CN109362572B - 一种通过种子无菌萌发获得沿阶草实生苗的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种通过种子无菌萌发获得沿阶草实生苗的方法，包括如下步骤：1）种子采集的时间及采后的低温预处理；2）种子的消毒灭菌；3）种子外植体的无菌萌发培养；4）壮苗生根培养；5）无菌苗的移栽与成活。该方法不但解决了沿阶草通过种子繁殖种苗困难的难题，而且还具有不受种子果皮或成熟度限制种子萌发，生长期由于水温条件的限制生长缓慢等优点；在短短3个月内就可获得具有完整根茎叶的正常健壮植株，移栽成活率极高可达100%；特别是明显提高了良种繁育质量，克服了生产上无性分株繁殖引起种质严重地衰退现象等问题，也有利于大规模工厂化生产良种，为生产上源源不断地提供整齐健壮的优良种苗及带动优良种苗的示范推广应用。

Description

一种通过种子无菌萌发获得沿阶草实生苗的方法

技术领域

本发明涉及植物育种领域，具体涉及一种通过种子无菌萌发获得沿阶草实生苗的方法。

背景技术

沿阶草(Ophiopogon japonicus)又名麦冬，属百合科沿阶草属多年生常绿草本植物，因其植株低矮，四季常绿，适应性广，喜温耐寒、耐瘠耐阴，抗病虫性好，无需修剪等特性而成为暖季型园林绿化中不可或缺的构景草坪地被植物。沿阶草的块根，又常为滋阴中药，《神农本草经》列为上品，具有养阴生津,润肺清心的功效，还是“药食同源”品种，在保健食品的开发方面也有大量的应用。

沿阶草种子在室外自然条件下发芽极度困难，本室研究发现原因有2点：1是果皮对种子萌发起到抑制作用。沿阶草的种子为肉质果，外果皮为一层蓝紫色蜡质结构，中果皮为较厚的果肉状，内果皮与中果皮紧密相连，是一层和外果皮颜色相似的薄薄的蓝色膜质层。在这三层果皮内部才是坚硬而又具有一定弹性的种子。种子在青绿未成熟时期，果皮和种子很难分离，种子也较硬并具有一定的弹性，此时果皮对种子萌发具有抑制作用，若不剥去果皮，种子萌发率基本为零。2是种子具有后熟性。沿阶草种子的成熟期一般为冬春季节，此时种子经过冬季的低温环境及春季果皮的自然风干，部分种子从果皮中脱落出来，当种子饱满发育正常未受到病虫害的侵染时，大概到了3、4月份会萌发长出芽苗(未发表)。以上原因造成沿阶草通过种子繁殖很困难。生产上沿阶草往往采用分株繁殖，但较低的繁殖系数及缓慢地生长习性，及无性繁殖引起种质严重地衰退现象，极大地影响了沿阶草优良种质的快繁及推广应用。

发明内容

发明目的：为了克服现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提供了一种通过种子无菌萌发获得沿阶草实生苗的方法。该方法具有操作简单，种子萌发率高，种苗生长健壮，良种选育质量明显提高，并有利于大规模工厂化生产优良种质等优点。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种通过种子无菌萌发获得沿阶草实生苗的方法，包括如下步骤：

1)种子采集的时间及采后的低温预处理：采集的沿阶草种子种类包括有金边细叶型、矮生型、长叶型及银纹沿阶草，采集的时间从当年10月底开始到第二年2月底结束；采集后的种子放入0℃冰箱低温冷藏处理1-2个月；

2)种子的消毒灭菌：把步骤1)采集的种子去果皮，放在洗衣粉中浸泡15-20min后流水冲洗2h，再用2％次氯酸钠液消毒20-25min，灭菌水冲洗3次后吸干表面水分，拿到超净工作台上备用；在超净工作台上用消毒液消毒灭菌，无菌水冲洗8-10次后，用灭菌吸水纸擦干水分，准备接种；

3)种子外植体的无菌萌发培养：将灭菌的种子先接种在琼脂7％+GA4.0mg/L培养基上，7-10天转接在含激素的MS培养基上，在无菌自然光下培养28-30天，统计种子的萌发率、丛生芽增殖倍数及生长发育情况；

4)壮苗生根培养：将上述丛生芽苗或生根芽苗分成单株，剪去老根老叶转入壮苗生根培养基，在1500-2000LX光下培养12h/d，26-30天小芽苗100％长成具有完整根茎叶的正常健壮植株；

5)无菌苗的移栽与成活：将上述生根的组培实生苗揭开瓶口的封口膜室内炼苗1-2d，之后取出小苗，洗净根上附着的培养基，移栽到装有蛭石和泥炭土的混合基质的穴盘中，适当遮荫，并及时浇水，保持种苗处在湿润状态直到长出新根，20d后统计成活率。

其中，所述所有的培养温度均在25-30℃。

其中，所述步骤2)中的消毒液采用升汞+吐温，消毒灭菌8-10min。

其中，所述步骤2)中的消毒液采用0.1％升汞+3滴吐温，消毒灭菌8-10min。

其中，所述步骤3)中的含激素的MS培养基为Ms+6-BA0.5～2.0mg/L+NAA0.2mg/L+KT1mg/L。

其中，所述步骤3)中的含激素的MS培养基为Ms+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L+KT1mg/L。

有益效果：相对于现有技术，本发明具有以下优点：该方法不但解决了沿阶草通过种子繁殖种苗困难的难题，而且还具有不受种子果皮或成熟度限制种子萌发，生长期由于水温条件的限制生长缓慢等优点；在方法上具有操作简单，种子萌发率高，成苗培养过程短，种苗生长健壮，在短短3个月内就可获得具有完整根茎叶的正常健壮植株，移栽成活率极高可达100％；特别是明显提高了良种繁育质量，克服了生产上无性分株繁殖引起种质严重地衰退现象等问题，也有利于大规模工厂化生产良种，为生产上源源不断地提供整齐健壮的优良种苗及带动优良种苗的示范推广应用。

具体实施方式：

下面通过实施例来进一步阐述本发明。

实施例1：

一种通过种子无菌萌发获得沿阶草实生苗的方法，包括如下步骤：

1、种子采集的时间及采后的低温预处理：采集的沿阶草种子种类包括有金边细叶型、矮生型、长叶型及银纹沿阶草等；采集的时间可从当年10月底开始(未成熟种子)到第二年2月底结束(成熟种子)；采集后的种子放入0℃冰箱低温冷藏处理1-2个月，以不经低温冷藏处理的种子作为对照组。

低温预处理对沿阶草种子萌发率的影响：将不同时间段采集的及经低温冷藏处理的沿阶草种子灭菌后接种在琼脂7％+GA4.0mg/L的诱导种子萌发培养基(标记为D1)上，每瓶接种5粒种子，共接种10瓶，在无菌自然光下培养28-30天后，观察种子萌发生长情况，并统计种子的萌发率。

萌发率＝萌芽的种子数/供试种子数*100％

关于不同时间段采集的种子经低温预处理后对萌发率的影响：10月底采集一次半成熟种子，12月中旬采集一次未完全成熟的种子，1月底和2月底各采集一次逐渐成熟的种子，分别用A，B，C，D表示；并将采集的种子取出一半于0℃低温冷藏，冷藏时间分别为一个月和两个月，未低温冷藏的为对照；去果皮后消毒灭菌，接种在诱导种子萌发培养基上，25天后统计分析结果。见表1。

表1沿阶草种子不同采集时间与冷藏时间对萌发率的影响

由表1看出：沿阶草未成熟种子(A和B)自然萌发率较低，只有30％，但经过一段时间的低温冷藏(1-2个月)，萌发率可大大提高(96％-90％)；而自然成熟的种子(C和D)无需低温冷藏萌发率就非常高(96％)，充分说明沿阶草种子具有后熟作用，且萌发需要一段时间的低温才能打破休眠。

2、种子的消毒灭菌：把上述种子分成未去果皮(标记为Q1)/去果皮(标记为Q2)2种，放在洗衣粉中浸泡15-20min后流水冲洗2h，再用2％次氯酸钠液消毒20-25min，灭菌水冲洗3次后吸干表面水分，拿到超净工作台上备用；在超净工作台上，分别用下述消毒液消毒灭菌：先用70-75％酒精浸泡30s，之后放入0.1％的升汞或0.1％升汞+3滴吐温中消毒6-10分钟，无菌水冲洗8-10次后,用灭菌吸水纸擦干水分，准备接种。

不同消毒方式对沿阶草种子染菌率及萌发率的影响：

将经过上述消毒灭菌后的种子，先取一半Q1去掉果皮(标记为Q3)，之后分别将Q1、Q2和Q3接种在琼脂7％+GA4.0mg/L的诱导种子萌发培养基上，每瓶接种5粒，共接种10瓶，自然光下培养15天统计种子染菌率；28-30天后统计种子的萌发率。以未去果皮的Q1作为对照组。

染菌率＝染菌的种子数/供试种子数*100％

关于不同消毒方式对不同种类沿阶草种子染菌率及萌发率的影响：把采集的金边细叶型(标记为J)、矮生型(标记为A)和长叶型(标记为C)沿阶草自然成熟的种子分成未去果皮(标记为Q1)和去果皮(标记为Q2)2种，放在洗衣粉中浸泡15-20min后流水冲洗2h，再用2％次氯酸钠液消毒20-25min，灭菌水冲洗3次后吸干表面水分，拿到超净工作台上备用；在超净工作台上，分别用下述消毒液消毒灭菌：先用70-75％酒精浸泡30s，之后放入0.1％的升汞(标记为S)或0.1％升汞+3滴吐温(标记为T)中分别消毒为6分钟(标记为6)、8分钟(标记为8)和10分钟(标记为10)，无菌水冲洗8-10次后，再取一半Q1去掉果皮(标记为Q3)，将Q1、Q2和Q3分别接种在只有琼脂的无菌空白培养基上，每瓶接种5粒，共接种10瓶，自然光下培养15天统计种子染菌率，28-30天观察种子萌发生长情况。以未去果皮的Q1作为对照组，实验结果见表2。

表2不同消毒方式对沿阶草种子染菌率及萌发率的影响

由表2可以看出：尽管沿阶草种子种类不同，但总的趋势是先去果皮再消毒要比消毒后再去果皮种子的污染率要低得多；另外在升汞中加入吐温比不加吐温种子的污染率明显低，以升汞+吐温消毒8-10min为效果最好；此外去果皮比不去果皮对种子萌发有明显的影响，其中不去果皮种子基本是不萌发的，去果皮3种沿阶草种子萌发率均达到95％以上。所以在实际的实验步骤中以采取种子预先去果皮，升汞+吐温消毒8min-10min，初始接种在只有琼脂的无菌空白培养基上为好。

3、不同种类激素浓度配比对沿阶草种子萌发及生长发育的影响：将灭菌好的种子接种在添加不同种类激素浓度配比的基本培养基上(表3)，每瓶接种5粒种子，每种激素配方培养基接种10瓶，在无菌自然光下培养28-30天，统计种子的萌发率、丛生芽增殖倍数及生长发育情况(表4)。以D1和D2作为对照配方。

丛生芽率＝丛生芽的种子数/供试种子数*100％

生根率＝生根的种子数/供试种子数*100％

表3不同种类培养基及激素浓度配比的配方

表4不同培养基配方对沿阶草种子萌发及生长发育的影响

实验结果表明(表4)：培养基配方对种子萌发率没有影响，但对生长发育影响很大，其中丛生芽增殖数与激素浓度配比有密切关系，芽诱导数量的多少与6-BA和KT浓度有关，丛生芽大小与生长素有关；最佳的激素组合配方为：Ms+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L+KT1mg/L，产生的丛生芽最多，长势叶色质量最好，丛生芽产生的部位在茎基部节上，即不影响丛芽的生长，也还可以继续作为下一代的繁殖材料，扩大繁殖系数。此外也可看出，初始培养先接种在只有琼脂的无菌空白培养基上尽管芽增殖倍数低，但染菌率明显降低，反而有利于种苗后期无菌植株的健壮生长，所以可通过优化步骤获得最佳实施例。

4、壮苗生根培养：将上述丛生芽苗或生根芽苗分成单株，剪去老根老叶转入壮苗生根培养基，在1500-2000LX光下培养12h/d，26-30天小芽苗100％长成具有完整根茎叶的正常健壮植株。

5、无菌苗的移栽与成活：将上述生根的组培实生苗揭开瓶口的封口膜室内炼苗1-2d，之后取出小苗，洗净根上附着的培养基，移栽到装有蛭石和泥炭土的混合基质的穴盘中，适当遮荫，并及时浇水，保持种苗处在湿润状态直到长出新根，20d后统计成活率可达100％。

实施例2最佳实施例

与实施例1基本相同，所不同的在于：初始培养首先将灭菌去果皮的种子外植体接种在只有琼脂7％+GA4.0mg/L的无菌空白培养基(D1)上，即可以在生长素的作用下诱导胚芽快速萌动发芽，又降低了种子外植体的染菌率，方便后续种苗无菌培养。为了缩短培养时间，上述无菌空白培养以培养7-10天后就转接到下述最佳激素配方的培养基即J3：Ms+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L+KT1mg/L上，培养28-30天后，统计结果得出平均芽增殖倍数可达11-13倍，每个外植体产生的丛生芽都较多，少则8-9个，多则13-15个，长势叶色质量均好，丛生芽产生的部位在茎基部节上，即不影响丛芽的生长，也还可以继续作为下一代的繁殖材料，扩大繁殖系数。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一种通过种子无菌萌发获得沿阶草实生苗的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）种子采集的时间及采后的低温预处理：采集的沿阶草（Ophiopogon japonicus）种子种类包括有金边细叶型、矮生型、长叶型及银纹沿阶草，采集的时间从当年10月底开始到第二年2月底结束；采集后的种子放入0℃冰箱低温冷藏处理1-2个月；

2）种子的消毒灭菌：把步骤1）采集的种子去果皮，放在洗衣粉中浸泡15-20min后流水冲洗2h，再用2%次氯酸钠液消毒20-25min，灭菌水冲洗3次后吸干表面水分，拿到超净工作台上备用；在超净工作台上用消毒液消毒灭菌，无菌水冲洗8-10次后，用灭菌吸水纸擦干水分，准备接种；

3）种子外植体的无菌萌发培养：将灭菌的种子先接种在琼脂7%+GA4.0mg/L培养基上，7-10天转接在含激素的MS培养基上，在无菌自然光下培养28-30天，统计种子的萌发率、丛生芽增殖倍数及生长发育情况；

4）壮苗生根培养：将上述丛生芽苗分成单株，剪去老根老叶转入壮苗生根培养基，在1500-2000LX光下培养12h/d，26-30天小芽苗100%长成具有完整根茎叶的正常健壮植株；

5）无菌苗的移栽与成活：将上述生根的组培实生苗揭开瓶口的封口膜室内炼苗1-2d，之后取出小苗，洗净根上附着的培养基，移栽到装有蛭石和泥炭土的混合基质的穴盘中，适当遮荫，并及时浇水，保持种苗处在湿润状态直到长出新根，20d后统计成活率；

所有的培养温度均在25-30℃，步骤2）中的消毒液采用升汞+吐温，消毒灭菌8-10min，步骤3）中的含激素的MS培养基为MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L+KT1mg/L。