CN109430265A - 利用凹凸棒石稳定水包油乳液制备香芹酚微胶囊抗菌剂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用凹凸棒石稳定水包油乳液制备香芹酚微胶囊抗菌剂的方法，它是先利用季铵化壳寡糖的水溶性和阳离子属性，结合天然纳米材料凹凸棒石的生物活性和纳米效应，将天然抗菌剂香芹酚分子在乳化剂作用下，制备凹凸棒石稳定的水包油乳液，再通过微胶囊制备技术将具有挥发性和刺激性气味的天然抗菌剂香芹酚包封，防止其挥发；然后通过氯化钙交联，进一步形成保护壳层；最后经分离、烘干得到香芹酚微胶囊抗菌剂。该香芹酚微胶囊抗菌剂具有广谱抗菌活性、抗菌效率高、无刺激性气味，同时具有高的热稳定性和抗菌持久性，可应用于饲料添加剂中，解决我国目前在动物养殖过程中长期依赖抗生素的现状。
Description
技术领域
本发明涉及一种香芹酚微胶囊抗菌剂的制备方法，尤其涉及一种利用凹凸棒石稳定水包油乳液制备香芹酚微胶囊抗菌剂的方法，属于黏土矿物功能材料领域。
背景技术
近些年，抗生素的滥用产生的细菌耐药性现象日趋严重，抗生素耐药性正在威胁着人类的健康，寻找新的抗生素替代产品和提供有效可行的抗菌策略显得极为迫切（Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 2014, 69: 827–834）。抗生素滥用现象在畜牧业尤其严重。目前畜牧业养殖户普遍将饲用抗生素添加到饲料中，将其作为添加剂来促进动物的生长，这不仅增加了“超级细菌”风险，同时对环境造成严重污染（Trends in FoodScience & Technology, 2013, 34: 96-108; Journal of Environmental ChemicalEngineering, 2018,6: 784-793）。
天然抗菌剂如香芹酚，具有广谱的抗菌活性，能够有效抑制或杀死一些细菌、真菌及病毒（Food Chemistry, 2016, 210: 402–414; ACS Sustainable Chemistry &Engineering, 2017, 5: 2320–2329），对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌及病原真菌等均具有抑制作用（International Journal of Pharmaceutics, 2017, 519: 67-78; BMCMicrobiology, 2005, 5: 1-9）。相关研究表明，香芹酚添加于饲料中，能明显改善动物的生产性能，改善肠道微生物菌群，从而提高饲料的消化率（Livestock Science, 2014,160: 82-88）。此外，香芹酚能够调控与动物生长相关的激素分泌，提高动物的免疫性能，进而改善肉类品质的功效（黑龙江畜牧兽医, 2018, 04: 162-164）。然而，香芹酚作为一种饲用抗菌剂，在动物安全养殖、健康养殖和无抗养殖方面得到应用。但是，香芹酚在使用过程中，香芹酚因热稳定性差和挥发性，同时具有一定的刺激性气味，限制了其在动物养殖过程中的使用效率。
发明内容
本发明的目的是针对香芹酚的热稳定性差和挥发性，提供一种利用凹凸棒石稳定水包油乳液制备香芹酚微胶囊抗菌剂的方法。
一、香芹酚微胶囊抗菌剂的制备
本发明香芹酚微胶囊抗菌剂的制备，是先制备凹凸棒石稳定的水包油乳液，再利用微胶囊技术封装香芹酚，在搅拌条件下，依次将芯材香芹酚和壁材（季铵化壳寡糖）分散在水体系中，经交联成型、分离、烘干，得到利用凹凸棒石稳定水包油乳液制备香芹酚微胶囊抗菌剂。具体步骤如下：
（1）凹凸棒石稳定水包油乳液的制备
在150~300r/min搅拌条件下，将海藻酸钠溶液与凹凸棒石悬浮液混合后形成均匀混合悬浮液A。海藻酸钠溶液的质量分数0.5~2.0%，凹凸棒石悬浮液的质量分数5.0~15%，海藻酸钠溶液与凹凸棒石悬浮液的体积比1:1~1:0.6。
将乳化剂与香芹酚混合充分乳化后加入到季铵化壳寡糖溶液中，150~300r/min搅拌10~30min，形成混合溶液B。所述乳化剂为司班80，其用量为香芹酚质量的0.5~1.0%；季铵化壳寡糖溶液的质量百分数为10~30%，季铵化壳寡糖的用量为香芹酚质量的10~20%。季铵化壳寡糖的作用：对形成的水包油乳液起协同稳定作用。
将混合溶液B加入到混合悬浮液A中，6000~8000r/min下搅拌乳化30~60min，即形成凹凸棒石稳定水包油乳液。混合溶液B与混合悬浮液A的体积比1:0.75~1:0.4。
（2）香芹酚微胶囊的制备
缓慢搅拌（搅拌速度30~50r/min）下，利用蠕动泵将上述制备的凹凸棒石稳定水包油乳液滴加到氯化钙溶液中，滴加完持续搅拌10~30min，然后将形成的微胶囊分离，37±2℃烘干，包装。蠕动泵的转速3~6r/min；氯化钙溶液的质量百分数0.5~2.0%。所得微胶囊的油相为香芹酚，其含量为10~30 wt%。
二、香芹酚微胶囊抗菌剂的微观结构
下面通过实验对本发明利用凹凸棒石稳定水包油乳液和制备的备香芹酚微胶囊进行具体说明。
图1是本发明制备的凹凸棒石稳定水包油乳液的显微镜照片。可以看出，乳胶粒均匀分布，表明成功得到凹凸棒石稳定的水包油型乳液。水包油乳液的主要稳定剂为天然纳米材料凹凸棒石，具有较高的分散性和棒状结构。
图2、图3分别是香芹酚微胶囊烘干前、烘干后的数码照片。可以看出，凹凸棒石稳定水包油乳液经氯化钙交联后形成大小均一的微胶囊小球（图2）；烘干后微胶囊小球的直径有所减小（图3），且明显的看出微胶囊中香芹酚被有效封装。
图4为香芹酚微胶囊的SEM照片。从图4中可以看出，微胶囊中的乳胶粒呈球形或是椭圆状的扁平形貌，乳胶粒之间存在一定的空隙，呈粗糙结构，该结构有利于微胶囊中香芹酚的缓释。
三、香芹酚微胶囊抗菌剂的性能
1、香芹酚微胶囊抗菌剂的包封率和含油量测定
测定方法：称取0.05g香芹酚微胶囊小球置于装有50mL乙醇的试管中，密封后超声2h（微波清洗仪），然后放入温度37℃的恒温摇床中，150r/min的振荡速度萃取 24h，为了使香芹酚被乙醇完全萃取，每隔6h进行30min的超声处理。萃取完全后，在4000r/min下离心10min，测定上清液吸光度，依据香芹酚标准曲线计算香芹酚含量，并根据公式（1）和（2）得出香芹酚微胶囊的包封率和含油量：
LC (%)=M t /M m×100 （1）
EE (%)=M t /M o×100 （2）
其中M t 、M m及M o分别是微胶囊中香芹酚的量、最初微胶囊的量以及最初香芹酚的量。
测试结果：香芹酚微胶囊抗菌剂的包封率在50~80%，含油量40~55%。
2、香芹酚微胶囊抗菌剂的抗菌活性评价
利用凹凸棒石稳定水包油乳液制备香芹酚微胶囊抗菌剂的抗菌活性评价采用最小抑菌浓度法，具体测试步骤如下：其中，实验设置实验组、阴性对照组、阳性对照组和空白对照组，培养基为MH肉汤，pH=7.2~7.4。
1.实验组
1.1标准菌株的准备：大肠埃希菌标准菌株ATCCC25922，金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC25923。取-20℃保存的大肠埃希菌ATCC25922及金黄色葡萄球菌ATCC25923，解冻后接种到LB肉汤培养基中，在35℃振荡箱中孵育12h，震荡频率160r/min，复活菌株后，再次转接至LB肉汤培养基中，于二氧化碳培养箱中35℃孵育，3h后细菌传代进入对数期后。将进入对数期的标准菌株菌液调至0.5麦氏标准浊度，再用MH肉汤1:10稀释，使之含菌量为107CFU/mL。
1.2培养基及抗菌药物稀释
标记一系列无菌试管试管。除每排的第1支试管外，每支试管内加MH肉汤2mL。然后每排第1管和第2管分别加入2mL稀释的抗菌药物，抗菌药物浓度已知并提前配制。从第2管开始依次倍比稀释至最后1管，最后1管弃去2mL。将加有抗菌材料的培养基高压灭菌备用。
1.3接种
移液枪将0.1mL标准菌株菌悬液加至各试管中，接种菌量约5×105CFU/mL。加样时移液枪枪头必须插到管内液面下加菌并注意避免与管内壁接触，加好菌液后的试管避免晃动。
1.4孵育及结果判断
35℃孵育16~20h后，以肉眼见菌液透澄清明无浑浊即为该抗菌材料对相应菌株的最小抑菌浓度。
2.阴性对照：含抗菌材料的MH肉汤培养基，但未接种细菌。
3.阳性对照：不含抗菌材料，但接种标准菌株的MH肉汤培养基。
4.空白对照：不含抗菌材料且未接种细菌的MH肉汤培养基。
测试结果表明：利用凹凸棒石稳定水包油乳液制备香芹酚微胶囊抗菌剂对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度分别为0.50mg/mL和0.25mg/mL。
本发明相对现有技术具有以下优点：
利用水包油型乳液的特点，季铵化壳寡糖的水溶性和阳离子属性，结合天然纳米材料凹凸棒石的生物活性和纳米效应，将天然抗菌剂香芹酚分子在乳化剂作用下，利用水包油乳液，使海藻酸钠交联季铵化壳寡糖形成微胶囊，并通过氯化钙交联形成保护壳层，进而制备一种香芹酚微胶囊抗菌剂，防止香芹酚挥发，同时解决香芹酚在使用过程中的刺激性气味；采用季铵化壳寡糖为壁材，通过钙离子的交联控制释放。因此，香芹酚微胶囊抗菌剂具有广谱抗菌活性、抗菌效率高、无刺激性气味，同时具有高的热稳定性和抗菌持久性，可应用于饲料添加剂中，解决我国目前在动物养殖过程中长期依赖抗生素的现状。
附图说明
图1为凹凸棒石稳定水包油乳液显微镜照片。
图2为凹凸棒石稳定水包油乳液制备的香芹酚微胶囊数码照片。
图3为香芹酚微胶囊37℃烘干后的数码照片。
图4为香芹酚微胶囊的SEM照片。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明香芹酚微胶囊抗菌剂的制备方法进行详细的说明。
实施例1
（1）凹凸棒石稳定水包油乳液的制备
在200r/min搅拌条件下，将50mL 0.5 wt%的海藻酸钠溶液与30mL 10 wt%的凹凸棒石悬浮液混合后形成均匀悬浮液A；
将0.2g的司班80与40g的香芹酚充分混合乳化后加入到20mL 20 wt%的季铵化壳寡糖溶液中，150r/min搅拌30min形成溶液B；
将溶液B加入到溶液A中，在6000r/min下搅拌乳化60min，即形成凹凸棒石稳定水包油乳液。
（2）香芹酚微胶囊的制备
缓慢搅拌下（30r/min），利用蠕动泵将凹凸棒石稳定水包油乳液滴加到0.5 wt%的氯化钙溶液中，蠕动泵转速3r/min；滴加完持续搅拌30min后，将形成的微胶囊分离，37℃烘干，包装。所得香芹酚微胶囊的包封率53.1%，含油量47.1%。
实施例2
（1）凹凸棒石稳定水包油乳液的制备
在150r/min搅拌条件下，将50mL 1.0 wt%的海藻酸钠溶液与50mL 15 wt%的凹凸棒石悬浮液混合后形成均匀悬浮液A；
将0.3g的司班80与30g的香芹酚充分混合后加入到10mL 30 wt%的季铵化壳寡糖溶液中，250r/min搅拌20min后形成溶液B；
将B加入到A中，8000r/min乳化30min即形成凹凸棒石稳定水包油乳液。
（2）香芹酚微胶囊的制备
缓慢搅拌下（40r/min），利用蠕动泵将凹凸棒石稳定水包油乳液滴加到1.5 wt%的氯化钙溶液中，蠕动泵转速4r/min；滴加完持续搅拌20min后，将形成的微胶囊分离，37℃烘干，包装。所得香芹酚微胶囊的包封率62.4%，含油量47.8%。
实施例3
（1）凹凸棒石稳定水包油乳液的制备
在200r/min搅拌条件下，将50mL 1.5 wt%的海藻酸钠溶液与40mL 15 wt%的凹凸棒石悬浮液混合后形成均匀悬浮液A。
将0.15g的司班80与20g的香芹酚充分混合后加入到20mL 15 wt%的季铵化壳寡糖溶液中，300r/min搅拌20min后形成溶液B；
将B加入到A中，7000r/min乳化40min即形成凹凸棒石稳定水包油乳液。
（2）香芹酚微胶囊的制备
缓慢搅拌下（50r/min），利用蠕动泵将步骤一得到的凹凸棒石稳定水包油乳液滴加到2.0 wt%的氯化钙溶液中，蠕动泵转速5r/min；滴加完持续搅拌20min后，将形成的微胶囊分离，37℃烘干，包装。所得香芹酚微胶囊的包封率65.5%，含油量44.5%。
实施例4
（1）凹凸棒石稳定水包油乳液的制备
在300r/min搅拌条件下，将50mL 2.0 wt%的海藻酸钠溶液与40mL 5 wt%的凹凸棒石悬浮液混合后形成均匀悬浮液A；
将0.25g的司班80与25g的香芹酚充分混合后加入到15mL 25 wt%的季铵化壳寡糖溶液中，150r/min搅拌30min后形成溶液B；
将B加入到A中，6000r/min乳化50min即形成凹凸棒石稳定水包油乳液。
（2）香芹酚微胶囊的制备
缓慢搅拌下（40r/min），利用蠕动泵将凹凸棒石稳定水包油乳液滴加到1.0 wt%的氯化钙溶液中，蠕动泵转速6r/min；滴加完持续搅拌10min后，将形成的微胶囊分离，37℃烘干，包装。所得香芹酚微胶囊的包封率76.5%，含油量44.5%。
实施例5
（1）凹凸棒石稳定水包油乳液的制备
在250r/min搅拌条件下，将50mL 1.0 wt%的海藻酸钠溶液与30mL 10 wt%的凹凸棒石悬浮液混合后形成均匀悬浮液A；
将0.125g的司班80与15g的香芹酚充分混合后加入到20mL 15 wt%的季铵化壳寡糖溶液中，200r/min搅拌20min后形成溶液B；
将B加入到A中，8000r/min乳化30min即形成凹凸棒石稳定水包油乳液。
（2）香芹酚微胶囊的制备
缓慢搅拌下（30r/min），利用蠕动泵将凹凸棒石稳定水包油乳液滴加到1.5 wt%的氯化钙溶液中，蠕动泵转速3r/min；滴加完持续搅拌30min后，将形成的微胶囊分离，37℃烘干，包装。所得香芹酚微胶囊的包封率60.3%，含油量46.2%。
Claims (8)
1.利用凹凸棒石稳定水包油乳液制备香芹酚微胶囊抗菌剂的方法，包括以下步骤：
（1）凹凸棒石稳定水包油乳液的制备：搅拌下将海藻酸钠溶液与凹凸棒石悬浮液混合后形成均匀混合悬浮液A；将乳化剂与香芹酚混合充分乳化后加入到季铵化壳寡糖溶液中，搅拌10~30min，形成混合溶液B；将混合溶液B加入到混合悬浮液A中，6000~8000r/min下搅拌乳化30~60min，即形成凹凸棒石稳定水包油乳液；
（2）香芹酚微胶囊的制备：缓慢搅拌下，利用蠕动泵将上述制备的凹凸棒石稳定水包油乳液滴加到氯化钙溶液中，滴加完持续搅拌10~30min，然后将形成的微胶囊分离，37±2℃烘干，包装。
2.如权利要求1所述利用凹凸棒石稳定水包油乳液制备香芹酚微胶囊抗菌剂的方法，其特征在于：步骤（1）混合悬浮液A的制备中，海藻酸钠溶液的质量分数0.5~2.0%，凹凸棒石悬浮液的质量分数5.0~15%，海藻酸钠溶液与凹凸棒石悬浮液的体积比1:1~1:0.6。
3.如权利要求1所述利用凹凸棒石稳定水包油乳液制备香芹酚微胶囊抗菌剂的方法，其特征在于：步骤（1）混合溶液B的制备中，所述乳化剂为司班80，其用量为香芹酚质量的0.5~1.0%；季铵化壳寡糖溶液的质量百分数为10~30%，季铵化壳寡糖的用量为香芹酚质量的10~20%。
4.如权利要求1所述利用凹凸棒石稳定水包油乳液制备香芹酚微胶囊抗菌剂的方法，其特征在于：步骤（1）中，搅拌速度为150~300r/min。
5.如权利要求1所述利用凹凸棒石稳定水包油乳液制备香芹酚微胶囊抗菌剂的方法，其特征在于：步骤（1）中，混合溶液B与混合悬浮液A以1:0.75~1:0.4的体积比混合。
6.如权利要求1所述利用凹凸棒石稳定水包油乳液制备香芹酚微胶囊抗菌剂的方法，其特征在于：步骤（2）中，蠕动泵的转速3~6r/min。
7.如权利要求1所述利用凹凸棒石稳定水包油乳液制备香芹酚微胶囊抗菌剂的方法，其特征在于：步骤（2）中，氯化钙溶液的质量百分数0.5~2.0%。
8.如权利要求1所述利用凹凸棒石稳定水包油乳液制备香芹酚微胶囊抗菌剂的方法，其特征在于：步骤（2）中，搅拌速度为30~50r/min。
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