CN109517838A - 一种农杆菌介导的海带分子育种的方法 - Google Patents

一种农杆菌介导的海带分子育种的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种农杆菌介导的海带分子育种的方法，涉及微生物技术领域，包括农杆菌的前处理、外源基因的导入和共培养遗传转化三步，或者先将外源质粒导入原始农杆菌，再筛选重组耐盐农杆菌，然后将海带配子体与重组耐盐农杆菌共培养进行遗传转化，克服了农杆菌侵染海洋藻类过程中的农杆菌高盐环境下正常生长的问题，海带配子体与农杆菌共培养的培养基等问题，为农杆菌介导的海带分子育种提供了技术基础，为海洋藻类的遗传转化和育种开辟了新的途径。

Description

一种农杆菌介导的海带分子育种的方法
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种农杆菌介导的海带分子育种的方法。
背景技术
植物遗传转化(plant genetic transformation)技术是应用DNA重组技术将外源基因通过生物、物理或化学等手段导入植物基因组，以获得外源基因稳定遗传和表达的植物遗传改良的一门转基因技术。目前最常用的转基因方法有基因枪法、电穿孔法和农杆菌介导法。但基因枪法和电穿孔法与农杆菌介导法相比存在着诸多缺点，比如：易引起多拷贝插入和非孟德尔遗传，目标基因与筛选基因有时发生重排，有益基因可能丢失，转化效率较低等。此外，对于不同的受体类型，需要相应优化转化参数；实验成本较高等。
农杆菌(Agrobacterium)是一类普遍存在于土壤中的革兰氏阴性细菌，农杆菌介导的遗传转化系统是以农杆菌能将其Ti质粒上的T-DNA插入植物基因组中引起植物遗传特性变异这一原理为基础。农杆菌介导的植物遗传转化已经成为植物转基因工程的一个经典转化模式。从最初的双子叶植物中进行，随着研究深入和技术的改进，渐渐在一些重要的单子叶植物以及在真菌中应用农杆菌转化获得了成功。而这种体系在海洋藻类中的应用目前还未有报道。
经济海洋植物包括海带(Sccharina japonica)、裙带菜(Undaria pinnatifida)、紫菜(Pyropia，Porphyra)等，其中仅海带的年产量就达到80万吨。因此这些经济海洋植物的遗传育种就显得极为重要。传统的遗传育种是靠进行种间杂交来完成的，但是由于品种稀少，野生杂种资源缺乏，环境污染，严重限制了依靠种间杂交育种实现遗传育种的需要。因此转基因育种就成为必要选择。
要完成农杆菌介导经济海洋植物遗传转化必须解决两者共生问题。共培养是转基因遗传转化过程中最为关键的一环，而两者生存条件差异较大，海水盐度一般为3.5％，正常农杆菌无法在海水盐度的培养基中正常生长，正常农杆菌无法满足海洋植物遗传转化的要求，因此有众多难题需要解决，比如：农杆菌高盐环境下正常生长的问题、海带配子体与农杆菌共培养的培养基问题等等。
发明内容
本发明的目的在于提供一种农杆菌介导的海带分子育种的方法。克服农杆菌侵染海洋藻类过程中的农杆菌高盐环境下正常生长的问题、海带配子体与农杆菌共培养的培养基等问题，为海洋藻类的遗传转化和育种开辟了新的途径。
一种农杆菌介导的海带分子育种的方法，所述的方法包括以下步骤：
(1)农杆菌的前处理：将原始农杆菌驯化为耐盐农杆菌；
(2)外源基因的导入：外源质粒导入步骤(1)得到的耐盐农杆菌，得到重组耐盐农杆菌；
(3)共培养遗传转化：海带配子体与步骤(2)得到的重组耐盐农杆菌共培养进行遗传转化，得到重组海带配子体。
在另一些实施方案中，所述的农杆菌介导的海带分子育种的方法，可以先将外源质粒导入原始农杆菌，获得重组原始农杆菌后，将重组原始农杆菌进行前处理，驯化为重组耐盐农杆菌后；将海带配子体与重组耐盐农杆菌共培养进行遗传转化，得到重组耐盐配子体。
即，在另一些实施方案中，所述的农杆菌介导的海带分子育种的方法包括以下步骤：
(1)外源基因的导入：外源质粒导入原始农杆菌，获得重组原始农杆菌；
(2)农杆菌的前处理：将步骤(1)获得的重组原始农杆菌驯化为重组耐盐农杆菌；
(3)共培养遗传转化：海带配子体与步骤(2)得到的重组耐盐农杆菌共培养进行遗传转化，得到重组海带配子体。
在以上操作步骤中，将外源质粒导入农杆菌的方法为电击转化，具体为将农杆菌处理为农杆菌感受态细胞后，利用电击转化将外源质粒导入农杆菌感受态细胞；所述的农杆菌可以为各种形式的农杆菌，例如耐盐农杆菌、原始农杆菌。
在以上操作步骤中，农杆菌的前处理方法具体包括以下步骤：
A、将原始农杆菌或重组原始农杆菌接种至培养基1中培养后，涂布于培养基2上培养进行单菌落分离；
B、将步骤(1)获得的单菌落接种至培养基3中培养后，即得耐盐农杆菌或重组耐盐农杆菌。
所述的培养基1的配方为：酵母提取物0.1g、蛋白胨0.5g、牛肉膏0.5g、蔗糖0.5g、硫酸镁(MgSO4 7H2O)0.05g，蒸馏水定容至100mL；高温高压灭菌。
所述的培养基2的配方为：酵母提取物0.1g、蛋白胨0.5g、牛肉膏0.5g、蔗糖0.5g、硫酸镁(MgSO4 7H2O)0.05g、琼脂1.8g，消毒海水定容至100mL；高温高压灭菌。
所述的培养基3的配方为：酵母提取物0.1g、蛋白胨0.5g、牛肉膏0.5g、蔗糖0.5g、硫酸镁(MgSO4 7H2O)0.05g，消毒海水定容至100mL；高温高压灭菌。
所述的步骤A中在培养基1中培养的条件为28℃，200rpm培养24小时。
所述的步骤A中在培养基2中培养的条件为28℃，培养72小时。
所述的步骤B中在培养基3中培养的条件为28℃，200rpm培养72小时。
在以上操作步骤中，共培养遗传转化的方法包括以下步骤：
C、海带配子体的处理：将海带配子体加入共培养培养液中，经超声波分散，细胞密度为105个/mL，得到海带配子体悬液；
D、农杆菌的活化：将重组耐盐农杆菌接种入培养基4中，培养至OD＝0.5，离心去上清，菌体沉淀用少量共培养培养液重悬，得到重组耐盐农杆菌悬液；
E、侵染共培养：将步骤(2)得到的重组耐盐农杆菌重悬液加入到步骤(1)得到的海带配子体悬液中，使农杆菌初始OD值达到0.05-0.15，共培养得到重组海带配子体。
所述的共培养培养液的配方为：酵母提取物0.1g、蛋白胨0.5g、牛肉膏0.5g、蔗糖0.5g、硫酸镁(MgSO4 7H2O)0.05g、5mg利福平、20μmol乙酰丁香酮(AS)，调节pH＝5.4，消毒海水定容至100mL；高温高压灭菌。
所述的培养基4的配方为：酵母提取物0.1g、蛋白胨0.5g、牛肉膏0.5g、蔗糖0.5g、硫酸镁(MgSO4 7H2O)0.05g、5mg利福平，消毒海水定容至100mL；高温高压灭菌。
上述步骤D中重组耐盐农杆菌接种入培养基4中培养的条件为：28℃，200rpm培养24-72小时。
上述步骤E共培养的条件为：黑暗，80rpm缓慢摇晃，培养温度为16℃，培养时间为48小时。
和现有技术相比，本发明至少具有如下技术进步：
本发明提供的方法克服了常规农杆菌在海水中难以生长，无法顺利进行遗传转化分子育种的技术问题。本发明提供的方法获得的耐盐农杆菌用于海带的分子育种，能够将外源质粒顺利导入海带配子体，成功获得重组海带配子体，为农杆菌介导的海带分子育种提供了技术基础。
附图说明
图1为实施例1中GV3101菌株生长特性曲线；
图2为实施例2中重组耐盐农杆菌阳性克隆检测的1％琼脂糖凝胶电泳图；
图3为实施例3中GUS染色后用70％乙醇脱色显微检测结果；
图4为实施例4中重组农杆菌阳性克隆检测的1％琼脂糖凝胶电泳图；
图5为实施例5中LBA4404菌株生长特性曲线；
图6为实施例6中海带配子体GUS染色未用70％乙醇脱色显微观察结果；
图7为实施例6中海带配子体GUS染色显微观察观察结果。
具体实施方式
以下实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。对所公开的实施例的下述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例中，而是可以应用于符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的更宽的范围。虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处列举优选的方法和材料。
除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同意义。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。
实施例1：耐盐农杆菌的制备
(1)活化农杆菌菌种：将原始农杆菌接种(购自唯地生物技术有限公司，菌种保藏号：AC1001)至培养基1中，28℃下培养24小时；
(2)耐盐农杆菌的筛选：取原始农杆菌100μl菌液涂布于培养基2(盐度为3.5％)上培养进行单菌落分离，培养条件为28℃，培养72小时；再挑取长势好的单菌落接种至培养基3(盐度为3.5％)中，培养条件为28℃，培养72小时，得到耐盐农杆菌菌液；取菌液涂布于培养基2上，28℃，培养72小时，得到耐盐农杆菌菌落；
(3)筛选菌株生长特性检测：分别挑取未经筛选的菌种的单菌落和耐盐菌株单菌落，于培养基1中培养至OD值为0.5(600nm下紫外分光光度计测定OD值)，分别取10μl接种于100mL培养基1和培养基3中培养72h，每6或12h取样检测，记录数据并分别作出生长曲线，比较筛选农杆菌与正常农杆菌生长曲线，评估测定筛选菌株生长特性。结果见图1(GV3101-A：原始农杆菌在培养基1中的生长曲线；GV3101-B：原始农杆菌在培养基3中的生长曲线；GV3101-1：耐盐农杆菌在培养基3中的生长曲线)。
图1结果表明，耐盐农杆菌在筛选条件下进入对数增长期的速度低于正常条件下培养的原始农杆菌，而原始农杆菌在筛选的高盐条件下培养截止到72h仍然没有出现对数增长期，因此可以判断筛选到的耐盐农杆菌比原始农杆菌具有更高的抗盐性。
实施例2：外源质粒导入实施例1制备的耐盐农杆菌
(1)耐盐农杆菌感受态细胞的制备
挑取实施例1制备的耐盐农杆菌单菌落接种到5mL培养基3中，28℃，200rpm暗培养过夜。将过夜培养的5mL菌液倒入500mL培养,3中扩大培养4-6h，其OD值大约为0.4-0.6左右，置于冰上30min，期间不时轻微摇晃，以使菌液冰冷彻底(以下步骤全部在冰上操作，以保证高的转化效率)。向六个离心管中分别倒满菌液，4℃下4000r/min，冷冻离心15min，小心倒掉上清，向50mL离心管中加入2mL超纯无菌水，枪重悬，然后加入30mL超纯无菌水，4℃下4000r/min，冷冻离心15min，小心再倒掉上清，用超纯无菌水重复水洗三次，合并为两管，加入少量10％甘油重悬沉淀，再加入30mL 10％甘油，4℃下4000r/min，冷冻离心15min，10％甘油洗涤两次，合并为一管，倒掉上清，留下少量液体(约1-2mL)，用枪吹匀，得到耐盐农杆菌感受态细胞。
(2)外源质粒导入耐盐农杆菌
将上述的感受态细胞在冰上培育约5min，添加1μl含有NPTII和GUS基因的pCAMBIA1302载体质粒(购自北京基因组研究所)，用枪吹匀，转移DNA/细胞混合物至预冷的电转杯中，将电转杯放入电转仪中进行电击转化(200欧姆，25μFd，2.5千伏)，立即添加800μl的LB/SOC培养基至电转杯中，吹匀后转入离心管中，28℃下恢复培养细胞1h，离心，倒掉上清，留100μl液体重悬菌液，转移到含有利福平+卡纳霉素抗性的固体培养基上涂板，28℃培养箱中过夜培养。
(3)阳性克隆检测
挑取7个单克隆活化后进行菌液PCR鉴定NPTII基因，pCAMBIA1302载体质粒为阳性对照，以验证载体是否转入农杆菌中。PCR反应体系为：上、下游引物各1μl，dNTP 1μl，10×buffer2.5μl，Taq酶0.3μl，DNA模板1μl，双蒸水(ddH2O)18.2μl；PCR反应程序：94℃预热变性10min，然后进入循环阶段，94℃热变性45s，52℃复性40s，72℃延伸50s，进行38个循环，最后72℃延伸10min,16℃，1h。反应结束后，1％琼脂糖凝胶电泳，EB染色，凝胶成像(G1-7：7个单克隆，M：markerDL2000)，NPTII基因的引物序列见表1，结果见图2。
表1：NPTII基因的引物序列：
图2结果显示：G1、G2、G3、G5和G7条带清晰明亮，表明pCAMBIA1302外源质粒成功导入到耐盐农杆菌中，得到了重组耐盐农杆菌。
实施例3：海带配子体与实施例2得到的重组耐盐农杆菌共培养转化
(1)海带配子体的处理：100mL共培养培养液(盐度为3.5％)，调节pH＝5.4，加入少量配子体超声波分散至1-10个细胞，密度约为105个/mL；
(2)农杆菌活化：培养基4(盐度为3.5％)活化重组耐盐农杆菌，培养至OD＝0.5，离心去上清，用少量共培养重悬，菌体沉淀用少量共培养培养液重悬，得到重组耐盐农杆菌悬液；
(3)侵染共培养：将农杆菌重悬液加入到海带配子体悬浮液中，使农杆菌初始OD值达到0.1左右。16℃，80rpm缓慢摇晃，黑暗条件下共培养,48小时，测OD值大约为1.0，相同条件下处理未加农杆菌侵染的配子体做为对照；
(4)GUS染色：培养结束后，吸取5mL培养液，4000rpm离心后倒掉上清，加入300μlGUS染液，重悬沉淀，置于37℃过夜，4000rpm离心后回收染液，沉淀中加入1mL 70％乙醇重悬，室温脱色3h后吸取少量显微观察，结果见图3(0：对照，1-5：实验组，1,2：10×物镜下观察到的染色结果；3,4,5：40×物镜下观察到的染色结果)。
结果显示：对照组未发现蓝色斑点，而实验组明显出现了蓝色斑点。由此推断，GUS基因在海带配子体中得到了瞬时表达，由耐盐农杆菌介导的海带配子体遗传转化，得到了重组海带配子体。转化效率约为1‰。
实施例4：外源质粒导入原始农杆菌
(1)根据实施例2中的方法制备原始农杆菌感受态细胞；
(2)根据实施例2中的方法将外源质粒导入原始农杆菌中；
(3)根据实施例2中的方法进行阳性克隆检测，1％琼脂糖凝胶电泳，EB染色，凝胶成像(L1-7：7个单克隆，M：markerDL2000)，NPTII基因的引物序列见表1，结果见图4。
图4结果显示：L1、L3、L4和L6条带清晰明亮，表明pCAMBIA1302外源质粒成功导入到原始农杆菌中，得到了重组农杆菌，可用于后续重组耐盐农杆菌的筛选。
实施例5：将实施例4获得的重组农杆菌处理为重组耐盐农杆菌
(1)根据实施例1中的方法活化重组农杆菌；
(2)根据实施例1中的方法进行重组耐盐农杆菌的筛选；
(3)根据实施例1中的方法检测筛选菌株的生长特性。结果见图5(LBA4404-A：重组农杆菌在培养基1中的生长曲线；LBA4404-B：重组农杆菌在培养基3中的生长曲线；LBA4404-1：重组耐盐农杆菌在培养基3中的生长曲线)。
图5结果表明，重组耐盐农杆菌在筛选条件下进入对数增长期的速度低于正常条件下培养的重组农杆菌，而重组农杆菌在筛选的高盐条件下培养截止到72h仍然没有出现对数增长期，因此可以判断筛选到的重组耐盐农杆菌比重组农杆菌具有更高的抗盐性。
实施例6：海带配子体与实施例5得到的重组耐盐农杆菌共培养转化
(1)根据实施例3中的方法处理海带配子体；
(2)根据实施例3中的方法活化农杆菌，得到重组耐盐农杆菌悬液；
(3)根据实施例3中的方法侵染共培养；
(4)根据实施例3中的方法进行GUS染色，GUS染色20h，未用70％乙醇脱色显微观察，结果见图6(0：对照组；1-3：实验组)；然后70％乙醇重悬，室温脱色3h后吸取少量在荧光显微下观察，结果见图7(A：未脱色荧光显微观察；B：脱色后荧光显微观察，10×；C：脱色后荧光显微观察，40×；D：脱色后常光显微观察，40×)。
图6结果显示：未经农杆菌侵染的对照组，没有发现颜色加深的细胞，而农杆菌侵染后的处理组则有颜色加深现象出现，由此初步判断为GUS基因瞬时表达结果。
图7结果显示：农杆菌侵染48h后，海带配子体依然具有较高活力，海带配子体70％乙醇脱色3h后，配子体中的色素基本去除，蓝色斑点并非色素体聚集形成，而是因为GUS基因表达染色形成，由此推断，GUS基因在海带配子体中得到了瞬时表达，耐盐农杆菌介导海带配子体的遗传转化，共培养得到了重组海带配子体。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种农杆菌介导的海带分子育种的方法，其特征在于：所述的方法包括以下步骤：
(1)农杆菌的前处理：将原始农杆菌驯化为耐盐农杆菌；
(2)外源基因的导入：外源质粒导入步骤(1)得到的耐盐农杆菌，得到重组耐盐农杆菌；
(3)共培养遗传转化：海带配子体与步骤(2)得到的重组耐盐农杆菌共培养进行遗传转化，得到重组海带配子体。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中将外源质粒导入农杆菌的方法为电击转化，具体为将农杆菌处理为农杆菌感受态细胞后，利用电击转化将外源质粒导入农杆菌感受态细胞。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：农杆菌的前处理方法具体包括以下步骤：
A、将原始农杆菌接种至培养基1中培养后，涂布于培养基2上培养进行单菌落分离；
B、将步骤A获得的单菌落接种至培养基3中培养后，即得耐盐农杆菌。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述的培养基1的配方为：酵母提取物0.1g、蛋白胨0.5g、牛肉膏0.5g、蔗糖0.5g、硫酸镁(MgSO4 7H2O)0.05g，蒸馏水定容至100mL；高温高压灭菌。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述的培养基2的配方为：酵母提取物0.1g、蛋白胨0.5g、牛肉膏0.5g、蔗糖0.5g、硫酸镁(MgSO4 7H2O)0.05g、琼脂1.8g，消毒海水定容至100mL；高温高压灭菌。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述的培养基3的配方为：酵母提取物0.1g、蛋白胨0.5g、牛肉膏0.5g、蔗糖0.5g、硫酸镁(MgSO4 7H2O)0.05g，消毒海水定容至100mL；高温高压灭菌。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述的步骤A中在培养基1中培养的条件为28℃，200rpm培养24小时；
所述步骤A中在培养基2中培养的条件为28℃，培养72小时；
所述步骤B中在培养基3中培养的条件为28℃，200rpm培养72小时。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的步骤(3)共培养遗传转化的方法具体包括以下步骤：
C、海带配子体的处理：将海带配子体加入共培养培养液中，经超声波分散，细胞密度为105个/mL，得到海带配子体悬液；
D、农杆菌的活化：将重组耐盐农杆菌接种入培养基4中，培养至OD＝0.5，离心去上清，菌体沉淀用少量共培养培养液重悬，得到重组耐盐农杆菌悬液；
E、侵染共培养：将步骤D得到的重组耐盐农杆菌重悬液加入到步骤C得到的海带配子体悬液中，使农杆菌初始OD值达到0.05-0.15，共培养得到重组海带配子体。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述的共培养培养液的配方为：酵母提取物0.1g、蛋白胨0.5g、牛肉膏0.5g、蔗糖0.5g、硫酸镁(MgSO4 7H2O)0.05g、5mg利福平、20μmol乙酰丁香酮(AS)，调节pH＝5.4，消毒海水定容至100mL，高温高压灭菌；
所述的培养基4的配方为：酵母提取物0.1g、蛋白胨0.5g、牛肉膏0.5g、蔗糖0.5g、硫酸镁(MgSO4 7H2O)0.05g、5mg利福平，消毒海水定容至100mL，高温高压灭菌。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述步骤D中重组耐盐农杆菌接种入培养基4中培养的条件为：28℃，200rpm培养24-72小时；
所述步骤E中共培养的条件为：黑暗，80rpm缓慢摇晃，培养温度为16℃，培养时间为48小时。
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