CN109527339A - 一种利用鼠李糖乳杆菌去除液体样品中展青霉素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用鼠李糖乳杆菌去除液体样品中展青霉素的方法，涉及污染物净化方法技术领域，技术方案为：(1)鼠李糖乳杆菌预处理；(2)调整含有展青霉素的液体体系的pH；(3)将步骤(1)预处理得到的鼠李糖乳杆菌加入到步骤(2)得到的液体体系中，摇床孵育后，将鼠李糖乳杆菌从液体体系中分离出去，即得到去除了展青霉素的液体。利用本发明提供的方法可以高效去除液体体系中的展青霉素，克服了现有技术中存在的技术问题，方法绿色环保，操作简单。

Description

一种利用鼠李糖乳杆菌去除液体样品中展青霉素的方法

技术领域

本发明涉及污染物净化方法技术领域，具体涉及一种利用鼠李糖乳杆菌去除液体样品中展青霉素的方法。

背景技术

展青霉素(Patulin，PAT)是由丝衣霉属(Byssochlamys)、青霉属(Penicillium)和曲霉属(Aspergillus)等真菌产生的有毒代谢产物，是一种非挥发性的水溶性多聚乙酰内酯类真菌毒素。它广泛的存在于水果及其制品，尤其是果汁及果酱中，摄入展青霉素会引起肝和肾的各方面疾病，它还有致癌、致畸、致突变的性质，所以减少食品中展青霉素的含量对食品安全十分重要。表1及表2为欧盟及我国规定的食品中展青霉素的限量标准。

表1欧盟规定的食品中展青霉素限量标准

表2我国规定的食品中展青霉素的限量标准

近年来，国内外学者研究了大量关于展青霉素脱除的技术。食品中展青霉素常用的脱除技术主要分为物理学方法、化学方法和生物学方法三大类。

物理法是指采用各种物理手段来减少水果在贮藏期感染致病霉菌或降低已经产生的展青霉素含量。如调控水果及制品的贮藏条件(低温贮藏、气调贮藏等)；加强水果的人工拣选和清洗，果汁澄清处理及加热加压处理；物理吸附水果制品中的展青霉素；水果及其制品的微波处理及辐照处理、超声波处理等。挑选高质量的原料是减少食品中展青霉素的第一步，但是这种方法耗时又费力，影响手工操作者的身体健康，而且据报道展青霉素可以从腐烂部位渗透至未腐烂部位，在完整的水果部位仍然可以检测到展青霉素。加强原材料的清洗也可以有效降低产品中展青霉素的含量，但是清洗会使展青霉素进入清洗用水中造成清洗容器、工具及环境的二次污染。另外，在果汁加工过程中使用吸附材料进行吸附，过滤装置过滤以及加热加压等操作均能降低果汁中展青霉素的含量。但通常也会严重影响果汁的颜色并且大大降低总酚含量，同时也会影响果汁的其他形状。工业生产中去除果汁中展青霉素最常见的方法是树脂吸附。但树脂处理基本不会破坏果汁的颜色和风味，但会使展青霉素吸附到树脂材料上，对环境造成污染。

化学方法主要有使用添加剂或化学杀菌剂等方法。但添加剂通常存在安全问题或安全隐患，而杀菌剂只能抑制展青霉素产生菌的生长和产毒，很少有能够直接去除食品中展青霉素的添加剂或杀菌剂见诸报道。

生物学方法对展青霉素的去除作用近年来逐渐受到关注，且大部分集中在酵母菌对展青霉素的去除作用的研究上，这不仅限制了生物法在生产实际中的应用，而且酵母菌的加入对果汁的酸度、糖度和色泽等品质有一定的不良影响。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供一种利用鼠李糖乳杆菌去除液体样品中展青霉素的方法，技术方案为：

(1)鼠李糖乳杆菌预处理；

(2)调整含有展青霉素的液体体系的pH；

(3)将步骤(1)预处理得到的鼠李糖乳杆菌加入到步骤(2)得到的液体体系中，摇床孵育后，将鼠李糖乳杆菌从液体体系中分离出去，即得到去除了展青霉素的液体。

步骤(1)所述鼠李糖乳杆菌为生长到对数期的鼠李糖乳杆菌。

步骤(1)所述预处理为酸处理或高温处理。

所述酸处理，具体为，将鼠李糖乳杆菌菌体悬浮在酸处理液中震荡处理。

所述震荡处理，震荡频率为100-200r/min，震荡处理时间为0.5-3h；所述酸处理液为2mol/L的HCl水溶液。

所述高温处理，处理温度为120-130℃，处理时间为0.5-2h。

步骤(2)所述调整含有展青霉素的液体体系的pH，调整pH至3.0。

步骤(3)所述鼠李糖乳杆菌在所述液体体系中的菌体浓度为为2.5×10⁹-1.25×10¹⁰CFU/mL。

步骤(3)所述摇床培养，摇床转速为150r/min，温度为15-42℃，培养时间为4-12h。

步骤(3)所述分离的方法为过滤或离心。

当菌株和展青霉素混合培养时间为4h、反应温度为37℃、pH值为3、液体中展青霉素初始浓度为1000μg/L、菌体处于对数期时，菌株能达到最大的展青霉素去除率，且菌体浓度越高，吸附的毒素量越多。

有益效果

利用本发明提供的方法可以高效去除液体体系中的展青霉素，克服了现有技术中存在的技术问题，方法绿色环保，操作简单。

展青霉素去除率，酸处理和121℃高温处理的去除率分别比活菌提高了21.37％和19.15％。

附图说明

图1展青霉素标准曲线；

图2菌体处理方式对去除率的影响，图2注：不同字母表示组间差异显著(P＜0.05)；

图3不同处理方式的菌体投射电镜观察(60000X)；注：图字母中分别代表不同处理方式获得的菌体，A为正常菌体；B为酸处理；C为碱处理；D为121℃热处理；E为100℃热处理；

图4洗脱复合物的PAT结合率的变化，注：不同字母表示组间差异显著(P＜0.05)；

图5反应时间对脱毒能力的影响，注：不同字母表示组间差异显著(P＜0.05)；

图6反应温度对脱毒能力的影响，注：不同字母表示组间差异显著(P＜0.05)；

图7pH值对脱毒能力的影响，注：不同字母表示组间差异显著(P＜0.05)；

图8菌体浓度对脱毒能力的影响，注：不同字母表示组间差异显著(P＜0.05)；

图9菌体生长时期对脱毒能力的影响，注：不同字母表示组间差异显著(P＜0.05)。

具体实施方式

实施例中使用的菌株：

鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)编号CICC20255，该菌株从菌种保藏机构(中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC))获取。

培养基的配制：

(1)MRS液体培养基

(2)MRS固体培养基：在上述MRS液体培养基的基础上添加1.8％-2.0％琼脂，调节pH5.8。

注：上述MRS培养基需要在121℃下高温灭菌15min后使用。

试验用溶液配制：

(1)PBS缓冲液

137mmoL/L氯化钠，2.7mmoL/L氯化钾，10mmoL/L磷酸氢二钾，2.0mmoL/L磷酸二氢钾，pH调至7.4。

(2)展青霉素的配制

1.PAT贮备液:准确称取5mg的展青霉素标准溶液，溶于50mL乙酸乙酯中，充分混匀溶解，并使用0.22gm微孔滤膜进行过滤除菌后贮存于-200℃，得到浓度为100mg/L的展青霉素贮备液。

2.PAT工作液:根据需要，准确量取一定体积的展青霉素标准品母液，用氮气吹干后溶于pH4.0水中，并定容至100mL，配制成不同浓度的展青霉素工作液。

(3)酸处理液：取36.5％浓盐酸(12.6mol/L)15.9ml，冰水浴中加入到84.1ml蒸馏水水中，配制成2mol/LHCl。

(4)碱处理液：取8g氢氧化钠固体加入到100mL蒸馏水中，配置成2mol/LNaOH溶液。

展青霉素的高效液相色谱法检测：

(1)检测条件:色谱柱UnitaryC18，150mm×4.6mm×5μm；柱温为30℃，流动相为甲醇:水＝10:90，流速1mL/min，检测器为紫外检测器，检测波长276nm，上样量为20μL，展青霉素的出峰时间为7-8min。(SN/T2534-2010)

(2)标准曲线绘制:用酸化水(冰醋酸调节pH值为4.0)配置不同浓度梯度(1500、1000、500、250、100μg/L)的PAT标准品，在高效液相色谱上进行定量检测，建立峰面积与PAT浓度之间的一元线性回归方程。结果如图1所示，由该曲线可以得出HPLC检测出的峰面积与PAT浓度的关系为：

y＝0.0116x+38.298

线性相关系数R2＝0.9992，在PAT浓度为250-1500μg/L的范围内，PAT浓度和峰面积之间符合线性关系。

(3)去除率的计算：

其中，P代表PAT去除率，A代表对照组PAT浓度，B代表菌体处理中残存的PAT浓度。

试验菌株的制备：

鼠李糖乳杆菌CICC20255

将-20℃冷冻保存的鼠李糖乳杆菌CICC20255以2％(v/v)的接种量接种于MRS培养基中，置于37℃培养24h，经两次传代进行活化。将活化的菌株进行平板计数，调整菌液浓度至2.5×10⁹CFU/mL。菌液于8000r/min、4℃、10min条件下离心，沉淀用PBS(pH6.0)冲洗两次，将获得的菌体置于鼓风干燥箱中，37℃干燥1h，于-20℃下保存以待后续使用。

实施例及对比例

(1)菌株预处理

取上述制备的鼠李糖乳杆菌CICC20255试验菌株，分别做以下处理：

高温处理：将菌体悬浮在4mLpH6.0PBS中，100℃加热60min；

灭菌处理：将菌体悬浮在4mLpH6.0PBS中，121℃高压灭菌60min；

酸处理：将菌体悬浮在4mL酸处理液中震荡处理1h；

碱处理：将菌体悬浮在4mL碱处理液中震荡处理1h。

将处理后的悬浮液于4℃、8000r/min离心10min，沉淀用PBS(pH6.0)洗3次，获得菌体沉淀。

(2)调整含有展青霉素(PAT)的液体体系的pH

配置含1000μg/LPAT的PBS，调整pH为6.0。

(3)将步骤(1)预处理得到的鼠李糖乳杆菌加入到步骤(2)得到的液体体系中，摇床孵育后，将鼠李糖乳杆菌从液体体系中分离出去，即得到去除了展青霉素的液体。

具体为：分别将步骤(1)制备的细胞(1.0×10¹⁰CFU/mL)悬于2mL含有1000μg/L展青霉素的PBS(pH 6.0)中，于37℃转速为150r/min的摇床中孵育4h。培养后的混合物于4℃、3000r/min离心15min，取上清液，加入20％(v/v)乙腈配置成待测样，使用HPLC检测展青霉素浓度。加入相同菌体浓度的未经预处理的鼠李糖乳杆菌活菌的实验组作为对照组，同时设未加入菌体的同浓度展青霉素溶液作为阴性对照组并使用HPLC检测展青霉素浓度。计算展青霉素吸附率。

实验结果如图2所示，由结果可知，菌体的处理方式对去毒效果确实有影响，活菌对PAT的去除率为51.36％，四种菌体处理方式都或多或少的改善了吸附效果，去除率分别达到了53.72±0.52％(碱处理)、72.73±1.05％(酸处理)、57.24±0.46％(100℃处理)和70.51±0.25％(121℃处理)，其中酸处理和121℃高温处理的去除率分别比活菌提高了21.37％和19.15％，而100℃和碱处理的去除率也分别比活菌增加了5.88％和2.36％。

酸处理和121℃处理后的菌株脱毒能力之间没有显著的差异，而酸处理和121℃处理后的菌株脱毒能力、碱处理和100℃处理后的菌株脱毒能力、活菌脱毒能力三者之间差异性显著。

不同细胞处理方式对鼠李糖乳杆菌细胞表面结构的影响对比：

通过透视电子显微镜(TEM)观察不同处理方式下菌体形态如图3所示，从图可以看出，与对照组相比，经过处理后细胞形态发生了显著的变化，细胞壁已经出现了不同程度的损伤，其中121℃处理和碱处理的细胞壁已经出现了缺失，内容物流出；酸处理和100℃处理的细胞壁形态改变微弱，但是也可以观察到其细胞外壁改变，我们推测，这并不影响细胞通透性的增强，反而最有利于细胞与毒素结合，

不同菌体处理方式对鼠李糖乳杆菌CICC20255-PAT复合物稳定性的影响对比：

处理后的体系中，展青霉素与鼠李糖乳杆菌结合形成复合物，且复合物中展青霉素与鼠李糖乳杆菌的结合是可逆的，展青霉素可以从复合物中重新释放出来。由此可见，复合物稳定性在一定程度上代表了细胞与毒素结合的紧密程度，因此复合物稳定性侧面说明细胞处理方式对鼠李糖乳杆菌脱毒能力的影响。

将处理结束后分离出来的细胞沉淀悬浮于4mL去离子水中，于2500r/min 4℃离心15min，取上清液，重复上述步骤3次，测定所得3次溶液中PAT的释放量。

用水洗脱复合物的过程中PAT结合率的变化如图4所示。从结果可以看出，洗脱过程使PAT结合率降低，也就是复合物中的PAT通过洗脱过程被重新释放。洗脱过程对对五组复合物产生了不同程度的影响，其中对活菌对照组产生的影响最大，PAT的结合率由52.11％降低为32.75％，酸处理复合物受到的影响最小，结合率由72.73％降低为66.92％。五组复合物稳定性顺序为：酸＞121℃＞100℃＞碱＞活菌。由此就可以说明，四种处理方式均增强了复合物稳定性，加强了菌体与PAT间的作用，使其结合的更加紧密。

孵育时间对菌体脱毒能力的影响对比：

取预处理后的菌体悬于2mL含有1000μg/L展青霉素的PBS(pH 6.0)中，调整菌液浓度为1×10¹⁰CFU/mL，混合均匀后于37℃、转速为150r/min的摇床中孵育不同时间(1、2、3、4、5、6、7h)。将培养后的混合物于4℃，3000r/min离心15min，取上清液，使用HPLC检测展青霉素，并计算展青霉素吸附率。

时间对于任何反应来说都是一个十分重要的因素，反应时间与吸附率间的关系体现了整个反应过程中吸附速率的变化，供试菌株在1、2、3、4、5、6和7h的时间段中的去除率结果如图5所示。由图可以看出，随着时间的增长，菌株对PAT的去除率迅速上升，当反应时间为4h时，去除率为50.9±1.07％，反应时间超过4h时，鼠李糖乳杆菌CICC20255对PAT的吸附效果基本趋于平稳，其中反应时间为4、5、6和7h时，去除率维持在50％左右，且差异不显著，数据表明反应时间达到4h就可以完成整个吸附过程。

孵育温度对菌体脱毒能力的影响对比：

取预处理后的菌体悬于2mL含有1000μg/L展青霉素的PBS(pH 6.0)中，调整菌液浓度为1×10¹⁰CFU/mL，混合均匀后于不同温度下(4℃、15℃、25℃、37℃、42℃)、转速为150r/min的摇床中孵育4h。将培养后的混合物于4℃，3000r/min离心15min，取上清液，使用HPLC检测展青霉素，并计算展青霉素吸附率。

反应温度是影响体系反应的一个常见因素，从图6中可以观察出，在37℃左右，鼠李糖乳杆菌CICC20255对PAT的脱毒能力呈现最佳状态，10¹⁰CFU/mL鼠李糖乳杆菌CICC20255与1000μg/mL的PAT在37℃的条件下培养4h，脱除率达到50.9％。超过37℃后，脱除率随温度升高而呈下降趋势。可以得出脱毒过程的最适反应温度为37℃。

孵育体系pH对菌体脱毒能力的影响对比：

取预处理后的菌体悬于2mL含有1000μg/L展青霉素的PBS(pH3.0、pH4.5、pH6、pH7.5、pH9.0)中，调整菌液浓度为1×10¹⁰CFU/mL，混合均匀后于37℃、转速为150r/min的摇床中孵育4h。将培养后的混合物于4℃，3000r/min离心15min，取上清液，使用HPLC检测展青霉素，并计算展青霉素吸附率。

反应体系pH对菌体脱毒能力的影响如图7所示，鼠李糖乳杆菌在pH5.5-8的环境下具有较好的去除能力。从图中可以看出，反应体系pH值在3左右时，去除率为50.39％，此时达到最佳状态，随着pH值的增加，去除率逐渐减小。

菌液浓度对菌体脱毒能力的影响对比：

取预处理后的菌体悬于2mL含有1000μg/L展青霉素的PBS(pH 6.0)中，调整菌液浓度为2.5×10⁹、5×10⁹、7.5×10⁹、1×10¹⁰、1.25×10¹⁰CFU/mL，混合均匀后于37℃、转速为150r/min的摇床中培养4h。将培养后的混合物于4℃，3000r/min离心15min，取上清液，使用HPLC检测展青霉素，并计算展青霉素吸附率。

图8显示了菌液浓度与去除率的关系，从图中可以看到，随着菌体浓度的增大，菌体对PAT的去除效果显著增加，原因是菌体浓度的增大会增加结合位点的数量，进而提高了展青霉素的吸附率。

菌体生长时间对菌体脱毒能力的影响对比：

取已活化3代的供试菌株，分别培养至迟缓期、对数初期、对数中期、对数末期及稳定期后于4℃、8000r/min离心10min。取沉淀悬于2mL含有1000μg/L展青霉素的PBS(pH6.0)中，调整菌液浓度为1×10¹⁰CFU/mL，混合均匀后于37℃、转速为150r/min的摇床中孵育4h。将培养后的混合物于4℃，3000r/min离心15min，取上清液，使用HPLC检测展青霉素，并计算展青霉素吸附率。

不同生长时期的菌体间存在一定的差异，可能会对菌体的去除能力产生一定的影响，菌体生长时期对菌体脱毒能力的影响如图9所示。由图可以看出，菌株在对数中期的时候对鼠李糖乳杆菌CICC20255的去除效果最好，去除率达到50.11±0.93％，对数中期以后，随着细胞的成熟凋亡，菌株对PAT的吸附能力逐步下降，这样的结果可能与菌株不同生长时期的表面结构和生理特性有关。

Claims (10)

1.一种利用鼠李糖乳杆菌去除液体样品中展青霉素的方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)鼠李糖乳杆菌预处理；

(2)调整含有展青霉素的液体体系的pH；

(3)将步骤(1)预处理得到的鼠李糖乳杆菌加入到步骤(2)得到的液体体系中，摇床孵育后，将鼠李糖乳杆菌从液体体系中分离出去，即得到去除了展青霉素的液体。

2.根据权利要求1所述的利用鼠李糖乳杆菌去除液体样品中展青霉素的方法，其特征在于：步骤(1)所述鼠李糖乳杆菌为生长到对数期的鼠李糖乳杆菌。

3.根据权利要求1所述的利用鼠李糖乳杆菌去除液体样品中展青霉素的方法，其特征在于：步骤(1)所述预处理为酸处理或高温处理。

4.根据权利要求3所述的利用鼠李糖乳杆菌去除液体样品中展青霉素的方法，其特征在于：所述酸处理，具体为，将鼠李糖乳杆菌菌体悬浮在酸处理液中震荡处理。

5.根据权利要求4所述的利用鼠李糖乳杆菌去除液体样品中展青霉素的方法，其特征在于：所述震荡处理，震荡频率为100-200r/min，震荡处理时间为0.5-3h；所述酸处理液为2mol/L的HCl水溶液。

6.根据权利要求3所述的利用鼠李糖乳杆菌去除液体样品中展青霉素的方法，其特征在于：所述高温处理，处理温度为120-130℃，处理时间为0.5-2h。

7.根据权利要求1所述的利用鼠李糖乳杆菌去除液体样品中展青霉素的方法，其特征在于：步骤(2)所述调整含有展青霉素的液体体系的pH，调整pH至3.0。

8.根据权利要求1所述的利用鼠李糖乳杆菌去除液体样品中展青霉素的方法，其特征在于：步骤(3)所述鼠李糖乳杆菌在所述液体体系中的菌体浓度为为2.5×10⁹-1.25×10¹⁰CFU/mL。

9.根据权利要求1所述的利用鼠李糖乳杆菌去除液体样品中展青霉素的方法，其特征在于：步骤(3)所述摇床培养，摇床转速为150r/min，温度为15-42℃，培养时间为4-12h。

10.根据权利要求1所述的利用鼠李糖乳杆菌去除液体样品中展青霉素的方法，其特征在于：步骤(3)所述分离的方法为过滤或离心。