CN111349652A - 一种农杆菌介导的海带配子体遗传转化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种农杆菌介导的海带配子体遗传转化方法。本发明提供的转化方法包括以下步骤：(1)侵染材料的制备；(2)农杆菌活化；(3)侵染共培养；(4)海水培养。本发明通过共培养的方式实现了目的基因向海带配子体的转化，操作简单，以含有GFP基因的表达载体转化耐盐农杆菌便于结果的检测，为海带的遗传育种开辟了新的转化途径，具有实际应用价值。

Description

一种农杆菌介导的海带配子体遗传转化方法
技术领域
本发明属于植物转基因技术领域，具体涉及一种农杆菌介导的海带配子体遗传转化方法。
背景技术
农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物或裸子植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。根癌农杆菌和发根农杆菌的细胞中有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因中，因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。目前，该方法在实验室条件下已经实现了对非农杆菌寄主的生物如真菌、单子叶植物、裸子植物以及动物细胞等的转化。它相对于传统的PEG原生质体，电击转化，LiAC等方法具有材料范围广，转化率高，单拷贝比例高，转化子稳定等优点。
海带作为一种重要的海洋水产作物，年产量在藻类中居首位。因此海带的遗传育种就显得极为重要。传统的遗传育种是通过种间杂交来完成的，但是由于海带品种稀少，野生杂种资源缺乏，严重限制了依靠种间杂交育种实现遗传育种的需要。因此转基因育种在海带育种发展中就成为必要选择。
之前报道的海带遗传转化研究基本都是采用基因枪法和电穿孔法。基因枪法，又叫粒子轰击细胞法或微弹技术，基因枪的作用是用压缩气体(氦或氮等)动力产生一种冷的气体冲击波进入轰击室，把粘有DNA的细微金粉打向细胞，穿过细胞壁、细胞膜、细胞质等层层构造到达细胞核，完成基因转移，只有很少部分的细胞符合这样的要求，大多数会因为力道不对而失败，但这少部分细胞已足够完成基因转移操作的需要。例如，中国专利201611194878.9公开了一种抗除草剂海带孢子体及其制备方法和应用，通过此发明可获得具有抗除草剂基因的幼小种苗，可以保持海带孢子体细胞无性繁殖的遗传稳定性。但基因枪法易引起多拷贝插入和非孟德尔遗传，目标基因与筛选基因有时发生重排，有益基因可能丢失，造成转化效率较低。
电穿孔法是将核酸、蛋白及其它分子导入多种细胞的高效技术，通过高强度的电场作用，瞬时提高细胞膜的通透性，从而吸收周围介质中的外源分子，这种技术可以将核苷酸、DNA与RNA、蛋白类、染料及病毒颗粒等导入原核和真核细胞内。例如，中国专利200810018458.4公开了一种地衣芽孢杆菌工业生产菌株遗传转化方法，运用此发明中的方法，地衣芽孢杆菌工业生产菌株的遗传转化率可达25-1250个/MG DNA，而且此发明可以用于现有技术不能实现的地衣芽孢杆菌菌种的遗传转化。但在电穿孔法中外源基因表达持续的时间很短，大多1至2月后表达量降至很低。
中国专利201811546506.7提供了一种农杆菌介导的海带分子育种的方法，克服了农杆菌侵染海洋藻类过程中农杆菌高盐环境下正常生长的问题、海带配子体与农杆菌共培养的培养基等问题，为海洋藻类的遗传转化和育种开辟了新的途径，但该方法检测过程较为繁琐，转化效率较低，有待进一步优化。
发明内容
为了解决现有技术中的问题，本发明提供了一种农杆菌介导的海带配子体遗传转化方法，以含有GFP基因的表达载体转化耐盐农杆菌，用该农杆菌在共培养培养液中对海带配子体克隆进行侵染和共培养，并用含羧苄西林的海水培养基继续培养，结果证明含有GFP基因的农杆菌介导法成功应用于海带配子体克隆的遗传转化，且检测简便，本发明为海带遗传转化开辟了新的转化途径。
本发明提供了一种农杆菌介导的海带配子体的遗传转化方法，包括以下步骤：
(1)侵染材料的制备：富集海带游孢子，用共培养液稀释海带游孢子，使得其中海带游孢子密度为1-9×104个/mL，得到海带游孢子悬液；
(2)农杆菌活化：采用共培养液培养活化耐盐农杆菌至OD＝0.4-0.6；得到耐盐农杆菌培养液；
(3)侵染共培养：将步骤(2)活化后的耐盐农杆菌培养液离心去除上清，沉淀菌体用共培养液重选后，加入至步骤(1)得到的海带游孢子悬液中，使耐盐农杆菌初始OD值达到0.05-0.3，使用共培养液补至总培养体积为2000mL；在16℃、60-100rpm的条件下，避光培养2天；2天后将温度降到12℃，在光周期为：12/12，光照强度3000lx的条件下继续培养7天；得到侵染共培养物；
(4)海水培养：离心去除步骤(3)得到的侵染共培养物中的培养基，沉淀部分使用含400mg/L羧苄青霉素的海水培养液在12℃、80rpm、3000lx的条件下继续培养7天；
优选地，所述的共培养液为pH＝5.4的含有50mg/L利福平的35‰YEB培养基；
优选地，步骤(1)中富集海带游孢子的方法为：将种海带阴干处理并进行放散，4小时后采用4000rpm、10min的条件对游孢子进行富集。
优选地，步骤(1)中海带游孢子悬液中海带游孢子密度为2×104个/mL。
优选地，步骤(2)中培养活化耐盐农杆菌至OD＝0.5。作为示例地，步骤(2)中使用的耐盐农杆菌为LBA4404、EHA105、GV3101中的一种。
耐盐农杆菌LBA4404、EHA105、GV3101均购自上海唯地生物技术有限公司；其中LBA4404的货号为AC1030；EHA105的货号为AC1012；GV3101的货号为AC1001。三种农杆菌的菌种信息均可于http://www.weidibio.com/info.asp？second_id＝10004进行查询。
优选地，步骤(3)中耐盐农杆菌初始OD值为0.114-0.263；更优选为0.136、0.132、0.221、0.114或0.263。
优选地，步骤(3)中培养条件为在16℃、80rpm的条件下，避光培养2天。
优选地，步骤(4)中所述的海水培养液为海水经孔径0.22μm滤网过滤，煮沸，冷却后加营养盐所得，所述的营养盐为24.3mg/L NaNO3，1.75mg/L KH2PO4。
本发明的有益效果：
1、本发明克服了传统的基因枪法转化效率低，电穿孔法表达不稳定的缺陷，显著的提高了海带配子体遗传转化效率，农杆菌介导的海带配子体遗传转化方法瞬时转化效率可达0.88‰，稳定表达效率可达0.019‰。
2、本发明显著缩短了转化周期，常规需要7-8月，而采用本发明的方法需要1-3个月，即可获得大量的稳定遗传的海带配子体。
3、本发明采用GFP基因的荧光作用观察转化结果，更准确，更便捷。
附图说明
图1为农杆菌EHA105-pBI221-BAR-GFP转化后的海带配子体中观察到绿色荧光。
图2为农杆菌GV3101-pBI221-BAR-GFP转化后的海带配子体中观察到绿色荧光。
图3为农杆菌LBA4404-pBI221-BAR-GFP转化后的海带配子体中观察到绿色荧光。
图4为农杆菌EHA105-pBI221-stGBSS-BAR-GFP转化后的海带配子体中观察到绿色荧光。
图5为农杆菌GV3101-pBI221-stGBSS-BAR-GFP转化后的海带配子体中观察到绿色荧光。
图6为农杆菌LBA4404-pBI221-stGBSS-BAR-GFP转化后的海带配子体中观察到绿色荧光。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步阐述本发明，需要说明的是，以下实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域普通技术人员在不脱离本发明原理的前提下，对本发明进行的改进和修饰也在本发明保护的范围内。
本发明具体实施例中使用的海水取自山东省青岛市沿海，而适合海带生长的海水都适用于本发明。
本发明使用的pBI221-GFP载体均购自优宝生物，产品编号为VT1389。
以下实施例使用的耐盐农杆菌LBA4404、EHA105、GV3101均购自上海唯地生物技术有限公司；其中LBA4404的货号为AC1030；EHA105的货号为AC1012；GV3101的货号为AC1001。三种农杆菌的菌种信息均可于http://www.weidibio.com/info.asp？second_id＝10004进行查询。
基础实施例：
1、试剂：
共培养液：35‰YEB+50mg/L利福平，调节pH＝5.4。
35‰YEB培养基：酵母提取物1g、蛋白胨5g、牛肉膏5g、蔗糖5g、硫酸镁(MgSO47H2O)0.5g，消毒海水定容至1000mL，高温高压灭菌。
海水培养液：海水经0.22μm滤膜过滤，煮沸，冷却后，每1000mL加入24.3mg NaNO3、1.75mg KH2PO4。
50mg/mL利福平：5g利福平(rifampicin)加DMSO至100mL。
400mg/L羧苄青霉素：40g羧苄青霉素(Carbenicillin)加无菌水至100mL。
2、实施过程：
(1)侵染材料的制备：将种海带(2014年8-9月采集编号201409006的种海带)阴干处理并进行放散，4小时后采用4000rpm、10min的条件对游孢子进行富集，用共培养液稀释海带游孢子，使得其中海带游孢子密度为2×104个/mL，得到海带游孢子悬液；
(2)农杆菌活化：采用共培养液培养活化耐盐农杆菌至OD＝0.5；得到耐盐农杆菌培养液；
(3)侵染共培养：将步骤(2)活化后的耐盐农杆菌培养液离心去除上清，沉淀菌体用共培养液重选后，加入至步骤(1)得到的海带游孢子悬液中，使耐盐农杆菌初始OD值达到0.114-0.263，使用共培养液补至总培养体积为2000mL；在16℃、80rpm的条件下，避光培养2天；2天后将温度降到12℃，在光周期为：12/12，光照强度3000lx的条件下继续培养7天；得到侵染共培养物；吸取100μL培养液在显微镜以及荧光显微镜蓝光下观察；
(4)海水培养：离心去除步骤(3)得到的侵染共培养物中的培养基，沉淀部分使用含400mg/L羧苄青霉素的海水培养液在12℃、80rpm、3000lx的条件下继续培养7天。
以下实施例中，实施例1-3所述的pBI221-BAR-GFP质粒为插入了BAR基因的pBI221-GFP载体质粒；实施例4-6所述的pBI221-stGBSS-BAR-GFP质粒为插入了stGBSS、BAR基因的pBI221-GFP质粒。
各实施例的具体参数为：
实施例1：侵染用农杆菌为转入pBI221-BAR-GFP质粒的农杆菌EHA105，侵染共培养的初始OD值为0.132。侵染共培养物的显微观察以及荧光显微镜蓝光下观察结果如图1所示。
实施例2：侵染用农杆菌为转入pBI221-BAR-GFP的农杆菌GV3101，侵染共培养的初始OD值为0.221。侵染共培养物的显微观察以及荧光显微镜蓝光下观察结果如图1所示。
实施例3：侵染用农杆菌为转入pBI221-BAR-GFP的农杆菌LBA4404，侵染共培养的初始OD值为0.136。侵染共培养物的显微观察以及荧光显微镜蓝光下观察结果如图1所示。
实施例4：侵染用农杆菌为转入pBI221-stGBSS-BAR-GFP的农杆菌EHA105，侵染共培养的初始OD值为0.114。侵染共培养物的显微观察以及荧光显微镜蓝光下观察结果如图1所示。
实施例5：侵染用农杆菌为转入pBI221-stGBSS-BAR-GFP的农杆菌GV3101，侵染共培养的初始OD值为0.263。侵染共培养物的显微观察以及荧光显微镜蓝光下观察结果如图1所示。
实施例6：侵染用农杆菌为转入pBI221-stGBSS-BAR-GFP的农杆菌LBA4404，侵染共培养的初始OD值为0.114。侵染共培养物的显微观察以及荧光显微镜蓝光下观察结果如图1所示。
图1-6表明，实施例1-6的方法农杆菌转化后的海带配子体中均观察到绿色荧光，即均能够完成农杆菌介导的海带配子体遗传转化。

Claims (10)

1.一种农杆菌介导的海带配子体遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)侵染材料的制备；
(2)农杆菌活化；
(3)侵染共培养；
(4)海水培养。
2.根据权利要求1所述的转化方法，其特征在于，所述的步骤(1)为富集海带游孢子，用共培养液稀释海带游孢子，得到海带游孢子悬液。
3.根据权利要求1所述的转化方法，其特征在于，所述的步骤(2)为采用共培养液培养活化耐盐农杆菌至OD＝0.4-0.6，得到耐盐农杆菌培养液。
4.根据权利要求1所述的转化方法，其特征在于，所述的步骤(3)为将步骤(2)活化后的耐盐农杆菌培养液离心去除上清，沉淀菌体用共培养液重悬后，加入至步骤(1)得到的海带游孢子悬液中，使耐盐农杆菌初始OD值达到0.05-0.3，在16℃、pH＝5.4、60-100rpm的条件下避光培养2天，得到侵染共培养物；2天后将温度降到12℃，在光周期为12/12，光照强度3000lx的条件下继续培养7天。
5.根据权利要求1所述的转化方法，其特征在于，所述的步骤(4)为离心去除步骤(3)得到的侵染共培养物中的培养基，沉淀部分使用含400mg/L羧苄青霉素的海水培养液在12℃、60-100rpm、3000lx的条件下继续培养7天。
6.根据权利要求2所述的转化方法，其特征在于，所述的海带游孢子悬液中海带游孢子密度为1-9×104个/mL。
7.根据权利要求3所述的转化方法，其特征在于，所述的耐盐农杆菌为LBA4404、EHA105、GV3101中的一种；所述的耐盐农杆菌含有绿色荧光表达载体pBI221-BAR-GFP和pBI221-stGBSS-BAR-GFP中的一种或多种。
8.根据权利要求4所述的转化方法，其特征在于，所述步骤(3)中耐盐农杆菌的初始OD值为0.114、0.132、0.136、0.221或0.263；培养的条件为在16℃、pH＝5.4、80rpm的条件下，避光培养2天，2天后将温度降到12℃，在光周期为：12/12，光照强度3000lx的条件下继续培养7天。
9.根据权利要求1-8所述的转化方法，其特征在于，所述的共培养液为pH＝5.4的含有50mg/L利福平的35‰YEB培养基。
10.权利要求1-9所述的转化方法在海带配子体遗传转化和海带育种中的应用。
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