CN1093167A - 一种测量细胞特性和诊断疾病的显微光解分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种采用选定频率和能量密度的 聚焦光来测定细胞膜强度的方法。本方法还可通过 将暴露于改变细胞特征的药物环境的细胞的膜强度 与对照组细胞的膜强度进行比较而用于诊断是否患 某些细胞疾病。

Description

大多数生物细胞可以在不改变细胞膜功能的完整性的前提下急剧地改变其形状（这也称为细胞的可变形性）。在特定的条件下，细胞膜会破裂并失去细胞质（即具有细胞脆性）。细胞可以同时具有任何高至低的变形性和高至低的脆性。不过，大多数细胞通常具有高变形性和中至低的脆性。

变形性对一些通常静止的细胞（如“感觉受体”）和通常运动的细胞（如血细胞和淋巴细胞）而言是一个重要的特性。细胞脆性对几乎所有的体细胞都是一个重要的特性，因为细胞环境中的变化可使水转移进细胞，使脆性细胞破裂。这样，细胞脆性的改变还可改变细胞发挥其正常的功能的能力。比如，当脆性异常高以至于使红血细胞的部分循环池发生破裂时会降低氧向组织的输送水平。因此，脆性在临床上是一个比变形性更为重要的细胞特性。

细胞脆性会随着细胞年龄、在血库的保存时间、用各种膜结合药物进行处理和膜或与血红蛋白有关的疾病的进程（如镰形细胞贫血及糖尿病）的发展而改变。这样，需要有一种快速、高度准确和简便易行的方法用于临床测量，把细胞脆性表示为一个细胞能力对功能的指数（称之为细胞完整性）。这些现有的方法包括渗透梯度爱克塔细胞测量法、过滤、微量吸移管抽吸以及渗透脆性法。当然，只有渗透脆性法这一种方法经常用于临床实验中。

渗透梯度爱克塔细胞测量法是一种已被开发用于测量细胞变形性的技术。这种技术用一个粘度计来测量由不同的渗透溶液在不同的旋转速度水平（即所施加的剪切应力）的条件下导致的红血细胞形状的改变。采用不同的渗透溶液使有可能这种爱克塔细胞测量法法来确定几种能影响红血细胞变形性的性质。不过，用爱克塔细胞测量法法所产生的渗透光谱曲线非常复杂，很难解释。这些曲线同时由于样品环境温度、pH值以及浆渗透摩尔浓度的改变而呈现很高的变化性。这样，目前需要很复杂的设备、对操作者的强化培训以及高度受控的试验环境才能使爱克塔细胞测量法法切实可行，但是只有很少的研究实验室才有这样的条件，而在临床机构中根本没有这样的条件。

其它测量细胞变形性的方法包括将细胞经各种大小的孔过滤、抽吸进尖端和逐渐变细程度固定的微量吸移管，以及一种光度法。所有的这些方法还需要非常复杂的设备和很大的操作者培训量;并且用这些方法分析一些样品中的较少的细胞时特别费时。这样，这些方法同样还没有被临床广泛采用。

作为测量细胞变形性的过滤法的一个变型，对在压力作用下穿过一个膜或箔体系（Helmut    Jahn，美国专利4797606）的红细胞进行阻抗测量（Hands等人，美国专利4835457）和时间测量（David    D.Paterson，美国专利4491012）。这些变型对滤器或箔的制造公差特别敏感，并且它们主要测量的仅仅是变形性而不是细胞的脆性。这样，这些派生的过滤法同样还不能用于常用的临床测量中。

渗透脆性试验法是一种最早开发的用于评价红血细胞完整性的方法，并且它是目前用于临床的很少的几种方法中的一种。渗透脆性试验法很费时，需要采用多个血液处理步骤，通常需要较多的血样，并且不能提供有关溶解（细胞膜破裂）率方面的信息。此方法用于细胞脆性中的这些限制以及对轻度的或中等的变化缺乏灵敏使这种渗透试验法在临床上的应用仅限于诊断一种称为遗传球形红细胞症的疾病。

大约五十年前人们首次证明，光可以使一些化学物质在试管中发生变化（称之为光活化作用）而诱发红血细胞的破裂或分裂（称之为溶血）。从此以后，这个基本的过程（称为光溶血）已在各种试管试验中得到大力的研究。

光溶血机制依赖于氧并且可能涉及到产生单纯的氧并且随之使红血细胞膜中的蛋白质发生氧化。这种蛋白质的氧化产生了水通道，同时被动的阳离子交换水平增加，而且后来的水流进细胞，产生溶血。光溶血还可伴随着细胞膜的脂层的过氧化。这种过氧化将改变脂双层中膜的流动性，限制细胞形变的能力，因为这种形变依赖于双脂层中的变化。

这样，大量的科学证据表明，某些特定的化学试剂可以被光激活，通过改变细胞膜中的蛋白质或脂层而破坏红血细胞。这些膜的变化破坏了膜的完整性，形成了通过增大细胞体积而改变细胞形状（即细胞变形能力）的水流，直到“细胞内的压力”破坏细胞膜（即细胞脆性）的程度足以使细胞质损失（以红血细胞的情形中即为溶解或溶血）。

目前的临床方法采用了毫升量的血液溶液来测量溶血发生处的渗透摩尔浓度（与内部水压等效）。不过，这些溶血方法不能将变形能力的改变与脆性的改变区分开，不能将由蛋白质层变化所致的膜的完整性的丧失与脂层的变化所致的膜的完整性的丧失区别开，并且临床应用中更灵敏的溶血试验所需的“溶血速率”。

目前的临床方法可以说是“宏观”的技术，其中较大的血量（毫升量级）暴露于各种测定溶血的渗透溶液。这些渗透脆性试验通常是在较大的试管或小杯中使用平行光来激活的。同样，目前的光溶血研究方法也是“宏观的”方法，需要将毫升量级的血液暴露于光激活条件下，并且获得每个测量结果都需要很长的分析时间。对用0.1mM的原卟啉作“细胞攻击”剂对所培养的红血细胞进行光激活需要大约20分钟的照射时间才能达到一般的20%的溶血，而100%的溶血需要25分钟或更长时间的照射。与此相似，用脱镁叶绿甲酯一酸作细胞攻击剂经20分钟以上时间的光照可达到约90%的溶血。用曙红-异硫氰酸盐作细胞攻击剂曝光3-4小时在光激活约11小时后可达到最大的溶血率。所有这些目前的方法首先都需要很长的时间，因为它们采用的是非聚焦光，这就使激活受低光功率密度的限制。

所有目前的渗透脆性和光溶血方法都需要多次稀释、离心和在分光光度计中分析才能得到细胞溶血百分比的单次测量结果。所以，目前的临床和研究方法都很费时，并且曝光量和时间的相关关系几乎不可能由一个血样得到。一些研究都已采用一种光散射装置来检测光溶血。不过，此装置对红血细胞浓度的非常微小的变化都很敏感，并且此装置需要制备一个红细胞浓度低于0.00025%的红血细胞单层，而即使采用目前的微量吸移管体系也极难实现。而且，由于采用焰红染料B作为细胞攻击剂的情况下100%的溶血需4小时，所以这种细胞单层法非常费时。

本发明包括采用一种新的“微光溶血”技术来将精确量的聚焦光能投射在一个非常小的细胞样品（小于25μl的细胞显微样品）的一个精确的微区来激活一种攻击邻近的细胞膜的化学试剂。本发明包括用一种“微光分析”技术来把由细胞攻击微区中被光激活的化学物质所致的细胞破裂的精确度做为时间的函数加以测量。这个过程可给出细胞脆性的定量的、与时间相关的、依赖于光量的测量结果。

本发明（称为显微光解分析法）与给出较不准确的细胞变形性或细胞脆性估算值的其它目前的方法相比有几个优点。显微光解分析法仅仅在细胞显微样品的一个非常小的限定的区域采用聚焦光来激活细胞攻击化学制剂。这样，可以用某一个别的显微样品中的多个显微样品区域来获得多个光激活结果，而把其中的一个区域作为未激活的对照。同样，可在光激活之前分析每个显微样品区域以得到确定溶解反应所需的其自身的对照值。与其它方法相反，用本发明的这种多重激活自身对照特点可以完成“能量剂量-溶解反应”试验，给出细胞膜脆性的非常精确的、与时间相关的测量结果。

与其它方法不同，在本发明中在细胞显微样品的一个小区域采用聚焦光仅需要2-10分钟这样的较短的光激活时间，同时，依细胞总体的大小，需要30-60分钟的时间即可完成细胞溶解。这样，用本发明可首次提供在低于一小时的整个测量时间内在一个单一的细胞显微样品（25μl）上测量细胞溶解率的完整的显微光解响应曲线。

在本发明中，可以将准确量（剂量）的各种药物加入到细胞显微样品中来试验这些药物对提高细胞脆性的效果（效力）。这样，本发明首次实现了在一个总量为150μl的血样上对6个药物剂量的完整的剂量-应答分析。

与其它方法不同，本发明（新方法）在将显微样品放入样品载体中以后就不再需要对细胞进行进一步的处理。用容易施行的重复试验法，通过在一个第二显微样品区域重复进行光激活，很容易实现这种新方法。新方法给出了仅依赖于光激活能和细胞攻击化学制剂的浓度和成分的显微光解结果。与其它方法相比，新方法并没有因可提高细胞的布朗运动从而混淆溶解测量结果的样品温度的改变（由光源引起）或因细胞显微样品中的其它血液成分（如血浆）的非特异效应而变得复杂化。这样，新方法只使聚焦光激活区域中具有非常特异的，与光有关的活性。

用新方法可以测量由于膜特性的变化所致的细胞膜脆性的改变，所述的膜特性的变化是由一种居于细胞的外部并且只在细胞的外部被激活的细胞攻击剂（一种细胞外试剂）而产生的。用新方法可以测量由于细胞内部结构的变化所致的细胞膜脆性的改变，所述的细胞膜脆性的改变是由一种穿过细胞膜而与细胞内部结构相结合的、被光激活的细胞攻击剂而产生的。这样，用新方法首次实现了对只改变细胞膜的疾病、只改变细胞内部成分的全身疾病以及由药物治疗所致的细胞变化的检测。

激活细胞间剂的能级将部分依赖于细胞的抗氧化状态。许多细胞（如红血细胞）通常携带氧，并且这些细胞能保证充分发育的抗氧化体系避免细胞自动氧化。目前评价细胞脆性或变形性的其他方法同样不能评价抗氧化活性，因为这些其他的方法不能在细胞内诱导氧化反应。本发明能够测量由于特定的外部及内部化学试剂的光激活作用所引发的细胞脆性的差别，这就成为一种测量细胞内抗氧化体系状态的新的方法。

本发明是一种新的“显微光解和微光分析方法”，它采用了通用设备与新工艺、解决方案和新的制备方法的一个新序列的新的组合。

相应于此，本发明的一个目的是提供一种显微镜、光源、光控制器、电视图象以及视频记录设备的新的配置，以形成标准照明条件下的细胞图象。

本发明的一个进一步的目的是提供一种新的显微镜校准步骤，以使细胞能在定量化的、聚焦的、频率特定的光能照射下显微曝光。

本发明的一个进一步的目的是采用一种公知的选择步骤来获得细胞样品。

本发明的一个进一步的目的是采用一种标准的缓冲溶液的制剂来提供细胞样品的标准的环境。

本发明的另一个目的是提供一种采用一种其它类型的测量所用的荧光色素溶液的新的制剂的新的方法，以便为细胞标本的不同的显显微样品提供一种可定量化的新的细胞攻击刺激物。

本发明的另一个目的是提供一种制备细胞样品的新的方法，以便在一个标准化的溶液（缓冲）环境中给出一种细胞和细胞攻击刺激物的标准化的混合物。

本发明的又一个目的是提供一种用于随后细胞分裂测量的新的显微样品制剂。

本发明的又一个目的是提供一种用于精确的光刺激攻击以便以一种新的标准化的方式在显微样品中破坏细胞的新的显微光解步骤。

本发明的再一个目的是提供一种用于显微样品图象的显微光解的新的步骤，以便在显微样品的小区域中进行光刺激细胞攻击过程的同时测量细胞随时间而变的分裂过程。

在阅读了后面的说明的基础上可以更好地了解这些和其他的改进。

通过参考后面的说明并结合附图，可以更好地一理解本发明，在这些附图中：

图1是在一个细胞显微样品的两个矩形区域中存活的未受损的人类红血细胞的百分数（按照相对响应区域光密度的量进行测量）与从在一个矩形区域中开始进行245焦耳/cm²的光活化细胞攻击刺激（空心环）以便形成显微光解以及在一个第二矩形区域中开始401焦耳/cm²的光活化细胞攻击刺激（实心环）以便形成显微光解的时间的函数关系的曲线图。

图2是表示图1中245焦耳/cm²刺激水平的重复曲线图，它给出了响应区域光密度与在给出图1结果的细胞样品的一个第三矩形区域中开始638焦耳/cm³光激活细胞攻击刺激（实心环）以便形成显微光解的时间的曲线关系。

图3是表示图1的重复曲线（空心环）图，图中的基线定义如下：

1）极大显微光解响应（MR）为零时响应区域光密度（ZROD）减去最小平顶响应区域光密度（PROD）;

2）极大响应百分比（MR%）为MR的100倍除以ZROD;并且

3）在特定时间t处的响应百分比（%响应（t））为ZROD量的100倍减去时间T时响应区域光密度（ROD（t）），所得的量再除以MR。

图4为将图3中的定义用于图1和图2中的三个响应区域光密度曲线所得的三个显微光解%响应曲线图。

图5是图4的显微光解%响应曲线（开口环）的重复的曲线图，图中基线定义如下：

1）响应半时间（T_1/2）为从开始细胞攻击到达到50%响应值的时间段，并且

2）%响应曲线的最大斜率为t＝T_1/2处的斜率。

图6是从4个兔采集红血细胞后第1天的7小时（圆形）、第2天（方形）、第3天（三角形）、第4天（钻石形）和第5天（倒置的三角形）的显微光解的%响应曲线（平均值±SEM）图。

图7是表示对兔（N＝3）红血细胞的细胞攻击刺激效果的%响应曲线（平均值±SEM）图，刺激强度分别为105焦耳/cm²（空心方形）、126焦耳/cm²（实心方形）、159焦耳/cm²（空心三角形）、168焦耳/cm²（实心三角形）、210焦耳/cm²（空心钻石形）以及210焦耳/cm²（实心钻石形）。

图8是显微样品中3%（圆形）、4%（三角形）及5%（方形）浓度的兔（N＝4）红血细胞的显微光解的%响应曲线（平均值±SEM）图。

图9是已从全血中分离出来的兔（N＝3）红血细胞（圆形）以及含有血浆和其它细胞（如血小板或白血细胞）的红血细胞（三角形）的显微光解的%响应曲线（平均值±SEM）图。

图10是在第5天（圆形）、在已用缓冲溶液及FITC-葡聚糖清洗和重构红血细胞之后第5天（钻石形）以及在已用缓冲溶液（但不用FITC-葡聚糖）清洗和重构红血细胞之后第5天（方形）兔（N＝4）红血细胞的显微光解的%响应曲线（平均值±SEM）图。

图11是已用带葡萄糖和白蛋白的标准缓冲溶液（方形）、带葡萄糖但不带白蛋白的缓冲溶液（实心钻石形）、带白蛋白但不带葡萄糖的缓冲溶液以及不带处理过的兔（N＝4）红血细胞的显微光解的%响应曲线（平均值±SEM）图。

图12是对先前已用浓度为5.0mM（钻石形）、0.5mM（方形）、0.05mM（圆形）或0.00mM（实心三角形）的二酰胺培养1小时的、用180焦耳/cm²（左半边）及90焦耳/cm²（右半边）的细胞攻击刺激强度刺激的兔（N＝6）红血细胞的显微光解的%响应曲线（平均值±SEM）图。

图13是对先前已用浓度为100μM（圆形）、30μM（钻石形）、10μM（方形）以及0μM（实心三角形）的氯丙嗪培养20分钟的、用180焦耳/cm²（左半边）及90焦耳/cm²（右半边）的细胞攻击刺激强度刺激的兔（N＝5）红血细胞的显微光解的%响应曲线（平均值±SEM）图。

图14是对先前已用浓度为0.02%（带间断线的圆形）、0.01%（钻石形）、0.005%（三角形），0.0025%（带间断线的方形）、0.00125%（圆形）以及0.000%（实心三角形）的戊二醛培养1小时的兔（N＝6）红血细胞的显微光解的%响应曲线（平均值±SEM）图。

图15为表示红血细胞显微光解的%响应曲线的极大响应百分比（MR%）以及T_1/2和斜率的条线图，所述的细胞取自5个照射强度为248±3.6J/cm²的正常的对照S prague-Dawley实验室鼠（C）、3个照射强度为245±4.1J/cm²的患由链脲佐菌素诱发的胰岛素依赖型糖尿病的S prague-Dawley鼠（D），以及6个照射强度为249±2.7J/cm²的患由饮食诱发的高胆甾醇血鼠（H）。

图16为表示浓度为0.5%-3.0%的人类（N＝3）红血细胞显微光解的%响应曲线的极大响应百分比（MR%）以及T_1/2和斜率的条线图。对所有的5个细胞浓度，一个主体接受549±0.3J/cm²的细胞攻击刺激，第二个接受340±1.1J/cm²的细胞攻击刺激，第三个接受198±1.3J/cm²的细胞攻击刺激。

图17为表示人类（N＝5）红血细胞显微光解的%响应曲线的极大响应百分比（MR%）以及T_1/2和斜率的条线图，所述的人类红血细胞先前已用浓度为10mM（实心条）、1mM（条纹条）以及0mM（清晰条）的pentoxifylline（PTFX）培养1小时。对所有的3个pentoxifylline浓度，一个主体接受658±6.6J/cm²的细胞攻击刺激，三个主体接受329±1.9J/cm²的细胞攻击刺激，并且一个主体接受196±0.7J/cm²的细胞攻击刺激。

图18为表示人类（N＝5）红血细胞显微光解的%响应曲线的极大响应百分比（MR%）以及T_1/2和斜率的条线图，所述的人类红血细胞先前已在4℃下用浓度为10mM（实心条）、1mM（条纹条）以及0mM（清晰条）的pentoxifylline（PTFX）培养24小时。对所有的3个pentoxifylline浓度，一个主体接受641±3.3J/cm²的细胞攻击刺激，三个主体接受330±1.7/cm²的细胞攻击刺激，并且一个主体接受205±0.7J/cm²的细胞攻击刺激。

图19为取自没有出现镰刀细胞疾病临床标志的4个女性和3个男性非洲-美洲人的红血细胞显微光解的%响应曲线的极大响应百分比（MR%）以及T_1/2和斜率的条线图，细胞刺激强度分别为A＝243±2.9J/cm²（清晰条）、B＝400±3.6J/cm²（条纹条）、C＝642±4.0J/cm²（实心条）。

图20为取自出现镰刀细胞疾病临床标志但没有出现血红蛋白F异常临床标志的4个女性和3个男性非洲-美洲人的红血细胞显微光解的%响应曲线的极大响应百分比（MR%）以及T_1/2和斜率的条线图，细胞刺激强度分别为A＝247±1.1J/cm²（清晰条）、B＝395±5.5J/cm²（条纹条）、C＝643±4.0J/cm²（实心条）。

图21为取自出现镰刀细胞疾病临床标志和F血红蛋白异常临床标志的1个女性和1个男性非洲-美洲人的红血细胞显微光解的%响应曲线的极大响应百分比（MR%）以及T_1/2和斜率的条线图，细胞刺激强度分别为A＝253±2.8J/cm²（清晰条）、B＝399±4.6J/cm²（条纹条）、C＝661±2.1J/cm²（实心条）。

图22为表示一个细胞显微样品如在左上部中所见的激活之前、开始如在右上部中所见的激活之后20分钟之后、开始如在左下部中所见的激活之后40分钟之后、开始如在右下部中所见的激活之后60分钟之后时的细胞攻击矩形区域的光显微照片。

虽然在本发明中可以采用具有一个75-300W弧光灯作为光源的任何显微镜，本发明优选实施例中用于通过显微镜物镜而对细胞显微样品进行反射照明而采用的是具有一个100W水银弧光灯的一个蔡司型20T光显微镜。用于通过显微镜聚焦镜而对细胞显微样品进行透射照明的是一个功率为50-300W弧光（最好为100W）的卤素灯。将一个带有靶电压外部控制器（一个电荷耦和器件（CCD）或硅增强靶（SIT）摄像头）的电视摄象机装上一个显微目镜接环以便进行适当的显微图象的拍摄、视频信号的记录、视频监视器的显示以及显微光解的分析。用一个标准盒式录像机（如一个Panasonic    6200型录像机）、一个时间-日期视频插入发生器（如Panasonic    810型）以及中分辨率电视监视器（最好至少600根水平线）来记录含有显微样品的细胞的显微区域图象以便在适当的时间联机或脱机分析图象。

本发明的优选实施例使用一个光学显微物镜（数值孔径为0.60的带有一个可变的内装透镜光阑的UMK    50×蔡司镜头）、一个显微管倍率镜（1.25X）、一个X-Y座标可动式的显微载物台（如一个蔡司20-T标准台）以及一个明视场工作台聚光镜（如一个蔡司20-T标准台），这些都是市售的部件。所采用的显微滤光管（最好是莱兹I-2型）带有一个优选范围为450-490nm的带通滤波器、一个最好为510nm的二向色镜以及一个长通阻挡滤光镜（最好为515nm）来匹配所选定的光激活细胞攻击荧光色素（如FITC）的激发和发射频率，以便测量当暴露在激发频率的光时从荧光色素释放出的缺乏电子的原子的量。

通过显微镜的反射照明光路在反射照明光源和显微镜滤光镜管之间配有一个可变的圆形光阑、一个固定的矩形光阑（最好孔径为4.0×3.5mm）以及一个中性密度滤光镜载体，以便允许并控制按级并按已知方式降低的、照射在显微镜载物台上的细胞显微样品上的荧光色素激发光能量。

通过细胞显微样品的透射照明光路在透射照明光源和工作台显微聚光镜之间配有一个圆形场光阑（最好为22mm直径的孔径）、以及一个滤色镜（对血红细胞而言最好为绿色滤光镜），以便控制照射在显微镜载物台上的细胞显微样品上的背景光能量。

显微镜校准过程

本发明包括一种新的显微镜光校准过程，它可以使细胞对特定量的特定频率的光能进行曝光，所述的光能的量为“光能密度”乘以“曝光时间”。在下列的过程中，关键的步骤是当在显微镜上的细胞显微样品“合焦”时，独立地调整反射照明和透身光路以便把来自每条光路的特定的光能量投射到细胞显微样品上的一个特定区域。可以用几种仪器（如EGG    580型辐射计）中的任何几种来测量光路中任何特定点上的光能。优选的仪器为61型United    Technology（UT）视力计，它可以测量微瓦量级电源投射出的光能。

开始校准透射照明光路时，用一个玻璃盖片住显微镜玻璃载片，并把载片放置在显微匀镜的载物台上。通过关闭可变的圆形光阑可以遮断反射照明光路。当调整物镜，使玻璃载片对与显微镜相连的电视摄象管聚焦以后，将透射照明光路的场光阑调整到将近关闭的位置（呈一个针孔开口）并提升工作台聚光器以使此场光阑与针孔开口合焦。然后采用调整工作台聚光器的X-Y坐标的技术，使此场光阑的针孔开口位于显微镜视场的中心。

将透射照明光路的光源电压调整到9.2伏左右。在场光阑的光限制器的出口测量光功率并使场光阑保持开启，直到在光限制器背脊出口处的光功率值为1.08-1.88（最好为1.48）毫瓦。如果在光限制器处的背脊光功率过高或过低，应调整灯源的电压。然后测量照射在显微镜载物台上的玻璃载片的光功率，并且部分关闭工作台聚光器上的内装光阑，使玻璃载片上接受的透射照明光功率为0.044-0.052（最好为0.048）毫瓦。

开始校准反射照明光路时，将荧光素乙酸酯（浓度为1.0mg/ml）滴在显微镜玻璃载物台上，并用一个玻璃盖罩盖上。将载片置于一个放在显微镜台上的样品载体中。将一个不透明的滤光器放在场限制器上，遮断透射照明光路。将反射照明光路的可变的圆形光阑略微开启，以便将此光阑中针孔的荧光象聚焦在与显微镜相连的电视摄象管上。然后调整光阑夹持器以便将此圆形光阑的荧光象定在电视视场中。

然后将圆形光阑完全开启并将固定的矩形光阑插进其在反射照明光路中的载体中。然后调节矩形光阑的调整装置，以便将此矩形光阑的荧光象定在电视视场中。然后调整反射照明光路的灯座中的灯泡，以便在矩形光阑的整个电视画面上产生均匀的荧光。完全关闭反射照明光路的圆形光阑，然后开启至矩形光阑在电视视场中的象为一个均匀的、没有任何直射光线反射进来的荧光矩形区域的程度。

在物镜的焦点平面（该平面相应于当在电视视场中聚焦盖罩时显微镜载物台上的样品载体中盖罩的位置）测量反射照明光路的光功率，并且通过部分关闭物镜光阑而将此光功率调整至0.39-0.41（最好为0.40）毫瓦。（如果在此点上的光功率过低，说明反射照明灯泡使用时间过长，应该更换。）

然后在反射照明光路中每次放入一个中性密度（ND）滤光器，以便校准照射在物镜的焦点平面上的、逐渐降低的反射光功率。标称反射光功率值对0.1的ND为0.30-0.32毫瓦，对0.3的ND为0.18-0.20，对0.6的ND为0.10-0.12。

用光能密度（ED）的量来表示用来提供破坏显微镜载物台上的一个显微样品（下面将详细叙述）中的细胞的光激发攻击能量的、反射照明的光量，所述的光能密度等于显微样品处的反射光功率乘以反射光曝光时间，再除以用反射光曝光的显微样品的区域大小。对上述设备配置和校准步骤而言，将反射曝光区域确定为在显微镜物镜的焦点处投影象区为0.000175cm²（140.91μm×124.24μm）的固定的矩形光阑。

光能密度的常用单位是焦耳/cm²，一焦耳（J）等于一安培电流流经一个一欧姆电阻一秒钟所释放出的总能量（等于一个一瓦或1000毫瓦的电源工作一秒钟所耗的能量）。对上述校准步骤而言，用UT视力计测量的反射光功率的单位为毫瓦（mw），由时间-日期视频插入发生器所测量的反射曝光时间以0.01分钟递增。用下列公式将这些测量单位转变为单位为J/cm²（即焦耳/cm²）的反射光能密度（ED）：

光能密度＝光功率×时间÷面积;或者

焦耳/cm²＝瓦×秒÷cm²;或者

ED（J/cm²）＝（mw÷1000）×（分×60）÷（0.000175cm²）;或者

ED（J/cm²）＝（342.86）×（mw）×（分钟）÷（1cm²）。

由上述校准步骤可给出采用优选的反射照明中性（ND）滤光器所得的、下面的反射光能密度（在显微镜物镜焦点处的ED值）。

ND 功率(mw) ED(J/cm²)

0.0    0.40    137.14×曝光分钟数

0.1    0.32    109.71×曝光分钟数

0.3    0.20    68.57×曝光分钟数

0.6    0.10    34.29×曝光分钟数

典型的曝光时间为2-10分，该时间可给出用于光激活攻击以破坏显微镜工作台上的显微样品中的细胞所需的、在68.58-1371.40J/cm²的范围内的反射光能密度的最终的等级。

显微镜校准过程中最后的步骤是当细胞显微样品一放在显微镜工作台上时调整摄象机的靶电压。此调整步骤把摄象机靶电压（基线靶电流）位置定性地调整到线性电压区间的中点左右以便给出细胞显微样品的透射照明光图象所需的合理的电视画面。不需要定量测量此起始摄象电压，因为所测得的摄象靶处光强度随后的变化是摄象靶电流变化量的百分比，当靶电压处于摄象机的线性电压范围中时，此变化量的百分比与起始的靶电压无关。

细胞采集过程

可以用动脉、静脉或混合毛细管（手指）血来进行红血细胞的显微光解分析。本专利报告中的数据是通过标准的穿刺方法从病人的anticubital静脉中以及有病的新西兰白鼠（2.5-4kg）的耳静脉中采血（常为1-2ml）并放入含有柠檬酸盐以防凝结的无菌管中的方式取得的。

在制备血样和细胞显微样品之前，将血液储存在0-4℃的冰箱中。所有的细胞和溶液过程只使用无菌的一次性吸管端、微量离心管、瓶、塞以及实验器具以防止细胞受污染和感染。

缓冲溶液的制备

随后的血液稀释（见下面）是用一种典型的缓冲溶液完成的，所述的缓冲溶液由7.6g/l的Nacl、0.26g/l的NaHPO₄·H₂O、1.28g/l的Na₂HPO₄、4g/l的葡萄糖以及5g/l的牛血清清蛋白。通过加入1N的NaOH而将缓冲溶液的pH调至7.4（通常血液的pH）。此缓冲溶液的最终的渗透度为311mOsm（接近正常血液的pH）。也可以用其他缓冲溶液;不过，葡萄糖和清蛋白为稳定细胞制剂和提供渗透性受限制从而控制能够影响随后的显微光解过程的跨细胞的水运动的分子所必需的组分。同样，由于总的缓冲溶液还影响跨细胞的水运动的快速阶段，最终渗透度控制在295-315mOsm非常关键。

缓冲溶液制备过程中最后的步骤是通过一个无菌的0.2μm的Nalgene过滤器来真空吸入缓冲溶液，以去除任何细菌或其它颗粒污染物。将过滤后的缓冲溶液分别装进带有橡皮塞的无菌玻璃瓶（最好瓶的容积为20ml）以供随后细胞样品制备所用。

荧光色素溶液的制备

用于细胞攻击的光激活剂的类型对于所分析细胞的类型是专用的，并且对于任何一种类型的细胞的细胞攻击剂都不止一种。例如，焰红染料B、曙红-异硫氰酸盐、脱镁叶绿甲酯一酸和原卟啉以前就已用于在一个较大容积的杯中进行光溶血分析。用于通过显微光解作用而破坏红血细胞膜的优选的细胞攻击荧光色素为可与一个较大的大分子（最好是20000道尔顿的葡聚糖）的荧光素异硫氰酸盐（FITC）。FITC-葡聚糖之所以优选是因为它不进入细胞，并且血液很少吸收在FITC    480nm的激发频率处的光能量。这样，所测得的投射在显微样品上的光能量准确地表示了做为细胞攻击剂的被激活的FITC的量。

将FITC-葡聚糖与0.9%的荧光素异硫氰酸盐溶液进行混合以使FITC-葡聚糖的浓度为50mg/ml。在随后的细胞显微样品制备中，显微样品中最终的FITC-葡聚糖的浓度在2-8mg/ml之间以实现红血细胞显微光解所需的最佳的光激活细胞攻击刺激。

细胞样品制备

可以对不同类型的细胞进行显微光解，并且细胞制备过程中的细胞分离部分将取决于细胞类型。下面叙述了对红血细胞的制备过程。

使冷冻血缓慢转化以使血液混合，然后用等份的缓冲溶液加以稀释（1∶1）。取出少量（80-100μl）的稀释血并倒入一个微量血细胞比容管，该管以一个选定的速度在一个IEC    MB血细胞比容离心器中旋转以使红血细胞朝微量血细胞比容管的一端稠化。然后测量稠化的红血细胞的长度，以给出稀释血液的血细胞比容（%细胞）值。

最终的细胞样品是稀释血液、FITC-葡聚糖、一种试验药物（如果需要的话）以及缓冲溶液的混合物，细胞样品体积为1ml，其组成为0.5-6.0%的红血细胞、2.0-8.0mg/ml的FITC-葡聚糖、0-10mg/ml的试验药物，其余的是缓冲剂。例如，通过将0.08ml（按4/50计算）的荧光色素溶液、0.12ml（按3/25计算）的稀释的血液、0.15ml（按3/20计算）的试验药物溶液以及0.65ml（按1.0-0.08-0.12-0.15计算）的缓冲溶液混合起来可以得到组成为4mg/ml的FITC-葡聚糖（作为上述的一种50mg/ml的荧光色素溶液）、3%的红血细胞（由25%的稀释的血溶液所得）以及3mg/ml的试验药物（作为20mg/ml的溶液）的细胞样品。以此方法为基础，可以通过标准化的光激活细胞攻击刺激手段试验单独一种可溶性材料或多种可溶性材料的混合物对细胞显微光解响应的作用。

细胞显微样品的制备

可以采用任何类型的透明的、不透水的材料（如塑料或玻璃）的小容积（50μl或更小）腔把一个细胞显微样品置于显微镜工作台上。关键部分是腔和防止显微样品失水的注入过程（失水将改变细胞显微样品组分浓度，从而改变显微光解）。下面介绍了一种新的简单的显微样品的制备方法。

将血细胞计数器（最好为Neubauer型）在乙醇中灭菌并在空气中干燥。作为本发明的一种新方法，将4个克尔吸收点（用于口腔制品的牙科棉花签）放入0.9%的NaCl溶液使之饱和。然后用一个精细镊将2个饱和的克尔点放在血细胞计数器的每个边井中，操作时应仔细，保证没有克尔点与血细胞计数槽的内侧边缘接触（不然克尔点中的溶液会因稀释而降低显微样品组分的浓度）。饱和的克尔点法是一种新的方法，它提供“饱和的”水汽压力，避免了显微样品水分通过透过血细胞计数腔的入口而蒸发到在大气中而可能发生的任何的损失。

用一个小的液滴分配器吸取2.5g/l的球蛋白溶液（由蒸馏水制成），并且将此溶液涂在血细胞计数器的盖罩托上。将盖罩放置在血细胞计数器的托上，并使之略微变尖，将盖罩密封在用球蛋白-涂覆的血细胞计数器托上。这点是本发明降低细胞显微样品的水份蒸发的一个新的手段。如采用通常的手段，盖罩仅仅放置在血细胞计数器的托上而不采用密封剂。而“托”中的一些不平整之处将在盖罩和“托”之间留下小的孔隙。因此在本发明中采用一种球蛋白溶液来密封这些小的孔隙是防止细胞显微样品的水份蒸发损失的一种新方法。

通过倒置溶液瓶，缓慢地混合细胞显微样品溶液。用一个无菌的转移吸管从瓶中吸入细胞显微样品溶液并且将22-25μl的这种溶液加入血细胞计数器/盖罩腔的开口中。毛细管作用会使细胞显微样品溶液抽进血细胞计数腔（其深度最好为0.1mm以使细胞层的数目标准化）。

然后将血细胞计数器放入位于显微镜工作台之上的一个样品载体中。此时，（通过从场限制器上移去不透明的滤光器而）打开透射照明光路，并且使细胞显微样品聚焦。然后将电视摄象机靶电压调整至中间区域（如上面显微镜校准过程中所述）。

显微光解细胞攻击过程

用视频技术记录下列过程中的电视-显微镜图象以用于以后过程的分析（也可以在此过程的同时对这些图象进行联机分析）。

细胞落在显微样品血细胞计数腔中所需的等待期定为5分钟。记录室温，并使血细胞计数器的工作温度保持在23.5-24.5℃以使细胞显微样品中红血细胞的布朗运动降至最低。在光透射照明期间对细胞进行聚焦以得到细胞显微样品“背景光密度”的对照读数。然后，通过把不透明的滤光器放在视场限制器上而封闭透射照明光路。

将时间-日期视频插入发生器的时间清至0.00（以分钟表示），并且在接通反射照明光路（通过将不透明的滤光器从反射光路移开）时使发生器开始计时。必要时检查并重新调整荧光图象的焦点。在所需时间（最好为1-6分钟）内保持反射光路接通，用一个预先选定的中性密度滤光器置于反射光路中，成为所需的、所测得的反射能量密度单位为J/cm²的细胞攻击刺激源（如上面显微镜校准过程中所述）。细胞攻击刺激时间结束时，关闭反射光路（通过将不透明的滤光器置于反射光路中）并且打开透射光路（通过将不透明的滤光器从场限制器上移开），形成细胞显微样品的象。记录这些细胞象，直到溶解（细胞的破裂）已达最大程度（矩形反射照明光路区域中保持完整的细胞少于5个）或者以开始时起已过60分钟。

此时，用手将血细胞计数器中的细胞显微样品重新放置在显微镜工作台上，使另一个显微样品区域接受第二个细胞攻击刺激。采用此过程可以对每个细胞显微样品在不同的细胞攻击水平（反射照明能量密度）上进行许多次显微光解测量。用血细胞计数器格栅侵蚀法来鉴别每个细胞攻击区域的位置，这样可以避免在对同一个细胞显微样品进行多次显微光解分析过程中无意中覆盖了有关的细胞攻击区域。

显微光解过程

当已把（血细胞计数器中的）细胞显微样品放置在显微镜工作台上以后，用5分钟的时间使细胞落入显微样品腔中。此时，透射光使显微样品在电视视场中形成一个较暗的斑纹象。此斑纹象是由于存在双凹形红血细胞所致，如图22所示。

使这个透射照明斑纹象区（比反射照明的和左形光阑面积大6-10倍）数字化（最好用图象技术数字化板），使数字图象的清晰度为512×512象素点阵（用1024×1024点阵会使分析结果更精确），用0至255之间的一个数值代表每个象素的光强度。计算此斑纹象中所有象素值的平均值，将此在0-255之间的值（通常为100-150）作为显微样品“背景光强度（BLI）。

如上所述（见“显微光解细胞攻击过程”部分），（通过移去不透明的滤光器而）使反射照明光路开启一定的时间，以激活细胞显微样品象上反射照明矩形区域中的细胞攻击刺激源。然后关闭反射照明光路。然后在以后的60分钟里（或者直到象中的矩形细胞攻击区域中的完整细胞数为5个或更少）以30秒的间隔将透射显微样品象数字化。

在暴露于细胞攻击刺激源的反射照明矩形区域以后，所曝光的细胞显微样品部分变得更明亮，并且随着时间的过去而逐渐其在透射照明象区的斑纹象越来越暗。这是因为细胞攻击区域中的细胞会失去其中部分或全部的内容，并且其细胞膜会因对细胞攻击刺激源的显微光解响应而失去其结构的完整性。

对矩形（约60×50象素）细胞攻击区域中的象素值进行平均，并且将逐个数字图象中的此象素平均值进行比较60分钟或者此象素平均值提高到一个变化幅度在3分钟内（6个图象）不超过±1%的平稳值。将在60分钟时的透射照明图象或具有矩形细胞攻击区域中象素平均的平稳值的第一个透射照明显微样品图象限定为极大细胞响应图象。对具有极大细胞响应图象的矩形细胞攻击区域中的30个最高的象素值（全部象素的10%）进行平均以确定代表一个不带完整细胞的象区的数字值（此值被称为“总溶解”光强度或TLI）。

将矩形细胞攻击区域中所有象素的平均值确定为每个数字化透射照明显微样品图象的“响应区域光强度（t）”。用下列公式将这些响应区域光强度（RTI（t））值转化为相对响应区域光密应（响应OD（t））：

响应OD（t）＝100（TLI-RLI（t））/（TLI-BLI），其中

TLI为透射照明显微样品图象的细胞攻击区域中总的溶解光强度，BLI为整个透射照明显微样品图象的背景光强度，RTI（t）为随时间而变的透射照明显微样品图象的细胞攻击区域的响应光强度。（TLI-BLE）这个量代表整个透射照明显微样品图象的平均光强度的范围。细胞攻击前矩形区域的零时平均光强度（RLI（O））可以比整个透射照明显微样品区域的平均背景光强度（BLI）更大或更小。这样，零时响应区域OD（O）可以比整个透射照明显微样品区域的100%的光密度范围更大或更小。由于一些完整细胞将保留在极大响应图象的矩形区域，因此极大细胞响应图象（RTI平稳区）中的平均响应区域光强度会比总的溶解光强度（TLI）要小。这样，最小平稳响应区域OD会大于0。

图1和2示出了从人类红血细胞5分钟暴露在三个水平的细胞攻击刺激源（单位为J/cm²）时间的开始，响应区域光密度随时间的变化。245J/cm²的细胞攻击刺激所产生的响应区域OD从零时的105%衰减到开始细胞攻击曝光后46分钟时最小的平稳值18%（图1）。401J/cm²较强的细胞攻击刺激所产生的响应区域OD从102%衰减到开始细胞攻击刺激后31分钟时的6%（图1），而638J/cm²更大的细胞攻击刺激所产生的响应区域OD从零时的91%衰减到开始细胞攻击后37分钟时最小的平稳值3%（图2）。这些数据表明，细胞攻击刺激的改变通过影响OD的最大变化幅度、响应区域OD曲线的斜率以及响应区域OD中至达到最大改变量之半所需时间而改变了与时间相关的响应区域OD曲线。

零时响应区域OD的偏差出现在施加细胞攻击刺激之前，并且它增加了随细胞攻击刺激而产生的随时间而变的响应区域OD曲线的统计偏差。为消除与攻击无关的零时响应区域OD的偏差影响，施行如图3所示的下列三步骤正则化过程，其中：

1）计算极大显微光解响应（MR），该值为零时响应区域OD（ZROD）减去极小平稳响应区域OD（PROD）;即MR＝ZROD-PROD。

2）计算极大响应百分比（MR%），该值为极大显微光解响应的100倍除以零时响应区域OD（ZROD）;即MR%＝（100）（MR）/（ZROD）。

3）将在特定时间t的%响应（%响应（t））定义为：零时响应区域OD（ZROD）减去在时刻t的响应区域OD（ROD（t））所得的量再除以极大显微光解响应（MR），再乘以100所得的值;即%响应（t）＝（100）（ZROD-ROD（t））/MR。

极大响应百分比（MR%）是在暴露于细胞攻击刺激源的矩形区域中最终被破坏的细胞百分数的度量。%响应（t）是暴露于细胞攻击刺激源的矩形区域中的、在时刻t已被破坏的细胞数的度量，并且它被表示为最终被破坏的细胞数的百分比。

如图4中所示，通过将上述的公式用在图1和2中所示的三个响应区域光密度曲线，得到了三个%响应曲线。从上述正则化过程产生了与时间相关的%响应曲线，这些曲线在开始从细胞攻击刺激以后从0%变到100%，而与零时响应区域OD（图3中的ZROD）的偏差无关。这些正则化的数据表示，细胞攻击刺激的变化通过将曲线的极大斜率和时间改变至曲线的半极大（50%）值而改变了随时间而变的%响应曲线。

此外，图5重复了图4中245J/cm²细胞攻击刺激的%响应曲线（空心圆），使细胞对特定水平的细胞攻击刺激精确地定量化，其中定义：

1）响应半时间（T_1/2）为从开始细胞攻击到达到50%响应值的时刻所经历的时间，并且

2）%响应曲线的最大斜率为t＝T_1/2时刻的斜率。

T_1/2为细胞对由细胞攻击刺激源所引起的破裂的平均阻力。最大斜率为开始细胞攻击刺激以后任何时刻最快的细胞破裂率的量度。此斜率提供了个别细胞对由细胞攻击刺激所引起的破裂的阻力的“总体”偏差的一个指数。例如，均匀细胞（每个细胞的抗细胞破裂阻力都与其它细胞相同）的总体的%响应曲线呈“阶梯形”，在t＝T_1/2以前响应值为0，而当t＝T_1/2时响应值一下成为100%。相反，非常不均匀的细胞（其中一些细胞的抗破裂阻力非常低，一些非常高，而一些细胞的阻力介于非常低和非常高之间）的总体的%响应曲线在刚刚开始细胞攻击刺激以后的斜率非常小，并且在T_1/2值以后较远的一个时刻该斜率值会达到100%。

可以从几种途径得到t＝T_1/2时刻%响应曲线的斜率。比如，%响应曲线的曲线拟合多项式在t＝T_1/2时的一阶导数值就给出了t＝T_1/2时%响应曲线的斜率值。下面给出了一种计算t＝T_1/2时%响应曲线的简单的方法：

1）定义T70为开始细胞攻击到%响应等于70%时所经历的时间（分钟）。

2）定义T30为开始细胞攻击到%响应等于30%时所经历的时间（分钟）。

3）在T_1/2时的斜率定义为（70%-30%）所得的值除以（T70-T30），单位为每分钟响应值的变化%（可简化为%/分）;即在T_1/2时的斜率（%/分）＝（70-30）/（T70-T30）。

这个简单的方法相当准确，因为所有的%响应曲线的坐标值在0%-100%的范围之间，并且所有的%响应曲线在30%-70%的范围之间都近乎线性，如图5中的例子所示。

动物细胞的显微光解

图6是从4个兔采集红血细胞后第1天的7小时（圆形）、第2天（方形）、第3天（三角形）、第4天（钻石形）和第5天（倒置的三角形）的显微光解的%响应曲线（平均值±SEM）图，显微样品组分中红血细胞的浓度为4%，FITC-葡聚糖的浓度为2mg/ml（150000道尔顿）。对所有的曲线，细胞攻击刺激者是210J/cm²。当从兔体采血以后从7小时至5天之间对细胞显微样品进行显微光解时，所有的%响应曲线都彼此相同。当从兔体采血以后在最初的6小时之间对细胞显微样品进行显微光解时，%响应曲线变化的形式是持续偏向左边。

图7是表示对兔（N＝3）红血细胞的细胞攻击刺激效果的%响应曲线（平均值±SEM）图，刺激强度分别为105焦耳/cm²（空心方形）、126焦耳/cm²（实心方形）、159焦耳/cm²（空心三角形）、168焦耳/cm²（实心三角形）、210焦耳/cm²（空心钻石形）以及210焦耳/cm²（实心钻石形），显微样品组分中红血细胞的浓度为4%，FITC-葡聚糖的浓度为2mg/ml（150000道尔顿）。空心标志的细胞攻击刺激是通过较低的反射照明光能量密度的反射光曝光10分钟而实现的，而实心标志的细胞攻击刺激是通过较高的反射照明光能量密度的反射光曝光8分钟而实现的。较低反射照明光功率在较长的反射照明曝光时间（空心标志）的%响应曲线与提供等量的细胞攻击刺激的同样的能量密度的、较高反射照明光功率在较短的反射照明曝光时间（空心标志）的%响应曲线完全相同。只要曝光的持续时间不短于4分钟，此发现对任何能量密度都是正确的。从图7中还可见，不同细胞攻击刺激水平的%响应曲线的斜率和T_1/2值是不同的。对显微样品不同的FITC-葡聚糖浓度而言，当FITC-葡聚糖浓度低于临界值2.0mg/ml时，兔红血细胞的%响应曲线也是不同的。

图8是显微样品中含有3%（圆形）、4%（三角形）及5%（方形）浓度的兔（N＝4）红血细胞的显微光解的%响应曲线（平均值±SEM）图。样品中FITC-葡聚糖的浓度为2mg/ml（150000道尔顿），所接受的细胞攻击刺激为210J/cm²。兔红血细胞的%响应曲线对处于3-5%范围之内的不同的显微样品细胞浓度而言基本相同，这表明细胞浓度适中的变化不会改变细胞对由光激活细胞攻击所引起的破裂的阻力的显微光解测量值。

图9是已从全血中分离出来的兔（N＝3）红血细胞（圆形）以及含有血浆和其它细胞（如血小板或白血细胞）的红血细胞（三角形）的显微光解的%响应曲线（平均值±SEM）图。显微样品组分中红血细胞的浓度为4%，FITC-葡聚糖的浓度为2mg/ml（150000道尔顿）。这些数据表明，兔红血细胞的%响应曲线不受显微样品中所存在的红血将或其他血细胞（如白血细胞）的影响。这样，可对整个血样品进行显微光解分析，而不需仔细分离红血细胞。

图10是在第5天（圆形）、在已用缓冲溶液及FITC-葡聚糖清洗和重构红血细胞之后第5天（钻石形）以及在已用缓冲溶液（但不用FITC-葡聚糖）清洗和重构红血细胞之后第5天（方形）兔（N＝4）红血细胞的显微光解的%响应曲线（平均值±SEM）图。显微样品的组分中FITC-葡聚糖的浓度为2mg/ml（150000道尔顿），红血细胞的浓度为4%，其余的为缓冲溶液，细胞攻击刺激为198J/cm²。在第5天清洗和重构（不用FITC-葡聚糖）的细胞当暴露于光激活环境时不会发生溶血。在第5天，用原始的FITC-葡聚糖缓冲溶液重构的、被清洗后的细胞的显微光解响应与未清洗的细胞相同，这表明清洗后的细胞仍有响应性，但仅在有FITC-葡聚糖时如此。这样，图10中表明，样品中有FITC对显微光解过程是必要条件，而在此方法中其他因素（如从光源中发出的热量）不会诱发溶血。FITC-葡聚糖（150000道尔顿）为一种大分子量中性葡聚糖，即使在非炎性条件下，它也不会越过上皮沟。由于清洗后的细胞没有响应性，图10中的数据表明显微光解响应不是非特异性光与一种胞内或甚至是膜内结合药物相互作用的结果。用FITC-葡聚糖作为细胞攻击剂的显微光解过程一定伴随着细胞膜外部环境及其对细胞膜的影响这种相互作用而发生。

图11是已用带葡萄糖和白蛋白的标准缓冲溶液（方形）、带葡萄糖但不带白蛋白的缓冲溶液（实心钻石形）、含白蛋白但不含葡萄糖的缓冲溶液以及不带处理过的兔（N＝4）红血细胞的显微光解的%响应曲线（平均值±SEM）图。所有的显微样品含有2mg/ml的FITC-葡聚糖（150000道尔顿）和4%浓度的红血细胞，并且暴露在180J/cm²（左边）和90J/cm²（右边）的细胞攻击刺激条件下。兔红血细胞的%响应曲线并不因从细胞显微样品中去除清蛋白而改变。根据科学文献的记载，去除清蛋白改变了红血细胞的形状。这样，这些数据表明，用显微光解过程可以测量那些仅依赖细胞于形状的特性之外的细胞特性。%响应曲线偏向左边反映出当从细胞显微样品中除去葡萄糖时细胞对标准化的细胞攻击刺激的灵敏度更高。当没有葡萄糖时（如图10中的左边所示），细胞甚至非常易于受非常低的细胞攻击刺激的影响（表现为斜率增大，T_1/2降低）。根据科学文献的记载，细胞需要葡萄糖以维持其ATP（三磷酸腺苷）水平，并且ATP为细胞代谢以维持细胞膜的完整性所必需。这样，这些数据表明用显微光解过程可检测细胞膜完整性的降低。

图12是对先前已用浓度为5.0μM（钻石形）、0.5mM（方形）、0.05mM（圆形）或0.00mM（实心三角形）的二酰胺培养1小时的、用180焦耳/cm²（左半边）及90焦耳/cm²（右半边）的细胞攻击刺激强度刺激的兔（N＝6）红血细胞的显微光解的%响应曲线（平均值±SEM）图，所述的显微样品含有2mg/ml的FITC-葡聚糖（150000道尔顿）、标准缓冲溶液和和4%浓度的红血细胞。兔红血细胞的%响应曲线偏向左边反映出当显微样品含有先前已用二酰胺培养1小时的细胞时细胞对标准化的细胞攻击刺激的灵敏度更高。图11的左半边表明，这些用二酰胺培养过的细胞更易于受非常低的细胞攻击刺激的影响（斜率增大，T_1/2减小）。根据科学文献的记载，二酰胺是一种能使细胞膜内蛋白质中的巯基氧化从而提高spectrin（它可以干扰细胞膜的蛋白质层破坏细胞膜完整性）的交联水平的药物。这样，这些数据表明，用显微光解过程能够检测由对细胞膜的蛋白质层的干扰所致的细胞脆性的提高。

图13是对先前已用浓度为100毫摩尔（圆形）、30μM（钻石形）、10μM（方形）以及0μM（实心三角形）的氯丙嗪培养20分钟的、用180焦耳/cm²（左半边）及90焦耳/cm²（右半边）的细胞攻击刺激强度刺激过的兔（N＝5）红血细胞的显微光解的%响应曲线（平均值±SEM）图，所述的显微样品含有2mg/ml的FITC-葡聚糖（15000道尔顿）、标准缓冲溶液和和4%浓度的红血细胞。兔红血细胞的%响应曲线偏向左边反映出当显微样品含有先前已用氯丙嗪培养20分钟的细胞时细胞对标准化的细胞攻击刺激的灵敏度更高。图12的左半边表明，这些用氯丙嗪培养过的细胞同样更易于受非常低的细胞攻击刺激的影响（减小，但斜率不变）。根据科学文献的记载，对此处所用的浓度而言，氯丙嗪的作用主要是通过氯丙嗪改变细胞膜内脂双分子层的排列的（对细胞膜内蛋白质层的作用较弱）作用而形成口腔细胞。这样，这些数据表明，用显微光解过程能够检测由对细胞膜的脂层的干扰所致的细胞脆性的提高。

图14是对先前已用浓度为0.02%（带间断线的圆形）、0.01%（钻石形）、0.005%（三角形），0.0025%（带间断线的方形）、0.00125%（圆形）以及0.000%（实心三角形）的戊二醛培养1小时的兔（N＝6）细胞显微样品的显微光解的%响应曲线（平均值±SEM）图，所述的显微样品含有2mg/ml的FITC-葡聚糖（150000道尔顿）、标准缓冲溶液和和4%浓度的红血细胞细胞攻击刺激为180J/cm²。兔红血细胞的%响应曲线偏向左边并且T_1/2提高斜率降低反映出当显微样品含有先前已用0.01%或更高浓度的戊二醛培养1小时的细胞时细胞对标准化的细胞攻击刺激的灵敏度更低。根据科学文献的记载，戊二醛降低膜的脆性（细胞较为不易破裂）和提高膜的刚性（细胞较为不易变形）。氯丙嗪更易提高膜的脆性（使膜易于破裂），而没有报道说膜的刚性有任何变化（变形性没有改变）。二酰胺可提高膜的脆性（使细胞更易破裂）和提高膜的刚性（细胞较为不易变形）。这样，比较如图12、13和14中所示的这三种试剂的效果表明，用显微光解过程可测量细胞膜脆性（而不仅仅是细胞膜刚性）的变化，并且用显微光解过程可膜的脆性的改变是由于脂层的改变还是由于蛋白质层的改变所致。

注射strepticin的实验室鼠是症状为血糖升高（高血糖）和葡萄糖流失进尿液中的人类胰岛素依赖型糖尿病的广泛使用的动物模型。通过饮食进行控制的实验室鼠是人类血胆甾醇过多的一个公知的动物模型。图15为表示红血细胞显微光解的%响应曲线的极大响应百分比（MR%）以及T_1/2和斜率的条线图，所述的细胞取自5个照射强度为248±3.6J/cm²的正常的对照S prague-Dawley实验室鼠（C）、3个照射强度为245±4.1J/cm²的患由链脲佐菌素诱发的胰岛素依赖型糖尿病的S prague-Dawley鼠（D），以及6个照射强度为249±2.7J/cm²的患由饮食诱发的高胆甾醇血鼠（H）。所有的细胞显微样品含有4mg/ml的FITC-葡聚糖（20000道尔顿）、标准缓冲溶液和3%浓度的红血细胞。从正常鼠、糖尿病鼠和高胆甾醇血鼠采集的红血细胞的%响应曲线中对显微光解过程的极大响应彼此相似。从高胆甾醇血鼠采集的红血细胞具有正常的T_1/2和斜率值。从糖尿病鼠采集的细胞具有显著变长的和较小的斜率值，表明糖尿病动物的细胞膜脆性显著降低。这些数据表明，用显微光解过程可以检测那些改变细胞膜中离子泵（如钙泵）的疾病（如糖尿病）。

人类细胞的显微光解

图16为表示浓度为0.5%-3.0%的人类（N＝3）红血细胞显微光解的%响应曲线的极大响应百分比（MR%）以及T_1/2和斜率的条线图，所述的细胞样品中含有4mg/ml的FITC-葡聚糖（20000道尔顿）。对所有的5个细胞浓度，一个主体接受549±0.3J/cm²的细胞攻击刺激，第二个接受340±1.1J/cm²的细胞攻击刺激，第三个接受198±1.3J/cm²的细胞攻击刺激。如图16中所示，人体红血细胞的显微光解所给出的结果表明，当显微样品的细胞浓度在1.0%-3.0%范围之间时，所得到的%极大响应相同;细胞浓度在0.5%-2.0%范围之间时，T_1/2相同;细胞浓度在0.5%-3.0%之间时，%响应曲线斜率相同。如图8中所示，当显微样品的细胞浓度在3%-5%之间时，兔红血细胞的显微光解的%响应曲线相同。这些数据说明，对动物和人而言，显微光解过程对处于特定（但不同）的浓度范围之内的细胞浓度的变化较不敏感。

根据科学文献的记载，pentoxifylline（一种在几种人类病状中可提高外周血的流动水平的治疗药剂）提高了细胞膜的“柔性”，使红血细胞较易通过血管;然而，pentoxifylline不仅仅能改变细胞膜的刚性（细胞的变形性）。图17为表示人类（N＝5）细胞显微样品的显微光解的%响应曲线的极大响应百分比（MR%）以及T_1/2和斜率的条线图，所述的显微样品中含有4mg/ml的FITC-葡聚糖（20000道尔顿）和1%浓度的红血细胞，所述的红血细胞先前已用浓度为10mM（实心条）、1mM（条纹条）以及0mM（清晰条）的pentoxifylline（PTFX）在4℃下培养1小时。对所有的3个pentoxifylline浓度，一个主体接受658±6.6J/cm²的细胞攻击刺激，三个主体接受329±1.9J/cm²的细胞攻击刺激，并且一个主体接受196±0.7J/cm²的细胞攻击刺激。图18为表示人类（N＝5）细胞显微样品的显微光解的%响应曲线的极大响应百分比（MR%）以及T_1/2和斜率的条线图，所述的显微样品中含有4mg/ml的FITC-葡聚糖（20000道尔顿）和1%浓度的红血细胞。所述的红血细胞先前已在4℃下用浓度为10mM（实心条）、1mM（条纹条）以及0mM（清晰条）的pentoxifylline（PTFX）培养24小时。对所有的3个pentoxifylline浓度，一个主体接受641±3.3J/cm²的细胞攻击刺激，三个主体接受330±1.7/cm²的细胞攻击刺激，并且一个主体接受205±0.7J/cm²的细胞攻击刺激。用pentoxifylline培养人类红血细胞1小时会改变那些细胞的显微光解响应。如图17中所示，随着pentoxifylline浓度的增加，%极大响应持续（依赖剂量而）降低，显微光解的%响应曲线的T_1/2增加，而斜率减小。如图18中所示，用pentoxifylline培养红血细胞24小时后，%极大响应的减小消失了，斜率的减小部分消失，但T_1/2依赖于剂量的增加依然存在。这些数据表明，显微光解过程对人类细胞膜药物诱发的改变很敏感，并且用显微光解法可以根据药物治疗后的时间函数鉴别药物治疗过的和未经药和的治疗的细胞。

图19为取自没有出现镰刀细胞疾病临床标志的4个女性和3个男性非洲-美洲人的红血细胞显微光解的%响应曲线的极大响应百分比（MR%）以及T_1/2和斜率的条线图，细胞刺激强度分别为A＝243±2.9J/cm²（清晰条）、B＝400±3.6J/cm²（条纹条）、C＝642±4.0J/cm²（实心条），细胞显微样品中含有4mg/ml的FITC-葡聚糖（20000道尔顿）、3%浓度的红血细胞和缓冲溶液。图20为取自出现镰刀细胞疾病临床标志但没有出现F血红蛋白异常临床标志的4个女性和3个男性非洲-美洲人的红血细胞显微光解的%响应曲线的极大响应百分比（MR%）以及T_1/2和斜率的条线图，细胞刺激强度分别为A＝247±1.1J/cm²（清晰条）、B＝395±4.0J/cm²（条纹条）、C＝643±4.0J/cm²（实心条），细胞显微样品中含有4mg/ml的FITC-葡聚糖（20000道尔顿）、3%浓度的红血细胞和缓冲溶液。如图19的左边中所示的未患镰刀细胞病的正常的人类红血细胞当暴露在强度在240J/cm²-660J/cm²这样一个很宽的范围的细胞攻击刺激以后，最终的破裂率为88-95%（百分比极大响应，MR%）。如图19中所示，当细胞攻击刺激增大时，这些正常的人类细胞的显微光解响应曲线的T_1/2持续减小，而斜率持续增大。与此相反，比较图20与图19时显然会发现，患镰刀细胞病的人类红血细胞的%极大响应大大降低（在中间的细胞攻击刺激水平处有一个峰），T_1/2（不是细胞攻击刺激水平的函数）显著提高，并且斜率大大降低这些数据表明，显微光解过程对人类细胞膜的病理学变化很敏感，并且显微光解可提供检测改变了细胞的人类疾病的多个参数。

图21为取自出现镰刀细胞疾病临床标志和F血红蛋白异常临床标志的1个女性和1个男性非洲-美洲人的红血细胞显微光解的%响应曲线的极大响应百分比（MR%）以及T_1/2和斜率的条线图，细胞刺激强度分别为A＝253±2.8J/cm²（清晰条）、B＝399±4.6J/cm²（条纹条）、C＝661±2.1J/cm²（实心条）。细胞显微样品中含有4mg/ml的FITC-葡聚糖（20000道尔顿）、3%浓度的红血细胞和缓冲溶液。比较图21和图19时显然会发现，同时患镰刀细胞病和血红蛋白F异常症的人的红血细胞会出现正常的%极大响应，异常高的T_1/2并且在较低的细胞攻击刺激处的斜率正常，但在较高的细胞攻击刺激处的斜率出现降低。这些数据表明，显微光解过程对血细胞膜的合并的病理学变化很敏感。这些数据同样表明，可以用显微光解过程的多个参数来区分如图19中所示的正常人类细胞和如图20中所示的由单一疾病改变的细胞，并且可以区分如图21中所示的多种异常所致的那两种情况。

上面详细的叙述主要是为便于理解，本身并不构成不必要的限制，因为对本领域普通技术人员而言，显然可以根据更新的公开内容并且在不背离本发明的精神和所附的权利要求保护范围的前提下，内容作出改进。

Claims (39)

1、一种测量细胞膜强度的方法，包括的步骤如下：

将膜强度待测的试验细胞悬浮在渗透压选定在约200-约400毫渗透压摩尔范围之间的生理盐水溶液中，形成一种含有细胞的溶液；

将一种不活泼的细胞攻击化学试剂加入到所述的含有细胞的溶液中，所述的不活泼的细胞攻击化学试剂包括吸收波长在约300-约900nm范围之间的辐射能的分子以从中产生高度活泼的缺乏电子的原子，形成一种对辐射能敏感的溶液；

确定一个含有所述的对辐射能敏感的溶液的显微样品的局域化的显微区域；

将一束选定波长在约300-约900nm范围之间的聚焦的第一辐射能投射到所述的对辐射能敏感的溶液的所述的显微样品上，将所述的对辐射能敏感的溶液中的所述的细胞对所述的辐射能量曝光一个选定的时间段，以确定在任何时刻在所述的显微样品的所述的局域化的显微区域中的细胞膜完整的细胞数；

测定在所述的局域化的显微区域中的细胞膜完整的细胞数；

在一个选定的时间间隔中的一个选定的时刻施加一束能量为在约300-约900nm之间、与所述的第一辐射能不同的一个选定的不同波长的第二辐射能，所述的第二辐射能光活化了所述的细胞攻击剂，从所述的细胞攻击剂中产生了高度反应性的缺乏电子的原子，构成一种细胞反应介质；

使在所述的细胞反应介质中的所述的高度反应性的缺乏电子的原子与在所述的局域化的显微区域中的所述的试验细胞进行反应，

从而破坏了所述的试验细胞的细胞膜，允许所述的细胞中的成分流失，并且通过所述的局域化的显微区域中的所述的试验细胞而改变了其对所述的第一辐射能的吸收；并且

通过将用于破坏暴露在所述的细胞反应介质后的所述的显微样品中的所述细胞的所述的细胞膜所述的第一辐射能的量与在施加所述的第二辐射能之前施加的所述的第一辐射能的量进行比较而定量分析所述的细胞膜的强度，并且在选定的时间段处确定在所述的局域化的显微区域中的完整的细胞数。

2、如权利要求1所述的测量细胞膜强度的方法，其中所述的分析步骤包括将起始的细胞数与被破坏的细胞数的极大值进行比较，确定达到被破坏的细胞数的极大值的1/2破坏程度所需时间，以及确定在所述的选定的时间段之间细胞破坏的最大比。

3、如权利要求1所述的测量细胞膜强度的方法，其中所述的分析步骤包括将起始的细胞数与被破坏的细胞数的极大值进行比较，确定达到被破坏的细胞数的极大值的1/2破坏程度所需时间，以及确定细胞破坏的最大比。

4、如权利要求1所述的测量细胞膜强度的方法，包括从由红细胞、白细胞、血小板或其混合物组成的一组细胞中选择所述的试验细胞的步骤。

5、如权利要求1所述的测量细胞膜强度的方法，包括将膜强度待测的试验细胞悬浮在渗透摩尔选定在约200-约400毫渗透压摩尔范围之间的生理盐水溶液中，形成一种含有细胞的溶液。

6、如权利要求1所述的测量细胞膜强度的方法，包括在从约1分钟至约60分钟的时间段内施加所述的聚焦的第一辐射能的步骤。

7、如权利要求1所述的测量细胞膜强度的方法，包括在从约1分钟至约10分钟的时间段内施加所述的聚焦的第一辐射能的步骤。

8、如权利要求1所述的测量细胞膜强度的方法，包括在60分钟期间或直到在所述的局域化的显微区域之中只有5个或更少的完整细胞按照约1秒钟至约1分钟的时间间隔内施加所述的聚焦的第一辐射能的步骤。

9、如权利要求1所述的测量细胞膜强度的方法，包括制备约25μl的对所述的辐射能敏感的溶液的显微样品。

10、如权利要求1所述的测量细胞膜强度的方法，包括施加一束波长在约300-约900nm范围之内的一个选定的不同的波长的、聚焦的第二辐射能，用来光活化所述的不活泼的细胞攻击剂，根据所选定的特定的不活泼的细胞攻击剂的情况，在约1秒钟至约10分钟的时间内从在所述的对辐射能敏感的溶液中的所述的细胞攻击剂中产生所述的高度反应性的缺乏电子的原子。

11、如权利要求1所述的测量细胞膜强度的方法，包括将一种不活泼的细胞攻击化学试剂加入到所述的含有细胞的溶液中，所述的不活泼的细胞攻击化学试剂包括吸收波长在约300-约900nm范围之间辐射能的分子以从中产生高度不活泼的缺乏电子的原子，形成一种对辐射能敏感的溶液，还包括选择所述的对待分析类型的细胞特异的细胞攻击剂的步骤。

12、如权利要求1所述的测量细胞膜强度的方法，包括将一种不活泼的细胞攻击化学试剂加入到所述的含有细胞的溶液中，所述的不活泼的细胞攻击化学试剂包括吸收波长在约300-约900nm范围之间辐射能的分子以从中产生高度不活泼的缺乏电子的原子，形成一种对辐射能敏感的溶液，还包括从由焰红染料B、曙红-异硫氰酸盐、脱镁叶绿甲酯一酸、原卟啉、荧光素异硫氰酸盐、荧光素异硫氰酸盐葡聚糖及其混合物所组成的一组物质中选择所述的细胞攻击剂的步骤。

13、如权利要求1所述的测量细胞膜强度的方法，还包括将一种试验药物加入到所述的含有细胞的溶液的步骤。

14、如权利要求1所述的测量细胞膜强度的方法，包括将从由戊二醛、葡萄糖、清蛋白、氯丙嗪、二酰胺、葡萄糖、清蛋白以及pentoxyifylline组成的一组物质中所选择的一种试验药物加入到所述的含有细胞的溶液的步骤。

15、如权利要求1所述的测量细胞膜强度的方法，还包括将一种胞内结合的特异的试验药物加入到所述的含有细胞的溶液的步骤。

16、如权利要求1所述的测量细胞膜强度的方法，还包括以下步骤：将二酰胺加入到所述的含有细胞的溶液中以氧化细胞膜中蛋白质的巯基，提高可干扰细胞膜的蛋白质层的spectrin的交联程度，以便通过提高膜的脆性和膜的刚性来破坏细胞膜的完整性。

17、如权利要求1所述的测量细胞膜强度的方法，还包括以下步骤：将氯丙嗪加入到所述的含有细胞的溶液中以产生stomatocyte并且改变所述的细胞膜的脂双层质，以便通过提高膜的脆性但使所述的细胞膜的刚性不受任何改变的方式来破坏细胞膜的完整性。

18、如权利要求1所述的测量细胞膜强度的方法，还包括将戊二醛加入到所述的含有细胞的溶液中以降低所述的细胞膜的脆性并提高膜的刚性的步骤。

19、如权利要求14所述的测量细胞膜强度的方法，还包括以下步骤：比较将从由戊二醛、氯丙嗪、二酰胺、葡萄糖、清蛋白以及pentoxyifylline组成的一种物质中所选择的至少一种试验药物加入到所述的含有细胞的溶液的效果，以测量细胞膜脆性而不是仅仅测量细胞膜刚性的变化，并且区别所述的细胞膜脆性的变化是由脂层改变引起的还是由蛋白层改变所引起的。

20、如权利要求8所述的测量细胞膜强度的方法，还包括将人类红血细胞选定为所述的试验细胞并且将所述的选定的红血细胞与对照细胞进行比较，以便通过由反映疾病所致的细胞膜的完整性的细胞响应曲线的变化而检测糖尿病的步骤。

21、如权利要求3所述的测量细胞膜强度的方法，还包括以下步骤：检测药物诱发的人类细胞膜的变化，并且通过将已知量的所述的药物加入到未经治疗的细胞中以考察进行药物治疗后效果与时间的函数关系并且通过将其与另一种试验药物pentoxifylline的治疗效果进行比较以区别药物治疗过的及未经药物治疗的人类细胞，所述的pentoxifylline是一种治疗试剂，它可以提高外周血的流动水平并且提高细胞膜的“柔性”，使红血细胞较易通过血管。

22、如权利要求2所述的测量细胞膜强度的方法，还包括以下步骤：通过用已知量的所述的ATP（三磷酸腺苷）处理含有细胞的溶液并且将未经处理的含有细胞的溶液中的细胞膜的完整性与经过处理的含有细胞的溶液中人类红血细胞的细胞膜的完整性进行比较的方式，测定ATP在含有细胞的溶液中的细胞的细胞膜中的含量。

23、如权利要求3所述的测量细胞膜强度的方法，还包括以下步骤：选定人类红血细胞为所述的试验细胞，并且将所述的选定的红血细胞与对照人类血细胞进行比较，以通过由于疾病所致的细胞膜完整性的变化引起的细胞响应曲线上的变化而检测镰刀形细胞贫血病。

24、如权利要求3所述的测量细胞膜强度的方法，还包括以下步骤：选定人类红血细胞为所述的试验细胞，并且将所述的选定的红血细胞与对照人类血细胞进行比较，以通过由病理学疾病所致的细胞膜完整性的变化而引起的细胞响应曲线的变化检测病理变化。

25、如权利要求2所述的测量细胞膜强度的方法，还包括以下步骤：选定人类红血细胞为所述的试验细胞，并且将所述的选定的红血细胞与对照人类血细胞进行比较，以便区分正常人类细胞和由单一疾病所改变的细胞，并且将所述的正常人类细胞和所述的由单一疾病所改变的细胞从由多种疾病所改变的细胞区别开。

26、如权利要求1所述的测量细胞膜强度的方法，包括以下步骤：将一种不活泼的细胞攻击化学试剂加入到所述的含有细胞的溶液中，所述的不活泼的细胞攻击化学试剂包括吸收波长在约300-约900nm范围之间辐射能的分子以从中产生高度不活泼的缺乏电子的原子，形成一种对辐射能敏感的溶液，还包括将一种特定的荧光色素选定为对一种特定类型细胞的所述的细胞攻击剂。

27、如权利要求1所述的测量细胞膜强度的方法，包括改变所述的含有细胞的溶液的所述的渗透性的步骤。

28、如权利要求1所述的测量细胞膜强度的方法，包括悬浮在所述的含有细胞的溶液中的所述的细胞浓度的步骤。

29、如权利要求2所述的测量细胞膜强度的方法，包括以下步骤：施加所述的第二辐射能以使带有正常细胞膜和进行正常代谢的未经处理的正常细胞发生一定形式的变化，并且将所述的未经处理的正常细胞的膜强度与已经暴露在一种化学试剂这种方式进行处理的细胞膜的强度进行比较

30、如权利要求29所述的测量细胞膜强度的方法，包括加入一种可改变细胞膜的（包括麻醉剂）的试剂、pentoxifylline、二酰胺、戊二醛和氯丙嗪的步骤。

31、如权利要求29所述的测量细胞膜强度的方法，包括加入一种可改变细胞膜的、对环境有害的试剂（包括一种重金属）的步骤。

32、如权利要求29所述的测量细胞膜强度的方法，包括加入一种可改变细胞膜的生物试剂的步骤，所述的试剂包括一种病毒、一种细胞、一种激素或一种酶。

33、如权利要求32所述的测量细胞膜强度的方法，包括加入一种可改变细胞膜的、可引起疾病（包括糖尿病、高血压、贫血、脓毒症以及一种改变免疫体系的疾病）的生物试剂的步骤。

34、如权利要求1所述的测量细胞膜强度的方法，还包括加入一种胞内结合的对所述的含有细胞的溶液特异的试验药物的步骤。

35、如权利要求1所述的测量细胞膜强度的方法，还包括加入一种胞外结合的对所述的含有细胞的溶液特异的试验药物的步骤。

36、如权利要求1所述的测量细胞膜强度的方法，还包括以下步骤：在一个有盖的盛器内制备约25μl的所述的对辐射能量敏感的溶液的显微样品，并且在所述的盛器内靠近所述的显微样品处放置至少一个用水饱和的芯，以防止所述的对辐射能量敏感的溶液的所述的显微样品脱水。

37、如权利要求1所述的测量细胞膜强度的方法，包括做出一条细胞响应曲线，所述的曲线反映了在细胞强度测量的所述选定的时间段内至少4次不同的定量的细胞膜完整性的测量结果。

38、一种测量细胞膜强度的方法，包括以下步骤：

分离细胞膜强度待测的试验细胞;

将所述的试验细胞悬浮在渗透压选定在约200-约400毫渗透摩尔范围之间的生理盐水溶液中，形成一种含有细胞的溶液;

将一种不活泼的细胞攻击化学试剂加入到所述的含有细胞的溶液中，所述的不活泼的细胞攻击化学试剂包括吸收波长在约300-约900nm范围之间的辐射能的分子以从中产生高度不活泼的缺乏电子的原子，形成一种对辐射能敏感的溶液;

在一个局域化的显微区域内制备所述的对所述的辐射能敏感的、含有所述细胞的溶液的一个显微样品;

将一束选定波长在约300-约900nm范围之间的聚焦的第一辐射能投射到所述的对辐射能敏感的溶液的细胞上，以确定在任何时刻在所述的显微样品的所述的局域化的显微区域中的细胞膜完整的细胞数;

测定在所述的显微样品的所述的局域化显微区域中细胞膜完整的细胞数;

在一个选定的时间间隔中的一个选定的时刻施加一束能量为在约300-约900nm之间、与所述的第一辐射能不同的一个选定的不同波长的第二辐射能，所述的第二辐射能光活化了所述的细胞攻击剂，从所述的对辐射能敏感的溶液中的所述的细胞攻击荧光色素试剂中产生了高度反应性的缺乏电子的原子;

使在所述的细胞攻击荧光色素试剂中的所述的高度反应性的缺乏电子的原子与在所述的局域化的显微区域中的所述的试验细胞进行反应，从而破坏了所述的试验细胞的细胞膜，允许所述的细胞中的成分流失，并且改变了细胞对所述的第一辐射能的吸收;

通过将所述的局域化显微区域中对所述的聚焦的第二辐射能曝光一个选定的时间段后的所述的细胞所吸收的所述的聚焦的第一辐射能量与施加所述的聚焦的第二辐射能之前、之中和之后所吸收的所述的聚焦的第一辐射能量进行比较而定量分析所述的细胞膜的强度;并且

将开始时的细胞数与被破坏的细胞数的极大值进行比较，确定达到被破坏的细胞数的极大值的1/2所需的时间以及破裂细胞的极大比值，并且做出一条反映至少4次细胞膜完整性的不同的定量的测量结果的细胞响应曲线。

39、如权利要求2所述的测量细胞膜强度的方法，还包括以下步骤;通过用已知量的所述的葡萄糖进行处理而测定在含有细胞的溶液中的细胞的细胞膜中葡萄糖的含量，并且将未经处理的含有细胞的溶液中的细胞的膜的完整性与经过处理的含有细胞的溶液中人类红血细胞的膜的完整性进行比较。

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