CN109521108A - 一种富硒蛹虫草奶粉中虫草素和腺苷的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及虫草素和腺苷同时检测方法，具体涉及一种富硒蛹虫草奶粉中虫草素和腺苷的检测方法，取样品0.50g(精确至0.01g)于50mL具塞离心管中，以一级水为提取溶剂，置涡旋仪以3000r/min涡旋1min后，超声30min；将超声后的上述溶液以8000r/min离心，取上清液1mL移至备有0.050gSAX净化剂容器中，置涡旋仪以3000r/min涡旋1min，静置10min，检测时，色谱柱(Poroshell120C18柱，2.7μm)柱温：35℃；进样量：10.0μL；流动相：A相水溶液，B相甲醇，有效避免其他成份对检测的影响，使检测结果更加精准、更加稳定。

Description

一种富硒蛹虫草奶粉中虫草素和腺苷的检测方法

技术领域

本发明涉及虫草素和腺苷同时检测方法，具体涉及一种富硒蛹虫草奶粉中虫草素和腺苷的检测方法。

背景技术

蛹虫草资源开发利用及深入研究在近几十年取得了很大进展，因其具有很高的营养价值和保健功效，蛹虫草及其产品已被越来越多的消费者所接受，蛹虫草的人工栽培已成规模，资源丰富，药理作用广泛，所以开发前景非常广阔。奶粉含有鲜奶中的优质蛋白质、脂肪、多种维生素及矿物质，是适合饮用的营养佳品，将蛹虫草和奶粉有机结合的蛹虫草奶粉不仅保留了奶粉的营养成分，且增加了蛹虫草的药理作用，使其成为一种新型保健品，具有更高的营养价值，因此虫草奶粉的研究和发展对虫草的开发利用及我国乳制品行业今后的发展具有十分重大的意义和推动作用。

虫草素腺苷的主要检测方法是高效液相色谱法，现有技术中对虫草素和腺苷的测定方法大多是针对人工培养蛹虫草菌丝基质进行检测，但这些检测方法不能满足富硒奶粉中虫草素和腺苷的测定，目前在国内文献中鲜少提到富硒奶粉中虫草素和腺苷的检测方法，且方法不完善，并没有明确的检出限及回收率实验，不具有明显的可靠性，因此尚需要进一步研究。

发明内容

针对以上问题，本发明的目的是提供一种高效、便捷、安全的富硒蛹虫草奶粉中虫草素和腺苷的检测方法。

本发明的目的通过以下的技术方案实现： 一种富硒蛹虫草奶粉中虫草素和腺苷的检测方法，包括以下检测步骤：

步骤1试样溶液的制备及提取：

（1）取蛹虫草奶粉样品0.50g（精确至0.01g）于50mL具塞离心管中，以一级水为提取溶剂，置涡旋仪以3000 r/min涡旋1 min后，超声30 min；

（2）将超声后的上述溶液以8000 r/min离心10min，取上清液1mL移至备有0.050 g（±0.001 g）SAX净化剂（以硅胶为基质的强阴离子交换吸附剂）容器中，置涡旋仪以3000 r/min涡旋1 min，静置10 min，取上清液过微孔滤膜，待上机分析；

步骤2虫草素及腺苷标准品溶液的配置；

步骤3色谱条件及数据检测。

将步骤1中所述试样上清液及步骤2中虫草素及腺苷混合标准溶液，按如下液相色谱条件进行测试：

色谱柱 （Poroshell120 C18柱，2.7μm）柱温：35 ℃；进样量：10.0 µL；流动相：A相为水溶液，B相为甲醇，梯度洗脱程序如下：0～1.0 min(B相10%)，1.0～5.5 min(B相10%～50%)，5.6～10.0 min(B相10%)；流速：0.25 mL/min；紫外检测器检测波长：260nm。

进一步，步骤2中，虫草素及腺苷标准品溶液的配置包括以下具体步骤：

(1)准确称取虫草素、腺苷标准品各10 mg，用流动相分别定容到10 mL，摇匀，分别配置成质量浓度均为1000 µg/mL的虫草素母液和腺苷母液；

(2)准确移取浓度为1000 µg/mL的虫草素母液1 mL和1000 µg/mL的腺苷标母液1mL，置于同一容量瓶用一级水定容到10 mL，摇匀，配置成质量浓度为100 µg/mL的虫草素和腺苷混合液；

(3)分别准确移取浓度为100 µg/mL的虫草素和腺苷混合液1 mL，用一级水定容至10mL摇匀，配置成质量浓度为10 µg/mL的虫草素母液和腺苷混合液；

(4)分别准确移取1 mL、2 mL、5 mL浓度为10 µg/mL的虫草素母液和腺苷混合液和1mL、2 mL、5 mL浓度为100 µg/mL虫草和腺苷混合液，用一级水定容至10 mL，混合均匀，制成质量浓度1.0 µg/mL、2.0 µg/mL、5.0 µg/mL、10.0 µg/mL、20.0 µg/mL、50.0 µg/mL的虫草素及腺苷混合标准曲线溶液。

进一步，步骤3中所用的色谱仪为高效液相色谱仪HPLC。

按本发明所述检测方法得到虫草素和腺苷的标准溶液高效液相色谱图及富硒蛹虫草奶粉中添加虫草素和腺苷的高效液相色谱图后可按以下方法计算所测虫草素和腺苷的残留含量：

虫草素、腺苷含量计算：

采用标准曲线法定量，按式（1）或仪器数据处理系统计算所测虫草素和腺苷的残留含量 X=（c×V×1000)/(1000×m )

式中：

X—— 试样中待测组分的含量，单位为毫克每千克(mg/kg)；

c —— 待测组分响应值在标准曲线上计算得到的浓度，单位为微克每毫升(µg/mL)；

V—— 样品定容体积，单位为毫升(mL)；

m—— 样品称样量，单位为克(g)。

有益效果：腺苷定量测定加标回收率实验结果如下：

虫草素定量测定加标回收率实验结果如下：

本发明所述检测方法的准确度和精密度实验：取同一批样品奶粉若干份，分别加入虫草素和腺苷标准品溶液中，按本发明的检测方法平行测定多次，腺苷的加标回收率为88.20%-99.00%，虫草素的加标回收率78.13 %-93.37 %，虫草素RSD值（相对标准偏差）为1.51 %-4.50 %，腺苷RSD值为1.43 %-3.22 %，均小于5%；

本发明所述检测方法的稳定性实验：取同一批样品奶粉若干份，按本发明方法进行1d、5d、10d、15d、20d、30d、60d、90d相同条件下的虫草素、腺苷峰面积，RSD值均无明显变化，虫草素RSD值为1.62 %-4.93%，腺苷RSD值为1.53%-3.55%；

本发明本着操作便捷、安全和尽量不引入非流动相溶剂原则，结合提取溶剂、提取净化剂、等因素进行实验，建立了最佳优化条件，可方便快捷的测定虫草素和腺苷的峰面积，从而经计算得到虫草素或腺苷的含量。

通过上述检测方法和检测条件的优化，有效避免了其他成份对虫草素和腺苷检测的影响，使检测结果更加精准、检测效果更加稳定。

附图说明

图1：虫草素和腺苷的标准溶液高效液相色谱图；

图2： 富硒蛹虫草奶粉中添加虫草素和腺苷的高效液相色谱图。

具体实施方式

以下给出本发明的具体实施方式，用来对发明内容作进一步详细的解释。并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

实施例1：

本实施例中的试剂为：自制一级水；SAX净化剂；

本实施例中所用仪器设备为： 高效液相色谱仪HPLC； 超纯水系统；超声波清洗/细胞破碎仪；3-18K型高速离心机；万分之一天平；涡旋振荡器；微量移液器；PTFE 滤膜0.22µm ；注射器2mL；2 mL进样小瓶。

一种富硒蛹虫草奶粉中的虫草素和腺苷的检测方法，包括以下检测步骤：

步骤1试样溶液的制备及提取：

（1）取虫草奶粉样品0.50 g（精确至0.01 g）于50mL具塞离心管中，以一级水为提取溶剂，置涡旋仪以3000 r/min涡旋1 min后，超声30 min；

（2）将超声后的上述溶液以8000 r/min离心10min，取上清液1mL移至备有0.050 g（±0.001 g）SAX净化剂（以硅胶为基质的强阴离子交换吸附剂）容器中，置涡旋仪以3000 r/min涡旋1 min，静置10 min，取上清液过微孔滤膜，待上机分析。

步骤2虫草素及腺苷标准品溶液的配置：

（1）准确称取虫草素、腺苷标准品各10 mg，用流动相分别定容到10 mL，摇匀，分别配置成质量浓度均为1000 µg/mL的虫草素母液和腺苷母液；

（2）准确移取浓度为1000 µg/mL的虫草素母液1 mL和1000 µg/mL的腺苷标母液1mL，置于同一容量瓶用一级水定容到10 mL，摇匀，配置成质量浓度为100 µg/mL的虫草素和腺苷混合液；

（3）分别准确移取浓度为100 µg/mL的虫草素和腺苷混合液1 mL，用一级水定容至10mL摇匀，配置成质量浓度为10 µg/mL的虫草素母液和腺苷混合液；

（4）分别准确移取1 mL、2 mL、5 mL浓度为10 µg/mL的虫草素母液和腺苷混合液和1mL、2 mL、5 mL浓度为100 µg/mL虫草和腺苷混合液，用一级水定容至10 mL，混合均匀，制成质量浓度1.0 µg/mL、2.0 µg/mL、5.0 µg/mL、10.0 µg/mL、20.0 µg/mL、50.0 µg/mL的虫草素及腺苷混合标准曲线溶液。

步骤3色谱条件及数据检测

（1）将步骤1中试样上清液及步骤2中虫草素及腺苷混合标准溶液按如下液相色谱条件进行测试；

（2）检测中液相色谱条件如下：

将超声后的上述溶液以8000 r/min离心10min，取上清液1mL移至备有0.050 g（±0.001 g）SAX净化剂（以硅胶为基质的强阴离子交换吸附剂）容器中，置涡旋仪以3000 r/min涡旋1 min，静置10 min，取上清液过微孔滤膜，待上机分析，可分别得到附图1虫草素和腺苷的标准溶液高效液相色谱图及附图2的富硒蛹虫草奶粉中添加虫草素和腺苷的高效液相色谱图。

步骤4虫草素、腺苷含量计算

采用标准曲线法定量，按式（1）或仪器数据处理系统计算所测虫草素和腺苷的残留含量

X=（c×V×1000)/(1000×m )

式中：

X—— 试样中待测组分的含量，单位为毫克每千克(mg/kg)；

c —— 待测组分响应值在标准曲线上计算得到的浓度，单位为微克每毫升(µg/mL)；

V—— 样品定容体积，单位为毫升(mL)；

m—— 样品称样量，单位为克(g)。

本实施例中的计算依据的数据是平均值，分析采用EXCEL数据整理；计算结果保留至小数点后两位，将过滤膜后的上清提取液经高效液相仪测试，可测的不同组虫草素和腺苷的峰面积；

本实施例1经检测得到富硒蛹虫草奶粉中虫草素含量为：253.84 mg/kg，腺苷含量为：64.62 mg/kg；加标回收率：腺苷加标回收率为88.20 %-99.00%，虫草素加标回收率为78.13%- 93.37%；精密度虫草素RSD值（相对标准偏差）为1.51 %-4.50 %，腺苷RSD值为1.43 %-3.22 %。

Claims (3)

1.一种富硒蛹虫草奶粉中虫草素和腺苷的检测方法，其特征在于：包括以下检测步骤：

步骤1试样溶液的制备及提取：

(1)取蛹虫草奶粉样品0.50g(精确至0.01g)于50mL具塞离心管中，以一级水为提取溶剂，置涡旋仪以3000r/min涡旋1min后，超声30min；

(2)将超声后的上述溶液以8000r/min离心10min，取上清液1mL移至备有0.050g(±0.001g)SAX净化剂(以硅胶为基质的强阴离子交换吸附剂)容器中，置涡旋仪以3000r/min涡旋1min，静置10min，取上清液过微孔滤膜，待上机分析；

步骤2虫草素及腺苷标准品溶液的配置；

步骤3色谱条件及数据检测：

将步骤1中所述试样上清液及步骤2中虫草素及腺苷混合标准溶液，按如下液相色谱条件进行测试：

色谱柱(Poroshell120C18柱，2.7μm)柱温：35℃；进样量：10.0μL；流动相：A相为水溶液，B相为甲醇，梯度洗脱程序如下：0～1.0min(B相10％)，1.0～5.5min(B相10％～50％)，5.6～10.0min(B相10％)；流速：0.25mL/min；紫外检测器检测波长：260nm。

2.如权利要求1所述的一种富硒蛹虫草奶粉中虫草素和腺苷的检测方法，其特征在于，步骤2中，虫草素及腺苷标准品溶液的配置包括以下具体步骤：

(1)准确称取虫草素、腺苷标准品各10mg，用流动相分别定容到10mL，摇匀，分别配置成质量浓度均为1000μg/mL的虫草素母液和腺苷母液；

(2)准确移取浓度为1000μg/mL的虫草素母液1mL和1000μg/mL的腺苷标母液1mL，置于同一容量瓶用一级水定容到10mL，摇匀，配置成质量浓度为100μg/mL的虫草素和腺苷混合液；

(3)分别准确移取浓度为100μg/mL的虫草素和腺苷混合液1mL，用一级水定容至10mL摇匀，配置成质量浓度为10μg/mL的虫草素母液和腺苷混合液；

(4)分别准确移取1mL、2mL、5mL浓度为10μg/mL的虫草素母液和腺苷混合液和1mL、2mL、5mL浓度为100μg/mL虫草和腺苷混合液，用一级水定容至10mL，混合均匀，制成质量浓度1.0μg/mL、2.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL、50.0μg/mL的虫草素及腺苷混合标准曲线溶液。

3.如权利要求1所述的一种富硒蛹虫草奶粉中虫草素和腺苷的检测方法，其特征在于，步骤3中所用的色谱仪为高效液相色谱仪HPLC。