方法，其中所述奶粉为脱脂奶粉。

7.如权利要求1所述的方法，其中所述乳酸菌液由嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌调配而成。

8.如权利要求1所述的方法，其中所述乳酸菌液的接种量的体积为培养基总体积的1-5％。

9.如权利要求1所述的方法，还包括在发酵完成后对发酵产物实施真空冷冻干燥的步骤。

10.一种在权利要求1所述的方法中所使用的培养基，该培养基包括：培养基总体积0.1-15％的米糠、0.1-0.5％的谷氨酸、0.1-5％的奶粉及1-5％的乳酸菌液，其余为水。