CN114341623A - 生物分子检测装置 - Google Patents
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Abstract
本文公开了一种用于分析细胞、囊泡或细胞或囊泡成分的生物分子检测装置（1），其包括具有光耦合单元的倏逝照明器，光耦合单元被配置成用于在倏逝照明器的第一表面上从具有预定波长的相干光（L）产生倏逝场，倏逝照明器的第一表面包括模板纳米图案（5），其包含多个预定线的相干布置，沿着所述预定线布置有用于细胞、囊泡或细胞或囊泡成分（8）的跨膜蛋白（81）、优选地可横向扩散的跨膜蛋白的结合物结构（82）的膜识别元件。膜识别元件（53）被配置成结合跨膜蛋白（81）的结合物结构（82）以基于倏逝照明器的模板纳米图案（5）在细胞、囊泡或细胞或囊泡成分（8）内形成跨膜纳米图案，使得倏逝场的光被结合到膜识别元件（53）的细胞、囊泡或细胞或囊泡成分（8）散射。预定线被布置成使得被结合到膜识别元件（53）的细胞、囊泡或细胞或囊泡成分（8）散射的光在预定检测位点（7）处相长干涉，其光程长度差是所述相干光（L）的预定波长的整数倍。
Description
技术领域
本发明属于生物分子检测装置及其用于检测生物分子相互作用、特别是细胞内或囊泡内相互作用的用途的领域。本发明进一步包括用于在细胞、囊泡、人工或细胞成分内产生跨膜纳米图案的方法。
背景技术
检测装置例如在各种各样的应用中用作生物传感器。一个特别的应用是检测或监测结合亲和力或过程。例如，在这种生物传感器的帮助下，可以执行检测靶样品与结合位点的结合的各种测定。典型地，在布置在生物传感器表面上的二维微阵列中的点处，在生物传感器上执行大量这样的测定。微阵列的使用为在高通量筛选中同时检测不同靶样品的结合亲和力或过程提供了工具。为了检测靶样品与特定结合位点结合的亲和力、靶分子与特定捕获分子结合的亲和力，将大量捕获分子固定在生物传感器外表面上的各个点处（例如通过喷墨点样或光刻）。每个点为预定类型的捕获分子形成单独的测量区。检测靶分子与特定类型的捕获分子的结合，并用于提供关于靶分子相对于特定捕获分子的结合亲和力的信息。
一种用于检测靶样品的结合亲和力的已知技术利用荧光标记。荧光标记能够在激发时发出荧光。发出的荧光具有特征发射光谱，其识别特定点处的当前荧光标记。被识别的荧光标记指示被标记的靶分子已经结合到存在于该点处的特定类型的结合位点。
在文章“zeptosens’蛋白微阵列中：“用于低丰度蛋白分析的新型高性能微阵列平台”（ Proteomics 2002，2，S. 383-393，Wiley-VCH Verlag 有限公司，69451 Weinheim，Germany）中描述了用于检测标记的靶样品的传感器。其中描述的传感器包括布置在衬底上的平面波导。平面波导具有能够在其上附着多个结合位点的外表面。此外，平面波导具有多个入耦合线，用于以这样的方式将相干光光束耦合到平面波导中，使得相干光光束沿着平面波导传播。相干光在全内反射下通过平面波导传播，相干光的倏逝场沿着平面波导的外表面传播。倏逝场在平面波导的外表面处穿透到较低折射率介质中的深度是通过平面波导传播的相干光的波长的几分之一的数量级。倏逝场激发被标记的靶样品的荧光标记，所述被标记的靶样品结合到被布置在平面波导表面上的结合位点。由于倏逝场穿透到平面波导外表面处的光学较薄介质中的深度非常小，所以只有结合到固定在平面波导外表面上的结合位点的被标记样品被激发。由这些标记发出的荧光然后在CCD摄像机的帮助下被检测到。
虽然原则上有可能使用荧光标记来检测结合亲和力，但是该技术是有缺点的，这在于检测到的信号是由荧光标记产生的，而不是由结合伴侣自身产生的。另外，标记靶样品需要额外的准备步骤。此外，标记的靶样品相对昂贵。另一个缺点是由荧光标记在靶样品处的空间位阻引起的结果失真，这可能干扰靶样品与捕获分子的结合。进一步的缺点是由于标记的光漂白或淬灭效应导致结果失真。另外，荧光标记可能显著影响感兴趣的化合物的化学、生物、药理学和物理性质。因此，仅仅依靠荧光标记的测量可能会因为这种标记的存在而失真。
发明内容
分析生物样品的关键要求是在化合物或感兴趣的结构部分与结合位点的特异性结合和非特异性结合之间进行区分。解决这一问题的已知策略（诸如表面等离子体共振（SPR）或Mach Zehnder）强烈依赖于参考测量，并且仅适合于静态条件下的测量。因此，这种技术通常不适合于高度复杂环境的测量，诸如检测活细胞内的生物分子相互作用。SPR测量传感器表面附近受体-配体结合时的折射率变化。然而，这种技术具有的缺点在于，它易受表面附近整个倏逝场体积中任何折射率变化的影响。实际上，这种传感器简单地将折射率整合到感测体积中，并且不能区分其不同的空间频率分量。因此，与传感器表面的非特异性结合以及温度梯度和不同的缓冲液组成仍然造成重大问题。
由于G蛋白偶联受体（GPCR）与许多疾病（诸如疼痛、哮喘、炎症、肥胖和癌症）的发展和进展有关，因此它们已经发展成为候选药物的特别突出的靶标，非常期望对活细胞中的这些受体进行详细分析。用于确定GPCR活性的全细胞测定传统上依赖于检测不同的细胞内第二信使（cAMP，Ca2+）、荧光标记蛋白的再定位（抑制蛋白募集到受体或受体内化）或在GPCR激活的信号传导级联控制下的报道基因的表达。然而，如上所述，荧光标记需要大量的生物分子修饰，诸如蛋白的过表达或荧光标记的引入，这并不总是可能的或合期望的，因为这些会改变细胞生理学或药物药理学。此外，GPCR通常调制多于一种效应子，这可能导致这些分析中的交叉敏感性。
无标记细胞测定（如共振波导光栅生物传感器）不需要任何分子标记。通常，这种折射传感器借助于传播限定感测体积的倏逝波来监测传感器芯片上方的折射率。细胞内容物在该感测体积内的重新分布导致折光率的整体变化，从而产生备受赞赏的动态质量重新分布（DMR）的整体图像。反过来，DMR固有地是交叉敏感性的，这意味着不同的GPCR介导的信号传导途径不能被传感器在时空上解卷积。
因此，本发明的总体目标是改进关于生物分子检测装置的现有技术，从而优选地完全或部分地避免现有技术的缺点。
在有利的实施例中，提供了一种生物分子检测装置，用于检测细胞或囊泡内的特定生物分子相互作用，优选地排除任何交叉敏感性。
在进一步有利的实施例中，提供了一种生物分子检测装置，用于特异性地监测跨膜蛋白活性，优选地排除任何交叉敏感性。
总体目标大致通过独立权利要求的主题来实现。进一步的有利和示例性实施例从说明书和附图中得出。
根据本发明的第一方面，通过一种用于分析细胞、囊泡或细胞或囊泡成分（优选活细胞）的生物分子检测装置来实现总体目标，该生物分子检测装置包括倏逝照明器，该倏逝照明器具有光耦合单元，该光耦合单元被配置成用于在倏逝照明器的第一表面上从具有预定波长的相干光产生倏逝场。倏逝照明器的第一表面包括模板纳米图案，该模板纳米图案包含多个预定线的相干布置，沿着这些预定线布置有用于细胞、囊泡或细胞或囊泡成分的跨膜蛋白（优选可横向扩散的跨膜蛋白）的结合物结构的膜识别元件。膜识别元件被配置成结合跨膜蛋白的结合物结构，用于基于倏逝照明器的模板纳米图案在细胞、囊泡或细胞或囊泡成分内形成跨膜纳米图案，使得倏逝场的光被结合到膜识别元件的细胞、囊泡或细胞或囊泡成分散射。预定线被布置成使得由结合到膜识别元件的细胞、囊泡或细胞或囊泡成分散射的光在预定检测位点处相长干涉，其中光程长度差是相干光的预定波长的整数倍。如技术人员所理解的，光程长度指的是特异性膜识别元件和预定检测位点之间的距离。如技术人员所理解的，倏逝照明器是能够从光源的相干光产生倏逝场的元件。
通常，细胞可以是活细胞。细胞成分可以例如仅是细胞的一部分，特别是仅是细胞膜或细胞隔室的一部分。
多条预定线通常被配置成充当具有多条光栅线的光学光栅的模板，所述光栅线诸如是凹槽、细长突起、折射率周期性变化的材料等。优选地，这些线是化学预限定的。沿着这些线布置的是膜识别元件，其可以用作用于结合物结构、特别是细胞、囊泡或细胞或囊泡成分的细胞外结合物结构的结合位点。优选地，膜识别元件被配置成特异性地结合到感兴趣的跨膜蛋白的结合物结构。因此，只有感兴趣的跨膜蛋白可能够结合到膜识别元件，而其他蛋白不能结合到膜识别元件。膜识别元件通常与预定线共价结合。
在一些典型的实施例中，预定线被没有识别元件的区域彼此分开。例如，没有识别元件的区域可以任选地包含连接物，其结合到倏逝照明器的第一表面，特别是平面波导，其中连接物包括具有不能结合到跨膜蛋白的结合物结构的结构部分的末端部分。
通过选择性结合在可细胞内横向扩散的跨膜蛋白，模板纳米图案允许将生物分子检测装置的模板纳米图案转移到活细胞中，从而在细胞自身中产生跨膜纳米图案。通常，多种不同预定线的膜识别元件结合到同一细胞，即多于一种的膜识别元件结合到或被配置成结合到单个细胞、囊泡或细胞或囊泡成分。因此，涉及跨膜蛋白相互作用的任何生物分子相互作用、甚至细胞间或细胞内过程都可以被选择性地检测到。在膜识别元件和跨膜蛋白的结合物结构之间结合时，倏逝光被散射并在预定检测位点处相长干涉。散射光的相长干涉与所有结合的跨膜蛋白相关，并产生测量强度相对于跨膜蛋白数量的二次标度。重要的是，未结合到分子识别元件的背景分子的随机散射以相等的概率相长和相消地干涉。结果，有效地抑制了交叉敏感性。令人惊讶的是，即使活细胞以及还有囊泡包括纳米尺度的高度不平坦的表面，但是由于任何细胞散射、特别是膜散射，几乎没有观察到任何交叉敏感性。虽然活细胞的测量可能容易被对在结合的膜识别元件处散射的光施加影响的信号干扰，但是还没有观察到敏感性的显著损失。这是令人惊讶的，因为细胞、囊泡或细胞成分显著大于纳米图案的预定线之间的距离。因此，通常在本文公开的实施例中，多种不同预定线的膜识别元件结合到同一细胞。通常，两条直接相邻的预定线之间的距离是单个细胞的2分之一至100分之一，优选10分之一至50分之一。
在一些实施例中，倏逝照明器包括或者是载体，其具有布置在载体表面上的平面波导，并且包括作为光耦合单元的光耦合器，该光耦合器用于将预定波长的相干光耦合到波导中，使得相干光通过平面波导传播，其中相干光的倏逝场沿着平面波导的第一表面传播，并且其中平面波导的第一表面包括模板纳米图案。
在一些实施例中，倏逝照明器是全内反射系统，其被配置成用于借助于光耦合单元、特别借助于棱镜或任何其他合适的光学元件，以预定波长并以预定角度将相干光的光束提供到倏逝照明器的第一表面上。
通常，为倏逝照明器供能的相干光源和/或沿平面波导传播的相干光具有预定波长，并且优选是单色的。通常，可以使用可见光或近红外光。相干倏逝场被散射中心散射，所述散射中心由结合到膜识别元件的细胞、囊泡或细胞成分形成，所述膜识别元件布置在不同的预定线上。在任何位置处的散射强度可以通过首先将来自每个单独的散射中心的电场贡献相加并且然后将得到的相量进行平方来确定。当跨膜成分被布置到纳米图案时，散射强度的最大值位于预定检测位置处，因为预定线被布置成使得在预定检测位置处，由不同散射中心散射的光的光程长度相差光波长的整数倍。因此，由结合到膜识别元件的细胞、囊泡或细胞成分散射的光在预定检测位置处相长干涉。源自预定线的位置的任何散射光都满足相长干涉的要求。预定检测位置处的强度图案优先形成但不限于衍射受限的艾里斑（Airy disk）。本质上，傅立叶光学可以得到的任何形状都是可能的。对于任何形状，使用匹配的滤波器都可以最好地恢复信号。
嵌入在平面偏振光中折射率为n0的介质中的折射率为nR的隔离膜识别元件-跨膜复合体的散射为：
其中，
r是从感趣的化合物到检测位点的距离，
λ是真空波长
IR是入射到跨膜复合物上的平面偏振场的强度
VR是跨膜复合物的体积；
并且其中
MR是跨膜复合物的摩尔质量，
NA是阿伏伽德罗常数，
因此，散射光的强度提供了在跨膜蛋白参与的生物分子相互作用期间发生的分子质量增加的途径。例如，如果某种信使化合物结合到跨膜蛋白，则生物分子检测装置允许计算质量增加。此外，由于质量增加，甚至可以观察到受体的二聚化，而没有任何交叉敏感性。
在倏逝照明器包括平面波导的情况下，平面波导通常具有在几百纳米范围内的厚度，即小于1 mm，特别是小于300 nm，优选在100和200 nm之间。根据本文的任何实施例的倏逝照明器通常具有高达1 cm的厚度，特别是高达0.8 mm的厚度，用于稳定波导。倏逝场呈指数下降，并且通常至少到达细胞、囊泡或细胞或囊泡成分的膜。例如，倏逝场可穿透高达80至100nm的细胞、囊泡或细胞或囊泡成分。原则上，通过在包括平面波导的实施例中调整波导参数或波长，以及在全内反射的实施例的情况下调整全内反射的波长和角度，可以使穿透深度适应于应用。
在进一步的实施例中，膜识别元件是至少对跨膜蛋白的结合物结构具有特异性的抗体。替代地，膜识别元件包含用于与跨膜蛋白的结合物结构、特别是鸟嘌呤或胞嘧啶衍生物建立共价键的亲电子部分。替代地，可以采用亲核部分。
在一些实施例中，所述多条预定线包括具有曲率的曲线，所述曲率被配置成使得由结合到膜识别元件的细胞、囊泡或细胞或囊泡成分散射的倏逝场的光在预定检测位点处干涉。
优选地，模板纳米图案的整体形状可以是圆状的，特别是圆形。在涉及平面波导的实施例中，它优选地可以是正方形的，以避免导模的透镜效应。
在优选实施例中，曲线以相邻线在光传播方向上之间的距离减小的方式布置，用于将由细胞、囊泡或细胞或囊泡成分散射的光聚焦到预定检测位点。替代地，多条预定线可以包括与光的传播方向成预定角度布置的直线，使得衍射光耦合到另一波导模式（布拉格条件）。可以采用附加的物理出耦合器来将衍射光聚焦到预定检测位点中。替代地，所述多条预定线可以包括直线或几乎直线，这些直线被布置成与光的传播方向成预定角度，使得衍射光形成自由传播的光束，该光束被检测器的透镜或透镜系统聚焦。在进一步的实施例中，预定线的相邻线之间的距离可以小于1.5 μm，优选小于1 μm。
在某些实施例中，预定线的相干布置包括圆形轮廓，其中圆形轮廓具有高达1000μm、优选高达500μm的直径。
在一些实施例中，识别元件的数量高达每平方毫米1010个，优选每平方毫米107至1010个。
在进一步的实施例中，倏逝照明器的第一表面包括细胞粘着剂。细胞粘着剂可以例如包括具有整联蛋白结合肽的分子（诸如RGD、YIGSR、IKVAV等），或其他细胞结合分子，诸如硫酸软骨素、透明质酸等。替代地或附加地，细胞粘着剂可以包含带正电荷的聚合物，诸如多聚赖氨酸和/或天然细胞粘着剂，诸如纤连蛋白、胶原、玻连蛋白、层粘连蛋白或其他合适的细胞粘着剂。
在一些实施例中，至少一种细胞、囊泡或细胞或囊泡成分优选经由跨膜蛋白的细胞外或囊泡外结合物结构结合到膜识别元件。
在某些实施例中，相邻的预定线之间的距离在倏逝场的光传播方向上减小。
在进一步的实施例中，所述多条预定线以这样的方式布置在倏逝照明器的外表面上，使得它们在xj、yj坐标中的位置由以下等式几何地定义：
其中，
λ是传播光的真空波长；
N是平面波导中导模的有效折射率；N取决于平面波导的厚度、载体的折射率、平面波导的第一表面上的介质的折射率以及导模的偏振；在全内反射系统的情况下，N可以经由全内反射角θTIR来表达：
ns是载体的折射率
f是预定检测位置的焦距；
A0是一整数，其被选择为接近于产品折射率ns和载体的预定检测位置的焦距f除以波长λ；
j是指示相应线的分度的连续整数。
所选的整数A0在具有负j值的线的中心处分配负x值，并且在具有正j值的线的中心处分配正x值。或者换句话说，整数A0定义x，y坐标系的原点，该坐标系用于倏逝照明器的外表面处的线的位置；所选A0值将检测位置置于x=0，y=0，z=-f处。
在一些实施例中，平面波导的折射率nw比载体的折射率ns基本上更高，并且其也比平面波导的第一表面上的介质的折射率nmed基本上更高。倏逝场的预定波长的光通常可以具有在40 nm至200 nm范围内的穿透深度。术语“基本上更高”应理解为表示允许光入耦合进入平面波导中的折射率差，在平面波导中光在全内反射下传播。沿着平面波导传播的光具有沿着平面波导的外表面传播的倏逝场。倏逝场具有依赖于折射率nmed、参数N（在平面波导的情况下，这是有效折射率）以及传播光的波长的穿透深度，使得穿透深度可以被调整，使得倏逝场的光被结合到位于外表面上的预定线上或附近的膜识别元件的细胞、囊泡或细胞或囊泡成分相干散射。上述穿透深度的近似值应理解为明确包括其确切的边界值。
在平面波导的进一步实施例中，光耦合器和模板纳米图案之间的距离可以在几厘米到1毫米的范围内，诸如，例如5厘米到1毫米。
在某些实施例中，载体可以由玻璃或透明聚合物制成。波导的示例性材料是过渡金属氧化物，诸如氧化钽。
在一些实施例中，光耦合器可以包括多条光栅线，特别是直光栅线，其垂直于光的传播方向，用于允许相干光在预定角度下相干耦合到平面波导中。
在某些实施例中，生物分子检测装置可以包括多于一个的模板纳米图案。例如，该装置可以包括多于一个的波导，每个波导包括单个纳米图案，或者一个或多个波导每个可以包括一个或多个模板纳米图案，它们可以任选地叠加在彼此顶部上。
在一些实施例中，预定线被没有膜识别元件的区域彼此分开。这些区域被配置成逆转光学调制，所述光学调制是由结构识别元件与跨膜蛋白的结合物结构的结合而诱导的，使得从结构识别元件与跨膜蛋白的结合物结构的结合而获得的信号在生物分子检测装置的不同操作窗口中提供，如与从结构识别元件与没有膜识别元件的区域的生物分子检测装置的跨膜蛋白的结合物结构的结合而获得的信号相比，所述信号被配置成逆转光学调制。优选地，从结构识别元件与跨膜蛋白的结合物结构的结合获得的信号接近于零，优选基本为零。因此，从结构识别元件与跨膜蛋白的结合物结构的结合获得的信号被没有识别元件的区域抵消。由于信噪比在测量点处强度基本为零时最佳，因此这种生物分子检测装置允许更好地检测细胞内或囊泡内的相互作用，诸如药物或信使分子与受体的结合。
在某些实施例中，没有识别元件的区域包括被配置成用于逆转光学调制的偏置质量，其通过结构识别元件与跨膜蛋白的结合物结构的结合而被诱导。典型地，偏置质量与跨膜蛋白的质量相匹配，该跨膜蛋白被配置成结合到生物分子检测装置的结构识别元件。
在一些实施例中，偏置质量是非吸收性纳米粒子或聚合物分子，诸如蛋白。
根据本发明的另一方面，通过使用根据本文描述的任一实施例的生物分子装置来检测与细胞、囊泡或细胞成分相关联的分子相互作用，实现了总体目标。特别地，该用途可以是用于检测生物分子相互作用的方法。
在一些实施例中，所述用途包括：提供根据本文描述的任何实施例的生物分子检测装置；将细胞或囊泡应用于膜识别元件，其中所述细胞或囊泡包括膜和具有细胞外或囊泡外结合物结构的至少一种跨膜蛋白；任选地沿着膜横向扩散至少一种跨膜蛋白；根据倏逝照明器的第一表面的模板纳米图案对准细胞或囊泡的至少一种跨膜蛋白，使得在细胞或囊泡的膜中形成跨膜纳米图案，其中跨膜纳米图案至少部分地对应于倏逝照明器的第一表面的模板纳米图案；在相对于多条预定线的预定光束产生位置处产生相干光的光束，所述相干光的光束具有预定波长，并且以这样的方式入射到具有结合的跨膜蛋白的膜识别元件上，使得相干光的入射光束的衍射部分在预定检测位点处相对于多条预定线相长干涉，其光程长度差是相干光的预定波长的整数倍，以提供代表具有在预定检测位点处结合到其上的细胞、囊泡或细胞或囊泡成分的跨膜蛋白的膜识别元件的信号；测量代表具有结合到其上的细胞、囊泡或细胞或囊泡成分的跨膜蛋白的膜识别元件的信号。
因此，这种实施例利用了跨膜蛋白能够在细胞膜或囊泡膜内横向扩散的性质。因此，一旦细胞外或囊泡外结合结构接近生物分子检测装置的膜识别元件，结合发生，并且跨膜蛋白被锁定在该位置中。用多种跨膜蛋白重复该过程，从而在细胞、囊泡或细胞或囊泡成分的膜内产生纳米图案，即跨膜蛋白纳米图案或通常的跨膜分子纳米图案，其至少部分或全部对应于生物分子检测装置的模板纳米图案。
在进一步的实施例中，该用途还包括将代表具有结合到其上的细胞、囊泡或细胞或囊泡成分的跨膜蛋白的膜识别元件的测量信号和仅代表膜识别元件的未结合信号进行比较的步骤。该步骤是优选的，但不是关键的，因为它可以导致定量结果，例如，当确定相互作用化合物的质量时。
在一些实施例中，从没有膜识别元件的区域获得的信号逆转光学调制，其是通过结构识别元件与跨膜蛋白的结合物结构的结合被诱导的，使得从结构识别元件与跨膜蛋白的结合物结构的结合所获得的信号在生物分子检测装置的不同操作窗口中提供，其中优选地，不同操作窗口处于接近于零的强度。因此，从结构识别元件与跨膜蛋白的结合物结构的结合中获得的信号被没有识别元件的区域抵消。由于信噪比在测量点处强度基本为零时是最佳的，因此这种生物分子检测装置允许更好地检测细胞内或囊泡内的相互作用，诸如药物或信使分子与受体的结合。
在进一步的实施例中，没有识别元件的区域包括被配置成用于逆转光学调制的偏置质量，其是通过结构识别元件与跨膜蛋白的结合物结构的结合被诱导的。通常，偏置质量与跨膜蛋白的质量相匹配，该跨膜蛋白被配置成结合到生物分子检测装置的结构识别元件。在一些实施例中，偏置质量是纳米颗粒或聚合物分子，诸如蛋白。
在某些实施例中，将细胞应用于膜识别元件，并且其中，在产生相干光的光束之前且优选在对准跨膜蛋白和形成跨膜纳米图案之后，对细胞进行修饰，使得只有部分细胞膜保留在生物分子检测装置上。
在一些实施例中，将遗传修饰的细胞或囊泡应用于膜识别元件，特别是被修饰的细胞或囊泡，使得其包含跨膜蛋白的至少一种结合物结构，所述结合物结构被配置成结合到生物分子检测装置的膜识别元件。这种细胞允许使用专门设计的跨膜蛋白，其可以被对应的膜识别元件特异性地识别。
在进一步的实施例中，除了例如经由跨膜蛋白将跨膜结合到预定线上的膜识别元件所需的结合位点之外，跨膜蛋白可被工程化以包含附加的细胞外结合位点或细胞内结合位点。附加的结合位点可以是例如HA（人流感血凝素）、FLAG或6His亲和力标签或允许分子与已知分子质量结合的任何部分。这可以在细胞内自动表达或添加到装置。这样做的优点是可以精确定量预定线上的固定的跨膜蛋白的数量。荧光成像可用于确定细胞的数量，这允许量化每个细胞的固定的跨膜蛋白的平均数量。
在进一步的实施例中，跨膜蛋白的结合物结构对沿着生物分子检测装置的倏逝照明器的预定线布置的抗体是特异性的。
在一些实施例中，相干光的光束仅在预定结合时间之后产生。例如，结合时间可以少于4小时，特别是少于2小时。在某些实施例中，预定结合时间可以是在细胞、囊泡或细胞或囊泡成分被应用到膜识别元件之后的0.5至4小时，特别是1.5至3小时。已经观察到，在该时间段之后，大量的跨膜蛋白结合到膜识别元件，并且纳米图案在膜内建立。显然，如果要观察到纳米图案的形成，可以在应用细胞、囊泡或细胞或囊泡成分之后伴随地或直接地产生相干光的光束。
在一些实施例中，跨膜蛋白包括细胞内或囊泡内荧光蛋白或与其他细胞内元件相互作用的蛋白。因此，生物分子检测装置可以与现有技术的荧光光谱学相结合。如果细胞内或囊泡内蛋白被配置成与附加的细胞内元件相互作用，则可以观察到完整的细胞内信号传导途径，因为附加的细胞元件的相互作用的质量增加带来测量信号强度的变化。
在进一步的实施例中，生物分子相互作用的感兴趣的蛋白包括高质量部分。使用这种高质量部分是有益的，因为较高的分子质量对获得的信号强度具有有益的影响，因此甚至使得能够进行单细胞测量。正如技术人员所理解的，高质量部分通常具有比跨膜蛋白的其余部分显著更大的分子量。例如，高质量部分可以具有150 kDa或更大的分子量。
在一些实施例中，另外，特别是同时，记录荧光信号和/或生物发光信号和/或折射信号。在涉及导波的实施例的情况下，特别是在平面波导中，构成倏逝照明器的第一表面上的总质量变化的折射信号可以根据预定检测位置的位移来确定。
f是预定检测位置的焦距
tcff是导模的有效厚度
N是导模的有效折射率，
nc是覆盖介质的折射率，
nf是波导膜的折射率
在进一步的实施例中，将单个细胞或单个囊泡应用于膜识别元件，或者将多个囊泡细胞应用于膜识别元件。
在一些实施例中，所应用的的细胞的细胞密度为0.001至0.02个细胞/μm2，优选为0.005至0.01个细胞/μm2。在其它实施例中，囊泡密度在高达200、优选高达100个囊泡/μm2的范围内。
在进一步的实施例中，代表膜识别元件与结合到其上的细胞、囊泡或细胞或囊泡成分的跨膜蛋白的分子相互作用的信号与跨膜蛋白与细胞间成分的直接或间接分子相互作用相关联。
在一些实施例中，测量代表膜识别元件与在预定检测位点处结合到其上的细胞、囊泡或细胞或囊泡成分的跨膜蛋白的分子相互作用的信号的步骤执行多次，特别是在规则的预定时间间隔内。
在进一步的实施例中，在至少一些测量中获得的信号与跨膜蛋白与细胞间成分的直接或间接分子相互作用相关联，该分子相互作用不同于先前测量期间测量的分子相互作用。
根据本发明的另一个方面，通过在细胞、囊泡或细胞或囊泡成分内产生跨膜纳米图案的方法来实现总体目标，该方法包括：提供根据本文所述任一实施例的生物分子检测装置，将细胞或囊泡应用于膜识别元件，其中细胞或囊泡包括膜和具有细胞外或囊泡外结合物结构的至少一种跨膜蛋白，任选地沿着膜横向扩散至少一种跨膜蛋白，将所述至少一种跨膜蛋白的细胞外结合结构结合到任何膜识别元件，并根据倏逝照明器第一表面的模板纳米图案对准所述至少一种跨膜蛋白，使得在细胞或囊泡的膜中形成跨膜纳米图案，其中跨膜图案至少部分或全部对应于倏逝照明器第一表面的模板纳米图案。
在一些实施例中，将遗传修饰的细胞或囊泡应用于膜识别元件，特别是被修饰的细胞或囊泡，使得其包含跨膜蛋白的至少结合物结构，所述结合物结构被配置成结合到生物分子检测装置的膜识别元件。
在进一步的实施例中，应用细胞、囊泡或细胞或囊泡成分直到在膜中形成跨膜纳米图案之间的时间范围为从0.5至4小时，优选0.5至3小时。
在一些实施例中，跨膜蛋白的细胞外结合物结构对沿着生物分子检测装置的倏逝照明器的预定线布置的抗体是特异性的。优选地，抗体被配置成识别跨膜蛋白的亲和力标签。亲和力标签可以是例如HA（人流感血凝素）、FLAG或6His亲和力标签。
在一些实施例中，跨膜蛋白包括细胞内或囊泡内荧光蛋白或被配置成用于与其他细胞内元件相互作用的蛋白。优选地，该蛋白被配置成用于与其他细胞内元件特异性地相互作用。
在一些实施例中，单个细胞或单个囊泡被应用于膜识别元件，或者其中，多个囊泡细胞被应用于膜识别元件。
在进一步的实施例中，施加的细胞的细胞密度为0.001至0.02个细胞/μm2，优选0.005至0.01个细胞/μm2。
通过以下条款进一步描述本发明：
条款1：一种用于分析细胞、囊泡或细胞或囊泡成分的生物分子检测装置（1），包括倏逝照明器，该倏逝照明器具有光耦合单元，该光耦合单元被配置成用于在倏逝照明器的第一表面上从具有预定波长的相干光产生倏逝场，该倏逝照明器的第一表面包括模板纳米图案（5），其包含多个预定线的相干布置，沿着所述预定线布置有用于细胞、囊泡或细胞或囊泡成分（8）的跨膜蛋白（81）、优选可横向扩散的跨膜蛋白的结合物结构（82）的膜识别元件，其中膜识别元件（53）被配置成结合跨膜蛋白（81）的结合物结构（82）以用于基于倏逝照明器（3）的模板纳米图案（5）在细胞、囊泡或细胞或囊泡成分（8）内形成跨膜纳米图案，使得倏逝场的光被结合到膜识别元件（53）的细胞、囊泡或细胞或囊泡成分（8）散射，并且其中，预定线被布置成使得被结合到膜识别元件（53）的细胞、囊泡或细胞或囊泡成分（8）散射的光在预定检测位点（7）处相长干涉，其光程长度差是相干光（L）的预定波长的整数倍。
条款2：根据条款1所述的生物分子检测装置（1），其中，所述倏逝照明器包括载体（2）和作为光耦合单元的光耦合器（4），所述载体具有布置在所述载体表面上的平面波导（3），所述光耦合器用于将预定波长的相干光（L）耦合到所述波导（3）中，使得所述相干光通过所述平面波导（3）传播，其中所述相干光（L）的倏逝场沿着所述平面波导（3）的第一表面传播，并且其中，所述平面波导的第一表面包括所述模板纳米图案（5）。
条款3：根据条款1所述的生物分子检测装置（1），其中，所述倏逝照明器是全内反射系统（□），其被配置成用于借助于所述光耦合单元、特别是借助于棱镜，以预定波长且以预定角度将相干光（L）的光束提供到所述倏逝照明器的第一表面上。
条款4：根据前述条款中任一项所述的生物分子检测装置（1），其中，所述膜识别元件（53）是至少特异于跨膜蛋白（81）的结合物结构（82）的抗体，或者其中，所述膜识别元件（53）包含用于与跨膜蛋白（81）的结合物结构（82）、特别是鸟嘌呤或胞嘧啶衍生物建立共价键的亲电子部分。
条款5：根据前述条款中任一项所述的生物分子检测装置，其中，所述多条预定线包括具有曲率的曲线，所述曲率被配置成使得由结合到膜识别元件的细胞、囊泡或细胞或囊泡成分散射的倏逝场的光在预定检测位点处干涉。
条款6：根据条款3的生物分子检测装置，其中，预定线的相干布置包括圆形轮廓，其中，圆形轮廓具有高达1000 μm、优选高达500 μm的直径。
条款7：根据前述条款中任一项所述的生物分子检测装置，其中，识别元件的数量高达1010个/mm2。
条款8：根据前述条款中任一项所述的生物分子检测装置，其中，所述倏逝照明器的第一表面包括细胞粘着剂。
条款9：根据前述条款中任一项所述的生物分子检测装置，其中，至少一种细胞、囊泡或细胞或囊泡成分经由跨膜蛋白的结合物结构结合到膜识别元件。
条款10：根据前述条款中任一项所述的生物分子检测装置，其中所述预定线被没有膜识别元件的区域彼此分开，并且其中，所述没有膜识别元件的区域被配置成逆转光学调制，所述光学调制是通过结构识别元件与跨膜蛋白的结合物结构的结合而诱导的，使得在生物分子检测装置的不同操作窗口中提供从结构识别元件与跨膜蛋白的结合物结构的结合获得的信号，其中不同操作窗口处于接近于零的强度。
条款11：根据条款8所述的生物分子检测装置，其中，没有识别元件的区域包括被配置成用于逆转光学调制的偏置质量。
条款12：根据条款1至9中任一项所述的生物分子检测装置用于检测与细胞、囊泡或细胞成分相关联的分子相互作用的用途。
条款13：根据条款10所述的用途，其中：
- 提供根据条款1至11中任一项所述的生物分子检测装置；
- 将细胞或囊泡应用于膜识别元件，其中细胞或囊泡包括膜和具有细胞外或囊泡外结合物结构的至少一种跨膜蛋白；
- 任选地，至少一种跨膜蛋白沿着膜横向扩散；
- 根据倏逝照明器的第一表面的模板纳米图案对准细胞或囊泡的至少一种跨膜蛋白，使得在细胞或囊泡的膜中形成跨膜纳米图案，其中，跨膜图案至少部分地对应于倏逝照明器的第一表面的模板纳米图案；
- 在相对于多条预定线的预定光束产生位置处产生相干光的光束，所述相干光的光束具有预定波长，并且以这样的方式入射到具有结合的跨膜蛋白的膜识别元件上，使得相干光的入射光束的衍射部分在预定检测位点处相对于多条预定线相长干涉，其光程长度差是相干光的预定波长的整数倍，以提供代表具有在预定检测位点处结合到其上的细胞、囊泡或细胞或囊泡成分的跨膜蛋白的膜识别元件的信号；
- 测量代表具有结合到其上的细胞、囊泡或细胞或囊泡成分的跨膜蛋白的膜识别元件的信号。
条款14：根据条款11所述的用途，还包括将代表具有结合到其上的细胞、囊泡或细胞或囊泡成分的跨膜蛋白的膜识别元件的测量信号与仅代表膜识别元件的未结合信号进行比较的步骤。
条款15：根据条款10至12中任一项所述的用途，其中，将细胞应用于膜识别元件，并且其中，在产生相干光光束之前，并且优选地在对准跨膜蛋白和形成跨膜纳米图案之后，对细胞进行修饰，使得只有部分细胞膜保留在生物分子检测装置上。
条款16：根据条款10至13中任一项所述的用途，其中，将遗传修饰的细胞或囊泡应用于所述膜识别元件，特别是修饰成使得其至少包含跨膜蛋白的结合物结构的细胞或囊泡，所述结合物结构被配置成结合到所述生物分子检测装置的膜识别元件。
条款17：根据条款10至14中任一项所述的用途，其中，所述跨膜蛋白的结合物结构对沿着所述生物分子检测装置的倏逝照明器的预定线布置的抗体是特异性的。
条款18：根据条款10至15中任一项所述的用途，其中，产生相干光的光束仅在预定的结合时间之后执行。
条款19：根据条款10至16中任一项所述的用途，其中，所述跨膜蛋白包括细胞内或囊泡内荧光蛋白或与其他细胞内元件相互作用的蛋白。
条款20：根据条款10至17中任一项所述的用途，其中，所述生物分子相互作用的感兴趣的蛋白包括高质量部分。
条款21：根据条款10至18中任一项所述的用途，其中另外地，特别是同时地，记录荧光和/或生物发光信号。
条款22：根据条款10至19中任一项所述的用途，其中，将单个细胞或单个囊泡应用于所述膜识别元件，或者其中，将多个囊泡细胞应用于所述膜识别元件。
条款23：根据条款10至20中任一项所述的用途，其中，所应用的细胞的细胞密度为0.001至0.02个细胞/μm2，优选0.005至0.01个细胞/μm2。
条款24：根据条款10至21中任一项所述的用途，其中，代表膜识别元件与结合到其上的细胞、囊泡或细胞或囊泡成分的跨膜蛋白的分子相互作用的信号与跨膜蛋白与细胞间成分的直接或间接分子相互作用相关联。
条款25：根据条款10至22中任一项所述的用途，其中，测量代表膜识别元件与在预定检测位点处结合到其上的细胞、囊泡或细胞或囊泡成分的跨膜蛋白的分子相互作用的信号的步骤执行多次，特别是在规则的预定时间间隔内。
条款26：根据条款23所述的用途，其中，在至少一些测量中获得的信号与跨膜蛋白与细胞间成分的直接或间接分子相互作用相关联，所述分子相互作用不同于在先前测量期间测量的分子相互作用。
条款27：根据条款10至24中任一项所述的用途，其中，除了将跨膜蛋白结合到预定线上的膜识别元件所需的结合位点之外，所述跨膜蛋白被工程化以包含附加的细胞外结合位点或细胞内结合位点。
条款28：一种用于在细胞、囊泡或细胞或囊泡成分内产生跨膜纳米图案的方法，该方法包括：
- 提供根据条款1至11中任一项所述的生物分子检测装置；
- 将细胞或囊泡应用于膜识别元件，其中，所述细胞或囊泡包括膜和具有细胞外或囊泡外结合物结构的至少一种跨膜蛋白；
- 任选地沿着膜横向扩散至少一种跨膜蛋白；
- 将所述至少一种跨膜蛋白的细胞外结合结构结合到任何膜识别元件，并根据所述消逝照明器的第一表面的模板纳米图案对准所述至少一种跨膜蛋白，使得在所述细胞或囊泡的膜中形成跨膜纳米图案，其中，所述跨膜图案至少部分对应于所述消逝照明器的第一表面的模板纳米图案。
条款29：根据条款26所述的方法，其中，将遗传修饰的细胞或囊泡应用于所述膜识别元件，特别是被修饰成使得其至少包含跨膜蛋白的结合物结构的细胞或囊泡，所述结合物结构被配置成结合到所述生物分子检测装置的膜识别元件。
条款30：根据条款26或27中任一项所述的方法，其中，在应用细胞、囊泡或细胞或囊泡成分直到在膜中形成跨膜纳米图案之间的时间范围为0.5至4小时，优选1.5至3小时。
条款31：根据条款26至28中任一项所述的方法，其中，所述跨膜蛋白的结合物结构对沿着所述生物分子检测装置的倏逝照明器的预定线布置的抗体是特异性的。
条款32：根据条款26至29中任一项所述的方法，其中，所述跨膜蛋白包括细胞内或囊泡内荧光蛋白或与其他细胞内元件相互作用的蛋白。
条款33：根据条款25至30中任一项所述的方法，其中，将单个细胞或单个囊泡应用于所述膜识别元件，或者其中，将多个囊泡细胞应用于所述膜识别元件。
条款34：根据条款26至31中任一项所述的方法，其中，所施加的细胞的细胞密度为0.001至0.02个细胞/μm2，优选0.005至0.01个细胞/μm2。
附图说明
图1示出了根据本发明第一实施例的生物分子检测装置的示意性表示；
图2示出了根据本发明另一实施例的生物分子检测装置的示意性横截面图；
图3a和3b示出了根据本发明实施例的生物分子检测装置的细胞膜和波导的放大图；
图4a至4c示出了在细胞、囊泡或细胞或囊泡成分内产生纳米图案期间，通过根据本发明实施例的生物分子检测装置获得的信号。
图5a和5b示出了通过将HEK293细胞应用于根据本发明的生物分子检测装置并进一步刺激和抑制β2ARs而获得的信号。
图6a和6b示出了通过将HEK293细胞应用于根据本发明的生物分子检测装置并进一步应用脱靶刺激物（图6a）以及具有靶刺激物的阳性对照（图6b）而获得的信号。
图7a和7b示出了根据本发明另一实施例的生物分子检测装置的示意性表示。
图8a和8b示出了根据本发明另一实施例的生物分子检测装置的示意性表示。
具体实施方式
图1示出了根据本发明实施例的生物分子检测装置1。生物分子检测装置1包括倏逝照明器，在该实施例中，该倏逝照明器包括具有表面的载体2，平面波导3布置在该表面上。检测装置还包括光耦合器4，用于将预定波长的相干光L耦合到平面波导3中，使得相干光通过平面波导传播，其中相干光的倏逝场沿着平面波导3的第一表面传播。平面波导的第一表面是背离载体2的表面，即在图1中可见的表面。除了光耦合器4之外，波导3的第一表面还包括模板纳米图案5，该模板纳米图案5包含多条预定线，膜识别元件沿着这些预定线布置（图1中未示出）。通常，光源6用于朝向光耦合器4提供相干光L的入射光束。光耦合器4将相干光L耦合到平面波导3中，在平面波导3上，相干光L沿着图1所示的箭头方向朝向模板纳米图案5传播。如果膜识别元件结合到细胞、囊泡或细胞或囊泡成分，则光被散射，并且由于预定线，这些线被布置成使得由结合到膜识别元件的细胞、囊泡或细胞或囊泡成分散射的光在预定检测位点7处相长干涉。在所示的特定实施例中，预定线是具有曲率的曲线，该曲率被配置成使得由结合到膜识别元件的细胞、囊泡或细胞或囊泡成分散射的倏逝场的光在预定检测位点7处干涉。模板纳米图案5的每个膜识别元件和检测位点7之间的距离被称为光程长度。
图2图示了图1所示的生物分子检测装置1沿着光L穿过平面波导3的传播方向穿过模板纳米图案5的示意性横截面。装置1包含载体2，在其表面上布置有波导3。活细胞8布置在平面波导3的第一表面的顶部上。此外，模板纳米图案5包括脊51和凹槽52。脊51是膜识别元件沿其布置的区域。凹槽52是不包含任何膜识别元件的区域。因此，细胞8的跨膜蛋白的结合物结构只能在对应的脊处结合到纳米图案5。应当注意，细胞、纳米图案、波导和载体的宽度不提供它们实际宽度或宽度比的任何指示。
图3a示出了直接在细胞8已经被应用于波导的第一表面之后，图2的生物分子检测装置的放大示意图。该细胞包括具有细胞外结合物结构82的跨膜蛋白81。在所示的特定实施例中，跨膜蛋白是G蛋白偶联受体（GPCR）。波导的模板纳米图案包括具有脊51的预定线，脊51包括膜识别元件53。如可以看出，跨膜蛋白的结合物结构82还不能与膜识别元件53相互作用。
在图3b的下部部分中，GPCR在膜内横向扩散，由此使得细胞外结合物结构能够与膜识别元件结合。结果，每个结合的GPCR被锁定在膜内的特异性位置处。结合到膜识别元件的所有GPCR的总体布置是对应于波导的模板纳米图案的纳米图案。换句话说，波导的模板纳米图案已经转化到细胞中。图3b的上部部分图示了配体86与形成在膜中的纳米图案的细胞外部分的结合（i）。配体的附着带来质量增加，这提供了测量信号的增加。配体86的结合导致细胞内相互作用。G蛋白信号传导受到配体结合的影响，其中Gα亚基83、Gβ亚基84和Gγ亚基85亚基被释放。这种释放导致质量减少，这触发了观察到的信号的减少（ii）。受体脱敏需要募集胞质蛋白87，这再次导致质量增加，并因此触发观察到的信号的增加。由于没有交叉敏感性，因此可以获得关于特定时间点处复合物质量的直接信息。
图4a和4b图示了通过使用本文描述的生物分子检测装置获得的理想输出信号。在图4a中，测量已经开始，并且获得了恒定的响应，因为跨膜蛋白的结合物结构还没有结合到波导的膜识别元件。当结合发生时，测量的信号增加，直到它达到恒定值（即，当所有可能的结合物结构都结合到膜识别元件时，参见图4b）。图4c示出了通过将HEK293细胞中的β2ARs（β-2肾上腺素能受体）与融合的自身反应性SNAP标签蛋白结合到生物分子检测装置的纳米图案的分子识别元件而获得的实验信号。在这个特定的实施例中，SNAP标签蛋白结合到BG-NH2衍生物，BG-NH2衍生物结合到波导。如可以看到的，在大约80-100分钟之后，观察到恒定的信号。
图5a示出了纳米图案的实时形成，以及通过刺激和抑制所采用的HEK293细胞获得的响应。参考图5a，在0和150分钟之间，所测量信号的第一次增加对应于细胞膜内纳米图案的形成。在150分钟时，培养物已经被换成测定缓冲液，从而导致信号减小。图5b示出了图5a中虚线区域的放大视图。在大约200分钟时，用1 μM异丙肾上腺素刺激细胞，这导致测量信号的增加。在大约225分钟时，用10 μM ICI 155.881竞争性抑制异丙肾上腺素导致信号的降低和初始状态的部分恢复。该测量证明了所获得的信号是所观察到的细胞内相互作用的结果，而不仅仅是结合到分子识别元件的自由SNAP标签的结果。
图6a示出了在用5 μM NECA刺激HEK293细胞以激活脱靶腺苷受体时获得的信号。由于初始测量信号的强度的轻微变化，描绘了相对于初始质量在受体处的质量增加。然而，由于没有来自脱靶受体的贡献，该质量增加对应于相对于固定受体复合物分子量的分子量增加（假设所有受体都被激活）。结果表明，在用NECA激活腺苷受体时，没有观察到明显的信号变化。相比之下，使用1 μM异丙肾上腺素的对照实验导致信号增加，这已经在图4c中示出。总之，这些结果表明确实没有观察到任何脱靶的相互作用的交叉敏感性，并且这些相互作用不影响测量结果。如上所述，没有交叉敏感性的原因是腺苷受体不结合到分子识别元件，并且因此在检测位点处没有接收到散射光。事实上，随机分布的受体以不相干的方式散射光，并且因此不参与这种聚焦效应。类似地，细胞体的形态学变化在其本质上是不相干的，并且因此也不对测量信号有贡献。这与记录特异性和非特异性分子相互作用以及细胞形态学变化两者的DMR和其他无标记测定形成鲜明对比。因此，细胞形态学不仅可以回答GPCR是否被激活的问题，还可以阐明时间发生和进展以及所涉及的分子的质量。
图7a和7b示出了根据本发明实施例的生物分子检测装置1’。装置1’包括具有光耦合单元4’的倏逝照明器2’，该光耦合单元4’被配置成用于在倏逝照明器2’的第一表面上从具有光源6’的预定波长的相干光生成倏逝场9’。倏逝照明器2’的第一表面5包括模板纳米图案5’，该模板纳米图案5’包含多个预定线的相干布置，沿着这些预定线，用于细胞8’的跨膜蛋白81的结合物结构的膜识别元件。如可以看到的，通过在膜识别元件和可横向扩散的跨膜蛋白81之间建立化学键，倏逝照明器2’的纳米图案5’被转置到细胞中作为跨膜纳米图案。在图7a的实施例中，光源6’和检测单元7’是物理上分离的部件，而在图7b所示的实施例中，它们是倏逝照明器2’的一体部分。
图8a和8b示出了根据本发明的生物分子检测装置1”的替代实施例。生物分子检测装置1包括倏逝照明器，在这些特定实施例中，该倏逝照明器是全内反射系统，该全内反射系统被配置成借助于光耦合单元4”以预定角度从光源6”将处于预定波长的相干光光束提供到倏逝照明器的第一表面上。这些实施例中的光耦合单元是棱镜。在图8a所示的实施例中，倏逝照明器包括折射率匹配介质11”和包含模板纳米图案5”的载片12”，所述折射率匹配介质诸如是折射率匹配油、DMSO、甘油、水混合物、水凝胶等。替代地，如图8b所示，倏逝照明器可以没有折射率匹配介质11”和载片12”。在这种情况下，纳米图案5”直接设置在光耦合单元4”的第一表面上，即棱镜上。
方法和材料
含有L-谷氨酰胺的细胞培养基DMEM高葡萄糖（4.5克/升）（BioConcept，瑞士）、Lipofectamine® 2000、Opti-MEM ® I（1×）Versene 1：5000（1×）、hank's平衡盐溶液（HBSS）、ZeozinTM购自Life Technologies Europe（Zug，瑞士）。HEPES来自GERBUBiotechnik 有限公司（Heidelberg，德国），胎牛血清（FBS）购自Sigma-Aldrich化学有限公司（Buchs SG，瑞士）。G418来自InvivoGen（圣地亚哥，美国），组织培养瓶来自VWR 国际有限公司（Dietikon，瑞士），Biofil®组织培养板24孔来自Axon Lab AG（瑞士Baden-Dattwil）。Corning Costar无菌黑色96孔板（透明底部，TC处理，多聚-D-赖氨酸涂覆）来自Vitaris AG（Baar，瑞士），定制涂覆的CulturPlate-96白色不透明96孔微板（无菌和组织培养处理）和ViewPlate-96白色96孔微板（透明底部，无菌和组织培养处理的）来自Perkin Elmer（Schwerzenbach，瑞士）。TPP 6孔组织培养板购自Faust labobedarf AG（Schaffhausen，瑞士）腔肠素400a，Deep Blue C（DBC）购自Cayman Chemical（Ann Arbor，Michigan，美国）。GRGDSPGSC-（DBCO）肽由LifeTein，LLC（美国，新泽西州Somerset）定制合成。BG-GLA-NHS获自BioConcept Ltd.（Alschwil，瑞士）。Azido-PEG4-NHS获自Jena Bioscience（Jena，德国）。用作生物相容性涂层的PAA-g-PEG-NH-PhSNPPOC共聚物由SuSoS提供。异丙肾上腺素盐酸盐和福莫特罗半富马酸盐购自Tocris Bioscience（布里斯托尔，英国）。ICI 118,551盐酸盐、荧光素-O’-乙酸和所有其他化学品购自Sigma-Aldrich化学有限公司（Buchs SG，瑞士）。具有145nm Ta2O5层的薄膜光波导获自Zeptosens，其输入和输出耦合光栅由IMTMasken und Teilungen AG（Greifensee，瑞士）的1 μm厚的SiO2层覆盖。
表达载体构建
β-Arrestin 2-mPlum：通过PCR（Phusion聚合酶，Finnzymes）扩增mPlum编码序列，并转移至含有β-arrestin 2编码序列的pcDNA3表达载体。
β-Arrestin 2 -GFP：通过PCR（Phusion 聚合酶，Finnzymes）扩增β-arrestin2编码序列，并转移至pEGFP（Clonetech）表达载体。
细胞系和细胞培养
稳定表达SNAP-beta2-肾上腺素能受体（称为SNAP-β2AR）的HEK293细胞系购自Cisbio（Codolet，法国）。稳定过表达的HEK293将所有HEK293细胞在37℃下培养于补充有10%-v/v胎牛血清和600 μg/ml G418以及5% CO2的DMEM中。
传感器芯片的制备
薄膜光波导用以前报道的类似方案处理（Nat. Nanotechnology 2017 DOI：10.1038/NNAN0.201 7.168）。简而言之，用0.1 %吐温20水溶液洗涤波导，然后在MilliQ水、异丙醇和甲苯中超声辅助洗涤。然后将芯片浸泡在温热的Hellmanex III中1分钟，用MilliQ水彻底冲洗并用高氧化性Piranha溶液（H2SO4/H2O2 7∶3）清洗30分钟。用MilliQ水过度洗涤之后，将芯片在以800 rcf离心干燥2分钟，并通过氧等离子体活化。等离子体处理之后，将芯片立即浸入PAA-g-PEG-NH-PhSNPPOC接枝共聚物涂层溶液（0.1 mg/ml，在1 mMHEPES pH 7.4中）中60分钟。为了完全钝化该层，用MilliQ水和乙醇洗涤芯片，并浸入25 mM氯甲酸甲酯在无水乙腈中的溶液中5分钟，其中含有2当量N,N-二异丙基乙胺。用乙醇和MilliQ水洗涤经涂覆的芯片，并用氮气射流吹干。将制备好的传感器芯片储存在4℃的暗处，直到进一步使用。
模板纳米图案的制备
根据标准反应浸没光刻（RIL）工艺制备模板纳米图案（Nat. Nanotechnology,2017, DOI： 10.1038/NNAN0.2017.168）。简而言之，将涂覆有共聚物的传感器芯片放在定制的支架中。使用对准辅助物对准用于产生纳米图案的相位掩模，并用0.1 %-v/v羟胺的DMSO溶液填充芯片和相位掩模之间的间隙。在定制构建的装置中，以2000 mJ/cm2的剂量在405 nm下进行光刻曝光。在照射之后，用异丙醇和MilliQ水洗涤芯片，并用1 mM胺反应性SNAP-tag底物（BG-GLA-NHS）功能化活化的脊，所述底物与SNAP-tag蛋白共价结合。为了增加细胞对芯片的粘附，通过整体暴露去除剩余的PhSNPPOC基团。然后用杂生物功能交联剂azido-PEG4-NHS对自由结合位点进行功能化。最后，将芯片与0.5 mM GRGDSPGSC-（DBCO）的叠氮化物反应性水溶液一起温育过夜，用异丙醇和MilliQ水洗涤，并用氮气射流干燥。
细胞测量
SNAP-β2AR细胞在T25培养瓶中生长至60-80%融汇，用温热的磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤两次，用1×Versene孵育5分钟，并重悬于细胞培养基中。为了减少来自无功能细胞碎片的基线信号贡献，连续两次将细胞以50 rpm离心1分钟，并重悬于培养基中。在含有500 μl细胞培养基的孵育室中，接种细胞以在波导上达到融汇。通过Countess自动细胞计数器（Invitrogen）确定，只有当存活力超过90%时，才接种细胞。除了实时建立跨膜纳米图案之外，将接种的细胞在37℃的CO2培养箱中保持2 h，以允许细胞粘附到传感器芯片（以及β2AR上的SNAP-tag与芯片上的SNAP-tag底物的共价相互作用）。然后用针对DMSO进行了调整的温热HBSS缓冲液（补充有20 mM HEPES，pH 7.4）洗涤含有细胞的孵育室两次，并将其转移到保持在35℃处的经修饰的F3000 ZeptoReader（Zeptosens）中。然后在执行测定之前，允许生物分子检测装置在ZeptoReader内温度平衡5-10分钟。对于所有测定，在用含有β2AR配体的缓冲液小心替换缓冲液之前，监测信号7分钟（基线测量），并且之后再监测21分钟。为了实时建立跨膜纳米图案实验，在补充有20mM HEPES，pH 7.4的细胞培养基中执行测量。一旦建立了纳米图案，小心地用HBSS缓冲液（补充有20 mM HEPES，pH 7.4）更换培养基。
用于信号采集的典型仪器参数如下：使用635 nm激光每10秒一幅图像，积分时间为0.25-1秒，这取决于初始信号的强度和ZeptoReader的照明路径中的灰度过滤值0.001。
数据分析
对于所有测定，取原始信号的平方根。然后对基线进行线性拟合，并且将基线用于对信号进行去趋势处理。然后将数据显示为与基线相比的分数变化。
对于BRET抑制蛋白募集测定，使用GraphPad Prism中的非线性回归“log（抑制剂）对响应（三个参数）”来拟合曲线下面积（AUC）对配体浓度的浓度-响应曲线，以计算plC50值。
Claims (17)
1.一种用于分析细胞、囊泡或细胞或囊泡成分的生物分子检测装置（1），包括具有光耦合单元的倏逝照明器，所述光耦合单元被配置成用于在所述倏逝照明器的第一表面上从具有预定波长的相干光（L）产生倏逝场，所述倏逝照明器的第一表面包括模板纳米图案（5），其包含多个预定线的相干布置，沿着所述预定线布置有用于细胞、囊泡或细胞或囊泡成分（8）的跨膜蛋白（81）、优选地可横向扩散的跨膜蛋白的结合物结构（82）的膜识别元件，其中，所述膜识别元件（53）被配置成结合跨膜蛋白（81）的结合物结构（82）以基于倏逝照明器的模板纳米图案（5）在细胞、囊泡或细胞或囊泡成分（8）内形成跨膜纳米图案，使得所述倏逝场的光被结合到所述膜识别元件（53）的细胞、囊泡或细胞或囊泡成分（8）散射，并且其中，所述预定线被布置成使得被结合到所述膜识别元件（53）的细胞、囊泡或细胞或囊泡成分（8）散射的光在预定检测位点（7）处相长干涉，其光程长度差是所述相干光（L）的预定波长的整数倍。
2.根据权利要求1所述的生物分子检测装置（1），其中，所述倏逝照明器包括载体（2）和作为光耦合单元的光耦合器（4），所述载体具有布置在所述载体表面上的平面波导（3），所述光耦合器用于将预定波长的相干光（L）耦合到所述波导（3）中，使得所述相干光通过所述平面波导（3）传播，其中所述相干光（L）的倏逝场沿着所述平面波导（3）的第一表面传播，并且其中，所述平面波导的第一表面包括所述模板纳米图案（5）。
3.根据权利要求1所述的生物分子检测装置（1），其中，所述倏逝照明器是全内反射系统，其被配置成用于借助于所述光耦合单元、特别是借助于棱镜，以预定波长并以预定角度将相干光（L）的光束提供到所述倏逝照明器的第一表面上。
4.根据前述权利要求中任一项所述的生物分子检测装置（1），其中，所述膜识别元件（53）是至少对所述跨膜蛋白（81）的结合物结构（82）具有特异性的抗体，或者其中，所述膜识别元件（53）包含用于与所述跨膜蛋白（81）的结合物结构（82）建立共价键的亲电子部分。
5.根据前述权利要求中任一项所述的生物分子检测装置，其中，所述多条预定线包括具有曲率的曲线，所述曲率被配置成使得由结合到所述膜识别元件的细胞、囊泡或细胞或囊泡成分散射的倏逝场的光在所述预定检测位点处干涉。
6.根据前述权利要求中任一项所述的生物分子检测装置，其中，所述倏逝照明器的第一表面包括细胞粘着剂。
7.根据前述权利要求中任一项所述的生物分子检测装置，其中，至少一种细胞、囊泡或细胞或囊泡成分经由所述跨膜蛋白的结合物结构结合到所述膜识别元件。
8.根据前述权利要求中任一项所述的生物分子检测装置，其中，所述预定线被没有膜识别元件的区域彼此分开，并且其中，所述没有膜识别元件的区域被配置成逆转光学调制，所述光学调制是由结构识别元件与跨膜蛋白的结合物结构的结合而诱导的，使得在生物分子检测装置的不同操作窗口中提供从结构识别元件与跨膜蛋白的结合物结构的结合获得的信号，其中，不同操作窗口处于接近于零的强度。
9.根据权利要求1至6中任一项所述的生物分子检测装置用于检测与细胞、囊泡或细胞成分相关联的分子相互作用的用途。
10.根据权利要求7所述的用途，其中：
- 提供根据权利要求1至8中任一项所述的生物分子检测装置；
- 将细胞或囊泡应用于膜识别元件，其中，所述细胞或囊泡包括膜和具有细胞外或囊泡外结合物结构的至少一种跨膜蛋白；
- 任选地，至少一种跨膜蛋白沿着所述膜横向扩散；
- 根据所述倏逝照明器的所述第一表面的所述模板纳米图案对准细胞或囊泡的至少一种跨膜蛋白，使得在细胞或囊泡的膜中形成跨膜纳米图案，其中，跨膜图案至少部分地对应于所述倏逝照明器的第一表面的模板纳米图案；
- 在相对于多条预定线的预定光束产生位置处产生相干光的光束，所述相干光的光束具有预定波长，并且以这样的方式入射到具有结合的跨膜蛋白的膜识别元件上，使得相干光的入射光束的衍射部分在预定检测位点处相对于多条预定线相长干涉，其光程长度差是所述相干光的预定波长的整数倍，以提供代表具有在预定检测位点处结合到其上的细胞、囊泡或细胞或囊泡成分的跨膜蛋白的膜识别元件的信号；
- 测量代表具有结合到其上的细胞、囊泡或细胞或囊泡成分的跨膜蛋白的膜识别元件的信号。
11.根据权利要求10所述的用途，进一步包括将代表具有结合到其上的细胞、囊泡或细胞或囊泡成分的跨膜蛋白的膜识别元件的测量信号与仅代表所述膜识别元件的未结合信号进行比较的步骤。
12.根据权利要求9到10中任一项所述的用途，其中，将细胞应用于所述膜识别元件，并且其中，在产生所述相干光的光束之前且优选地在对准所述跨膜蛋白并形成所述跨膜纳米图案之后，对所述细胞进行修饰，使得仅部分所述细胞膜保留在所述生物分子检测装置上。
13.根据权利要求9到12中任一项所述的用途，其中，所述跨膜蛋白的所述结合物结构对沿着所述生物分子检测装置的所述倏逝照明器的预定线布置的抗体是特异性的。
14.根据权利要求9到13中任一项所述的用途，其中，所述生物分子相互作用的感兴趣的蛋白包含高质量部分。
15.根据权利要求9至14中任一项所述的用途，其中另外，特别是同时，记录荧光和/或生物发光信号。
16.一种用于在细胞、囊泡或细胞或囊泡成分内产生跨膜纳米图案的方法，所述方法包括：
- 提供根据权利要求1至8中任一项所述的生物分子检测装置；
- 将细胞或囊泡应用于所述膜识别元件，其中，所述细胞或囊泡包括膜和具有细胞外或囊泡外结合物结构的至少一种跨膜蛋白；
- 任选地，沿着所述膜横向扩散至少一种跨膜蛋白；
- 将所述至少一种跨膜蛋白的细胞外结合结构结合到任何膜识别元件，并根据所述消逝照明器的第一表面的模板纳米图案对准所述至少一种跨膜蛋白，使得在所述细胞或囊泡的膜中形成跨膜纳米图案，其中，所述跨膜图案至少部分地对应于所述消逝照明器的第一表面的模板纳米图案。
17.根据权利要求16中任一项所述的方法，其中，所述跨膜蛋白的结合物结构对沿着所述生物分子检测装置的倏逝照明器的预定线布置的抗体是特异性的。
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