CN111587787A - 一种樱花组织培养方法 - Google Patents

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徐海秦
张兵
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朱英武
聂超仁
袁鸿
王福生
刘丹
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Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种樱花组织培养方法。该樱花组织培养方法，选用4‑5月份的成熟带芽茎段作为外植体，接种前用75％酒精冲洗30s，之后用浓度为2％的NaClO溶液浸泡2min，待外植体灭菌处理完成后接入添加6‑BA3.0mg/L，NAA0.2mg/L的MS培养基中进行侧芽诱导培养，试验结果为侧芽诱导率提升至约85％左右，在继续观察培养21天之后转入添加6‑BA2.0mg/L，2,4‑D0.6mg/L，GA0.5mg/L的MS培养基中进入增殖培养阶段，利用该培养基对侧芽进行增殖，观察结果，结果表明在该实验条件下对侧芽的增殖系数最高，为了防止和进一步改善并预防试管中的幼苗不利于组培实验结果的褐化现象，可与加入抗褐化剂AC1.0mg/L抗褐化培养基交替使用。该樱花组织培养方法，具备侧芽诱导率高、生根率高、褐化率低等优点。

Description

一种樱花组织培养方法
技术领域
本发明涉及生物技术技术领域，具体为一种樱花组织培养方法。
背景技术
植物组织培养技术的概念最早由植物学家Haberlandt提出，利用的原理是细胞的全能性，每个细胞都有独立分化为一个完整个体的能力。组织培养技术将植物体的一部分置于培养基内培养，培养基内添加适合生长的物质，并提供无菌、适合的培养环境，从而可以分化得到组织、器官或完整个体的现代技术。植物组织培养技术是一项近些年来逐渐发展起来的现代生物科技技术，因为它既具有繁殖速度快、系数大的优点，同时在遗传过程中能够遗传植株亲本的特性，除此之外，组织培养的周期短，成本低，因此，这项技术越来越受到关注。近年来一些木本植物比如桃树、苹果、梨等都已取得一定的成果，但木本植物的组织培养研究还存在一定的问题与困难，组培再生有点困难，离体再生体系还需要完善。
樱花通过组织培养技术来实现快速大量繁殖的相关研究开展比较晚，最早Boxus在1974年通过组织培养技术用樱花愈伤组织诱导出了樱花丛芽，在此之后樱花组织培养技术越来越受到关注，研究内容主要包含了愈伤组织诱导、不定芽分化、器官再生等相关技术。等人对8种不同的樱亚属观赏价值高的樱花不同部位进行了组织培养，结果表明子叶的诱导效果不如胚轴，诱导不同品种樱花的分化程度相差很大，这说明樱花胚培养的技术及有效途径还需要进一步研究完善。利用野樱桃的叶片进行了器官再生研究，研究结果表明在培养基中加入0.5mg/L6-BA和0.05mg/LTDZ，野樱桃平均分化6.83个芽，且6-BA的浓度会显著影响植株的伸长。希腊Aristotle University的Sarropoulou等学者探究了不同浓度PVP和IBA含量对樱花组培生根的影响，发现添加1g/L PVP和1g/L IBA时生根率达到100％。2019年，美国Michigan State University的Mohamed等研究学者，将甜樱桃(Prunus aviumL.)的叶片接种在含有4.54μM(TDZ)和2.95μM(IBA)的培养基上，再生率达到32.5％，平均每个植株有1.1个芽。
目前，对于樱花组织培养技术的探索还停留在一个初步的阶段，不同品种樱花的组织培养研究结果都存在很大的不同，没有找到相对普遍适用的培养方案。樱花组织培养研究主要探究了外植体类型、培养基类型、外源激素等对组织培养诱导、增殖和生根的作用。同时樱花组织培养中需要解决的问题有外植体污染、褐化、玻璃化以及外植体器官再生率低等。解决组培中这些问题，找到普适于樱亚属植物的培养方案，完善樱花组织培养体系具有非常大的意义。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种樱花组织培养方法，具备侧芽诱导率高、生根率高和褐化率低等优点，解决了上述问题。
(二)技术方案
为实现上述过程简单和检测结果明显的目的，本发明提供如下技术方案：
一种樱花组织培养方法，包括以下步骤；
S1、选用4-5月份的成熟带芽茎段作为外植体，对外植体进行清洗、消毒。
S2、接入诱导培养基进行侧芽诱导培养，诱导培养基配比为：MS、6-BA3.0mg/L、NAA0.2mg/L。
S3、接入增殖培养基进行增殖培养，增殖培养基配比为：MS、6-BA2.0mg/L、2,4-D0.6mg/L、GA0.5mg/L。
S4、进入生根培养阶段，生根培养基配比为：MS、ABT8g/L、蔗糖60g/L。
S5、当植株的生根数量超过10～12条时，将组培瓶的封口膜去除，进行开瓶炼苗，使培养基暴露在空气中。
S6、开瓶5天后移栽入蛭石：草炭的体积比为1:1的基质中。
优选的，所述外植体清洗、消毒的步骤为：接种前用75％酒精冲洗30s，之后用浓度为2％的NaClO溶液浸泡2min。
优选的，所述侧芽诱导培养21天后进入增殖培养阶段。
优选的，所述侧芽诱导培养阶段可与加入抗褐化剂AC1.0mg/L抗褐化培养基交替使用，交替周期为7天，以7天为一个周期进行增殖培养，三个周期后转入生根培养阶段。
(三)有益效果
与现有技术相比，本发明提供了一种樱花组织培养方法，具备以下有益效果：
1、在樱亚属植物的组培研究中，不定芽分化是制约实验成功的关键点，也是研究难点之一，而本发明在不定芽分化方面，通过实验所得分化率约为6.25％，解决了不定芽分化的问题。
2、本发明采用4-5月份的成熟带芽茎段作为外植体，经过清洗灭菌后进行诱导培养、增殖培养及生根培养，同时在增殖培养阶段与添加AC0.5g/L的抗褐化培养基交替使用，得到的育苗，具备侧芽诱导率高、生根率高和褐化率低等优点。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
一种樱花组织培养方法，包括以下步骤：
外植体应选用4-5月份的成熟带芽茎段，接种前用75％酒精冲洗30s，之后用浓度为2％的NaClO溶液浸泡2min。
待外植体灭菌处理完成后接入添加6-BA3.0mg/L，NAA0.2mg/L的MS培养基中进行侧芽诱导培养，试验结果为侧芽诱导率提升至约85％左右。
在继续观察培养21天之后转入添加6-BA2.0mg/L，2,4-D0.6mg/L，GA0.5mg/L的MS培养基中进入增殖培养阶段，利用该培养基对侧芽进行增殖，观察结果，结果表明在该实验条件下对侧芽的增殖系数最高，为了防止和进一步改善并预防试管中的幼苗不利于组培实验结果的褐化现象，可与加入抗褐化剂AC1.0mg/L抗褐化培养基交替使用，交替周期为7天，以7天为一个周期进行增殖培养。
三个周期后转入添加ABT8g/L，蔗糖60g/L的MS培养基中进行生根培养，生根率高达100％，平均根长约2.5cm。
生根过程中观察根的生长数量，当植株的生根数量超过10～12条时，将组培瓶的封口膜去除，进行开瓶炼苗，使培养基暴露在空气中。
开瓶5天后移栽入蛭石：草炭的体积比为1:1的基质中。
在试验中，诱导愈伤组织的外植体容易受损，因此4-5月份枝条、一年生‘御殿场’樱的成熟叶片成为提高试验成活率和试验客观性的重要因素，试验的前期处理需先使用浓度为75％的酒精溶液冲洗30s，浓度为1％的NaClO溶液浸泡30s后将叶片接入诱导愈伤的培养基，培养基的成分为：
1/2MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.3mg/L+2,4-D1.5mg/L，为了更有利于诱导出愈伤组织，先在暗室培养5d后进行光照条件下培养，三周后将诱导出愈伤组织的叶片转入增殖培养基，其成分为在1/2MS培养基中添加6-BA0.5mg/L，NAA0.05mg/L，在该培养基中愈伤组织的增殖系数可达3.5，试验结果表明，正常增殖的愈伤组织，形态质地为致密颗粒状，其颜色为绿色，边缘略红，愈伤组织增殖的过程中易发生褐化现象，为降低愈伤组织增殖试验过程中的褐化率，可与添加AC0.5g/L的抗褐化培养基交替使用，能将褐化率降低到45％，交替周期为一周，增殖培养阶段的时间为3周左右，之后移入新的培养基中诱导不定芽的发生，该培养基的具体成分为：
1/2MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.03mg/L+GA1.5mg/L+蔗糖60g/L，此时最有利于愈伤组织吸收培养基中的养分，而在不定芽分化方面，该试验所得分化率约为6.25％。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (4)

1.一种樱花组织培养方法，其特征在于，包括以下步骤；
S1、选用4-5月份的成熟带芽茎段作为外植体，对外植体进行清洗、消毒。
S2、接入诱导培养基进行侧芽诱导培养，诱导培养基配比为：MS、6-BA3.0mg/L、NAA0.2mg/L。
S3、接入增殖培养基进行增殖培养，增殖培养基配比为：MS、6-BA2.0mg/L、2,4-D0.6mg/L、GA0.5mg/L。
S4、进入生根培养阶段，生根培养基配比为：MS、ABT8g/L、蔗糖60g/L。
S5、当植株的生根数量超过10～12条时，将组培瓶的封口膜去除，进行开瓶炼苗，使培养基暴露在空气中。
S6、开瓶5天后移栽入蛭石：草炭的体积比为1:1的基质中。
2.根据权利要求1所述的一种樱花组织培养方法，其特征在于：所述外植体清洗、消毒的步骤为：接种前用75％酒精冲洗30s，之后用浓度为2％的NaClO溶液浸泡2min。
3.根据权利要求1所述的一种樱花组织培养方法，其特征在于：所述侧芽诱导培养21天后进入增殖培养阶段。
4.根据权利要求1所述的一种樱花组织培养方法，其特征在于：所述侧芽诱导培养阶段可与加入抗褐化剂AC1.0mg/L抗褐化培养基交替使用，交替周期为7天，以7天为一个周期进行增殖培养，三个周期后转入生根培养阶段。
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