KR101590508B1 - 세포 생존량 측정 방법 및 이를 위한 장치 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 세포의 생존량 측정 시 화학물질을 첨가하여 세포에 손상을 주거나, 화학물질의 반응에 의한 악영향을 주지 않고, 광 바이오 센서(OPTICAL BIO-SENSOR)를 이용하여 수 마이크로 크기를 갖는 세포의 부피 변화 및 세포액의 굴절률 변화를 관찰함으로써, 세포의 생존량을 비표지(LABEL-FREE) 방식으로 측정할 수 있도록 하는 세포 생존량 측정 방법 및 이를 위한 장치에 관한 것이다.
이를 위해 본 발명은 광 바이오 센서칩 표면에 세포가 접촉되도록 설치하는 단계; 상기 세포에 등장액(ISOTONIC BUFFER)과 고장액(HYPERTONIC BUFFER) 또는 저장액(HYPOTONIC BUFFER)을 교차 투입하여 삼투압의 변화를 발생시키는 단계; 상기 삼투압의 변화에 대한 반응으로, 세포막을 통해 물이 유입 또는 유출되고 이로 인한 세포액의 굴절률 변화를 상기 광바이오센서칩이 장착된 광 바이오센서로 관측하여 산 세포와 죽은 세포를 구분하여 생존량을 측정하는 단계로 이루어지는 세포 생존량 측정 방법 및 이를 위한 장치가 제공된다.

Description

세포 생존량 측정 방법 및 이를 위한 장치{METHOD AND DEVICE FOR MEASUREMENT FOR CELL VIABILITY}
본 발명은 표면 굴절률 측정이 가능한 광 바이오 센서(OPTICAL BIO-SENSOR)를 이용하여 세포의 생존량(CELL VIABILITY)을 비표지(LABEL-FREE) 방식으로 측정할 수 있도록 하는 방법 및 이를 위한 장치에 관한 것이다.
일반적으로 세포의 생존량(CELL VIABILITY) 측정에서 사용되는 방법으로 세포에 염료를 투입하여, 살아있는 세포는 염색이 되지 않고, 죽은 세포만 염색이 이루어지는 원리를 이용해, 전체 세포의 염색 유무를 통해 생존량을 산정하는 염색법이 널리 사용되고 있다.
이러한 염색법에 의한 세포의 생존량 측정 방법에서 주로 트리판 블루(TRYPAN BLUE) 염료가 가장 많이 사용되는 있는 바, 트리판 블루 염료는 세포에 투입된 후 시간이 지남에 따라 살아있는 세포도 염색을 진행시키기 때문에 염료 투입 후 3~5분 내에 신속하게 측정을 완료해야 하는 문제점이 있다.
뿐만 아니라, 트리판 블루 염료는 단백질과 친화력이 매우 크므로 세포를 부유시킨 희석액에 혈청성분이 있으면 측정이 부정확해질 수 있으며, 독성이 강해서 측정을 위한 세포에 손상을 가해 측정이 부정확해질 수 있는 문제점이 있다.
한편, 염색법에 사용되는 또 다른 염료로서, 에오신(EOSIN)이 사용되고 있다.
에오신 용액은 트리판 블루에 비해 세포에 투입된 후 염색이 천천히 진행되는 장점이 있으나, 색상이 붉은 색을 띄어 감별이 어려운 문제점이 있어, 세포 생존량 측정 시 실험자의 주관적 판단이 개입되어야 하는 단점이 있다.
또한, MTT(3-(4,5-DIMETHYLTHIAZOL-2-YL)-2,5-DIPHENYL TETRAZOLIUM BROMIDE) 및 XTT 효소의 반응에 의해 세포가 환원되어 색상이 변화는 정도를 통해 세포의 생존량을 측정하는 방법이 있으나, MTT 및 XTT 효소의 반응에 의한 방법은 환원 반응 결과로 발생된 생성물이 세포와 상호작용을 발생하여 측정 감도(SENSITIVITY)가 낮고, 세포의 생존량 측정을 위한 준비 과정 및 절차가 복잡한 문제점을 있다.
이에 따라, 최근 들어서는 세포에 영향을 줄 수 있는 화학물질을 첨가하지 않아 세포의 생존량 측정에 영향을 미치지 않으며, 시간에 구애됨이 없이 비표지 방식으로 신속하게 세포의 생존량을 측정하는 방법 및 장치의 개발이 활발히 이루어지고 있다.
일예로써, 국내등록 제10-0845332호 "회절 광학 소자가 집적된 바이오칩 및 이를 이용한 세포 생장성 측정방법" 에는 회절 광학 소자가 집적된 세포 생장성 측정용 판과 이를 이용한 초점 평면 형성 차이에 의한 세포 생장성 측정방법에 관한 기술이 기재되어 있다.
국내등록 제10-0845332호는 세포 생장성 측정용 판에 집적된 회절 광학 소자에 의해 회절된 빛이 세포가 살아 있는 경우에는 특정 높이에서 초점이 일치하고, 세포의 생장성에 이상이 생기는 경우에는 세포 표면 형질 차이에 의해 초점이 불일치하는 특징을 이용하여, 이러한 초점 평면 형성 차이를 이미징 장치로 분석하여 세포 생장성을 측정할 수 있도록 구성된다.
하지만, 국내등록 제10-0845332호는 세포에 입사한 빛이 회절 광학 소자와 렌즈를 거쳐 초점 평면에 모여지는 단순 형상만을 이용함으로써, 박테리아나, 포유류 세포와 같은 수 마이크로 크기를 갖는 세포를 정확하게 관측하는데 한계가 있을 수 밖에 없다.
국내공개특허 제10-2007-0086024호 국내공개특허 제10-1994-0009686호 국내공개특허 제10-2012-0049634호 국내등록특허 제10-0845332호
이에 상기와 같은 점을 감안하여 발명된 본 발명은 세포의 생존량 측정 시 화학물질을 첨가하여 세포에 손상을 주거나, 화학물질의 반응에 의한 악영향을 주지 않고, 광 바이오 센서(OPTICAL BIO-SENSOR)를 이용하여, 수 마이크로 크기를 갖는 세포의 부피 변화 및 세포액의 굴절률 변화를 관찰함으로써, 세포의 생존량을 비표지(LABEL-FREE) 방식으로 측정할 수 있도록 하는 세포 생존량 측정 방법 및 이를 위한 장치를 제공함을 목적으로 한다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명에 따르면,광 바이오 센서칩 표면에 세포가 접촉되도록 설치하는 단계와, 상기 세포에 등장액(ISOTONIC BUFFER)과 고장액(HYPERTONIC BUFFER)을 교차 투입하거나 상기 등장액과 저장액(HYPOTONIC BUFFER)을 교차 투입하여 삼투압의 변화를 발생시키는 단계 및 상기 삼투압의 변화에 대한 반응으로서, 상기 세포의 세포막을 통해 물이 유입 또는 유출되고 이로 인한 세포액의 굴절률 변화를 상기 광바이오센서칩이 장착된 광 바이오센서로 관측하여 산 세포와 죽은 세포를 구분하여 생존량을 측정하는 단계로 이루어지는 세포 생존량 측정 방법이 제공된다.
상기 광 바이오 센서칩은 SPR(SURFACE PLASMON RESONANCE: 표면 플라즈몬 공명)센서, MCW(METAL CLAD WAVEGUIDE: 금속 피복 광도파로) 센서, LONG-RANGE SPR 센서, RESONANT MIRROR 센서, 광도파로형 굴절률 센서 및 엘립소미터(ELLIPSOMETER) 중 어느 하나의 센서에 장착되어 사용되는 것을 특징으로 한다.
상기 광 바이오 센서칩의 표면에 세포를 설치하는 방법으로서, 상기 센서칩을 렉틴으로 표면을 처리하여 친화력을 이용하여 센서칩 표면에 세포를 설치하는 것을 특징으로 한다.
상기 광 바이오 센서칩의 표면에 세포를 설치하는 또 다른 방법으로서, 상기 광 바이오 센서칩의 표면에 미리 미세우물(MICRO-WELL) 패턴을 형성시킴으로써 세포가 침강하여 미세우물에 단순 포획되어 센서표면에 접촉되는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 미세우물 패턴은 상기 광바이오센서칩 표면상에 스핀코팅법으로 도포된 포토레지스트와 일반적인 포토리소그라피 (photolithography) 기술을 이용하여 형성되는 것을 특징으로 한다.
상기 센서칩 표면에 패턴된 상기 미세우물의 깊이와 크기는 모두 1~50mm 범위를 갖는 것을 특징으로 한다.
상기 패턴된 미세우물에 상기 세포가 한 개씩 단순 포획된 다음, 상기 세포액의 굴절률 변화를 상기 광바이오센서로 관측한 결과 얻어지는 센서 시그날로서 반사광세기를 측정할 때 이미지측정을 통해 개별 세포의 생사를 측정, 분석하는 것을 특징으로 한다.
상기 고장액 또는 저장액의 굴절률을 등장액의 굴절률과 일치되도록 하여 버퍼의 굴절률 효과를 배제함으로써, 삼투압에 대한 세포의 반응만을 관측할 수 있도록 하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 세포액의 굴절률 변화를 상기 광바이오센서로 관측한 결과 얻어지는 센서 시그날로서, 반사광의 공명각도, 공명파장, 반사광의 위상 및 반사광 세기 변화 중 어느 하나로 선택되어 지는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따르면, 광바이오센서칩의 일측 면으로 유리기판이 위치하고, 상기 유리기판상에 센서층이 형성되며 이 센서층면에 세포를 설치시키는 광 바이오 센서부와, 상기 광 바이오 센서부의 일측에 형성되어, 상기 세포에 삼투압 발생을 위한 시료를 공급하는 시료주입부와, 상기 광 바이오 센서부에 형성된 상기 유리기판으로 광을 조사시키는 광원부 및 상기 광 바이오 센서부로부터 반사되는 광을 관측하여, 상기 세포의 삼투압 변화에 따라 변화되는 굴절률 변화를 통해 상기 세포의 생존량을 산정하는 반사광 검출부를 포함하는 세포 생존량 측정 장치가 제공된다.
이러한 본 발명에 따른 세포 생존량 측정 방법 및 장치에 의하면, 화학물질을 사용하여 세포에 손상을 주거나, 화학반응이 일어나 정확한 세포의 생존량 측정에 영향을 주는 일이 없이, 비표지 방식으로 세포의 생존량을 간편하게 측정할 수 있으며, 시간에 따른 화학반응 특성에 의한 시간 제약 없이 실시간으로 신속, 정확하게 세포의 생존량을 측정할 수 있는 효과가 있다.
또한, 본 발명에 의하면, 광 바이오 센서칩에 입사되는 광의 소산장을 이용하여 세포액의 굴절률을 측정함으로써, 세포 생존량의 정확한 측정이 가능하며, 특히, 미세우물 패턴에 의한 개별 세포의 포획으로 개별 세포 관측이 가능하여, 정확한 세포의 생존량을 측정할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명에 따른 세포 생존량 측정 장치의 구성을 나타낸 개념도.
도 2는 도 1에 도시된 광 바이오 센서칩의 다른 일 실시예를 나타낸 사시도.
도 3은 실험예 1에 의해 제조된 등장액과 저장액의 굴절률을 나타낸 그래프.
도 4는 실험예 1에서 각각의 광 바이오 센서칩에 삽투압 변화를 가하여 나타내는 신호를 나타낸 그래프.
도 5는 도 4에 도시된 그래프에 각각 해당되는 이미지를 확대하여 나타낸 사진.
도 6 및 도 7은 실험예 1에 의해 얻어진 결과에 대한 세포의 생존 수와, 삼투압 변화 후 나타난 이미지의 픽셀(PIXEL) 변화량과의 관계를 나타낸 그래프.
도 8은 실험예 2에서 센서칩에 세포를 포함한 현탁액을 흘려 표면굴절률이 증가된 이미지를 나타낸 개념도.
도 9는 실험예 2에서 마이너스 삼투압을 가했을 때의 표면굴절률에 의한 이미지를 나타낸 개념도.
이하 본 발명의 실시예를 첨부된 예시도면을 참조로 상세히 설명하며, 이러한 실시예는 일례로서 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으므로, 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
본 발명은 염료 등의 화학물질을 첨가하지 않아 세포 생존량 측정의 정확도에 영향을 주지 않고 실시간으로 비표지 방식의 세포 생존량을 측정하는 장치 및 방법을 제공하는데 있다.
이를 위해 본 발명에서는 입사광의 소산장(EVANESCENT FIELD)을 이용한 표면굴절률 측정 방식의 광 바이오 센서를 세포 생존량을 측정하기 위한 수단으로 이용하였다.
즉, 표면굴절률을 측정하기 위한 광 바이오 센서칩의 표면에 세포를 접촉시킨 상태에서, 삼투압 변화를 주고 이때, 세포의 반응인 물의 유입 또는 유출로 인한 세포액의 굴절률 변화를 표면굴절률 측정센서로 관측하여 산 세포와 죽은 세포를 구별하도록 구성된다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 생존량 측정 방법을 위한 장치의 구성을 나타낸다.
참고로, 본 발명의 세포 생존량 측정 방법을 위한 장치는 광 바이오 센서를 포함한 전체 시스템을 의미하는 것일 수 있으며, 이러한 전체 시스템을 광 바이오 센서칩과 혼용하여 사용될 수 있다.
도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 세포 생존량 측정 방법을 위한 장치는 세포를 설치하는 광 바이오 센서부(10)와, 광 바이오 센서부(10)에 시료를 투입할 수 있도록 하는 시료주입부(20)와 광 바이오 센서부(10)에 광을 조사시키는 광원부(30) 및 광 바이오 센서부(10)로부터 반사된 빛을 측정하여 세포의 생존량을 측정하는 반사광 측정부(40)를 포함한다.광 바이오 센서부(10)는 일측 면에 세포를 부착하여 설치하는 면인 센서층(100)과 유리기판(130)이 순차로 형성되어, 유리기판(130)으로 입사되어 반사되는 광의 소산장(EVANESCENT FIELD)을 이용해 세포의 표면 굴절률을 측정한다.
그리고, 광 바이오 센서부(10)의 외부에는 광을 조사시키는 광원부(30)가 설치된다.
본 발명에 따른 세포 생존량 측정 장치에서, 광 바이오 센서부(10)는 SPR(SURFACE PLASMON RESONANCE: 표면 플라즈몬 공명) 센서로 구성될 수 있다.
광 바이오 센서부(10)로서, SPR 센서가 적용될 경우 센서층(100)은 금속 박막(110)과 유리기판과의 접착력을 유지하지 위한 ADHESION LAYER(120)로 이루어질 수 있다.
SPR 센서는 금, 은 구리와 같은 금속 박막의 표면을 따라 전파하는 자유전자의 양자화된 진동을 의미하는 것으로, 이와 같은 SPR 센서는 프리즘과 같은 유전매체를 지나 내부 전반사 임계각 이상의 각도로 금속 박막에 입사하는 입사광에 의해 여기되어 공명을 일으킨다.
이때, 광 바이오 센서층(100)과 측정 대상매체인 세포의 경계면 부근에는 광원부(30)로부터 입사되는 광의 전자기장이 형성되는데 계면에 수직한 방향의 전자기장의 분포는 경계 면에서 가장 크고 측정 대상매체인 세포 속으로 갈수록 지수함수적으로 급격히 감쇄하는 형태의 소산장(EVANESCENT FIELD)이 형성되며, SPR 센서는 소산장의 침투 깊이 내에서 발생하는 굴절률의 변화를 감지해 낸다.
또한, 광 바이오 센서부(10)는 MCW(METAL CLAD WAVEGUIDE: 금속 피복 광도파) 센서로 구성될 수 있다.
이때, 광 바이오 센서부(10)로서 MCW 센서가 적용될 경우 센서층(100)은 실리카(SiO2) 박막(110)과 티타늄 피복(clad; 120)로 이루어질 수 있다.
MCW 센서를 적용할 경우 더 깊은 소산장의 침투 깊이를 갖는 특징이 있어, 박테리아(1~5㎛)나 포유류 세포(5~50㎛)와 같은 마이크로 크기의 물체를 관측 및 분석하는데 더욱 적합하다.
금속 MCW 센서는 센서 표면으로부터 소산장의 침투 깊이가 약 1.5㎛로 SPR 센서보다 훨씬 더 확장된 소산장의 침투 깊이를 갖는다.
또한, 본 발명에 따른 세포 생존량 측정 장치에서, 상기 광 바이오 센서부(10)는 SPR 센서와, MCW 센서에 국한되지 않고, LONG-RANGE SPR 센서, RESONANT MIRROR 센서, 광도파로형 굴절률 센서 및 엘립소미터(ELLIPSOMETER) 등 표면 굴절률 측정이 가능한 다양한 종류의 센서가 적용 가능하다.
또한, 측정 가능한 세포에 있어서는 표준세포계로 널리 사용되는 중국햄스터난소세포(CHINESE HAMSTER OVARY; CHO) 뿐만 아니라, 삼투압 변화에 대한 항상성 유지 과정으로서, 세포막을 통한 수분의 이동을 나타내는 모든 세포가 사용될 수 있다.
한편, 세포가 설치되는 광 바이오 센서부(10)의 일측에는 세포에 시료를 투입하여, 삽투압의 변화를 발생시키도록 하는 시료주입부(20)가 형성된다.
시료주입부(20)로 투입되는 시료는 등장액(ISOTONIC BUFFER), (고장액 HYPERTONIC BUFFER) 및 저장액(HYPOTONIC BUFFER)가 이용되며, 이러한 시료를 교차로 투입할 수 있도록 투입부(210)와, 먼저 투입된 시료를 외부로 배출하는 배출부(220)를 포함한다.
세포에 시료를 투입하여 삼투압의 변화를 발생시키는 과정에서 등장액과 고장액 및 저장액의 굴절률이 다를 경우에는 삼투압 변화에 대한 세포의 반응에 기인한 굴절률 변화만의 관측이 불가능하므로, 사용하는 고장액 및 저장액의 굴절률을 등장액의 굴절률과 일치시키도록 polyvinylpyrrolidone(PVP) 등을 첨가하거나 희석시켜 등장액과 동일한 굴절률을 갖는 버퍼를 만든다.
이때, 사용되는 고장액 및 저장액을 만들기 위한 물질로는 스크로오스(SUCROSE)나, 마니톨(MANNITOL) 등 세포막의 이동이 불가능한 큰 분자들로 이루어진 군 중에서 선택할 수 있다.
그리고, 광원부(30)를 향하는 광 바이오 센서부(10)의 일측 면에는 광원부(30)로부터 조사된 빛을 세포로 침투시키고, 세포액의 굴절률 변화가 포함된 광을 반사시키는 역할을 하는 유리기판(130)이 형성된다.
그리고, 상기 광 바이오 센서부(10)의 외부에는 유리기판(130)을 통해 반사된 빛을 관측하여, 세포액 굴절률 변화를 통해 산 세포와 죽은 세포를 구분하여 세포 생존량을 측정하는 반사광 검출부(40)를 포함한다.
이때, 유리기판(130)의 전방의 둘레부에는 센서층(100)으로부터 내부전반사가 일어날 수 있게 하는 프리즘(140)이 형성될 수 있으며, 유리기판(130)과 광원부(30) 사이에는 편광기(320)와 원주렌즈(330)가 설치될 수 있다.
도 2는 도 1에 도시된 센서기판의 또 다른 일 실시형태를 나타낸다.
도시된 바와 같이, 세포가 부착되는 센서층(100)의 일측 면에는 세포를 포획시킬 수 있는 다수의 미세우물(MICRO-WELL) 패턴(172)이 형성된 포토레지스트층(170)이 더 형성될 수 있다.
따라서, 세포를 센서층(100)에 부착시킬 경우 다수의 미세우물 패턴(172)에 세포가 포획되어 개별세포에 대한 세포의 생존을 구별할 수 있다.이하에서는 본 발명에 따른 세포 생존량 측정 방법을 설명하여, 상기한 본 발명의 세포 생존량 측정 장치의 작용을 함께 설명하도록 한다.
이하의 설명에서 앞선 세포 생존량 측정 장치의 설명에 사용된 도면부호와 동일한 기능을 하는 구성에 대하여는 동일한 도면 부호를 붙여 설명한다.
본 발명에 따른 세포 생존량 측정 방법에 의하면, 첫 단계로서, 세포를 설치하기 위한 광 바이오 센서칩을 준비하는 단계가 진행된다.
이 단계에서, 광 바이오 센서칩으로 광이 입사되는 유리기판(130)을 70℃ ~ 90℃의 피라나 용액(PIRANHA SOLUTION, H2SO4:H2O2=3:1)에 담지시켜 표면에 흡착된 오염물질을 제거시키고, 증류수(DW; DISTILLED WATER)로 세척한 후 질소가스로 건조시킨다.
그리고, 질소가스에 의해 건조된 유리기판(130)을 전자빔 증착기에 넣고, ~1x10-6torr에서 티타늄(titanium)과, 실리카(silicon dioxide)를 연속적으로 증착시켜, 광 바이오 센서칩을 제작한다.
다음 단계로 제작된 광 바이오 센서칩의 표면에 콘카나발린A(CONCANAVALIN A)를 반응시켜 표면을 처리하는 단계가 진행될 수 있다.
광 바이오 센서칩의 표면에 콘카나발린A(CONCANAVALIN A)를 반응시키는 단계는 광 바이오 센서칩의 표면에 5N NaOH용액에서 초음파처리(SONICATION)를 하여 광 바이오 센서칩 표면에 (-) 전하가 띄게 한 후 증류수(DW; DISTILLED WATER)로 세척하고, 질소가스로 건조시킨 후 0.01% poly-L-lysine(PLL)에 넣고 흔들어 준 다음 1mg/ml(10mM PB pH5.0에)의 농도의 콘카나발린A(CONCANAVALIN A)를 떨구어 반응시키도록 한다.
다음 단계로 제작된 광 바이오 센서칩에 등장액(ISOTONIC BUFFER)을 투입하여 기준선(BASELINE)을 잡아준 후 저장액을 투입하여 상기 등장액의 굴절률과 일치되는 상기 저장액(HYPOTONIC BUFFER)을 제조하는 단계가 진행된다.
이때, 사용되는 등장액은 멸균된 PBS(PHOSPHATE BUFFERED SALINE)를 이용하는 것이 바람직하다.
즉, 멸균된 PBS로 기준선(BASELINE)을 잡아준 후 멸균된 PBS와 일치하는 굴절률을 갖는 저장액을 만들기 위해 일단 DW(증류수)에 polyvinylpyrrolidone(PVP, average MW=360KDa)을 녹인 다음, PVP의 농도를 조절하면서 멸균된 PBS를 희석시킴으로써, 저장액의 역할을 하면서도 등장액과 동일한 굴절률을 가지는 저장액으로 제조한다.
다음 단계로 광 바이오 센서칩의 표면에 세포가 놓이도록 설치하는 단계가 이루어진다.
이때, 세포는 HyClone SFM4 CHO Cell 배양 배지를 이용하여 희석시킨 후 광 바이오 센서칩에 설치하는 것이 바람직하다.
다음 단계로 세포에 상기 등장액과 상기 저장액을 교차 투입하여 삼투압의 변화를 발생시키는 단계가 진행된다.
이때, 세포에 등장액을 투입하여 기준선(BASELINE)을 확보한 후, 상기 저장액을 일정시간 투입하여 세포를 반응시키고, 다시 등장액을 투입하여 세포의 반응에 의한 부피가 원상태로 돌아오도록 삼투압의 변화를 발생시킨다.
이와 동시에 또는 다음 단계로서, 광 바이오 센서칩에 광을 조사시키는 단계 및 광 바이오 센서칩으로부터 반사되는 광을 관측하여, 세포의 삼투압 변화에 따른 굴절률의 변화를 통해 산 세포와 죽은 세포를 구분하여 생존량을 측정하는 단계가 진행된다.
이때, 본 발명에서는 광 바이오 센서칩으로 입사되는 광의 소산장(EVANESCENT FIELD)을 이용한 표면굴절률 측정 방식의 광 바이오 센서를 사용하여, 광 바이오 센서칩 표면에 접촉된 세포가 삽투압 변화를 일으킬 경우 발생되는 수분의 유입 또는 유출로 인한 세포액의 굴절률 변화를 측정하여, 산 세포와 죽은 세포를 구별하는 방식으로 세포의 생존량을 측정한다.
따라서, 본 발명에 따른 세포 생존량 측정 방법에 따르면, 기존의 염색법에 의한 세포 생존량 측정 방법과 같이, 세포에 영향을 줄 수 있는 화학물질을 첨가하지 않아도 되므로, 세포 생존량 측정에 영향을 미치지 않으며, 시간의 구애 받지 않고 실시간으로 비표지 방식에 의해 세포의 생존량을 측정할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 앞선 실시예에서 고장액 또는 저장액을 제조하는 단계 이후 광 바이오 센서칩에 세포를 설치하는 단계 이전에 상기 광 바이오 센서칩의 표면에 스핀코팅법으로 미세우물(MICRO-WELL) 패턴(172)이 형성된 포토레지스트층(170)을 형성하는 단계 및 포토레지스트층(170)의 표면에 상기 세포가 놓이도록 설치하는 단계를 수행하여, 광 바이오 센서칩의 표면에 형성된 미세우물 패턴(172)에 세포가 한 개씩 자연 포획된 후 삼투압 변화에 의해 나타나는 이미지를 측정하는 것을 특징으로 한다.
본 실시예에 따르면, 상기 포토레지스트층(170)에 형성된 미세우물 패턴(172)에 세포가 포획될 경우, 우물의 이미지가 밝아지고, 저장액을 흘렸을 때 다시 어두워지는 우물의 세포만 살아있는 것을 나타내므로, 이러한 작용을 통해 세포의 생존량을 비표지 방식으로 측정할 수 있다.
[실험예 1]
본 발명의 실험예 1에서는, 표면굴절률 측정 방식의 광 바이오 센서 중, 입사광의 소산장(EVANESCENT FIELD)의 침투깊이가 깊은 MCW(METAL CLAD WAVEGUIDE) 센서를 적용한 광 바이오 센서칩을 만들어 센서표면을 당 결합 단백질인 렉틴의 일종인 콘카나발린 A(CONCANAVALIN A)로 코팅 한 후 중국햄스터난소세포 (CHINESE HAMSTER OVARY; CHO)를 센서 칩 표면에 붙이고, 광 바이오 센서칩에 장착된 시료주입부(sample flow system; 20)를 통해 등장액과 저장액을 차례로 흘려주어 나온 시그널 변화를 관찰하였다. 이후 실제 광 바이오 센서칩에 붙어있는 세포를 트리판 블루(TRYPAN BLUE)로 염색하고 현미경으로 관찰하여 부착된 세포의 생존량을 측정한 다음, 이를 등장액을 흘렸을 때와 저장액을 흘렸을 때 픽셀(pixel)변화량 차이와 비교 분석하였다.
1-1. MCW 센서칩의 제작
유리기판(BK7,22mm x 22mm x 0.3mm; 130)을 피라나 용액(piranha solution, H2SO4:H2O2=3:1)에 80℃에서 10분간 담지시켜 표면에 흡착된 오염물질을 제거시키고, DW(DISTILLED WATER)로 세척하고 질소가스로 건조시켰다. 그 후 유리기판을 전자 빔 증착기에 넣고, ~1x10-6torr에서 티타늄(titanium)을 0.5Å/s의 속도로 9nm, 실리카(silicon dioxide)를 3.5Å/s의 속도로 320nm를 연속적으로 증착하여 MCW 센서가 적용된 광 바이오 센서칩을 제작하였다.
1-2. 콘카나발린 A(CONCANAVALIN A)로 칩 표면처리
상기 실험예 1-1에서 제조된 광 바이오 센서칩을 5N NaOH용액에서 10분간 초음파처리(SONICATION)를 하여 표면을 (-) 전하가 띄게 한 후 DW로 세척하고 질소가스로 건조시켰다. 그 후 0.01% poly-L-lysine(PLL) 500μl를 칩 위에 올려 12시간동안 30rpm으로 흔들어주며 처리하였다. 이렇게 아민기(AMINE GROUP)로 표면 개질된 광 바이오 센서칩의 표면에 50% glutaraldehyde를 10mM PB (pH7.4)로 2.5%의 농도로 희석시킨 용액 200μl를 떨구어 2시간 반응시켰다. 그 후, 당과 잘 결합하는 단백질인 콘카나발린A(CONCANAVALIN A)를 1mg/ml(10mM PB pH5.0에)의 농도가 되도록 만들고, 이 용액 200μl를 광 바이오 센서칩 위에 올려 2시간 반응시키고 DW로 다시 한번 세척하고 질소가스로 건조시켰다.
1-3. 등장액과 저장액의 굴절률 맞추기
등장액(Isotonic buffer)인 멸균된 PBS(PHOSPHATE BUFFERED SALINE)로 기준선(BASELINE)을 잡아준 후 멸균된 PBS와 굴절률은 같으며 저장액 용액을 만들기 위하여 일단 DW(DISTILLED WATER)에 100μM의 polyvinylpyrrolidone(PVP, AVERAGE MW=360KDa)을 녹인 다음, PVP의 농도를 조절하면서 멸균된 PBS를 0.531배 희석시켜 저장액(hypotonic buffer) 역할을 하면서도 등장액 용액과 굴절률을 거의 동일하게 (굴절률 차이<10-5) 갖는 용액을 만들었다. MCW 센서를 이용하여 굴절률 변화를 관측한 결과, 도 3 에서 도시된 바와 같이, 멸균된 PBS를 26μM PVP(DW)로 0.531배 희석시킨 저장액이 멸균된 PBS인 등장액과 굴절률 차이가 10-5 이하 (0.1픽셀~10-5 에 해당) 임을 확인하였다.
1-4. 광 바이오 센서칩 위에 중국햄스터난소세포 붙이기
실험에 쓰인 모든 광 바이오 센서칩의 표면에 생존량(Viability)이 95%이상 되는 중국햄스터난소세포를 HyClone SFM4 CHO Cell 배양 배지를 이용하여 1x106cells/ml의 수로 희석시킨 후, 칩에 1ml을 올리고 20분간 반응시켜 세포를 붙였다. 멸균된 PBS로 약하게 두 번 헹궈 칩에 붙지 못한 세포들을 제거하고, 칩 위에 붙어서 죽어가는 세포들의 생존량을 확인하기 위해 세포가 붙은 칩을 멸균된 PBS에 담가 놓았다.
1-5. 삼투압 변화에 대한 세포 반응 관찰
세포가 부착된 광 바이오 센서칩을 본 발명의 세포 생존량 측정 장치에 장착한 후 최초 등장액인 멸균 PBS를 10μl/min의 속도로 흘려주어 5분간 기준선(BASELINE)을 확보한 후, 상기 실험예 1-3에서 제조된 저장액 용액(멸균 PBS를 26μM의 PVP(DW)로 0.531배 희석)을 10μl/min의 속도로 10분간 흘려주었다. 그 후 저장액에 반응했던 세포가 다시 원래의 상태로 회복하기 위하여 등장액인 멸균된 PBS를 10μlmin의 속도로 5분간 흘려주어 세포의 부피가 다시 원래의 상태로 돌아오게 한 후 등장액과 저장액 환경에서의 픽셀(pixel) 변화량 차이를 분석하였다. 실험예 1-4에서 설명한 바와 같이 다양한 생존량을 보이는 세포들이 붙은 광 바이오 센서칩들을 이용해 시간이 지날수록 계속적으로 위의 과정처럼 삼투압 변화를 주었을 때 나타난 시그널을 도 4 에 나타내었다.
1-6. 광 바이오 센서칩 위의 CHO세포를 트리판 블루(TRYPAN BLUE)로 염색한 후 현미경 관찰
상기 실험예 1-5의 실험에 사용된 광 바이오 센서칩들에 설치된 세포의 생존량을 알기 위해 0.4%의 트리판 블루(trypan blue)를 멸균된 PBS로 2배 희석한 용액 1ml을 칩 위에 올려 1분 동안 반응 시킨 후 멸균된 PBS로 3번 헹궈 주었다. 그 후 도립 현미경(inverted microscope)을 이용하여 MCW 센서로 측정한 세포들을 200배로 관찰하여 나타낸 사진이 도 5 에 도시되어 있다. 이를 통해 산 세포와 죽은 세포를 구분하고 생존량을 알아낼 수 있다.
1-7. 삼투압 변화에 대한 세포의 반응도와 세포의 생존도와의 관계
실험예 1-5에서 실시한, 삼투압 변화 후 나타난 등장액과 저장액에 대한 픽셀(pixel) 변화량 차이는 결국 삼투압 변화에 대한 세포들의 반응 크기를 나타내는데, 이것이 실험예 1-6에서 측정한 세포의 생존량과 비례하는 관계가 있음을 확인 하였다. 즉, 살아 있는 세포들이 많을수록, 생존량이 높을수록 픽셀(pixel) 변화량은 크고, 반대로 살아 있는 세포들이 적어, 생존량이 낮을수록 픽셀(pixel) 변화량은 작은 결과를 나타내었다. 이러한 결과가 도 6 및 도 7 에 나타나 있다. 이들 결과로부터 광 바이오 센서칩 표면에 세포를 부착시킨 후, 삼투압 변화를 주었을 때에 대한 세포의 반응인 수분의 유입 또는 유출로 인해 세포액의 굴절률이 변하게 되며, 이를 표면굴절률 측정용 센서를 통해 굴절률 변화량을 관측함으로써, 세포와 죽은 세포를 구별하여, 최종적으로 세포 생존량을 비표지로 측정할 수 있음을 확인하였다.
[실험예 2]
본발명에 따른 실험예 2에서는 표면굴절률 측정하기 위한 광 바이오 센서칩 표면을 당 결합 단백질인 렉틴의 일종인 콘카나발린 A (CONCANAVALIN A)로 코팅 한 후 CHO 세포를 광 바이오 센서칩 표면에 붙이고 신호를 측정하는 방식인 실험예 1과는 달리 광 바이오 센서칩 표면에 미리 미세우물(MICRO-WELL) 패턴(172)을 형성시켜 각 미세우물에 세포 한 개씩 자연 포획되도록 한 후, 삼투압 변화를 주어 나타나는 반응을 이미지 측정 방식을 통해 각 세포의 개별 신호를 관측한다.
2-1. MCW 센서칩 상에 미세우물(MICRO-WELL) 패턴(172) 형성
본 발명에 따른, 실험예2를 구현하기 위해 필요한 광 바이오 센서칩 표면상의 미세우물 패턴을 형성하는 방법은 일반적인 광리소그라피 방법을 이용한다. 스핀코팅법으로 포토레지스트층(170)를 2~30mm 범위의 두께로 상기 실험예1-1의 MCW 센서로 구성된 광 바이오 센서칩 위에 코팅한 다음 그 위에 미세우물 형상이 새겨진 마스크를 올려놓고 빛을 쬐면 마스크의 패턴의 음양에 따라 포토레지스트가 감광되며 이어지는 현상단계를 거쳐 도 2에 도시된 바와 같이 광 바이오 센서칩의 표면 위에 미세우물 패턴(172)을 형성시킨다.
2-2. 미세우물에 세포 포획 후, 이미징 방식으로 관찰
세포를 함유하는 배양 현탁액을 센서표면에 흘린 후 정체시키면, 도 8에서 보는 바와 같이, 수 초 내에 세포가 가라앉아 각 우물에 세포가 포획되고, 세포가 포획된 우물의 센서표면 부근의 굴절률이 증가하므로 밝은 이미지로 변하게 된다.
2-3. 삼투압 변화에 대한 각 우물의 이미지 관찰
상기 실험예 2-2의 상태에, 저장액을 흘려서 마이너스 삼투압을 가하게 되면 세포가 포획된 우물 중 살아있는 세포만 이에 반응하여 세포액의 굴절률이 감소한다. 따라서, 도 9에서 도시된 바와 같이, 살아 있는 세포가 포획되어 있는 우물에서만 센서 시그날 및 반사광의 세기가 감소하여 어두운 이미지로 변하고, 죽은 세포의 우물 이미지는 변화가 없게 된다. 이와 같은 방식으로, 살아 있는 세포와 죽은 세포를 정확히 구분하여 포획된 전체 세포 수에 대한 살아 있는 세포 수의 비율로서 배양액 내 세포 생존량을 비표지로 정확히 측정 가능하다.
10: 광 바이오 센서부
20: 시료주입부
30: 광원부
40: 반사광 검출부
100: 센서층
130: 유리기판

Claims (10)

  1. 금속 피복 광도파로(METAL CLAD WAVEGUIDE, MCW) 센서칩 표면에 세포가 접촉되도록 설치하는 단계;
    상기 세포에 등장액(ISOTONIC BUFFER)과 고장액(HYPERTONIC BUFFER)을 교차 투입하거나 상기 등장액과 저장액(HYPOTONIC BUFFER)을 교차 투입하여 삼투압의 변화를 발생시키는 단계; 및
    상기 삼투압의 변화에 대한 반응으로서, 상기 세포의 세포막을 통해 물이 유입 또는 유출되고 이로 인한 세포액의 굴절률 변화를 상기 금속 피복 광도파로 센서칩이 장착된 금속 피복 광도파로 센서로 관측하여 산 세포와 죽은 세포를 구분하여 생존량을 측정하는 단계;
    로 이루어지는 세포 생존량 측정 방법.
  2. 삭제
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 금속 피복 광도파로 센서칩의 표면에 세포를 설치하는 방법으로서, 상기 센서칩의 표면을 콘카나발린 A(concanavalin A)로 처리하여 친화력을 이용하여 센서칩 표면에 세포를 설치하는 것;
    을 특징으로 하는 세포 생존량 측정 방법.
  4. 삭제
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 세포액의 굴절률 변화를 상기 금속 피복 광도파로 센서로 관측한 결과 얻어지는 센서 시그날로서, 반사광의 공명각도, 반사광의 위상 및 반사광 세기 변화 중 어느 하나로 선택되어지는 것을 특징으로 포함하는 세포 생존량 측정 방법.
  6. 청구항 1에 있어서,
    상기 금속 피복 광도파로 센서칩의 표면에 세포를 설치하는 방법으로서, 상기 금속 피복 광도파로 센서칩의 표면에 미세우물(MICRO-WELL) 패턴을 형성하여 세포가 침강하여 미세우물에 단순 포획되어 센서표면에 접촉되는 단계;
    를 특징으로 하는 세포 생존량 측정 방법.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 청구항 6에 있어서,
    상기 미세우물에 상기 세포가 한 개씩 단순 포획된 다음, 세포액의 굴절률 변화를 상기 금속 피복 광도파로 센서로 관측한 결과 얻어지는 센서 시그날로서 반사광 세기를 측정할 때 이미지측정을 통해 개별 세포의 생사를 측정, 분석하는 것을 특징으로 하는 세포 생존량 측정 방법
  10. 금속 피복 광도파로 센서칩의 일측 면으로 유리기판이 위치하고, 상기 유리기판상에 센서층이 형성되며, 이 센서층 면에 세포를 설치시키는 광 바이오 센서부;
    상기 광 바이오 센서부의 일측에 형성되어, 상기 세포에 삼투압 발생을 위한 시료를 공급하는 시료주입부;
    상기 광 바이오 센서부에 형성된 상기 유리기판으로 광을 조사시키는 광원부; 및
    상기 광 바이오 센서부로부터 반사되는 광을 관측하여, 상기 세포의 삼투압 변화에 따라 변화되는 세포액의 굴절률 변화를 통해 상기 세포의 생존량을 산정하는 반사광 검출부;
    를 포함하는 세포 생존량 측정 장치.
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