CN109362565A - 一种皂荚组培快繁方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种皂荚组培快繁方法，目前皂荚主要采用扦插、嫁接和播种等传统方式进行育苗，存在育苗成本高，苗木长势不好、参差不齐、良种潜力未能得到充分发挥等缺点。本发明以优良无性系嫩枝为外植体，通过外植体消毒、诱导培养、丛生芽增殖、不定根发生、炼苗移栽等过程获得了皂荚离体再植株，建立皂荚组织培养快速繁殖技术体系，可以保持皂荚无性系母本的优良性状，有利于皂荚优良无性系苗木的规模化生产。

Description

一种皂荚组培快繁方法
技术领域
本发明涉及农业生物技术中植物组织培养的方法，具体地说，涉及一种皂荚组培快繁方法。
背景技术
皂荚别名：皂角、肥皂英、大皂。全国各地有分布。属落叶乔木，秋季采荚果，四季采剌，晒干。味辛，性寒，有小毒。具有消痰平喘，通窍攻坚。近年来随着集体林权制度改革的推进和商品材价格的上涨，林农经营皂荚的积极性加大，皂荚经营水平和良种意识的不断提高，对皂荚良种壮苗的需求日益增加，因此，如何快速扩繁皂荚优良基因型显得十分必要。近年来生物工程技术的快发展，尤其是组培快繁体系的建立，为林木的无性选育提供了一定的技术支撑。利用组织培养技术进行珍稀濒危物种及优良品系树种繁育，具有加速育种、缩短繁殖过程、节省空间、减少劳动、周年生产等特点。而目前皂荚主要采用扦插、嫁接和播种等传统方式进行育苗，存在育苗成本高，苗木长势不好、参差不齐、良种潜力未能得到充分发挥等缺点，使得目前皂荚优质壮苗的供应还无法满足市场的需求。为了满足市场对皂荚苗的巨大需求，本发明以优良无性系嫩枝为外植体，通过外植体消毒、诱导培养、丛生芽增殖、不定根发生、炼苗移栽等过程获得了皂荚离体再植株，建立皂荚组织培养快速繁殖技术体系，不仅能有效地克服皂荚传统育苗中的一些缺陷，而且对繁育出的无性系苗木在保持母本的优良性状起到一定的作用，有利于皂荚优良无性系苗木的规模化生产。
发明内容
本发明的目的在于提供出一种皂荚组培快繁方法，本发明以优良无性系嫩枝为外植体，通过外植体消毒、诱导培养、丛生芽增殖、不定根发生、炼苗移栽等过程获得了皂荚离体再植株，建立皂荚组织培养快速繁殖技术体系，从而实现了本发明的目的。
本发明的一种皂荚组培快繁方法，包括以下的步骤：
步骤1，外植体采集及消毒：采取皂荚树桩基部形态表征一致的当年生萌动状态的饱满嫩枝作为外植体，在流水下冲洗4h，浸泡于3%～5%洗衣粉溶液12分钟，用软毛刷3%～5%洗衣粉溶液轻轻刷洗材料，再用自来水以滴水的形式冲洗96min，用蒸馏水冲洗10次，于超净工作台中以75%～80%乙醇溶液浸泡68s，无菌水冲洗9次，再用含有0.08%吐温-20的0.8%升汞溶液消毒19min，无菌水冲洗9次后用无菌滤纸吸干表面的水分备用;
步骤2，诱导培养：将经步骤（1）处理后的嫩枝剪成约2.0cm的茎段并接种到诱导培养基进行丛生芽诱导培养,接种后置于每天光照15小时，光照强度为2100lx，置于培养温度为28℃，空气相对湿度为75%～80%的条件下培养32天后统计诱导情况; 诱导培养基为：MS+1.1mg/L NAA+8.1mg/L 6-BA+3.1mg/L KT+1.6g/L AC+32g/L蔗糖+6.1g/L琼脂，pH为5.3；
步骤3，丛生芽增殖：将步骤（2）诱导培养得到丛生芽接种到增殖培养基进行不定芽增殖培养,接种后置于每天光照16小时，光照强度为2500lx，置于培养温度为25℃，空气相对湿度为75%～80%的条件下培养45天后统计发芽数; 增殖培养基为：MS+0.6mg/L 2,4-D+5.2mg/L 6-BA+1.2mg/L NAA+1.6g/L AC+32g/L蔗糖+6.2g/L琼脂，pH为5.3；
步骤4，生根培养：将步骤（3）增殖中获得的植株无根嫩梢8cm从基部切下并接种至生根培养基中进行诱导生根,接种后置于每天光照15小时，光照强度为3500lx，置于培养温度为23～25℃，空气相对湿度为75%～80%的条件下培养32天后统计生根情况; 生根培养基为：White+1.3mg/L NAA+3.2mg/L IBA+32g/L蔗糖+6.2g/L琼脂，pH为5.3；
步骤5，炼苗移栽：将生根培养基上获得的具备移栽条件的瓶苗进行炼苗，瓶苗移至常温下6天后，打开瓶盖5天，然后洗去附着于苗根系上的培养基，在 1000 倍的生物菌剂中浸泡12min，然后移栽至盛有所设计的移栽培养基质的容器袋中进行培养，每个容器袋移栽1株生根苗,置于带有遮阴网的自动喷雾的塑料大棚内保温保湿温度控制在 15～35℃，湿度应保持在 75％～85％左右，避免阳光直射，移栽32天后统计成活率。移栽培养基质为由泥炭土:蛭石:珍珠炭:草灰=3:2:2:1混合而成基质。
与现有技术相比本发明的优点是：皂荚近年来随着集体林权制度改革的推进和商品材价格的上涨，林农经营皂荚的积极性加大，皂荚经营水平和良种意识的不断提高，对皂荚良种壮苗的需求日益增加。而目前皂荚主要采用扦插、嫁接和播种等传统方式进行育苗，存在育苗成本高，苗木长势不好、参差不齐、良种潜力未能得到充分发挥等缺点，使得目前皂荚优质壮苗的供应还无法满足市场的需求。为了满足市场对皂荚苗的巨大需求，本发明以优良无性系嫩枝为外植体，通过外植体消毒、诱导培养、丛生芽增殖、不定根发生、炼苗移栽等过程获得了皂荚离体再植株，建立皂荚组织培养快速繁殖技术体系，可以保持皂荚无性系母本的优良性状，有利于皂荚优良无性系苗木的规模化生产。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。
实施例1：
（1）外植体采集及消毒：采取皂荚基部形态表征一致的当年生萌动状态的饱满嫩枝作为外植体，在流水下冲洗 1h，浸泡于3%洗衣粉溶液4min，用软毛刷3%洗衣粉溶液轻轻刷洗材料，再用自来水以滴水的形式冲洗 55min，用蒸馏水冲洗 2次，于超净工作台中以75%乙醇溶液浸泡18s，无菌水冲洗4次，再用含有0.01%吐温-20的0.3%升汞溶液消毒4min，无菌水冲洗62次后用无菌滤纸吸干表面的水分备用。
（2）诱导培养：将经步骤（1）处理后的嫩枝剪成约1.4cm的茎段并接种到诱导培养基进行丛生芽诱导培养。接种后置于每天光照15小时，光照强度为1900lx，置于培养温度为23℃，空气相对湿度为75%的条件下培养28天后诱导率达98%。所述的诱导培养基为：MS+0.1mg/L NAA+4.0mg/L 6-BA+1.4mg/L KT+0.6g/L AC+24g/L蔗糖+4.8g/L琼脂，pH为5.6。
（3）丛生芽增殖：将步骤（2）诱导培养得到丛生芽接种到增殖培养基进行不定芽增殖培养。接种后置于每天光照10小时，光照强度为1200lx，置于培养温度为23℃，空气相对湿度为75%的条件下培养38天后芽数9个以上。所述的增殖培养基为：MS+0.5mg/L 2,4-D+3.9mg/L 6-BA+0.4mg/L NAA+0.8g/L AC+ 24g/L蔗糖+4.9g/L琼脂，pH为5.6。
（4）生根培养：将步骤（3）增殖中获得的植株无根嫩梢4cm从基部切下并接种至生根培养基中进行诱导生根。接种后置于每天光照12小时，光照强度为1800lx，置于培养温度为23℃，空气相对湿度为75%的条件下培养32天后生根达到99%以上。所述的生根培养基为：White+0.2mg/L NAA+1.2mg/L IBA+16g/L蔗糖+3.8g/L琼脂，pH为5.6。
（5）炼苗移栽：将生根培养基上获得的具备移栽条件的瓶苗进行炼苗，瓶苗移至常温下 3天后，打开瓶盖 1天，然后洗去附着于苗根系上的培养基，在 1000 倍的生物菌剂中浸泡 4min，然后移栽至盛有所设计的移栽培养基质的容器袋中进行培养，每个容器袋移栽1株生根苗。置于带有遮阴网的自动喷雾的塑料大棚内保温保湿温度控制在 25℃，湿度应保持在 75％～85％左右，避免阳光直射，移栽38天后成活率达到94%以上。所述的移栽培养基质为由泥炭土:蛭石:珍珠炭:草灰=2:2:1:1混合而成基质。
实施例2：
（1）外植体采集及消毒：采取皂荚树桩基部形态表征一致的当年生萌动状态的饱满嫩枝作为外植体，在流水下冲洗 2h，浸泡于3%洗衣粉溶液6min，用软毛刷4%洗衣粉溶液轻轻刷洗材料，再用自来水以滴水的形式冲洗68min，用蒸馏水冲洗 3次，于超净工作台中以78%乙醇溶液浸泡28s，无菌水冲洗4次，再用含有0.01%吐温-20的0.2%升汞溶液消毒6min，无菌水冲洗5次后用无菌滤纸吸干表面的水分备用。
（2）诱导培养：将经步骤（1）处理后的嫩枝剪成约1.3cm的茎段并接种到诱导培养基进行丛生芽诱导培养。接种后置于每天光照16小时，光照强度为1000lx，置于培养温度为25℃，空气相对湿度为75%的条件下培养28天后诱导率达97%。所述的诱导培养基为：MS+0.2mg/LNAA+5.8mg/L 6-BA+1.8mg/L KT+0.8g/L AC+28g/L蔗糖+4.8g/L琼脂，pH为5.5。
（3）丛生芽增殖：将步骤（2）诱导培养得到丛生芽接种到增殖培养基进行不定芽增殖培养。接种后置于每天光照12小时，光照强度为2600lx，置于培养温度为25℃，空气相对湿度为75%的条件下培养40天后芽数6个以上。所述的增殖培养基为：MS+0.4mg/L 2,4-D+3.3mg/L 6-BA+0.4mg/L NAA+0.8g/L AC+ 22g/L蔗糖+3.6g/L琼脂，pH为5.5。
（4）生根培养：将步骤（3）增殖中获得的植株无根嫩梢4cm从基部切下并接种至生根培养基中进行诱导生根。接种后置于每天光照12小时，光照强度为2100lx，置于培养温度为23℃，空气相对湿度为75%的条件下培养31天后生根达到96%以上。所述的生根培养基为：White+0.6mg/L NAA+1.8mg/L IBA+21g/L蔗糖+4.3g/L琼脂，pH为5.5。
（5）炼苗移栽：将生根培养基上获得的具备移栽条件的瓶苗进行炼苗，瓶苗移至常温下 3天后，打开瓶盖 2天，然后洗去附着于苗根系上的培养基，在 1000 倍的生物菌剂中浸泡 5min，然后移栽至盛有所设计的移栽培养基质的容器袋中进行培养，每个容器袋移栽1株生根苗。置于带有遮阴网的自动喷雾的塑料大棚内保温保湿温度控制在 25℃，湿度应保持在 75％～85％左右，避免阳光直射，移栽28天后成活率达到95%以上。所述的移栽培养基质为由泥炭土:蛭石:珍珠炭:草灰=2:2:2:1混合而成基质。

Claims (1)

1.一种皂荚组培快繁方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤1，外植体采集及消毒：采取皂荚树桩基部形态表征一致的当年生萌动状态的饱满嫩枝作为外植体，在流水下冲洗4h，浸泡于3%～5%洗衣粉溶液12分钟，用软毛刷3%～5%洗衣粉溶液轻轻刷洗材料，再用自来水以滴水的形式冲洗96min，用蒸馏水冲洗10次，于超净工作台中以75%～80%乙醇溶液浸泡68s，无菌水冲洗9次，再用含有0.08%吐温-20的0.8%升汞溶液消毒19min，无菌水冲洗9次后用无菌滤纸吸干表面的水分备用;
步骤2，诱导培养：将经步骤（1）处理后的嫩枝剪成约2.0cm的茎段并接种到诱导培养基进行丛生芽诱导培养,接种后置于每天光照15小时，光照强度为2100lx，置于培养温度为28℃，空气相对湿度为75%～80%的条件下培养32天后统计诱导情况; 诱导培养基为：MS+1.1mg/L NAA+8.1mg/L 6-BA+3.1mg/L KT+1.6g/L AC+32g/L蔗糖+6.1g/L琼脂，pH为5.3；
步骤3，丛生芽增殖：将步骤（2）诱导培养得到丛生芽接种到增殖培养基进行不定芽增殖培养,接种后置于每天光照16小时，光照强度为2500lx，置于培养温度为25℃，空气相对湿度为75%～80%的条件下培养45天后统计发芽数; 增殖培养基为：MS+0.6mg/L 2,4-D+5.2mg/L 6-BA+1.2mg/L NAA+1.6g/L AC+32g/L蔗糖+6.2g/L琼脂，pH为5.3；
步骤4，生根培养：将步骤（3）增殖中获得的植株无根嫩梢8cm从基部切下并接种至生根培养基中进行诱导生根,接种后置于每天光照15小时，光照强度为3500lx，置于培养温度为23～25℃，空气相对湿度为75%～80%的条件下培养32天后统计生根情况; 生根培养基为：White+1.3mg/L NAA+3.2mg/L IBA+32g/L蔗糖+6.2g/L琼脂，pH为5.3；
步骤5，炼苗移栽：将生根培养基上获得的具备移栽条件的瓶苗进行炼苗，瓶苗移至常温下6天后，打开瓶盖5天，然后洗去附着于苗根系上的培养基，在 1000 倍的生物菌剂中浸泡12min，然后移栽至盛有所设计的移栽培养基质的容器袋中进行培养，每个容器袋移栽1株生根苗,置于带有遮阴网的自动喷雾的塑料大棚内保温保湿温度控制在 15～35℃，湿度应保持在 75％～85％左右，避免阳光直射，移栽32天后统计成活率，移栽培养基质为由泥炭土:蛭石:珍珠炭:草灰=3:2:2:1混合而成基质。
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