CN109479726A - 京红早樱的组织培养快速繁殖方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种京红早樱的组织培养快速繁殖方法，涉及植物组织培养技术领域。京红早樱的组织培养快速繁殖方法包括提供外植体、外植体消毒、启动培养、增殖培养、壮苗培养、生根培养和炼苗移栽，通过对这些步骤进行针对性的改进，实现了京红早樱的有效组培快繁，采用本发明方法对京红早樱外植体消毒和启动培养后能显著降低培养后芽苗的污染率和褐化率，增殖培养后诱导分化率高，增殖迅速，形成的新芽伸长性好，增殖系数高，生根培养后根系粗壮、韧性好、根数多，生根率高，炼苗移栽后成活率显著提升。本发明方法简便易行，为京红早樱的遗传转化与分子育种提供了技术支撑。
Description
技术领域
本发明涉及植物组织培养技术领域，具体而言，涉及一种京红早樱的组织培养快速繁殖方法。
背景技术
京红早樱(Cerasus serrulata‘Jing hong zao ying’，)是一种极少数能耐零下20度的大红色重瓣早樱品种，为蔷薇科樱属下的落叶乔木，具有观赏价值高、适应性强和抗性强的优点，极具开发价值。
传统樱花的繁殖方法主要有播种、分株、嫁接和高空压条等，绝大多数樱花种类扦插不易生根，这些繁殖方法成苗慢，难以大量生产。随着组培技术的发展，组培成为樱花快速繁殖和工厂化生产的一条新途径。
虽然研究人员对樱花的组织培养繁殖方法已经开展了一些研究，通过叶片、叶柄、茎段或嫩梢等外植体培养获得了再生植株，但目前还未有针对京红早樱品种的组织培养与快速繁殖方法，同时在组织培养快速繁殖过程中还存在外植体易污染、易褐化死亡、丛生芽少、丛生芽茎段不易伸长以及生根困难等问题，不能满足实际生产需求。
因此，所期望的是寻求一种京红早樱的组织培养快速繁殖方法，其能够解决上述技术问题中的至少一个。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种京红早樱的组织培养快速繁殖方法，组培中主要克服褐化、茎节短不易伸长、长势慢、生根难的问题，该方法实现了京红早樱的组培快繁，污染率低、褐化率低，诱导分化率高，增殖迅速，形成的新芽伸长性好，增殖系数高，生根培养后根系粗壮、韧性好、根数多，生根率高，炼苗移栽后成活率显著提升。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明提供了一种京红早樱的组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤：
(a)提供外植体：以当年抽条的至少含有一个腋芽的茎段为外植体；
(b)外植体消毒：先用65-75vt％的酒精浸泡10-15s，然后用0.5-0.8wt％H2O2溶液浸泡摇动10-15min，再用0.1-0.2wt％HgCl2溶液浸泡摇动4-5min，用无菌水冲洗3-5次，去除表面水分；
(c)启动培养：将步骤(b)消毒后的茎段转移至启动培养基中，培养15-20天开始形成丛生芽，培养25-30天获得不定芽苗；启动培养基包括：3/4MS+6-BA 1-2mg/L+NAA 0.05-0.15mg/L+PVP 0.5-1.5g/L+凝胶剂0.4-0.6wt％+碳源3-4wt％，pH 5.6-6.0；培养环境包括：培养温度25-28℃，光照强度1000-1500lux，每天的光照时间12-14h；
(d)增殖培养：将步骤(c)新抽出的腋芽2-3cm接种到增殖培养基中，培养30-35天后形成丛生苗；增殖培养基包括：3/4MS+6-BA 1.5-2mg/L+IBA 0.05-0.15mg/L+GA3 0.1-0.3mg/L+GO凝胶液4-6ml/L；培养环境包括：培养温度25-28℃，光照强度1500-2000lux，每天的光照时间12-14h；
(e)壮苗培养：将步骤(d)获得的丛生苗接种到壮苗培养基中，培养25-30天后获得壮苗；壮苗培养基为3/4MS+6-BA 0.4-0.6mg/L+NAA 0.005-0.015mg/L+GA3 0.04-0.06mg/L+GO凝胶液4-6ml/L+凝胶剂0.5-0.7wt％+碳源1-3wt％，pH 5.6-6.0；培养环境包括：培养温度25-28℃，光照强度2000-2500lux，每天的光照时间12-14h；
(f)生根培养：将步骤(e)获得的壮苗2-3cm接种到生根培养基中，培养30-35天；生根培养基包括：1/2MS+NAA 0.2-0.4mg/L+IBA 0.1-0.3mg/L+AC 0.5-1.5g/L+GO凝胶液9-11ml/L+凝胶剂0.5-0.7wt％+碳源1-3wt％，pH 5.6-6.0；培养环境包括：培养温度25-28℃，光照强度2000-2500lux，每天的光照时间15-17h；
(g)炼苗移栽：生根培养30-35天后，先将组培器皿封口盖松动但不打开，在温度为25-28℃，光照强度为2000-2500lux的环境条件下炼苗2-3天，再将组培器皿封口盖打开露出缝隙后炼苗2-3天，然后将组培器皿封口盖完全打开后炼苗2-3天后移栽；
选择根长2cm以上、生根数3条以上以及生长健壮的组培苗进行移栽，将根部清洗和消毒后的组培苗移栽到灭过菌的基质中，覆膜培养，早晚喷水，一周后，部分揭膜，继续培养一周后，全部揭膜，保持土壤湿润，培养30-35天后移栽到大田；基质包括腐殖土、珍珠岩和蛭石，腐殖土、珍珠岩和蛭石的质量比为5-7:2-4:1。
优选地，在本发明提供的技术方案的基础上，步骤(a)中，所述外植体取自当年抽出的新嫩枝条，保留4-6mm叶柄和枝条顶端幼嫩部分，截段2-3cm。
优选地，在本发明提供的技术方案的基础上，步骤(c)中，启动培养基包括：3/4MS+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.1mg/L+PVP 1g/L+凝胶剂0.5wt％+碳源3wt％，pH 5.8。
优选地，在本发明提供的技术方案的基础上，步骤(d)中，增殖培养基包括：3/4MS+6-BA 2mg/L+IBA 0.1mg/L+GA3 0.2mg/L+GO凝胶液5ml/L。
优选地，在本发明提供的技术方案的基础上，步骤(f)中，生根培养基包括：1/2MS+NAA 0.3mg/L+IBA 0.2mg/L+AC 1g/L+GO凝胶液10ml/L+凝胶剂0.6wt％+碳源2wt％，pH5.8。
优选地，在本发明提供的技术方案的基础上，步骤(e)中，壮苗培养基包括：3/4MS++6-BA 0.5mg/L+NAA 0.01mg/L+GA3 0.05mg/L+GO凝胶液5ml/L+凝胶剂0.6wt％+碳源2wt％，pH 5.8。
优选地，在本发明提供的技术方案的基础上，步骤(g)中，移栽后的环境条件包括：环境湿度为60-80％，环境温度为18-30℃；光照强度条件包括：移栽后前15-20天，通过外遮阳控制光照强度5000-8000lux，然后打开外遮阳。
优选地，在本发明提供的技术方案的基础上，步骤(g)中，基质还包括石英砂，石英砂、腐殖土、珍珠岩和蛭石的质量比为1-2:5-7:2-4:1。
优选地，在本发明提供的技术方案的基础上，步骤(c)中启动培养基、步骤(e)中壮苗培养基和步骤(f)中生根培养基中的凝胶剂均独立地包括琼脂、卡拉胶或Gelrite中的一种或几种，优选为卡拉胶。
优选地，在本发明提供的技术方案的基础上，步骤(c)中启动培养基、步骤(e)中壮苗培养基和步骤(f)中生根培养基中的碳源均独立地包括葡萄糖、麦芽糖或蔗糖中的一种或几种，优选为蔗糖。
与已有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明方法从外植体取材、外植体消毒、启动培养、增殖培养、生根培养和炼苗培养等步骤进行针对性的改进，实现了京红早樱的组培快繁，消毒和启动培养后能显著降低培养后芽苗的污染率和褐化率，腋芽15-20天后的萌芽率达80％以上，启动25-30天后新芽的污染率低于10％，褐化率低于20％，增殖培养后诱导分化率高，增殖迅速，形成的新芽伸长性好，增殖30-35天后新芽可伸长到2-4cm，每芽的叶片达到6片以上，叶色嫩绿，增殖系数高，达4以上，生根培养后根系粗壮、韧性好、根数多，生根率高，达90％以上，炼苗移栽后成活率显著提升，达85％以上。本发明方法简便易行，弥补了京红早樱组培快繁方法的空白，为京红早樱的遗传转化与分子育种提供了技术支撑。
在组培中使用了氧化石墨烯GO凝胶液，大大缓解了京红早樱茎节短不易伸长、长势慢和生根难的问题。氧化石墨烯凝胶(GO凝胶液)具有促进缓释的作用，可以吸收和输送培养基中的营养物质，使得组培苗得以长得更健壮、更高，叶片浓绿且叶面积更大。同时氧化石墨烯可以大大促进组培苗的生根，使得组培苗得以长出更多的须根，吸收营养速率更快，苗更健壮。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明提供了一种京红早樱的组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤：
(a)提供外植体：以当年抽条的至少含有一个腋芽的茎段为外植体；
(b)外植体消毒：先用65-75vt％的酒精浸泡10-15s，然后用0.5-0.8wt％H2O2溶液浸泡摇动10-15min，再用0.1-0.2％HgCl2溶液浸泡摇动4-5min，用无菌水冲洗3-5次，去除表面水分；
(c)启动培养：将步骤(b)消毒后的茎段转移至启动培养基中，培养15-20天开始形成丛生芽，培养25-30天获得不定芽苗；启动培养基包括：3/4MS+6-BA 1-2mg/L+NAA 0.05-0.15mg/L+PVP 0.5-1.5g/L+凝胶剂0.4-0.6wt％+碳源3-4wt％，pH 5.6-6.0；培养环境包括：培养温度25-28℃，光照强度1000-1500lux，光照时间12-14h/d；
(d)增殖培养：将步骤(c)新抽出的腋芽2-3cm接种到增殖培养基中，培养30-35天后形成丛生苗；增殖培养基包括：3/4MS+6-BA 1.5-2mg/L+IBA 0.05-0.1mg/L+GA3 0.1-0.3mg/L+GO凝胶液4-6ml/L；培养环境包括：培养温度25-28℃，光照强度1500-2000lux，光照时间12-14h/d；
(e)壮苗培养：将步骤(d)获得的丛生苗接种到壮苗培养基中，培养25-30天后获得壮苗；壮苗培养基为3/4MS+6-BA 0.4-0.6mg/L+NAA 0.005-0.015mg/L+GA3 0.04-0.06mg/L+GO凝胶液4-6ml/L+凝胶剂0.5-0.7wt％+碳源1-3wt％，pH 5.6-6.0；培养环境包括：培养温度25-28℃，光照强度2000-2500lux，每天的光照时间12-14h；
(f)生根培养：将步骤(e)获得的壮苗2-3cm接种到生根培养基中，培养30-35天；生根培养基包括：1/2MS+NAA 0.2-0.4mg/L+IBA 0.1-0.3mg/L+AC 0.5-1.5g/L+GO凝胶液9-11ml/L+凝胶剂0.5-0.7wt％+碳源1-3wt％，pH 5.6-6.0；培养环境包括：培养温度25-28℃，光照强度2000-2500lux，光照时间15-17h/d；
(g)炼苗移栽：生根培养30-35天后，先将组培器皿封口盖松动但不打开，在温度为25-28℃，光照强度为2000-2500lux的条件下炼苗2-3天，再将组培器皿封口盖打开露出缝隙后炼苗2-3天，然后将组培器皿封口盖完全打开后炼苗2-3天后移栽；选择根长2cm以上、生根数3条以上以及生长健壮的组培苗进行移栽，将根部清洗和消毒后的组培苗移栽到灭过菌的基质中，覆膜培养，早晚喷水，一周后，部分揭膜，继续培养一周后，全部揭膜，保持土壤湿润，培养30-35天后移栽到大田；基质包括腐殖土、珍珠岩和蛭石，腐殖土、珍珠岩和蛭石的质量比为5-7:2-4:1。
京红早樱属于蔷薇科樱属下的落叶乔木，叶片长圆卵形至长圆倒卵形，先端渐尖，叶边有单锯齿或重锯齿，下面中肋和细脉有长柔毛，花为深红色，花瓣倒卵形，先端全缘或微凹，花期在2-3月。
目前还未有适用于该品种的樱花的组培快繁方法，本发明提出了一种京红早樱的组培快繁方法，包括外植体取材、外植体消毒、启动培养、增殖培养、壮苗培养、生根培养和炼苗移栽步骤。
外植体取材
以京红早樱当年抽条的至少含有一个腋芽的茎段为外植体。示例性的方式是在不同季节采集当年抽出的新嫩枝条，新发枝条通常在10公分左右，为半木质化枝条，采集后去除叶片，保留4-6mm(例如4mm、5mm或6mm)叶柄和枝条顶端幼嫩部分，枝条截段2-3cm，至少含有1个腋芽。
外植体消毒
先用65-75vt％的酒精浸泡10-15s，然后用0.5-0.8wt％H2O2溶液浸泡摇动10-15min，再用0.1-0.2wt％HgCl2溶液浸泡摇动4-5min，用无菌水冲洗3-5次，去除表面水分。
vt％表示体积分数，酒精的体积分数示例性的例如为65vt％、66vt％、68vt％、70vt％、72vt％、74vt％或75vt％，酒精浸泡时间示例性的例如为10s、12s、14s或15s；wt％表示质量分数，H2O2溶液的质量分数示例性的例如为0.5wt％、0.6wt％、0.7wt％或0.8wt％，H2O2溶液浸泡摇动时间示例性的例如为10min、12min或15min；HgCl2溶液的质量分数示例性的例如为0.1wt％、0.12wt％、0.15wt％、0.18wt％或0.2wt％，HgCl2溶液浸泡摇动时间示例性的例如为4min、4.5min或5min。
优选地，用无菌水冲洗时每次2-3min。
优选地，去除表面水分的方式为用无菌滤纸吸干水分。
优选地，外植体消毒前用饱和肥皂水溶液振荡洗涤5-10min，然后用自来水冲洗干净。
通过采用上述方式对外植体进行消毒，能显著降低其培养后的污染率和死亡率，启动培养25天后污染率低于10％，褐化率低于20％。
启动培养
优选将消毒后的茎段在50mg/L的抗坏血酸+100mg/L的柠檬酸高压灭菌溶液中浸泡半小时以便减轻褐化后，转移至启动培养基中，启动培养基包括：3/4MS+6-BA 1-2mg/L+NAA 0.05-0.15mg/L+PVP 0.5-1.5g/L+凝胶剂0.4-0.6wt％+碳源3-4wt％，pH 5.6-6.0。
启动培养基中3/4MS为基本培养基，培养基中添加1-2mg/L的6-BA(人工合成的细胞分裂素，6-苄氨基腺嘌呤)、0.05-0.15mg/L的NAA(α-萘乙酸)、0.5-1.5g/L的PVP(聚乙烯吡咯烷酮)、0.4-0.6wt％的凝胶剂和3-4wt％的碳源。
6-BA的添加量示例性的例如为1mg/L、1.2mg/L、1.5mg/L、1.6mg/L、1.8mg/L或2.0mg/L；NAA的添加量示例性的例如为0.05mg/L、0.06mg/L、0.07mg/L、0.08mg/L、0.09mg/L或0.1mg/L；PVP的添加量示例性的例如为0.5mg/L、0.6mg/L、0.7mg/L、0.8mg/L、0.9mg/L、1mg/L、1.2mg/L或1.5mg/L；凝胶剂包括但不限于琼脂、卡拉胶或Gelrite等，凝胶剂的添加量示例性的例如为0.4wt％、0.5wt％或0.6wt％；碳源包括但不限于葡萄糖、麦芽糖或蔗糖等，碳源的添加量示例性的例如为3wt％、3.5wt％或4wt％。
启动培养基的pH为5.6、5.7、5.8、5.9或6.0。
启动培养的培养环境包括：培养温度25-28℃，优选暗培养5天后，转入光下培养，以减轻褐化，光照强度1000-1500lux，每天的光照时间为12-14h。
培养温度示例性的例如为25℃、26℃、27℃或28℃，光照强度示例性的例如为1000lux、1100lux、1200lux、1300lux、1400lux或1500lux，每天的光照时间示例性的例如为12h、13h或14h。
培养15-20天开始形成丛生芽，萌芽率高，培养25-30天获得不定芽苗。
增殖培养
将新抽出的腋芽2-3cm接种到增殖培养基中，增殖培养基包括：3/4MS+6-BA 1.5-2mg/L+IBA 0.05-0.15mg/L+GA3 0.1-0.3mg/L+GO凝胶液4-6ml/L。
增殖培养基中3/4MS为基本培养基，培养基中添加1.5-2mg/L的6-BA、0.05-0.15mg/L的IBA、0.1-0.3mg/L的GA3(赤霉素)和4-6ml/L的GO凝胶液。
GO凝胶液为氧化石墨烯凝胶(水凝胶)，是氧化石墨烯分散于水中形成的高分散性氧化石墨烯，呈凝胶态液体。可通过市售方式获得。本发明采用的GO凝胶液是由GO凝胶液母液稀释10-20倍得到，即5-10wt％的GO凝胶液母液。
优选地，GO凝胶母液主要由以下步骤制备得到：
先将石墨粉体加入80-90℃的氧化剂A中反应3-4h，分离、干燥后获得反应物A；再在冰浴条件下向反应物A中加入氧化剂B进行混合，混合液在40-50℃下反应12-24h，加水继续混合1-10h，静置；弃去上层清液，下层悬浮液即GO凝胶母液；氧化剂A是将Mn3O4和[Co(NH3)6]Cl3溶于100-120℃的浓硫酸中得到的，氧化剂B是将KMnO4溶于浓硫酸中得到的。
优选地，GO凝胶液采用以下方法制备得到：
(1)将Mn3O4和[Co(NH3)6]Cl3溶于100-120℃的浓硫酸中，得到氧化剂A；
(2)将石墨粉体加入80-90℃的氧化剂A中反应3-4h，分离、干燥得到反应物A；
(3)在冰浴条件下向反应物A中加入浓硫酸，再加入KMnO4溶解，混合液在40-50℃下反应12-24h，加水继续混合1-10h，静置；
(4)弃去上层清液，加入下层悬浮液体积的10-20倍的水稀释，得到GO凝胶液。
该方法获得的GO凝胶液GO分散度高，对组培苗的增殖具有很好的促进效果。
6-BA的添加量示例性的例如为1.5mg/L、1.6mg/L、1.7mg/L、1.8mg/L、1.9mg/L或2.0mg/L；6-BA浓度在3mg/L以下的培养条件下，都不会发生玻璃化现象。IBA的添加量示例性的例如为0.005mg/L、0.006mg/L、0.008mg/L、0.1mg/L、0.12mg/L或0.15mg/L；GA3的添加量示例性的例如为0.1mg/L、0.2mg/L或0.3mg/L。GO凝胶液的添加量示例性的例如为4ml/L、5ml/L或6ml/L，该浓度下对于组培苗增殖效果明显是基于大量其他树种的组培实验基础所得数据。
增殖培养的培养环境包括：培养温度25-28℃，光照强度1500-2000lux，每天的光照时间为12-14h。
培养温度示例性的例如为25℃、26℃、27℃或28℃，光照强度示例性的例如为1500lux、1600lux、1700lux、1800lux、1900lux或2000lux，每天的光照时间示例性的例如为12h、13h或14h。
丛生芽茎段能够伸长，芽生长快，增殖系数高，培养30-35天后形成丛生苗。
壮苗培养
将获得的丛生苗接种到壮苗培养基中，培养25-30天后获得壮苗。
壮苗培养基中3/4MS为基本培养基，培养基中添加0.4-0.6mg/L的6-BA、0.005-0.015mg/L的NAA和0.04-0.06mg/L的GA3、4-6ml/L的GO凝胶液、0.5-0.7wt％的凝胶剂和1-3wt％的碳源。
6-BA的添加量示例性的例如为0.4mg/L、0.5mg/L或0.6mg/L；NAA的添加量示例性的例如为0.005mg/L、0.008mg/L、0.01mg/L、0.012mg/L或0.015mg/L；GA3的添加量示例性的例如为0.04mg/L、0.05mg/L或0.06mg/L；GO凝胶液如上文所述，其添加量示例性的例如为4ml/L、5ml/L或6ml/L；凝胶剂包括但不限于琼脂、卡拉胶或Gelrite等，凝胶剂的添加量示例性的例如为0.5wt％、0.6wt％或0.7wt％；碳源包括但不限于葡萄糖、麦芽糖或蔗糖等，碳源的添加量示例性的例如为1wt％、2wt％或3wt％。
pH为5.6、5.7、5.8、5.9或6.0。
培养环境包括：培养温度25-28℃，光照强度2000-2500lux，每天的光照时间12-14h。
壮苗培养温度示例性的例如为25℃、26℃、27℃或28℃，光照强度示例性的例如为2000lux、2100lux、2200lux、2300lux、2400lux或2500lux，每天的光照时间示例性的例如为12h、13h或14h。
生根培养
将获得的壮苗2-3cm接种到生根培养基中，培养30-35天。
生根培养基中1/2MS为基本培养基，培养基中添加0.2-0.4mg/L的NAA、0.1-0.3mg/L的IBA(生长素类似物，吲哚丁酸)、0.5-1.5g/L的AC(活性炭)、9-11ml/L的GO凝胶液、0.5-0.7wt％的凝胶剂和1-3wt％的碳源。
NAA的添加量示例性的例如为0.2mg/L、0.3mg/L或0.4mg/L；IBA的添加量示例性的例如为0.1mg/L、0.2mg/L或0.3mg/L；AC的添加量示例性的例如为0.5g/L、0.6g/L、0.8g/L、1g/L、1.2g/L或1.5g/L；凝胶剂包括但不限于琼脂、卡拉胶或Gelrite等，凝胶剂的添加量示例性的例如为0.5wt％、0.6wt％或0.7wt％；碳源包括但不限于葡萄糖、麦芽糖或蔗糖等，碳源的添加量示例性的例如为1wt％、2wt％或3wt％。GO凝胶液如上文所述，其添加量示例性的例如为9ml/L、10ml/L或11ml/L，该浓度下对于组培苗生根效果明显是基于大量其他树种的组培实验基础所得数据。
启动培养基的pH为5.6、5.7、5.8、5.9或6.0。
培养温度示例性的例如为25℃、26℃、27℃或28℃，光照强度示例性的例如为2000lux、2100lux、2200lux、2300lux、2400lux或2500lux，每天的光照时间示例性的例如为15h、16h或17h。
生根培养后根系粗壮、韧性好，根数多，生根率高。
炼苗移栽
炼苗过程包括：先将组培器皿封口盖松动但不打开，在温度为25-28℃，光照强度为2000-2500lux的环境条件下炼苗2-3天，再将组培器皿封口盖打开露出缝隙后炼苗2-3天，然后将组培器皿封口盖完全打开后炼苗2-3天后移栽。
组培器皿典型但非限制性的例如为组培瓶。炼苗环境温度示例性的例如为25℃、26℃、27℃或28℃，光照强度示例性的例如为2000lux、2100lux、2200lux、2300lux、2400lux或2500lux。
采用光照逐渐增强的逐步炼苗方式进一步增强组培苗的抵抗力。
选择根长2cm以上、生根数3条以上以及生长健壮的组培苗进行移栽，将根部清洗和消毒后的组培苗移栽到灭过菌的基质中，覆膜培养，早晚喷水，一周后，部分揭膜，继续培养一周后，全部揭膜，保持土壤湿润，培养30-35天后移栽到大田；基质包括腐殖土、珍珠岩和蛭石，腐殖土、珍珠岩和蛭石的质量比为5-7:2-4:1。
优选地，消毒方式为用稀释500-1000倍的多菌灵溶液浸泡根部10-30s，例如10s、15s、20s或30s。
优选地，移栽后的前天用稀释500-1000倍的多菌灵溶液对移栽基质进行消毒(覆膜3-4小时后揭膜)。
基质中腐殖土的质量份数例如为5份、6份或7份，珍珠岩的质量份数例如为2份、3份或4份，蛭石的质量份数例如为1份。
采用该方式炼苗移栽后移栽成活率高。
本发明方法从外植体取材、外植体消毒、启动培养、增殖培养、生根培养和炼苗培养等步骤进行改进，消毒和启动培养后能显著降低培养后芽苗的污染率和褐化率，增殖培养后诱导分化率高，增殖迅速，形成的新芽伸长性好，增殖系数高，生根培养后根系粗壮、韧性好、根数多，生根率高，炼苗移栽后成活率显著提升。本发明方法简便易行，实现了京红早樱的组培快繁，为京红早樱的遗传转化与分子育种提供了技术支撑。
采用本发明方法具有较低的污染率和褐化率，启动效果好，腋芽15-20天后的萌芽率达80％以上，启动25-30天后新芽的污染率低于10％，褐化率低于20％，增殖30-35天后新芽可伸长到2-4cm，每芽的叶片达到6片以上，叶色嫩绿，增殖系数达4以上，组培苗生根率90％以上，移栽成活率达85％以上。
在一种实施方式中，步骤(c)中，启动培养基包括：3/4MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.1mg/L+PVP 1g/L+凝胶剂0.5wt％+碳源3wt％，pH 5.8。
通过优化启动培养基的成分，降低新芽褐化率，提高萌芽率。启动培养基中添加PVP 1g/L后，茎段的底端切口周围有粘液包裹，可以有效防止导致组培苗褐化的酚类物质继续扩散，从而降低褐化率。
在一种实施方式中，步骤(d)中，增殖培养基包括：3/4MS+6-BA 2mg/L+IBA 0.1mg/L+GA3 0.2mg/L+GO凝胶液5ml/L。
通过优化增殖培养基的成分，有利于进一步提高增殖系数。
在一种实施方式中，步骤(f)中，生根培养基包括：1/2MS+NAA 0.3mg/L+IBA0.2mg/L+AC 1g/L+GO凝胶液10ml/L+凝胶剂0.6wt％+碳源2wt％，pH 5.8。
通过优化生根培养基的成分，有利于进一步提高生根率。
在一种实施方式中，步骤(e)中，壮苗培养基包括：3/4MS++6-BA 0.4-0.6mg/L+NAA0.005-0.015mg/L+GA3 0.04-0.06mg/L+GO凝胶液5ml/L+凝胶剂0.6wt％+碳源2wt％，pH5.8。
采用优选的壮苗培养基能够获得较好的壮苗效果。
在一种实施方式中，步骤(g)中，移栽后的环境条件包括：环境湿度为60-80％，环境温度为18-30℃；光照强度条件包括：移栽后前15-20天，通过外遮阳控制光照强度5000-8000lux，然后打开外遮阳。
环境湿度示例性的例如为60％、70％或80％，环境温度示例性的例如为18℃、20℃、22℃、24℃、25℃、26℃、28℃或30℃。
移栽后前15-20天，通过外遮阳控制光照强度示例性的例如为5000lux、6000lux、7000lux或8000lux，然后打开外遮阳。
移栽后采用逐步加大光照的方式对组培苗进行驯化，能进一步提升其移栽成活率。
在一种实施方式中，步骤(g)中，基质还包括石英砂；石英砂、腐殖土、珍珠岩和蛭石的质量比为1-2:5-7:2-4:1。
基质中石英砂的质量份数例如为1份、1.5份或2份，通过加入一定比例的石英砂，能进一步提升移栽成活率。
下面结合具体实施例和对比例对本发明作详细说明。
试验材料：于2018年4-8月，不同季节取京红早樱当年抽出的新嫩枝条为外植体，新发枝条10公分左右时，半木质化枝条，材料来源于陕西宝鸡。
植物激素和培养基类均采用市售产品。
GO凝胶液采用以下方法制备得到：
(1)将Mn3O4和[Co(NH3)6]Cl3溶于100℃的浓硫酸中，得到氧化剂A；
(2)将石墨粉体加入80℃的氧化剂A中反应4h，过滤、烘干得到反应物A；
(3)在冰浴条件下向反应物A中加入浓硫酸，再加入KMnO4溶解，混合液在50℃下反应12h，加水继续混合10h，静置；
(4)弃去上层清液，加入下层悬浮液体积的14倍的水稀释，得到GO凝胶液。
实施例1
一种京红早樱的组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤：
(1)外植体取材：
采集外植体，去除叶片，保留5mm叶柄和枝条顶端幼嫩部分，枝条截段2cm，至少含有1个腋芽。
(2)外植体消毒：
用饱和肥皂水溶液振荡洗涤10min，然后用自来水冲洗干净，预处理的材料在超净工作台中，用70％的酒精浸泡10s，0.6％H2O2溶液中浸泡摇动15min，0.1％HgCl2溶液中浸泡摇动4min，无菌水冲洗5次，3min/次，最后用无菌滤纸吸干水分。
(3)启动培养：
将消毒后的茎段在50mg/L的抗坏血酸+100mg/L的柠檬酸高压灭菌溶液中浸泡半小时减轻褐化后，转移至启动培养基中，启动培养基为：3/4MS+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.1mg/L+PVP 1g/L+卡拉胶0.5wt％+蔗糖3wt％，pH 5.8-6.0；培养环境包括：培养温度25℃，暗培养5天后，转入光下培养，以减轻褐化，光照强度1500lux，每天的光照时间12h；培养15天开始形成丛生芽，培养25天获得不定芽苗。
(4)增殖培养：
将新抽出的腋芽2cm左右接入增殖培养基中，增殖培养基为：3/4MS+6-BA 2mg/L+IBA 0.1mg/L+GA3 0.2mg/L+GO凝胶液5ml/L；培养环境包括：培养温度25℃，光照强度2000lux，每天的光照时间12h；培养30天后形成丛生苗。
(5)壮苗培养：
将获得的丛生苗，接种到壮苗培养基中，壮苗培养基为：3/4MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.01mg/L+GA3 0.05mg/L+GO凝胶液5ml/L+卡拉胶0.6wt％+蔗糖2wt％；培养环境包括：培养温度25℃，光照强度2500lux，每天的光照时间12h。壮苗培养25天，获得壮苗。
(6)生根培养：
将2cm的壮苗接入生根培养基中，生根培养基为：1/2MS+NAA 0.3mg/L+IBA 0.2mg/L+AC 1g/L+GO凝胶液10ml/L+卡拉胶0.6wt％+蔗糖2wt％，pH 5.8-6.0；培养环境包括：培养温度25℃，光照强度2500lux，每天的光照时间16h；生根培养30天。
(7)炼苗移栽：
生根培养基培养30d后，先将组培瓶封口盖松动但不打开，在温度为25℃，光照强度为2500lux组培室进行炼苗两天，再将组培瓶封口盖轻轻打开少许缝隙后炼苗两天，接着将封口盖打开后炼苗两天后移栽。移栽前一天用稀释一千倍的多菌灵水溶液对移栽基质进行消毒(覆膜4小时后揭膜)，移栽时选择根长2厘米以上，生根数3条以上，生长健壮的组培苗进行移栽，移栽时将组培苗从培养基中取出，用清水将根部的培养基清洗干净，用稀释一千倍的多菌灵水溶液浸泡根部15s，移栽到灭过菌的腐殖土：珍珠岩：蛭石＝6：3：1(质量比)的基质中，控制温室内湿度60-80％，移栽后前15天，通过温室内外遮阳网的使用控制光照强度6000lux，之后打开外遮阳驯化，温度25℃，移栽后覆膜培养，早晚喷水，一周后，覆盖膜打开少许，继续培养一周后，揭膜培养，保持土壤湿润，培养30天后移栽到大田。
实施例2-5
实施例2-5与实施例1的不同之处在于，步骤(3)中的启动培养基不同，具体如下：
实施例2：3/4MS+6-BA 2mg/L+NAA 0.15mg/L+PVP 0.5g/L+卡拉胶0.5wt％+蔗糖3wt％；
实施例3：3/4MS+6-BA 1.2mg/L+NAA 0.08mg/L+PVP 0.8g/L+卡拉胶0.5wt％+蔗糖3wt％；
实施例4：3/4MS+6-BA 1.8mg/L+NAA 0.12mg/L+PVP 1.2g/L+卡拉胶0.5wt％+蔗糖3wt％；
实施例5：3/4MS+6-BA 1mg/L+NAA 0.05mg/L+PVP 1.5g/L+卡拉胶0.5wt％+蔗糖3wt％。
实施例6-9
实施例6-9与实施例1的不同之处在于，步骤(4)中的增殖培养基不同，具体如下：
实施例6：3/4MS+6-BA 1.5mg/L+IBA 0.15mg/L+GA3 0.1mg/L+GO凝胶液4ml/L；
实施例7：3/4MS+6-BA 1.6mg/L+IBA 0.12mg/L+GA3 0.15mg/L+GO凝胶液6ml/L；
实施例8：3/4MS+6-BA 1.8mg/L+IBA 0.08mg/L+GA3 0.25mg/L+GO凝胶液5ml/L；
实施例9：3/4MS+6-BA 2.0mg/L+IBA 0.10mg/L+GA3 0.3mg/L+GO凝胶液5ml/L。
实施例10-12
实施例10-12与实施例1的不同之处在于，步骤(5)中壮苗培养基不同，具体如下：
实施例10：3/4MS+6-BA 0.4mg/L+NAA 0.015mg/L+GA3 0.04mg/L+GO凝胶液4ml/L+卡拉胶0.6wt％+蔗糖2wt％；
实施例11：3/4MS+6-BA 0.6mg/L+NAA 0.005mg/L+GA3 0.06mg/L+GO凝胶液6ml/L+卡拉胶0.6wt％+蔗糖2wt％；
实施例12：3/4MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.01mg/L+GA3 0.05mg/L+GO凝胶液5ml/L+卡拉胶0.6wt％+蔗糖2wt％。
实施例13-15
实施例13-15与实施例1的不同之处在于，步骤(6)中生根培养基不同，具体如下：
实施例13：1/2MS+NAA 0.2mg/L+IBA 0.3mg/L+AC 0.5g/L+GO凝胶液9ml/L+卡拉胶0.6wt％+蔗糖2wt％；
实施例14：1/2MS+NAA 0.4mg/L+IBA 0.1mg/L+AC 1.5g/L+GO凝胶液11ml/L+卡拉胶0.6wt％+蔗糖2wt％；
实施例15：1/2MS+NAA 0.3mg/L+IBA 0.1mg/L+AC 0.8g/L+GO凝胶液10ml/L+卡拉胶0.6wt％+蔗糖2wt％。
实施例16
实施例16与实施例1的不同之处在于，步骤(7)中基质为腐殖土：珍珠岩：蛭石＝5：4：1(质量比)。
实施例17
实施例17与实施例1的不同之处在于，步骤(7)中基质为腐殖土：珍珠岩：蛭石＝7：2：1(质量比)。
实施例18
实施例18与实施例1的不同之处在于，步骤(7)中基质为石英砂：腐殖土：珍珠岩：蛭石＝1：7：2：1(质量比)。
实施例19
实施例19与实施例1的不同之处在于，步骤(7)中控制光照始终保持光照强度8000lux。
对比例1
对比例1与实施例1的不同之处在于，步骤(2)外植体的消毒方法为：用70％的酒精浸泡10s，3％次氯酸钠溶液中浸泡摇动15min。
对比例2
对比例2与实施例1的不同之处在于，步骤(2)外植体的消毒方法为：用70％的酒精浸泡10s，0.1％HgCl2溶液中浸泡摇动4min，0.6％H2O2溶液中浸泡摇动15min。
对比例3-4
对比例3-4与实施例1的不同之处在于，步骤(3)中的启动培养基不同，具体如下：
对比例3：3/4MS+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.1mg/L+卡拉胶0.5wt％+蔗糖3wt％；
对比例4：3/4MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.2mg/L+PVP 0.4g/L+卡拉胶0.5wt％+蔗糖3wt％。
对比例5-8
对比例5-8与实施例1的不同之处在于，步骤(4)中的增殖培养基不同，具体如下：
对比例5：3/4MS+6-BA 2mg/L+IBA 0.1mg/L+NAA 0.2mg/L+GO凝胶液5ml/L；
对比例6：3/4MS+6-BA 2mg/L+IBA 0.1mg/L+GA3 0.2mg/L+GO凝胶液2ml/L；
对比例7：3/4MS+6-BA 2mg/L+IBA 0.1mg/L+GA3 0.2mg/L+GO凝胶液8ml/L；
对比例8：3/4MS+6-BA 2mg/L+IBA 0.1mg/L+GA3 0.2mg/L。
对比例9
对比例9与实施例1的不同之处在于，步骤(5)中壮苗培养基不同，具体如下：
对比例9：3/4MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.01mg/L+GA3 0.05mg/L+卡拉胶0.6wt％+蔗糖2wt％。
对比例10-12
对比例10-12与实施例1的不同之处在于，步骤(6)中的生根培养基不同，具体如下：
对比例10：1/2MS+IBA 0.2mg/L+AC 1g/L+GO凝胶液10ml/L+卡拉胶0.6wt％+蔗糖2wt％；
对比例11：1/2MS+NAA 0.3mg/L+IBA 0.2mg/L+AC 1g/L+GO凝胶液5ml/L+卡拉胶0.6wt％+蔗糖2wt％；
对比例12：1/2MS+NAA 0.3mg/L+IBA 0.2mg/L+AC 1g/L+卡拉胶0.6wt％+蔗糖2wt％。
对比例13
对比例12与实施例1的不同之处在于，步骤(7)中生根培养基培养30d后，将组培瓶封口盖打开，在温度为25℃，光照强度为2500lux组培室进行炼苗一周后移栽。
对比例14
对比例13与实施例1的不同之处在于，步骤(7)中基质为腐殖土：珍珠岩＝6：4(质量比)，保持基质总量不变。
对比例15
对比例14与实施例1的不同之处在于，步骤(7)中基质为腐殖土、珍珠岩和蛭石的质量比为4：1：1(质量比)，保持基质总量不变。
对比例16
对比例16与实施例1的不同之处在于，GO凝胶液采用以下方法制备得到：
(1)将Mn2O3溶于100℃的浓硫酸中，得到氧化剂A；
(2)将石墨粉体加入80℃的氧化剂A中反应4h，过滤、烘干得到反应物A；
(3)在冰浴条件下向反应物A中加入浓硫酸，再加入KMnO4溶解，混合液在50℃下反应12h，加水继续混合10h，静置；
(4)弃去上层清液，加入下层悬浮液体积的14倍的水稀释，得到GO凝胶液。
试验例
分别采用实施例1-19以及对比例1-16的方法对京红早樱进行组织培养，(1)启动培养15天后，统计丛生芽的萌芽率，启动培养25天后统计不定芽苗的污染率和褐化率；(2)增殖培养30天后统计新芽的平均伸长长度、叶片情况以及增殖系数(单个外植体再生形成的芽的平均数)；(3)生根培养30天后统计平均生根率；(4)组培苗移栽至基质后培养30天后统计移栽成活率。结果如表1所示。
表1京红早樱组织培养结果
由表1可以看出，采用本发明方法具有较低的污染率和褐化率，污染率低于10％，褐化率低于20％，15天后的萌芽率达80％以上，增殖30天后新芽可伸长到2-4cm，每芽的叶片达到6片以上，叶色嫩绿，增殖系数达4以上，组培苗生根率90％以上，移栽成活率达85％以上。
实施例2-5改变启动培养基成分配比，会影响启动效果，在培养基种类上选择更适合的3/4MS培养基，当添加6-BA 1.5mg/L、NAA 0.1mg/L、PVP1g/L时，启动效果最好，同时后续增殖、生根步骤效果也均得以提升。
实施例6-9改变增殖培养基成分配比，会影响增殖效果，在培养基种类上选择更适合的3/4MS培养基，当添加6-BA 2mg/L、IBA 0.1mg/L、GA30.2mg/L、GO凝胶液5ml/L时，增殖效果最好，生根率和成活率也较高。
实施例10-12改变壮苗培养基成分配比，芽苗的生根率和和成活率均能保持较高水平。
实施例13-15改变生根培养基成分配比，会影响生根效果，在培养基种类上选择更适合的1/2MS培养基，当添加NAA 0.3mg/L、IBA 0.2mg/L、AC1g/L、GO凝胶液10ml/L时，生根率和成活率更高。
实施例16-17改变基质各成分配比，会影响移栽成活率，其中腐殖土：珍珠岩：蛭石＝6：3：1移栽成活率最高，实施例18在基质中进一步增加石英砂成分，移栽成活率更高，实施例1较实施例19移栽成活率更高。
对比例1-2采用不同的消毒方式和顺序，消毒效果不如实施例1好，对比例3-4可以看出，添加PVP以及加入特定配比的植物激素能明显提升启动效果。对比例8增殖培养基中未添加GO凝胶液，对比例9壮苗培养基中未添加GO凝胶液，新芽生长情况较弱，对比例12生根培养基中未添加GO凝胶液，生根效果差。对比例13采用与本发明不同的炼苗方式，对比例14基质与本发明不同，发现移栽成活率显著下降。可见采用本发明方法具有低污染率、低褐化率、高萌芽率，增殖系数高，生根率高，具有较高的移栽成活率。
对比例16的增值和生根效果较实施例差，这是由于采用对比例16制得的GO凝胶液中GO分散效果差，不能很好地发挥GO的促生长、促生根的效果。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
Claims (10)
1.一种京红早樱的组织培养快速繁殖方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a)提供外植体：以当年抽条的至少含有一个腋芽的茎段为外植体；
(b)外植体消毒：先用65-75vt％的酒精浸泡10-15s，然后用0.5-0.8wt％H2O2溶液浸泡摇动10-15min，再用0.1-0.2wt％HgCl2溶液浸泡摇动4-5min，用无菌水冲洗3-5次，去除表面水分；
(c)启动培养：将步骤(b)消毒后的茎段转移至启动培养基中，培养15-20天开始形成丛生芽，培养25-30天获得不定芽苗；启动培养基包括：3/4MS+6-BA 1-2mg/L+NAA 0.05-0.15mg/L+PVP 0.5-1.5g/L+凝胶剂0.4-0.6wt％+碳源3-4wt％，pH 5.6-6.0；培养环境包括：培养温度25-28℃，光照强度1000-1500lux，每天的光照时间12-14h；
(d)增殖培养：将步骤(c)新抽出的腋芽2-3cm接种到增殖培养基中，培养30-35天后形成丛生苗；增殖培养基包括：3/4MS+6-BA 1.5-2mg/L+IBA 0.05-0.15mg/L+GA3 0.1-0.3mg/L+GO凝胶液4-6ml/L；培养环境包括：培养温度25-28℃，光照强度1500-2000lux，每天的光照时间12-14h；
(e)壮苗培养：将步骤(d)获得的丛生苗接种到壮苗培养基中，培养25-30天后获得壮苗；壮苗培养基为3/4MS+6-BA 0.4-0.6mg/L+NAA 0.005-0.015mg/L+GA3 0.04-0.06mg/L+GO凝胶液4-6ml/L+凝胶剂0.5-0.7wt％+碳源1-3wt％，pH 5.6-6.0；培养环境包括：培养温度25-28℃，光照强度2000-2500lux，每天的光照时间12-14h；
(f)生根培养：将步骤(e)获得的壮苗2-3cm接种到生根培养基中，培养30-35天；生根培养基包括：1/2MS+NAA 0.2-0.4mg/L+IBA 0.1-0.3mg/L+AC 0.5-1.5g/L+GO凝胶液9-11ml/L+凝胶剂0.5-0.7wt％+碳源1-3wt％，pH 5.6-6.0；培养环境包括：培养温度25-28℃，光照强度2000-2500lux，每天的光照时间15-17h；
(g)炼苗移栽：生根培养30-35天后，先将组培器皿封口盖松动但不打开，在温度为25-28℃，光照强度为2000-2500lux的环境条件下炼苗2-3天，再将组培器皿封口盖打开露出缝隙后炼苗2-3天，然后将组培器皿封口盖完全打开后炼苗2-3天后移栽；
选择根长2cm以上、生根数3条以上以及生长健壮的组培苗进行移栽，将根部清洗和消毒后的组培苗移栽到灭过菌的基质中，覆膜培养，早晚喷水，一周后，部分揭膜，继续培养一周后，全部揭膜，保持土壤湿润，培养30-35天后移栽到大田；基质包括腐殖土、珍珠岩和蛭石，腐殖土、珍珠岩和蛭石的质量比为5-7:2-4:1。
2.按照权利要求1所述的京红早樱的组织培养快速繁殖方法，其特征在于，步骤(a)中，所述外植体取自当年抽出的新嫩枝条，保留4-6mm叶柄和枝条顶端幼嫩部分，截段2-3cm。
3.按照权利要求1所述的京红早樱的组织培养快速繁殖方法，其特征在于，步骤(c)中，启动培养基包括：3/4MS+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.1mg/L+PVP 1g/L+凝胶剂0.5wt％+碳源3wt％，pH 5.8。
4.按照权利要求1所述的京红早樱的组织培养快速繁殖方法，其特征在于，步骤(d)中，增殖培养基包括：3/4MS+6-BA 2mg/L+IBA 0.1mg/L+GA3 0.2mg/L+GO凝胶液5ml/L。
5.按照权利要求1所述的京红早樱的组织培养快速繁殖方法，其特征在于，步骤(f)中，生根培养基包括：1/2MS+NAA 0.3mg/L+IBA 0.2mg/L+AC 1g/L+GO凝胶液10ml/L+凝胶剂0.6wt％+碳源2wt％，pH 5.8。
6.按照权利要求1所述的京红早樱的组织培养快速繁殖方法，其特征在于，步骤(e)中，壮苗培养基包括：3/4MS++6-BA 0.5mg/L+NAA 0.01mg/L+GA3 0.05mg/L+GO凝胶液5ml/L+凝胶剂0.6wt％+碳源2wt％，pH 5.8。
7.按照权利要求1-6任一项所述的京红早樱的组织培养快速繁殖方法，其特征在于，步骤(g)中，移栽后的环境条件包括：环境湿度为60-80％，环境温度为18-30℃；光照强度条件包括：移栽后前15-20天，通过外遮阳控制光照强度5000-8000lux，然后打开外遮阳。
8.按照权利要求1-6任一项所述的京红早樱的组织培养快速繁殖方法，其特征在于，步骤(g)中，基质还包括石英砂；石英砂、腐殖土、珍珠岩和蛭石的质量比为1-2:5-7:2-4:1。
9.按照权利要求1-6任一项所述的京红早樱的组织培养快速繁殖方法，其特征在于，步骤(c)中启动培养基、步骤(e)中壮苗培养基和步骤(f)中生根培养基中的凝胶剂均独立地包括琼脂、卡拉胶或Gelrite中的一种或几种，优选为卡拉胶。
10.按照权利要求1-6任一项所述的京红早樱的组织培养快速繁殖方法，其特征在于，步骤(c)中启动培养基、步骤(e)中壮苗培养基和步骤(f)中生根培养基中的碳源均独立地包括葡萄糖、麦芽糖或蔗糖中的一种或几种，优选为蔗糖。
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