JP3579424B2 - 定常状態でのルミネセンスの存続時間による分析物の検出 - Google Patents

定常状態でのルミネセンスの存続時間による分析物の検出 Download PDF

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Description

発明の背景
分子状の酸素は動物の細胞機能に必要不可欠であるが、一方、O2からの保護が、例えばニトロゲナーゼのような植物酵素の機能には必要となる。動物、特に哺乳類は、生命維持の過程においてO2の持続的供給と利用に完全に依存している。このことは、特に、高度にO2を消費する組織、例えば神経組織および筋肉（横紋筋および平滑筋ともに）について言える。これら組織への酸素供給の妨害は、数分という短い時間でも細胞死および器官機能に必要な機能の損失をもたらす。さらにまた、細胞の機能を究極的に支援するのは、血液や他の体液中の酸素濃度よりはむしろ組織内の酵素濃度である。したがって、体液および組織の酸素濃度の測定は、数例を挙げれば、血管性疾患（例えば動脈硬化症）、糖尿病、鎌状細胞症および創傷治癒障害の患者で見出される組織への酸素供給の障害に関して、臨床的に極めて重要である。したがって、血液および体液の酸素濃度を測定する方法並びに装置について多くの特許が発行され、さらに本発明者らの生体系内での組織の酸素濃度の最初の測定に関する米国特許5,186,173号（以下、ザッカーマン（Zuckerman）'173特許）が発行されたことは，驚くに当たらない。
これらの特許は、各々が体液または組織のPO2の非侵襲的測定に伴う問題を強調しているが、臨床で広く利用されることを妨げてきた欠陥をも有している。非侵襲的測定の要求を達成するために、最近の特許は光学的方法に変ったが、これらの方法は、酸素分子による色素の燐光または蛍光（フルオレセンス）の消滅を伴う。
例えば、米国特許4,476,870号（Petersonら）は、ペリレン（perylene）のような蛍光性物質がカテーテル内に封入されたカテーテル構造物を開発した。このカテーテルは血管に挿入され、血中のO2による蛍光消滅が光学繊維を用いて測定できる。この装置は体液または血液のPO2の測定を可能にしたが、次の２つの欠陥を有する。第１に、血液のPO2は、血管内に挿入する前にカテーテルプローブが外部で目盛設定された後に初めて正確に測定できる。第２に、この技術は、PO2が単一部位、すなわちプローブの先端で測定されるので、局所解剖学的情報を提供できない。
米国特許4,810,655号では、カーリル（Khalil）らが、燐光の強度の代わりにその存続時間を測定することによって、使用の度に事前にカテーテルの目盛を設定する必要性は克服されたと主張する。理論的には、直接の存続時間系では事前の目盛設定の必要性を克服したはずであるが、実際には、カーリルらの特許の表４に示されたように、用いられたポルフィリンの燐光存続時間は光に曝すとともに変化し、使用前の目盛設定は依然として必要であった。さらに、時間分析する直接存続時間系（time−resolved direct lifetime system）では実施に手間がかかり、定常状態方式より正確さは低い。
バンダークーイとウィルソン（米国特許4,947,850号）は、O2感受性プローブ物質（例えばアルブミンに強固に結合させた金属ポルフィン）の燐光存続時間の測定に基づく方法を開発した。この物質はミリ秒（10-3秒）の時間単位で燐光を発し、さらにその燐光存続時間は酸素分子によって減少（消光）する。このO2感受性プローブは、血中に注入することが可能な（したがって画像化される組織の血管構造内の血液中PO2の局所的測定が可能になる）燐光を発する分子である。しかしながら、バンダークーイが記載した他のプローブと同様に、金属ポルフィリンの自家消光のために、これらプローブ分子の単独では用いることができない。すなわち、自家消光は、プローブ濃度依存性の崩壊時間に対して変化を生じ、これは分子状の酸素によって誘発されるものよりもはるかに大きい。注射部位での漏れ、および種々の動物またはヒトでの血液容量の違いのために、血中の正確なプローブ濃度を知ることは不可能であるので、自家消光を排除するために彼らはこのプローブを修飾しなければならない。米国特許4,947,850号（カラム３、ライン15）では“ポルフィリンが好ましくは用いられ、当該組成物は、好ましくは、燐光性組成物と結合する蛋白組成物と混合されるにが好ましく、アルブミン性…組成物が好ましい。”と開陳されている。彼らの刊行物（J.Vanderkooiらの「燐光消滅による酸素分子濃度の光学的測定方法」J.Biol.Chem.262（12）:5476−5482（４月1987））に記載されているように、この技術は、アルブミンまたはこのプローブ分子に結合した他の何らかの分子質量の大きな蛋白がなければ、全く機能しない。血中に静脈内注射された場合に、この分子量の大きな蛋白（分子量＝67,000）が、このプローブ分子の小さな結合部または血管壁の脂質膜の通過を妨げ、したがって血中の酸素濃度の測定が制限される。
同様に、米国特許4,579,430号（Bille）は、網膜血管内の酸素飽和や、血液ヘモグロビンへのO2の結合％の測定を可能にする方法を開示する。先の特許によって明らかにされたように、被検患者では、血液の酸素飽和および酸素濃度は正常のままであるが、組織は低酸素症を呈していると考えられる。そのような疾患には、糖尿病、未熟児網膜症並びに高血圧性および動脈硬化性疾患が含まれる。同様に、長時間の外科手術（例えばバイパス手術、頸動脈手術）中、および長期に及び集中治療中に、血液の酸素飽和および／または濃度は注意深くモニターされ維持されるが、それでも低酸素症による中等度から重度の脳障害が生じることが分かっている。組織の機能と健康に関係があるのは組織内の酸素濃度であり、組織酸素濃度は、血液酸素濃度または飽和の他に組織の酸素消費速度、血流速度および血管の口径に左右される。したがって、場所的および時間的な組織のPO2を測定することができることは極めて重要である。
組織のPO2の非侵襲的、局所解剖的測定は、ザッカーマンの'173特許で強調された。この特許では、高度に脂溶性のあるプローブ物質（例えば、ピレンブチレートナトリウム（sodium pyrenebutyrate））が静脈内または腹腔内に注射されるか、または適切な場合には局所的に用いられる。この脂溶性、生体適合性プローブ物質は血液から出て、組織細胞の脂質バイレヤー（二層構造体）内に蓄積する。一旦ピレンブチレートが組織の細胞の脂質バイレヤー内に蓄積されるとプローブは本質的に組織自体となる。当該特許に詳述されたこのことおよびデジタル画像化システムとによって、組織の健康と機能を支える組織酸素濃度の局所的測定が初めて可能となった。
ザッカーマン'173特許では、O2濃度は、蛍光強度の関係で表されたスターン−ボルマー（Stern−Volmer）の等式にしたがって、蛍光強度の測定によって決定される。このザッカーマン'173特許の発明は、場所的時間的な組織PO2の非侵襲的測定を初めて可能にしたが、臨床的利用が妨げられていること、および現時点では実験動物についての研究的利用に限られていることの２つの欠陥を有する。最も顕著な制限は、蛍光強度は、組織内の各場所のピレンブチレート濃度（これは組織内細胞の脂質組成の位置的相違によって変動する）および組織酸素濃度の位置的分布の両方によって決定されるという事実に起因する。この問題を避けるため、さらに複数の場所の酸素濃度を抽出するために、各部位の蛍光強度は、組織を0mmHgのPO2（酸素が無い状態）下に置いた場合の同じ位置の蛍光強度に対する比で表される。これは実験の最後に動物を100％のN2で呼吸させることによって達成できるであろう。そのような方法は疑いもなく細胞死をもたらすので、人間には臨床的に用いることはできない。ザッカーマン'173特許の発明の第２の血管は、ピレンブチレートの発光波長での蛍光強度に対する血液の光ふるい分け作用に起因する。これは同様に、画像化される組織の血管構造内の血液の光学密度を別々に測定することによって、実験の状況下では修正できる。
ザッカーマン'173特許の装置および方法の欠陥は、両方とも、蛍光強度の代わりに蛍光存続時間（消光）を直接測定することによって、排除できるであろう。あるPO2でのある組織内の蛍光存続時間は、一旦装置の目盛り付けが検査室で行われれば、臨床時に0mmHgのPO2下に組織を置く必要は避けられる。なぜならば、蛍光衰退定数はピレンブチレート濃度に左右されず、同様に血管構造内の血液の吸収によって影響を受けないからである。しかしながら、蛍光存続時間はナノ秒（10-9秒）の時間的規模で発生し、さらに、そのような短い存続時間を複数の位置で測定するためには、直接必要とされる煩雑で高価な装置に加えて、使用可能なシグナル／ノイズ比を達成するために紫外線励起波長での組織による強いパルスのレーザ励起（パルス持続時間＜20ナノ秒）を必要とするであろう。ピレンブチレートおよび他の蛍光プローブ分子の量子効率は一般に0.5未満であるので、蛍光によって発光放射エネルギーに変換されない光子呼吸は熱に変換され、したがって組織の損傷を生じる。時間分析による蛍光直接存続時間の決定で用いられる集中レーザパルスに続いて起こる組織損傷は、この方法の生体系内での使用における主要な欠点である。ここに、時間分析方法よりはむしろ、蛍光存続時間の間接的測定を提供する定常状態における酸素濃度の生体系内での局所解剖的測定のための方法の必要性が存在する。
従来技術の欠陥を考えると、多くの形態で利用でき、さらに蛍光存続時間の間接的測定による場所的時間的な体液、血液および組織のPO2の測定を可能にする方法が望まれるところである。そのような方法は、血管内に挿入することが可能で、使用するたびに事前に外部で煩雑な口径決定を実施することを必要としない、酸素感受性カテーテルの構築を可能にするであろう。同様に、そのような方法は、生体適合する脂溶性染料の静脈内注射により、さらに画像のデジタル処理技術の利用により、画像化組織の血管構造内の血液PO2の測定とともに組織PO2の局所解剖的測定を可能にするであろう。さらに拡張すれば、光学的な連続切片作成法の利用は、画像化組織の容積内の断層撮影により組織および血液PO2の三次元分布を測定することを初めて可能にするであろう。極めて重要なことには、そのような方法は、ヒトの血管疾患、代謝性疾患およびその他の疾患の診断並びに治療を含む臨床的利用に特に適切であろう。のみならず、冷光（ルミネセンス）存続時間の間接的な定常状態測定の方法は、酸素分子の他に生物学的および身体的に重要な多数の他の物質の場所的および時間的な濃度測定に等しく応用できるであろう。
発明の目的
したがって、本発明の総体的な目的は、生物学的および身体的に重要な多数の物質の濃度および場所的分布を生体系外及び生体系内で、定常状態でのルミネセンス存続時間の測定によって決定する装置および方法を提供することにある。
本発明の別の目的は、画像化組織内での組織および体液の酸素濃度またはPO2の生体系内断層撮影による測定の方法および装置とともに、従来技術の欠点を克服する光学繊維カテーテルを用いた血液または体液のPO2を測定する方法および装置を提供することにある。
本発明のまた別の目的は、蛍光性プローブ物質を用いた組織および体液の酸素濃度を生体系内で測定する方法及び装置を提供することにあり、このプローブ物質の蛍光存続時間は分子酸素によって衰退し、酸素濃度またはPO2は、この蛍光性プローブ物質の蛍光異方性を測定することによって決定される。
本発明のまた別の目的は、正確で非侵襲的であり、さらに再現性のある結果を提供する組織および体液の酸素濃度を生体系内で決定する方法および装置を提供することにある。
発明の要旨
本発明のこれらの目的およびその他の目的は、定常状態でルミネセンスの存続時間を測定することによって、生物学的および身体的に重要な多数の物質の濃度および分布を生体系内および生体系外で決定する装置並びに方法を提供することによって達成される。
一般的な例では、励起状態が当の物質によって消滅する発蛍光団は、単独または適切な粘度の媒体内で担体分子と共役している場合に、ブラウン回転を自由に受ける。分析媒体は、発蛍光団によって強く吸収される波長の線偏光された連続光を照射される。発光された蛍光は励起光の偏光面に対して平行および垂直なベクトル成分に分離されて、照射標本の蛍光異方性の計算が可能になる。消光物質の濃度は、発蛍光団の蛍光異方性を消光物質の濃度と相関させた関数を用いることによって決定される。
自身では励起状態を鎮めない物質の濃度を決定するためには、測定される一定量の物質を消光分子またはエネルギー転移受容分子と共役させて、サンプル内のルミネセンス標識物質とルミネセンス未標識物質とが標識担体分子上の点（sites）を競合する競合反応を設定する。サンプル内の未標識物質の濃度が増加し、担体分子上の標識物質にとって代わるまで、担体発蛍光団のルミネセンス存続時間は増加するであろう。蛍光異方性は、担体分子上のルミネセンス標識の発光バンドで測定され、測定物質の濃度は、蛍光異方性を測定される物質濃度に相関させて経験的に求められる関数を用いて決定される。
消光物質が酸素分子である特定例では、本発明の目的は、光学繊維カテーテルによる血液または体液のPO2を測定する方法と同様に、画像化組織内の組織および体液の酸素濃度またはPO2の生体系内による局所解剖的測定のための装置および方法を提供することによって達成される。第１の方法では、脂溶性で生体適合性の傾向性プローブ物質が動物体に投与されて、組織細胞の脂質バイレヤー内に蓄積される。第２の方法では、傾向性プローブ物質は、体液（例えば血液）内に当該プローブ物質を保持させる分子量の大きな分子と共役される。カテーテル構造物を開示する第３の方法では、PO2はカテーテルの先端で測定される。先端には、粘稠な非極性溶媒に溶解した蛍光性プローブ物質を含む。
詳述する全ての方法で、分子酸素によって蛍光存続時間が衰退する蛍光性プローブ物質が好ましく、酸素濃度またはPO2はこの蛍光性プローブ物質の蛍光異方性を測定することによって決定される。生体適合性の蛍光性プローブ物質を含む体液または組織、またはカテーテルの先端内の無極性溶媒中の蛍光性プローブ物質は、発蛍光団によって強力に吸収される波長の連続する線偏光された紫外光を照射される。発光蛍光は、励起光の偏光面に対して平行および垂直なそのベクトル成分に分離され、したがって当該照射標本の蛍光異方性の計算を可能にする。組織および／または画像化標本の体液PO2、または封入カテーテルの先端の液体のPO2は、O2−消光性発蛍光団の蛍光異方性を酸素濃度または酸素分圧に相関させる数式を用いることによって決定される。
【図面の簡単な説明】
本発明のその他の目的および多くの付随する特徴は、以下の図面と合わせて下記の詳細な説明を参照することによって、一層理解され、容易に評価されるであろう。
図１は、発蛍光団含有溶液の酸素分圧（PO2）の関数として、無極性溶媒に溶解させたO2−消光性発蛍光団の蛍光異方性の理論的図表である。一群の曲線は、生きた組織細胞の脂質で発生することが分かっているブラウン回転運動（Ｒ）のレンジに関する式６に由来する。蛍光異方性は、全ての回転速度でPO2が増加するにつれて単調に増加する。
図２は、画像化標本内の組織および体液のPO2の局所解剖的分布を決定するために用いられる画像処理装置の概略図である。
図３は、封入された光学繊維カテーテルの先端と接触する体液の酸素濃度またはPO2を測定するために用いられる本発明の装置の図である。
図４は、カテーテルの先端のPO2を決定するために必要な計算を実行するために用いることができるデータプロセッサ（マイクロプロセッサ構造物）の概略図である。MUXはマルチプレクサで、Ｔは温度である。Ｇは、線状偏光に対する平行面および垂直面の二色性鏡の伝送効率（dichroic mirror's transmission efficiency）について修正するために用いられる経験定数である。I1およびI2は、それぞれ励起光の偏光面に対して平行および垂直に分離された蛍光発光の強度である。
図５は、ウシ属の分離眼球および潅流眼球の網膜内の網膜細動脈に対して平行（上）および垂直（下）に測定したPO2レベルのグラフ図である。細動脈に沿った縦方向のPO2の低下は、表示した理論関数に適合し（実線で示した直線）、一方、細動脈に対して垂直に測定したPO2はクロフ（Krogh）の数字モデルに適合する（実線で示した曲線）。R2は決定係数である。
提出物件Ａは、“ビデオ画像の作成、操作および分析用ソフト”（Copyright 1993,Biometric Imaging,Inc.）から抜粋した基本コードである。
好ましい実施例の詳細な説明
本発明は、従来技術に固有のいくつかの問題を取り上げる。本発明は、発蛍光団による光子の吸収および放出は、発蛍光団の分子枠内で明瞭に限定された配向を有する電気双極子遷移モーメントによって生じるという、認知された物理的原理に基づく。無極性溶媒または任意の向きに発蛍光団を含む脂質バレイヤーでは、適切な向きにある分子のみが線偏光によって励起され、したがって励起され蛍光を発する分子の非平衡配向を生じる。この異方性（およびその回転緩和）は放出光の偏光に反映される。線偏光のパルスによって誘導される時間分析する傾向異方性の事例は、下記の等式によって表すことができる：
Figure 0003579424
式中、Ａは蛍光異方性で、ｔはパルス発生励起後の観察時間であり、
Figure 0003579424
は平均分子回転時間（ラジアン／秒）であり、A0は“凍結”状態（ブラウン回転が存在しない）の蛍光異方性である。
しかしながら、もし蛍光異方性が定常状態（連続的励起）で測定されるならば、Ａは、減衰する強度によって重み付けされた、ある時間に亙る時間分割された減衰の平均である：
Figure 0003579424
式中、τは発蛍光団の蛍光存続時間である。
変換を実施することによってペラン（Perrin）の等式が得られる：
Figure 0003579424
この式は、理想的球面分子においては以下の式になる：
Figure 0003579424
式中、Rgはガス定数、Ｔは温度、ηは粘度、Ｖは発蛍光団の流体力学容積である。
まず最初に、本発明は、O2−消光発蛍光団（例えば、ピレンブチレートナトリウム）の場合を考えるが、これは無極性溶媒または脂質バレイヤー（例えば、体内の全ての組織に見出されるようなもの）内に蓄積される。発蛍光団の蛍光存続時間は、以下の形式のスターン−ボルマーの関係によってそれぞれ酸素濃度または酸素分圧に相関させることが可能である。
Figure 0003579424
式中、αはブンゼン（Bunsen）溶解度係数で、KDは動的消光定数で、τ０はO2の非存在下での蛍光存続時間である。式３および式５を結合させることによって、我々は、酸素分圧を定常状態の蛍光異方性に公式的に相関させる数学的関係を推論した：
Figure 0003579424
したがって、式６は本発明の中心的かつ新規な概念であり、定常状態の蛍光異方性測定が正確な方法として用いることが可能なことを示す。この方法は単純な構成で実施でき、（ｉ）組織細胞の脂質バレイヤー内にO2−消光性発蛍光団が蓄積した後の、場所的時間的な組織のPO2と、（ii）赤血球細胞の資質バレイヤー内に発蛍光団が蓄積してからの、或は血流中に注入された蛋白質に発蛍光団が共役される間の発蛍光団血液PO2の局所解剖的分布と、（iii）O2透過膜によってサンプルから分離され、無極性溶媒または脂質（例えば、鉱物油またはパラフィン油）中にピレンのような発蛍光団を含む挿入可能なカテーテル先端のPO2とを決定できる。
式６で表される数学的関係は、組織細胞の脂質の中で発生することが知られているブラウン回転運動の値に対して図１にプロットされている。図１のように、正常状態の蛍光異方性は、全ての回転速度でPO2値の増加とともに系統的に増加する。言い換えれば、PO2が上昇するにつれて、発蛍光団の蛍光存続時間は短くなり（式５）、存続時間中に発蛍光団によって掃引される角度が減少する。したがって、PO2の増加とともに蛍光異方性が増加する。PO2の他に、そのような状態で蛍光異方性に影響を与える他の変数は、温度および脂質バイレヤーの粘度である。しかしながら、生体系内での画像化組織および／または血管構造の場合には、体はこれらの変数を見事に調節する。同様に、小容量のO2感受性先端部をもつカテーテルは、それが挿入された血管内の血液温度によって速やかに平衡に達するであろう。のみならず、式４で示したように、いくつかの病的状態で認められる体温またはカテーテル先端の温度の小さな変動は、同時の温度測定、および、定常状態の蛍光異方性測定からPO2を計算するときの式４の適用とによって、正確に相殺することができる。
本発明は、直接の蛍光存続時間系の全ての利点を有し、しかも強力なパルス発生によるレーザ励起の必要性も画像化標本の潜在的損傷作用もない。さらに、40〜135ナノ秒の範囲で蛍光衰退を測定するために必要とされる煩雑で高価な装置は不要である。同様に、持続的な定常状態の蛍光異方性の決定は、極めて多数の蛍光衰退現象の平均時間であるので、そのような定常状態の測定は、いずれの時間分析方法よりももっと正確にちがいない。本発明は、定常状態の蛍光異方性の測定によってPO2を決定するものであり、一方、ザッカーマン,173特許と同様に米国特許4,476,870号（Peterson）では、蛍光強度は測定変数である。さらに、本発明は、両方とも燐光物質の存続時間の直接測定からPO2を決定する発明である、米国特許4,810,655号（Khalilら）で開示された発明および米国特許4,947,850号（Vanderkooi）の発明とも異なる。燐光発生物質は、本発明で用いられる好ましい蛍光発生物質よりもずっと長い存続時間を有し、したがって容易に測定ができる。本発明では、蛍光存続時間の間接的測定（すなわち蛍光異方性）が、従来技術における制限なしに生体系内での組織および体液のPO2の測定を提供する実施が容易な構成が用いられている。
消光酸素分子の濃度を蛍光異方性に相関させる数学的推論は、酸素濃度または酸素分圧の決定方法の具体例として上記に示したが、励起状態を消滅させることが可能な全ての発蛍光団に関する一般例として書き直すことができ、それによって当該消光物質の濃度を決定できる。より一般的な場合を考慮して、その蛍光がスターン−ボルマー関係にしたがってある物質によって消光される全ての発蛍光団のためには、式５は以下に示すように書き直すことができる：
Figure 0003579424
式中、［Ｑ］はある発蛍光団の消光物質濃度である。同様に、式６は、消光物質濃度に対する蛍光異方性の関係について、以下のように書き直すことができる：
Figure 0003579424
結果として、本発明は消光酸素分子の特定例として提示したが、それは、励起状態を衰退させる物質の濃度を決定する一般的方法として見ることができる。実際には、この技術による解析は、消光物質の非存在下の発蛍光団の蛍光存続時間に対して媒体の粘度（したがって発蛍光団の回転速度）を調節することによって、与えられた発蛍光団および消光物質について最適化させることができる。これは、脂溶性発蛍光団については適切な粘度の脂質を選択することによって、また非脂溶性発蛍光団については、グリセロール−水混合物中でグリセロール濃度を調節することによって、もしくは蔗糖−水媒体中で蔗糖濃度を調節することによって粘度が操作される媒体中で、十分な流体力学容積をもつ担体分子に発蛍光団を共役させることによって達成できる。本発明が適用できる発蛍光団および消光物質の種類の包括的リストを意図はしないが、蛍光存続時間が陽子で消光される発蛍光団のフルオレセインまたはフルオレセイン誘導体のpHの定常状態での測定を考えることもできる。同様に、塩化物濃度を発蛍光団キニンを利用する同じ定常状態法を用いて決定でき、また、沃化物濃度を発蛍光団γ−ピレン酪酸を用いて決定できる。適切な発蛍光団−消光物質の組合せを選択することによって、さらに粘度を操作することによって、したがって所望の消光物質の濃度範囲を越えて得られる蛍光存続時間の範囲に対しては発蛍光団の回転速度を調整することによって、被験者のイオンおよび他の消光物質の濃度を検出するために本明細書に提示した一般的方法を適用できることは、当業者には明白であろう。
励起状態の消光物質の濃度を決定するために本発明を適用することに加えて、さらに本方法を拡張して、サンプル中の興味の対象となるいずれの物質の濃度の決定をも包含することができる。本発明の実施例では、発蛍光団は、問題の物質に対して高い親和性を有するもっと大きい担体分子に共役される。同様に、測定されるべき多量の物質が、担体発蛍光団の励起状態の消光物質に共役される。決定されるべき未標識物質を大量に含むサンプルとともに蛍光標識された物質が分析混合物に添加され、当該担体分子上の点（sites）で競合を生じる。この競合は、消光物質標識分子を担体から追い出し、それによって担体発蛍光団の蛍光存続時間を増加させる。担体発蛍光団の存続時間の増加は、今度は、該担体発蛍光団の発光波長で測定されるサンプルの蛍光異方性を減少させるであろう。したがって、本発明の実施例では、蛍光異方性は、濃度が決定されるべき物質のサンプル濃度が増加するにつれ減少するであろう。言い換えれば、分析される物質の濃度が増加するにつれ、担体上の消光物質の数は減少し、したがって担体発蛍光団の傾向存続時間が増加し（式７）、それによってその存続時間中に担体発蛍光団によって掃引される角度が増加する。したがって、蛍光異方性は測定される物質の濃度が増加するにつれ減少する。
本方法に用いられる２つの発蛍光団のための興味ある選択は、フォルスター
Figure 0003579424
のエネルギー転移が可能なエネルギー供与体および受容体分子を表している。フォルスターのエネルギー転移の基本的模範例は、供与体の吸収領域内でのある波長の光による該供与体分子の励起を伴っている。少量の励起エネルギーが、分子の振動エネルギーの形で周囲に引き渡される（電子的に励起された分子の最も低い振動状態への遷移）；残りは、受容体分子へ蛍光の発光によって、またはエネルギー転移によって放出される。エネルギーの転移効率は、供与体の量子収量と、供与体の発光スペクトルと受容体の吸収スペクトルとの間の重複程度と、供与体と受容体との間の配向及び距離とに依存する。上記の条件の適合度に依存して、受容体および供与体の場所的接近は、供与体の発蛍光団の蛍光存続時間の短縮をもたらす。供与体−受容体対が上記の方法にしたがって用いられるとき、供与体の発光波長で測定される蛍光異方性は、サンプル中の測定される物質の濃度の増加につれて減少する。フォルスターのエネルギー転移する供与体−受容体対の使用の顕著な利点は、供与体の吸収バンドをより長い波長へと移動できることであり、それによってより安価な光源（例えば、発光ダイオード（LED）およびレーザダイオード）の使用を可能にすることである。
エネルギー転移する供与体−受容体対を用いる本発明の具体例は、２つの非制限的実施例によって示されるであろう。先ず、ホルモン（蛋白質）の量を検出するためにデザインされた検出系を考えてみよう。当該蛋白に対して培養された多クローン性抗体をFITC（フルオレセインイソチオシアネート）で標識して供与体として機能させ、一方、大量の当該蛋白はマラカイトグリーンイソチオシアネートで標識して適切な受容体を提供する。これらの標識分子は、サンプル内の未標識蛋白とともに適切な粘度を与えるために、グリセロール−水緩衝液中で混合される。混合物はFITCのための吸収波長の線偏光された光を照射され、サンプルの蛍光異方性はFITCの発光波長（供与体発光）で決定される。問題の未標識蛋白（ホルモン）の量がサンプル中で増加するにつれ、受容体発蛍光団で標識された蛋白と競合し、それによって供与体蛍光の存続時間を増加させる。したがって、FITC発光バンド（供与体波長）での蛍光異方性は、サンプル中で増加する未標識蛋白濃度の関数として系統的に減少するであろう。第２の例として、血中グルコースレベルを測定するためにデザインされた系を考えてみよう。この場合には、供与体発蛍光団としてカスケードブルーで標識した、グルコースに対して高い親和性をもつコンカナバリンＡ（ConA）を担体分子として、大量の発蛍光団で標識されたグルコース（例えば、６−NBD−グルコサミン（６−（Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−1,3−ジアゾ−ル−１−４−イル）アミノ）６−デオキシグルコース））を受容体として用いることができる。この系では、血中グルコースは蛍光標識されたグルコースと競合し、したがってカスケードブルー発光バンドで測定された蛍光異方性の減少を生じる。２つの非制限的実施例を提供したが、本明細書に開示した基本的な方法は、糖類、DNA断片、ホルモン、薬物および免疫グロブリンのような物質の被験者における濃度を決定するために利用できることは、当業者には明白であろう。
次に示される図は、組織のPO2の局所解剖的測定および画像化組織の血管構造内の血液PO2の分布の局所解剖的決定のための、本発明の実施例を表す。さらに、使用のたびに事前に目盛設定を必要としないカテーテル構造物もまた開示される。この開示から、本発明の方法を用いてここに開示された構造物の変形によって、上記の物質の濃度および場所的分布について他の（生物学的または身体的）標本を調べることができることも、当業者には容易に理解されるところであろう。
下記に示すように、蛍光異方性は、下記の式によって一般事例として使用できるように定義され、消光物質酸素のための具体例として正式に記載される：
Figure 0003579424
式中、Ｉ‖およびＩ⊥は、線偏光された励起放射線に対してそれぞれ平行および垂直な電気的ベクトルをもつ蛍光発光の強度である。Ｇは、平行および垂直平面における二色性鏡の伝送効率の修正に用いられる経験的修正因子である。さらに式中、異方性の正式な定義に用いられる別の記号は、既に上記に記載したとおりである。
図２は、画像化組織の組織および血液のPO2の局所解剖的マッピングのためにデザインされた装置10の概略図である。適切な溶媒中のまたはリポソームに取り込まれた、例えばピレンブチレートナトリウムのようなO2−消光性生体適合プローブ物質は、被験者の器官内に静脈注射される。組織12は、タングステン光源16を用いた光学繊維照明器14によって非偏光可視光で照射される。高圧水銀バルブ18の発光体エネルギーは、シャッタ22が付けられている集光レンズ20によって集められ、グラン−トンプソン偏光器（Glan−Thompson Polarizer）24（Ealing,Inc.製）を通過する。UV光は励起フィルタ26（340nmピーク、25nm半バンドパス）でスペクトルに似た形状にされ、続いて、400nm未満の波長を反射する二色性鏡28（Omega Optical）によって反射され、対物レンズ30を通り画像化組織に到達する。
励起組織12から放射される蛍光（波長＞400nm）は対物レンズ30によって集められ、二色性鏡28を通過し、400〜420nmの波長を通す発光フィルタ32を通り、ウォラストン（Wollaston）プリズム偏光器34に入る。偏光器34は、励起偏光面に対して平行な（36）および垂直な（38）線偏光成分に発光蛍光を分離する。これらベクトル成分（ＩおよびＩ）は、２台のビデオカメラ40Aおよび40B（例えばクシビオン（Xybion）モデル250）のCCDチップによって、それぞれ別個にかつ同時に検出される。十分な空間的解像度をもつまた別の光学検出器（例えば、低速走査低音CCDカメラ、SITカメラもしくはISITカメラ、または光ダイオードアレイ（図示されていない））もまた、発光蛍光の平行および垂直成分の二次元分布の検出に適切であることは当業者には明白であろう。
２台のビデオカメラの出力は、マイクロコンピュータ44（例えば、好ましくは33または66MHzで作動するプロセッシングチップをもつ、IBM（商標）またはクローンコンピュータ）内の２台のデジタル化ボード42Aおよび42B（例えば、イメージングテクノロジーから市販されているもの、またはデータトランスレーションのモデルDT3851）でデジタル化される。そのような装置が、この作業およびその後のモニタ46上の表示に先行する画像処理作業のためには十分である。
このコンピュータは、バイオメトリックイメージ社（Biometric Imaging Inc.）が製造し著作権をもつソフトを使用する。このソフトの基本コードは本明細書に添付されており、CCDアレイ内の各ピクセル部位の傾きやオフセットの多様例を修正ファイルによって修正することを可能にし、それによって検出アレイを通過する均質な応答性が保証される。同様に、このソフトのパッケージはアレイ内のピクセル強度を定量化し、フィルタを通し平均化することを可能にし、さらに式９によつて複数部位で異方性を計算することを可能にし、各ピクセル部位で式６を用いることによって組織のPO2の二次元表示への変換を可能にする。本標準装置は、約33ミリ秒以内に空間的に組織のPO2値を300,000以上収集することができる。式６の定数のための値は、酸素微小電極および間接存続時間（異方性）系による組織のPO2の同時測定を伴う目盛設定実験の間に決定される。
短い蛍光存続時間（＜20ナノ秒）をもつ内在性発蛍光団のために、発光波長での自家蛍光がある程度の異方性を示し、したがって生理学的レベルのO2によって消光されない場合には、そのような“自家異方性は”は、生体適合性のO2−消光性蛍光プローブ物質を注射する前に、画像化してディスクに保存することができる。この場合には、O2−消光性プローブ物質の注射の後の全異方性（Atotal）は、以下の式によってその成分異方性（“自家異方性”もしくはAtissueおよびO2依存性異方性、Aprobe）に相関させることができる：
Figure 0003579424
式中、ａ＋ｂ＝１である。O2依存性異方性は、続いて式11によって全異方性から分離できるが、ここで、Ａ（PO2）はPO2依存性異方性であり、ａは、組織のPO2がO2微小電極によって及び蛍光異方性の光学的測定によって測定される実験で経験的に決定される定数である。
Figure 0003579424
この修正は、当該ソフトパッケージ内のプログラムによって、ピクセル−バイ−ピクセルを原則として迅速に都合よく実施することができる。
異方性よりはむしろ蛍光強度の測定に頼るザッカーマン'173特許の発明を凌ぐ本発明の直接の利点は、当業者には明白なことであろう。すなわち、ズッカーマン特許では、組織のPO2測定は、O2−消光性蛍光プローブ物質が画像化組織内で平衡（安定）濃度に達した後に初めて開始することができる。なぜならば、場所的時間的蛍光強度は、組織のPO2に対するのと同様に組織内のプローブ濃度に対しても相関性を有するからである。本明細書で詳述した間接存続時間系では、強度よりむしろ蛍光異方性（これは、プローブ濃度に非感受性である）が組織のPO2の決定要素であり、したがって、十分なプローブ物質が適切なシグナル／ノイズレベルを提供するために蓄積されると、直ちにPO2測定を開始することができる。同様に、異方性方法は、代謝によるプローブ物質の時間依存性分解に非感受性であるので、長時間に亙って局所解剖的に組織のPO2を測定することができる。
提示物件Ａのソフトパッケージには仮想着色プログラムが含まれており、これは、医師が組織のPO2の分布を迅速に解釈することを可能にする付記スケールとともに、異なる色相を組織のPO2の異なる値に割り当てることによって、組織のPO2の光学的マップを二次元空間で表すことを可能にするものであることを、この際指摘しておくべきであろう。間接存続時間系を実施するために書かれたこのプログラムは、基本的に“リアルタイム”で進行し、したがって組織の酸素付加を高めるためにデザインされた治療方法（例えば、糖尿病性網膜症の治療でしばしば用いられる網膜組織のPO2を増加させるために用いられるレーザ処置）の効果を、医師が直ちに調べることを可能にする。
間接存続時間系の組織のPO2を画像化する能力は、共焦点技術、または例えば提示物件Ａに含まれるようなデジタルデコンボルーションプログラムの適用によって、光学的連続切片形成の実現によって二次元から三次元に拡張することができる。この態様では、組織のPO2を局所解剖的に一望することができ、組織のPO2および血液のPO2を組織容積内で三次元で画像化させることが可能になる。そのような三次元情報は、都合よく仮想着色して、さらに三次元再構築アルゴリズムを用いてモニタスクリーンに描き出すことができる。光学連続切片の形成と三次元再構築は、画像化組織内の種々の深さにある異常な組織のPO2領域を医師が検出し治療することを可能にする。
図３は、使用の度に事前に目盛設定を実施する必要がない封入カテーテル構造物で間接蛍光存続時間系を実現するために、本発明にしたがって構築された装置50を示す。前述の具体例のように、高圧水銀バルブ52の発光エネルギーは、シャッタ56を付けた集光レンズ54によって集められ、グラン−トンプソン偏光器58（例えば、イーリング社（Ealing,Inc.）からカタログ番号34−5223で市販されているようなもの）を通過する。UV光は励起フィルタ60（ピークは340nm、半バンドパスは25nm）によってスペクトルに似た形状となり、続いて、400nm未満の波長を反射する二色性鏡62（例えば、オメガオプティカルから400DCLPとして市販されているようなもの）によって反射され、対物レンズ64を通過する。単一モード偏光保存ガラス繊維66（例えば、イーリング社からモデルHB450として市販されているようなもの）が当該対物レンズの焦点に固定される。そのような繊維のコア直径は典型的には10ミクロン未満で、したがって極めて細いカテーテルをデザインすることを可能にする。１ミリメートル以下の細いカテーテルの場合には、線偏光はO2感受性先端部68を直接通過し、一方、より大きい直径のカテーテルのためには、ガラス繊維66は、カテーテル先端部68の均質な照度を提供する平行光線作成レンズ70の焦点に配置される。
密閉されたO2感受性先端部68は、先端部68中の無極性粘性媒体74から光学成分を分離する石英板72を含む。カテーテル先端部68は、無極性粘性媒体74（例えば、パラフィンまたは鉱物油でその中にピレン酪酸またはピレン76が溶解されている）を含む。ピレンは、ピレン酪酸またはその塩より約10倍長い蛍光存続時間を有し、したがって測定の正確さを高め、1mmHg以下のPO2の正確な測定が可能である。無極性粘性溶媒に溶解されたO2−消光性プローブ物質は、O2透過膜（例えば、ポリエチレン）によってカテーテル内に密閉される。微小サーミスタ80もまたカテーテル先端部68に組み込まれ、温度の同時測定を可能にし、したがって式４の関係にしたがって進行するように温度の修正が可能になる。
光学機器は逆にできるので、プローブ先端部68から出た線偏光蛍光発行は、単一モード偏光保存ガラス繊維に沿って戻り、対物レンズ64で集光される。400nm以上の波長は二色性鏡62を通過し、400〜420nmの波長は発光フィルタ82からウォラストンプリズム偏光器84を通過する。この偏光器は、発光蛍光を励起偏光面に対してその平行（86A）および垂直（86B）な線偏光成分に分離する。当該ベクトル成分（Ｉ‖およびＩ⊥）は、２台の光学検出器88Aおよび88Bによってそれぞれ別個にかつ同時に検出される。この光学検出器は光ダイオードでも光電子増幅管でもよい。
このカテーテルデザインは、単一部位すなわちカテーテル先端部でPO2測定を提供するので、異方性は式９から計算することができ、さらに簡単なマイクロプロセッサ90によって式６にしたがいPO2に相関させることができる。そのような一般的なマイクロプロセッサのデザインは図４に図示する。さらにまた、一旦上記式で用いられる関係および定数が決定されると、それらは固定され、製造されるすべてのカテーテルで用いることができ、各カテーテルは工場で個々に目盛を設定する必要がなく、また臨床で使用する前に目盛を設定する必要もない。このことは、工場でも現場でも常に再目盛設定が必要な従来の構造を凌ぐ、本発明のカテーテルのもつ極めて大きな利点を示している。
実施例
網膜組織の組織PO2の局所解剖的分布を測定するために、以下のように図２に概略的に図示したように画像装置を設置する。ウシ属の眼球網膜を近在の屠殺場より入手し、実験室まで氷上で輸送した。ド・クー、ゾンネンバーグとトラップの方法（de Coo,Zonnenberg ＆ Trap,Current Eye Research,12（４）:293−301（1993））にしたがい、最初に108μＭのピレンブチレートナトリウムを補充した酸素付加血清非含有のMEM（minimal essential mediumu）を使って、適温動脈潅流のために分離されたウシ眼球を用意した。ピレンブチレートナトリウム含有のMEMで１時間潅流した後に、生体適合蛍光性プローブ物質は網膜組織で平衡濃度に達した。続いて、組織PO2の測定を実施している間、酸素付加のMEMだけで眼球を潅流させた。角膜屈折は、UV透過ガラスで作製された注文作製の基底レンズ（Optical Industries）で無効にし、網膜は初めに可視光線で画像化し、網膜細動脈を含む網膜領域が選択された。一旦適切な配向を確立したら、可視光線を中止して線偏光紫外線（UV）を照射した。
高圧水銀バルブの発光エネルギーを集光レンズで集めてシャッタで制御し、さらにグラン−トンプソン偏光器（Ealing,Inc.）を通過させたUV光を、励起フィルタ（340nmピーク、25nm半バンドパス）によってスペクトル類似の形状にし、続いて、400nm未満の波長を反射させる二色性鏡（Omega Optical）によって反射させ、対物レンズを通って画像化網膜組織に到達させる。励起組織から出る発光蛍光（波長＞400nm）は、対物レンズで集光され、二色性鏡を通過し、さらに400〜420nmの波長を通す発光フィルタを通り、ウォラストンプリズム偏光器に到達する。この偏光器は発光蛍光を励起偏光面に対してその平行および垂直な線偏光成分に分離する。当該ベクトル成分（Ｉ‖およびＩ⊥）は、２台のビデオカメラ（Xybion model 250）のCCDチップによってそれぞれ別個にかつ同時に検出される。
励起偏光面に対して平行および垂直な蛍光発光のベクトル成分は、先に明らかにした66MHzで作動するコンピュータ内の先に説明した２台のデジタル化ボードによってデジタル化され、ハードディスク（図示されていない）に保存される。提示物件Ａのコンピュータソフトはこのコンピュータで作動し、CCDアレイ内の各ピクセル部位の傾斜およびオフセットの変形例がこのソフトの修正ファイルによって修正されることを可能にし、それによって検出アレイ間の均質な応答性を保証する。同様に、このソフトは、式９によって複数の位置で異方性を計算することを可能にし、各ピクセル部位で式６を用いることによって組織のPO2の二次元的表現に変換できる。本方法は、約33ミリ秒以内にそれぞれ離れた場所の網膜組織のPO2値を300,000以上集めることを可能にする。式６で用いられる定数のための値は、酸素微小電極によって及び間接存続時間（異方性）系によって組織PO2を同時に測定することを伴う目盛設定実験で予め決定された。
この系および得られた網膜組織のPO2の光学的マップの有効性と正確さを検査するために、網膜細動脈に対して平行および垂直なPO2の勾配を測定した。これらの関係を表す関数は、酸素拡散の数学的処理から予想でき、さらに文献で十分に確立されている。これらの測定の結果は図５に示されている。酸素拡散の数学的処理は、細動脈に対して平行な組織の縦方向のPO2の低下は、直線関係（その勾配は、組織の酸素消費速度（Ｍ）と正比例し、細動脈内の酸素含有溶液の速度×細動脈の直径（Ｄ）の２乗に逆比例する）に従うはずであると予言する。図５の上に示すように、血管に沿って測定した組織のPO2はこの十分に確立された直線関係と極めて良く一致し、直線適合性のための決定係数（R2）は0.96である（即ち、データの変動値の96％が予想される直線適合値によって占められる）。同様に、細動脈に対して垂直なPO2の勾配は、数学的にはクロフモデルによって表される単調に減少する関数に従うはずである。図５（下）では、クロフモデル対応線は、適合度（R2）0.99でデータと適合した（すなわち、データの変動値の99％が予想される数学的関係によって占められる）。したがって、図５のデータは、間接蛍光存続時間系が時間的空間的に組織のPO2を調べるために非侵襲的で有効な方法を提供することを示している。
本発明を好ましい具体例と実例を組み合わせて詳述したが、本明細書を熟読された当業者には、前述の方法について種々の変形、置換およびその他の変更を加えることは可能であろう。したがって、特許権による保護範囲は、添付の請求の範囲に含まれるものおよびそれと同等のものによってのみ限定されるであろう。
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Claims (36)

  1. 人体外にあって該人体に戻さない媒体中の分析物の濃度を測定する方法であって、
    （ａ）照射された時にルミネセンスを生じ、そのルミネセンスが前記媒体中の分析物で消光されるプローブ物質を、前記媒体内に導入する工程と、
    （ｂ）前記プローブ物質がルミネセンスを生じるように、線偏光された光を照射する工程と、
    （ｃ）前記プローブ物質より放出されたルミネセンスを、前記線偏光された光の偏光面に対して平行なベクトル成分および垂直なベクトル成分に分離する工程と、
    （ｄ）前記照射された媒体の空間的または時間的なルミネセンス異方性を、前記ベクトル成分の関数として計算する工程と、
    （ｅ）前記ルミネセンス異方性を前記媒体中の分析物の濃度に相関させる式の形の数学的関数を適用する工程とを有することを特徴とする方法。
  2. 更に、以下の式により、前記プローブ物質のルミネセンスの存続時間を演算する工程を有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
    Figure 0003579424
    式中、τはルミネセンスの存続時間であり、［Ｑ］は分析物の濃度であり、KDは動的消光定数であり、τ０は分析物の非存在下でのルミネセンス存続時間である。
  3. 更に、以下の式を選択する工程を有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
    Figure 0003579424
    式中、Ａは蛍光異方性で、以下のように定義され、
    Figure 0003579424
    ここで、Ｉ‖およびＩ⊥は、工程（ｂ）の線偏光された光に対してそれぞれ平行および垂直な電気的ベクトルをもつルミネセンス発光の強度であり、Ｇは、平行および垂直面における伝達効率について修正するために用いられる経験的修正因子であり、
    Figure 0003579424
    は平均分子回転時間（ラジアン／秒）であり、A0は“凍結”状態（ブラウン回転の非存在下）におけるルミネセンス異方性であり、KDは動的消光定数であり、τ０は消光物質非存在下のルミネセンス存続時間であり、［Ｑ］は決定されるべき分析物の濃度である。
  4. 更に、前記媒体中の分析物の濃度の地勢的分布を決定する工程を有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
  5. 前記プローブ物質が先端部とサーミスタとを有する光センサ内に配分され、
    更に、以下の式に従って、前記センサの先端部の温度に対する異方性測定を修正する工程を有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
    Figure 0003579424
    式中、Rgはガス定数、Ｔは温度、ηは粘度、Ｖはプローブ物質の流体力学容積、Ａはルミネセンス異方性、A0は“凍結”状態（ブラウン回転の非存在下）におけるルミネセンス異方性、τ蛍光存続時間である。
  6. 更に、光学的連続切片作成法により前記媒体中の分析物濃度の地勢的分布を断層撮影で決定する工程を有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
  7. 人体外にあって該人体に戻さない媒体中の分析物の濃度を測定する方法であって、
    （ａ）照射された時にルミネセンスを生じるように選択されるプローブ分子を、前記分析物に対して親和性を有する担体に共役させ、該担体を媒体に添加する工程と、
    （ｂ）前記プローブ分子のルミネセンスエネルギーの消光物質と前記プローブ分子のルミネセンスエネルギーのエネルギーの転移受容体とからなるグループから選ばれた物質を共役させたある量の分析物を、前記媒体に添加する工程と、
    （ｃ）前記プローブ分子がルミネセンスを発生させるように、線偏光された光を前記媒体に照射する工程と、
    （ｄ）前記プローブ分子によって放出されたルミネセンスを、前記線偏光された光の偏光面に対して平行および垂直なベクトル成分に分離する工程と
    （ｅ）前記照射された媒体の空間的または時間的なルミネセンス異方性を、前記ベクトル成分の関数として計算する工程と、
    （ｆ）前記ルミネセンス異方性を前記媒体中の分析物の濃度に相関させる経験的に決定された数学的関数を適用する工程とを有することを特徴とする方法。
  8. 前記工程（ｅ）のルミネセンス異方性Ａは、次のように定義されることを特徴とする請求項７に記載の方法。
    Figure 0003579424
    ここで、Ｉ‖およびＩ⊥は、工程（ｃ）の線偏光された光に対してそれぞれ平行および垂直な電気的ベクトルをもつルミネセンス発光の強度であり、Ｇは、平行および垂直面における伝達効率について修正するために用いられる経験的修正因子である。
  9. 更に、前記媒体中の分析物の濃度の地勢的分布を決定する工程を有することを特徴とする請求項７に記載の方法。
  10. 前記プローブ物質が先端部とサーミスタとを有する光センサ内に配分され、
    前記方法は、更に、経験的に決定された数学的関数により、前記センサの先端部の温度に対する異方性測定を修正する工程を有することを特徴とする請求項７に記載の方法。
  11. 更に、光学的連続切片作成法により前記媒体中の分析物濃度の地勢的分布を断層撮影で決定する工程を有することを特徴とする請求項７に記載の方法。
  12. 人体外にあって該人体に戻さない媒体中の分析物の濃度を測定する方法であって、
    （ａ）照射された時にルミネセンスを生じるように選択されるプローブ分子を、前記分析物に対して親和性を有する担体に共役させ、該担体を媒体に添加する工程と、
    （ｂ）前記プローブ分子のルミネセンスエネルギーの消光物質と前記プローブ分子のルミネセンスエネルギーのエネルギー転移受容体とからなるグループから選ばれた物質を共役させた既知量の分析物を、前記媒体に添加する工程と、
    （ｃ）未知量の分析物を含む分析されるべきサンプルを前記媒体に添加する工程と、
    （ｄ）前記プローブ分子がルミネセンスを発生させるように、線偏光された光を前記媒体に照射する工程と、
    （ｅ）前記プローブ分子によって放出されたルミネセンスを、前記線偏光された光の偏光面に対して平行および垂直なベクトル成分に分離する工程と
    （ｆ）前記照射された媒体の場所的または時間的なルミネセンス異方性を、前記ベクトル成分の関数として計算する工程と、
    （ｇ）前記ルミネセンス異方性を前記媒体中の前記未知量の分析物の濃度に相関させる経験的に決定された数学的関数を適用する工程とを有することを特徴とする方法。
  13. 前記工程（ｆ）のルミネセンス異方性Ａは、次のように定義されることを特徴とする請求項12に記載の方法。
    Figure 0003579424
    ここで、Ｉ‖およびＩ⊥は、工程（ｄ）の線偏光された光に対してそれぞれ平行および垂直な電気的ベクトルをもつルミネセンス発光の強度であり、Ｇは、平行および垂直面における伝達効率について修正するために用いられる経験的修正因子である。
  14. 更に、前記媒体中の分析物の濃度の地勢的分布を決定する工程を有することを特徴とする請求項12に記載の方法。
  15. 前記プローブ物質が先端部とサーミスタとを有する光センサ内に配分され、
    前記方法は、更に、経験的に決定された数学的関数により、前記センサの先端部の温度に対する異方性測定を修正する工程を有することを特徴とする請求項12に記載の方法。
  16. 更に、光学的連続切片作成法により前記媒体中の分析物濃度の地勢的分布を断層撮影で決定する工程を有することを特徴とする請求項12に記載の方法。
  17. 分析物の濃度を測定する装置であって、
    （ａ）光センサに向け偏光された光を照射する手段と、
    （ｂ）光で照射された時にルミネセンスを生じ、そのルミネセンスが前記分析物で消光されるよう選択されるプローブ物質を収納する手段を有する光センサと、
    （ｃ）前記プローブ物質より放出されたルミネセンスを、前記偏光された光の偏光面に対して平行なベクトル成分および垂直なベクトル成分に分離し、前記ベクトル成分の強度を検出する手段と、
    （ｄ）前記分析物の濃度を前記強度の値に基づいて算出する手段を有し、前記分離検出手段から得られた強度を処理する手段とを有することを特徴とする装置。
  18. 前記光センサは粘性媒体を含み、前記プローブ物質と粘性媒体とは、前記分析物を透過する膜で前記分析物から分離されていることを特徴とする請求項17に記載の装置。
  19. 前記算出手段は、以下の式により分析物の濃度を算出する手段を有することを特徴とする請求項17に記載の装置。
    Figure 0003579424
    式中、Ａは蛍光異方性で、以下のように定義され、
    Figure 0003579424
    ここで、Ｉ‖およびＩ⊥は、前記照射手段から発する偏光された光に対してそれぞれ平行および垂直な電気的ベクトルをもつルミネセンス発光の強度であり、Ｇは、平行および垂直面における伝達効率について修正するために用いられる経験的修正因子であり、
    Figure 0003579424
    は平均分子回転時間（ラジアン／秒）であり、A0は“凍結”状態（ブラウン回転の非存在下）におけるルミネセンス異方性であり、KDは動的消光定数であり、τ０は消光物質非存在下のルミネセンス存続時間であり、［Ｑ］は決定されるべき分析物の濃度である。
  20. 前記分析物は媒体中に配分され、前記装置は、前記媒体中の分析物の濃度の地勢的分布を決定する手段を更に有することを特徴とする請求項17に記載の装置。
  21. 前記光センサは先端部とサーミスタとを有し、前記装置は、以下の式に従って、前記センサの先端部の温度に対する異方性測定を修正する手段を更に有することを特徴とする請求項17に記載の装置。
    Figure 0003579424
    式中、Rgはガス定数、Ｔは温度、ηは粘度、Ｖはプローブ物質の流体力学容積、Ａはルミネセンス異方性、A0は“凍結”状態（ブラウン回転の非存在下）におけるルミネセンス異方性、τは蛍光存続時間である。
  22. 分析物の濃度を測定する装置であって、
    （ａ）光センサに向け偏光された光を照射する手段と、
    （ｂ）光で照射された時にルミネセンスを生じるプローブ分子に共役され、分析物に対し高い親和性を持つ担体を収納する手段を有し、更に、前記プローブ分子のルミネセンスエネルギーの消光物質と前記プローブ分子のルミネセンスエネルギーのエネルギー転移受容体とからなるグループから選ばれた物質を共役させた既知量の分析物を収納する光センサと、
    （ｃ）前記光センサは、共役でない形態の前記分析物を含む媒体内に配分され、
    （ｄ）前記プローブ物質より放出されたルミネセンスを、前記偏光された光の偏光面に対して平行なベクトル成分および垂直なベクトル成分に分離し、前記ベクトル成分の強度を検出する手段と、
    （ｅ）前記光センサに接触する前記共役でない形態の分析物の濃度を前記強度の値に基づいて算出する手段を有し、前記分離検出手段から得られた強度を処理する手段とを有することを特徴とする装置。
  23. 前記光センサは担体と共役された分析物とを含む粘性媒体を含み、前記担体と共役された分析物とは、共役でない形態の前記分析物を透過するが共役された前記分析物を透過しない膜で、前記共役でない形態の分析物から分離されていることを特徴とする請求項22に記載の装置。
  24. 前記装置は、前記媒体中の分析物の濃度の地勢的分布を決定する手段を更に有することを特徴とする請求項22に記載の装置。
  25. 前記光センサは先端部とサーミスタとを有し、前記装置は、経験的に決定された数学的関数により、前記センサの先端部の温度に対する異方性測定を修正する手段を更に有することを特徴とする請求項22に記載の装置。
  26. 前記装置は、前記媒体中の分析物の濃度の空間的分布を決定する手段を更に有することを特徴とする請求項22に記載の装置。
  27. 媒体中に配分された分析物の濃度を測定する装置であって、
    （ａ）光で照射された時にルミネセンスを生じ、そのル ミネセンスが前記分析物で消光されるよう選択されるプ ローブ物質を含む前記媒体に対し、偏光された光を照射する手段と、
    （ｂ）前記プローブ物質より放出されたルミネセンスを、前記偏光された光の偏光面に対して平行なベクトル成分および垂直なベクトル成分に分離し、前記ベクトル成分の強度を検出する手段と、
    （ｃ）前記分析物の濃度を前記強度の値に基づいて算出する手段を有し、前記分離検出手段から得られた強度を処理する手段とを有することを特徴とする装置。
  28. 前記算出手段は、以下の式により分析物の濃度を算出する手段を有することを特徴とする請求項27に記載の装置。
    Figure 0003579424
    式中、Ａは蛍光異方性で、以下のように定義され、
    Figure 0003579424
    ここで、Ｉ‖およびＩ⊥は、前記照射手段から発する偏光された光に対してそれぞれ平行および垂直な電気的ベクトルをもつルミネセンス発光の強度であり、Ｇは、平行および垂直面における伝達効率について修正するために用いられる経験的修正因子であり、
    Figure 0003579424
    は平均分子回転時間（ラジアン／秒）であり、A0は“凍結”状態（ブラウン回転の非存在下）におけるルミネセンス異方性であり、KDは動的消光定数であり、τ０は消光物質非存在下のルミネセンス存続時間であり、［Ｑ］は決定されるべき分析物の濃度である。
  29. 前記装置は、前記媒体中の分析物の濃度の地勢的分布を決定する手段を更に有することを特徴とする請求項27に記載の装置。
  30. 以下の式に従って、温度に対する異方性測定を修正する手段を更に有することを特徴とする請求項27に記載の装置。
    Figure 0003579424
    式中、Rgはガス定数、Ｔは温度、ηは粘度、Ｖはプローブ物質の流体力学容積、Ａはルミネセンス異方性、A0は“凍結”状態（ブラウン回転の非存在下）におけるルミネセンス異方性、τは蛍光存続時間である。
  31. 前記装置は、光学的連続切片作成法により前記媒体中の分析物の濃度の地勢的分布を断層撮影で決定する手段を更に有することを特徴とする請求項27に記載の装置。
  32. 媒体中に配分された分析物の濃度を測定する装置であって、
    （ａ）光で照射された時にルミネセンスを生じるプロー ブ分子に共役された担体と、前記プローブ分子のルミネ センスエネルギーの消光物質と前記プローブ分子のルミ ネセンスエネルギーのエネルギー転移受容体とからなる グループから選ばれた物質を共役させた既知量の分析物 とを含む前記媒体に向かい、偏光された光を照射する手段と、
    （ｂ）前記プローブ物質より放出されたルミネセンスを、前記偏光された光の偏光面に対して平行なベクトル成分および垂直なベクトル成分に分離し、前記ベクトル成分の強度を検出する手段と、
    （ｃ）前記分析物の濃度を前記強度の値に基づいて算出する手段を有し、前記分離検出手段から得られた強度を処理する手段とを有することを特徴とする装置。
  33. 前記算出手段は、経験的に決定された数学的関数により、前記分析物の濃度を算出する手段を有することを特徴とする請求項32に記載の装置。
  34. 前記装置は、前記媒体中の分析物の濃度の地勢的分布を決定する手段を更に有することを特徴とする請求項32に記載の装置。
  35. 経験的に決定された関数により、前記媒体の温度に対する異方性測定を修正する手段を更に有することを特徴とする請求項32に記載の装置。
  36. 光学的連続切片作成法により前記媒体中の分析物の濃度の地勢的分布を断層撮影で決定する手段を更に有することを特徴とする請求項32に記載の装置。
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