CN109312318B - 糖化反应液、糖化酶组合物、糖的制造方法及乙醇的制造方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供能够通过简便的工序使利用酶的糖化反应效率提高的糖化反应液、糖化酶组合物、糖的制造方法以及乙醇的制造方法。所述糖化反应液是将纤维素和半纤维素中的至少一者进行糖化的糖化反应液,其含有:纤维素和半纤维素中的至少一者、糖化酶、二氧化硅或含有二氧化硅的物质、和选自硫脲、硫脲衍生物和异硫脲衍生物及它们的盐中的至少1种的化合物(A)。
Description
技术领域
本发明涉及糖化反应液、糖化酶组合物、糖的制造方法以及乙醇的制造方法。
背景技术
以往,已知以包含纤维素或半纤维素的纤维素系生物质为原料,制造乙醇的纤维素系生物乙醇。
作为由包含纤维素或半纤维素的纤维素系生物质生成葡萄糖这样的糖的方法(糖化技术),已知在纤维素系生物质中加入硫酸进行水解的方法,但存在反应器的腐蚀、废液处理的问题。此外,例如,也提出了使用使磺基担载于碳、沸石等而得的固体酸催化剂将纤维素系生物质进行糖化的方法,但因为是固体彼此的反应,因此反应速度极其慢,而且具有未反应残渣与固体酸催化剂的分离困难这样的问题。进一步,上述的任何方法都难以控制水解,反应过度进行了的结果是,也有糖本身分解,糖的收率降低的问题。
另一方面,也已知使用酶进行糖化的方法(参照专利文献1)。这样的方法包含:将原料用加压热水进行处理的热水处理工序、将该热水处理物进行机械粉碎处理的机械粉碎处理工序、和将该机械粉碎物用酶进行糖化处理的糖化处理工序。然而,这样的方法具有用酶进行糖化时的反应速度慢,所得的糖化液的浓度不能说充分这样的问题。
因此提出了下述方法:通过使酶担载于二氧化硅系介孔体而使用,可以与将酶溶解了的状态相比使酶高浓度地存在于反应体系中,更有效率地进行酶反应(参照专利文献2)。然而,这样的方法具有需要将酶吸附固定化于载体的工序这样的问题,此外,被固定化的酶与未被固定化的酶相比,具有反应效率可能会降低到40%~50%左右这样的问题。进一步,因为是固体彼此的反应,因此也有未反应残渣与固定了酶的载体的分离困难这样的问题。
此外,也已知将二氧化硅溶胶与酶混合,制成二氧化硅凝胶后,进行了粉末化的固定化酶(参照专利文献3、4)。这样的固定化酶虽然也可以回收酶,但是反应效率本身低。此外,也已知将0.5μm~100μm的二氧化硅粉末与酶混合而将包含纤维素的植物纤维水解的方法,但具有混合二氧化硅粉末的效果不明确,未反应残渣与悬浮的二氧化硅粉末的分离困难这样的问题(参照专利文献5)。
进一步,也提出了使用包含酶和胍、脲等糖化反应促进剂将纤维素系生物质进行糖化的方法(参照专利文献6)。然而,该糖化反应促进剂并没有促进糖化反应,而是在保存一定期间后也不会使生物质的分解性能降低的、保存稳定性优异的物质。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本特开2006-136263号公报
专利文献2:日本特开2009-125006号公报
专利文献3:日本特公昭63-2595号公报
专利文献4:日本特公昭63-21475号公报
专利文献5:日本特开平10-66594号公报
专利文献6:日本特开2011-234715号公报
发明内容
发明所要解决的课题
本发明是鉴于上述情况而提出的,其目的是提供能够通过简便的工序而使利用酶的糖化反应效率提高的糖化反应液、糖化酶组合物、糖的制造方法以及乙醇的制造方法。
用于解决课题的手段
实现上述目的的本发明的第1方案是一种糖化反应液,是将纤维素和半纤维素中的至少一者进行糖化的糖化反应液,其特征在于,含有:上述纤维素和上述半纤维素中的至少一者、糖化酶、二氧化硅或含有二氧化硅的物质、和选自下述通式(1)和(2)所示的化合物及其盐中的至少1种的化合物(A)。
[上述通式(1)和通式(2)中的R1~R5表示氢原子或碳原子数1~4的烷基,上述烷基中的氢原子的一部分可以被烯丙基、羟基、酯基、氨基、羧基、氰基、硝基、磺基、膦酰基或卤原子取代。]
实现上述目的的本发明的第2方案是第1方案的糖化反应液,其特征在于,上述含有二氧化硅的物质为硅藻土或硅砂。
实现上述目的的本发明的第3方案是第1方案或第2方案的糖化反应液,其特征在于,上述化合物(A)与上述二氧化硅或含有二氧化硅的物质中的二氧化硅的质量比率(化合物(A)/二氧化硅)为0.00001以上且0.1以下。
实现上述目的的本发明的第4方案是第1方案~第3方案中任一项的糖化反应液,其特征在于,上述化合物(A)包含选自硫脲、N-甲基硫脲、1,3-二甲基硫脲、三甲基硫脲、四甲基硫脲、1-烯丙基-3-(3-羟基乙基)-2-硫脲、亚乙基硫脲、脒基硫脲、S-甲基异硫脲、S-乙基异硫脲、S-[2-(二甲基氨基)乙基]异硫脲、S-苄基异硫脲、和S-(2-氨基乙基)异硫脲中的至少1种。
实现上述目的的本发明的第5方案是一种糖化酶组合物,是将纤维素和半纤维素中的至少一者进行糖化的糖化酶组合物,其特征在于,含有:糖化酶、二氧化硅或含有二氧化硅的物质、和选自下述通式(1)和(2)所示的化合物及其盐中的至少1种的化合物(A),上述化合物(A)与上述二氧化硅或含有二氧化硅的物质中的二氧化硅的质量比率(化合物(A)/二氧化硅)为0.00001以上且0.1以下。
[上述通式(1)和通式(2)中的R1~R5表示氢原子或碳原子数1~4的烷基,上述烷基中的氢原子的一部分可以被烯丙基、羟基、酯基、氨基、羧基、氰基、硝基、磺基、膦酰基或卤原子取代。]
实现上述目的的本发明的第6方案是第5方案的糖化酶组合物,其特征在于,上述含有二氧化硅的物质为硅藻土或硅砂。
实现上述目的的本发明的第7方案是第5方案或第6方案的糖化酶组合物,其特征在于,上述化合物(A)包含选自硫脲、N-甲基硫脲、1,3-二甲基硫脲、三甲基硫脲、四甲基硫脲、1-烯丙基-3-(3-羟基乙基)-2-硫脲、亚乙基硫脲、脒基硫脲、S-甲基异硫脲、S-乙基异硫脲、S-[2-(二甲基氨基)乙基]异硫脲、S-苄基异硫脲、和S-(2-氨基乙基)异硫脲中的至少1种。
实现上述目的的本发明的第8方案是一种糖的制造方法,是使用将纤维素和半纤维素中的至少一者进行糖化的糖化反应液来制造糖的糖的制造方法,其特征在于,上述糖化反应液含有:上述纤维素和上述半纤维素中的至少一者、糖化酶、二氧化硅或含有二氧化硅的物质、和选自下述通式(1)和(2)所示的化合物及其盐中的至少1种的化合物(A)。
[上述通式(1)和通式(2)中的R1~R5表示氢原子或碳原子数1~4的烷基,上述烷基中的氢原子的一部分可以被烯丙基、羟基、酯基、氨基、羧基、氰基、硝基、磺基、膦酰基或卤原子取代。]
实现上述目的的本发明的第9方案是第8方案的糖的制造方法,其特征在于,上述含有二氧化硅的物质为硅藻土或硅砂。
实现上述目的的本发明的第10方案是第8方案或第9方案的糖的制造方法,其特征在于,上述化合物(A)与上述二氧化硅或含有二氧化硅的物质中的二氧化硅的质量比率(化合物(A)/二氧化硅)为0.00001以上且0.1以下。
实现上述目的的本发明的第11方案是第8方案~第10方案中任一项的糖的制造方法,其特征在于,上述化合物(A)包含选自硫脲、N-甲基硫脲、1,3-二甲基硫脲、三甲基硫脲、四甲基硫脲、1-烯丙基-3-(3-羟基乙基)-2-硫脲、亚乙基硫脲、脒基硫脲、S-甲基异硫脲、S-乙基异硫脲、S-[2-(二甲基氨基)乙基]异硫脲、S-苄基异硫脲、和S-(2-氨基乙基)异硫脲中的至少1种。
实现上述目的的本发明的第12方案是一种乙醇的制造方法,其特征在于,使用通过第8方案~第11方案中任一项的制造方法而获得的糖,利用发酵微生物进行乙醇发酵,来制造乙醇。
实现上述目的的本发明的第13方案是第12方案的乙醇的制造方法,其特征在于,在制造糖的工序中添加发酵微生物,从而同时进行糖的制造和乙醇发酵。
实现上述目的的本发明的第14方案是第12方案或第13方案的乙醇的制造方法,其特征在于,上述发酵微生物为酵母、霉或细菌。
实现上述目的的本发明的第15方案是第14方案的乙醇的制造方法,其特征在于,上述发酵微生物为属于酵母(Saccharomyces)属、发酵单胞菌(Zymomonas)属、毕赤酵母(Pichia)属、假丝酵母(Candida)属、发酵细菌(Zymobacter)属、棒状杆菌(Corynebacterium)属、克鲁维酵母(Kluyveromyces)属或埃希氏菌(Escherichia)属的微生物。
实现上述目的的本发明的第16方案是第12方案~第15方案中任一项的乙醇的制造方法,其特征在于,在15℃以上且35℃以下进行乙醇发酵。
发明的效果
根据本发明,可以提供能够通过简便的工序使利用酶的糖化反应效率提高的糖化反应液、糖化酶组合物、糖的制造方法以及乙醇的制造方法。
附图说明
图1是表示实施例4、7、8和比较例1~3、7、10~14的由硫脲的添加带来的糖化反应效率的提高效果的测定结果的图。
图2是表示实施例1~6和比较例1、4~9、12的由硫脲浓度带来的糖化反应效率的提高效果的测定结果的图。
图3是表示实施例9~18和比较例1、12的由硫脲衍生物或异硫脲衍生物的添加带来的糖化反应效率的提高效果的测定结果的图。
图4是表示实施例19和比较例1、7、15的由硫脲的添加带来的糖化反应效率的提高效果的测定结果的图。
图5是表示实施例20、21和比较例16~19的由硫脲浓度带来的乙醇发酵效率的提高效果的测定结果的图。
具体实施方式
在本发明中,作为用于生成葡萄糖这样的糖的原料,使用纤维素和半纤维素中的至少一者。
这样的纤维素或半纤维素在例如阔叶树、针叶树等农林水产物资源、或该农林水产物资源的废弃物这样的纤维素系生物质中含有。更具体而言,可举出甘蔗渣、稻秸、玉米秸秆、油棕空果串、木材纤维、木材片、单板屑、木粉、纸浆类、废纸类、棉、海鞘、乙酸菌等。此外,这些原料只要来源于纤维素系生物质,就没有特别限定,可以单独使用1种,也可以混合使用2种以上。
这些中,优选为桉木粉(阔叶树)、杉木粉(针叶树)、甘蔗渣、稻秸、玉米秸秆、油棕空果串、棉等所含有的纤维素或半纤维素。在这些情况下,虽然理由不确定,但易于解纤,可以以较高收率获得糖。
这里,所谓纤维素,是指葡萄糖通过β-1,4糖苷键聚合而得的聚合物。半纤维素是指葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖等通过糖苷键聚合而得的聚合物,是纤维素以外的水不溶性的多糖类。
此外,纤维素可以包含作为其部分分解物的纤维寡糖、纤维二糖等,可以为结晶性也可以为非结晶性。此外,可以为进行羧基甲基化、醛化或酯化而得的衍生物。需要说明的是,如上所述,纤维素或半纤维素只要来源于生物质,就没有特别限定,可以为植物来源、真菌来源、细菌来源等。
作为本发明的糖化酶,使用以纤维素酶作为主体的糖化酶。所述纤维素酶是指将纤维素或半纤维素分解直到葡萄糖等糖的酶。
作为生产这样的糖化酶的微生物,没有特别限定,可举出例如,枝顶孢(Acremonium)属菌、曲霉(Aspergillus)属菌、毛壳(Chaetomium)属菌、镰刀菌(Fusarium)属菌、腐质霉(Humicola)属菌、耙齿菌(Irpex)属菌、毛平革菌(Phanerochaete)属菌、青霉(Penicillium)属菌、裂褶菌(Schizophyllum)属菌、侧孢霉(Sporotrichum)属菌、栓菌(Trametes)属菌、木霉(Trichoderma)属菌等。除了这些以外,还可举出梭菌(Clostridium)属菌、假单胞菌(Pseudomonas)属菌、纤维单胞菌(Cellulomonas)属菌、瘤胃球菌(Ruminococcus)属菌、芽孢杆菌(Bacillus)属菌等细菌;硫化叶菌(Sulfolobus)属菌、链霉菌(Streptomyces)属菌、高温放线菌(Thermoactinomyces)属菌、高温单孢菌(Thermomonospora)属菌等放线菌。需要说明的是,这些糖化酶可以被人工改变。此外,这些糖化酶可以单独使用1种,也可以混合使用2种以上。
这些中,特别优选为曲霉(Aspergillus)属来源的糖化酶和木霉(Trichoderma)属来源的糖化酶。因为这些糖化酶对结晶性纤维素的活性高。
此外,纤维素酶可以为一系列的酶组。作为这样的酶组,可举出内切葡聚糖酶(EC3.2.1.74)、纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91)、β-葡糖苷酶(EC 23.2.4.1,EC 3.2.1.21)等。本发明优选混合使用不同的微生物来源的纤维素酶。在该情况下,通过它们的协同效果,能够进一步促进纤维素或半纤维素的糖化。
上述的纤维素酶多数一般为在pH3以上且pH6以下的范围具有最适的酶活性的酶,但也可以为在pH6~pH10的范围具有最适的酶活性的被称为碱性纤维素酶的酶。此外,上述的纤维素酶虽然多数多为在反应温度25℃以上且50℃以下的范围具有最适的酶活性的酶,但也可以为在70℃以上且100℃以下的范围具有最适的酶活性的被称为耐热性纤维素酶的酶。
本发明中作为二氧化硅或含有二氧化硅的物质,可以使用二氧化硅、硅藻土或硅砂。作为含有二氧化硅的物质的硅藻土和硅砂是二氧化硅为主成分的天然物。二氧化硅是至少含有二氧化硅的化合物的总称,一般在表面的一部分存在硅烷醇基。该二氧化硅的粒子形状可以为球状也可以为非球状,粒子结构可以为实心结构也可以为多孔结构,结晶性可以为非晶质也可以为结晶质,可以以粉末状、悬浮液、分散液的任何状态使用。二氧化硅表面的一部分可以被硅烷醇基以外的其它官能团修饰。此外,可以为通过硅烷偶联剂、硅醇盐、或硅酸离子等与二氧化硅以外的化合物的表面反应而存在二氧化硅的层的形式。其中特别优选应用胶态二氧化硅、硅藻土和硅砂。
本发明中,胶态二氧化硅的平均一次粒径为1nm以上且400nm以下,优选为5nm以上且350nm以下,使其在糖化反应液中存在而使用。平均一次粒径是由通过氮吸附法(BET法)测定的比表面积S(m2/g)通过换算式(D(nm)=2720/S)算出的。需要说明的是,胶态二氧化硅作为分散于水、甲醇、乙醇、丙酮、甲基乙基酮、乙二醇等分散介质而得的分散液而使用,分散液被称为胶体液、溶胶等。本发明中,可以在不损害酶的活性的范围内选择分散介质,但优选应用水、乙醇等分散介质。
作为胶态二氧化硅的制造方法,有以水玻璃作为原料的水玻璃法、以金属醇盐作为原料的醇盐法、以氯化硅化合物作为原料的气相法等。可以使用通过任何制造法获得的胶态二氧化硅,但优选应用通过水玻璃法获得的胶态二氧化硅。
在本发明的下述通式(1)和(2)所示的化合物中,式中的R1~R5表示氢原子、或碳原子数1~4的烷基,该烷基中的氢原子的一部分可以被烯丙基、羟基、酯基、氨基、羧基、氰基、硝基、磺基、膦酰基或卤原子取代。这些取代基的数优选为1~4,进一步优选为1~3。
作为选自上述通式(1)和(2)所示的化合物及其盐中的至少1种的化合物(A),具体而言,可举出硫脲、硫脲衍生物和异硫脲衍生物。作为硫脲衍生物,可举出N-甲基硫脲、1,3-二甲基硫脲、三甲基硫脲、四甲基硫脲、1,3-二乙基-2-硫脲、1,3-二异丙基硫脲、1-烯丙基-2-硫脲、1-烯丙基-3-(3-羟基乙基)-2-硫脲、1-乙酰基-2-硫脲、(2-甲氧基乙基)硫脲、亚乙基硫脲、脒基硫脲等。作为异硫脲衍生物,可举出S-甲基异硫脲、S-乙基异硫脲、S-苄基异硫脲、S-[2-(二甲基氨基)乙基]异硫脲、S-(2-氨基乙基)异硫脲、S-[4-[(4-硝基苄基)氧基]苯乙基]异硫脲等。作为通式(1)或(2)所示的化合物的盐,可举出S-甲基异硫脲的盐。作为盐,可举出盐酸盐、硫酸盐和氢溴酸盐等,可以使用例如S-(2-氨基乙基)异硫脲溴化物等。根据需要,可以单独使用1种,也可以混合使用2种以上。其中,优选为硫脲、N-甲基硫脲、1,3-二甲基硫脲、三甲基硫脲、四甲基硫脲、1-烯丙基-3-(3-羟基乙基)-2-硫脲、亚乙基硫脲、脒基硫脲、S-甲基异硫脲、S-乙基异硫脲、和S-[2-(二甲基氨基)乙基]异硫脲,特别优选为硫脲、N-甲基硫脲、1,3-二甲基硫脲、三甲基硫脲、四甲基硫脲、亚乙基硫脲、脒基硫脲、S-甲基异硫脲、S-乙基异硫脲、和S-[2-(二甲基氨基)乙基]异硫脲。
本发明的糖化反应液以纤维素和半纤维素中的至少一者作为原料,并且含有作为糖化酶组合物的、糖化酶、二氧化硅或含有二氧化硅的物质、和选自上述通式(1)和(2)所示的化合物及其盐中的至少1种的化合物(A)。详细情况在后面叙述,但从享有糖化反应效率(也简称为反应效率)的提高效果的观点考虑,优选在糖化反应液中,使二氧化硅或含有二氧化硅的物质与化合物(A)并用。
这里,在糖化反应液中,糖化酶的浓度换算成BSA(Bovine serum albumin;牛血清来源白蛋白)的蛋白质浓度为0.001质量%以上且3.0质量%以下,优选为0.001质量%以上且1.0质量%以下。如果糖化酶的浓度低于该范围则反应效率降低,不优选,另一方面,如果高于该范围则不仅糖化酶不易溶解于溶液,而且经济上不合适。
此外,在糖化反应液中,二氧化硅或含有二氧化硅的物质中的二氧化硅的浓度为0.001质量%以上且40质量%以下,优选为0.005质量%以上且10质量%以下。如果二氧化硅或含有二氧化硅的物质中的二氧化硅的浓度低于该范围则反应效率降低,不优选,另一方面,如果高于该范围则不仅分散性恶化,而且经济上不合适。
此外,在糖化反应液中,糖化酶与二氧化硅或含有二氧化硅的物质中的二氧化硅的质量比率(糖化酶/二氧化硅)为0.0002以上且300以下,优选为0.002以上且30以下。如果两者的质量比率不在该范围则反应效率的提高变得不显著。
此外,在糖化反应液中,化合物(A)的浓度为0.00001质量%以上且10质量%以下,优选为0.0001质量%以上且1质量%以下。如果化合物(A)的浓度低于该范围则反应效率降低,不优选,另一方面,如果高于该范围则不仅分散性恶化,而且经济上不合适。
此外,在糖化反应液中,化合物(A)与二氧化硅或含有二氧化硅的物质中的二氧化硅的质量比率(化合物(A)/二氧化硅)为0.00001以上且0.1以下,优选为0.0001以上且0.01以下。如果两者的质量比率不在该范围则反应效率的提高变得不显著。
此外,糖化反应液的pH为3以上且11以下,优选为3以上且6以下。如果pH低于3,则发生二氧化硅或含有二氧化硅的物质的凝集,从而糖化酶的反应效率降低,另一方面,如果pH高于11,则二氧化硅或含有二氧化硅的物质易于溶解,因此不优选。
作为糖化反应液的pH调节剂,可举出硫酸、盐酸、硝酸这样的无机酸;乙酸、草酸这样的羧酸;柠檬酸、酒石酸、苹果酸这样的羟基酸;氢氧化钠、氢氧化钾这样的氢氧化物盐;氨、尿素等。只要是不损害本发明的效果的范围,则使用时对其种类、浓度没有特别限制。此外,这些pH调节剂可以单独使用1种,也可以混合使用2种以上。进一步可以以具有缓冲作用的缓冲液的状态使用。
此外,关于本发明的糖化反应液,优选使反应温度为5℃以上且100℃以下,特别优选为20℃以上且55℃以下。优选根据糖化酶的最适温度来设定反应温度。一般而言,如果反应温度低于5℃则糖化反应的效率显著降低,如果高于100℃则糖化酶可能失活,不优选。
需要说明的是,含有纤维素或半纤维素的纤维素系生物质的前处理只要通过公知的范围进行即可。一般而言,可以通过采用切碎机等的物理粉碎、和通过酸或碱处理将木质素和纤维素及半纤维素的结构进行化学破坏,来制成糖化反应用原料。
在制作糖化反应液时,可以在分散有糖化酶的反应液中添加二氧化硅或含有二氧化硅的物质和化合物(A),也可以在分散有二氧化硅或含有二氧化硅的物质和化合物(A)的反应液中添加糖化酶。可以同时添加二氧化硅或含有二氧化硅的物质和化合物(A),也可以分开添加,只要糖化反应效率不降低,无论添加顺序如何均可。此时,可以以粉末状态添加化合物(A),也可以以溶液状态添加。此外,只要是不损害本发明的效果的范围,则pH调节剂等其它添加剂可以以任意的顺序添加。
如以上说明的那样,本发明的糖化反应液通过以纤维素和半纤维素中的至少一者作为原料,并含有作为糖化酶组合物的、糖化酶、二氧化硅或含有二氧化硅的物质、和选自通式(1)和(2)所示的化合物及其盐中的至少1种的化合物(A)来获得。在该糖化反应液中,虽然机制不清楚,但通过使二氧化硅或含有二氧化硅的物质与化合物(A)并用,可以进一步促进纤维素或半纤维素的糖化。
此外,本发明的糖化反应液通过二氧化硅或含有二氧化硅的物质与化合物(A)的并用,可以减少糖化酶的使用量,因此成本性也优异。
也可以使用本发明中获得的糖,通过进行乙醇发酵的发酵微生物使其进行乙醇发酵而获得乙醇。可以在获得了糖后,添加进行乙醇发酵的发酵微生物,使其进行乙醇发酵而获得乙醇,也可以在使用上述糖化反应液获得糖的工序中添加进行乙醇发酵的发酵微生物,从而同时进行糖的制造与乙醇发酵,而获得乙醇。
本发明的发酵微生物可举出酵母、霉、细菌等。其中特别优选为酵母或细菌。此外,这些发酵微生物可以单独使用1种,也可以混合使用2种以上。作为所使用的发酵微生物,可举出例如,属于酵母(Saccharomyces)属、发酵单胞菌(Zymomonas)属、毕赤酵母(Pichia)属、假丝酵母属(Candida)属、发酵细菌(Zymobacter)属、棒状杆菌(Corynebacterium)属、克鲁维酵母(Kluyveromyces)属、埃希氏菌(Escherichia)属等的微生物。
进行乙醇发酵时的优选的发酵温度为15℃以上35℃以下,更优选为28℃以上32℃以下。一般而言,如果发酵温度低于15℃则发酵微生物的活动不活跃,因此乙醇发酵的效率显著降低,此外,如果高于35℃则发酵微生物可能会凋亡,不优选。
一般而言,在使用微生物进行乙醇发酵时,除了葡萄糖等糖作为用于细胞增殖的碳源使用以外,也可使用氮源、其它营养素。本发明的乙醇发酵中,如上所述通过糖化反应而获得的糖(葡萄糖)成为碳源。此外,作为氮源,可举出尿素、氨、氨基酸等,作为其它营养素,可举出维生素、矿物质等,根据需要添加它们。需要说明的是,本发明的乙醇发酵中,作为氮源,使用了尿素。
此外,本发明的采用进行乙醇发酵的发酵微生物的乙醇的制造方法,通过二氧化硅或含有二氧化硅的物质与化合物(A)的并用,即使在进行乙醇发酵时的优选的发酵温度下也可以有效率地通过糖化酶而获得糖,因此利用了所得的糖的乙醇发酵也可以有效率地进行。一般而言,获得糖的反应温度比获得乙醇的发酵温度高,因此在乙醇发酵工序前需要将反应液冷却,产生能量的浪费,但根据本发明的方法,可以使获得糖的反应温度与获得乙醇的发酵温度为相同温度范围,可以避免能量的浪费,因此是有效率的。
实施例
以下,基于实施例进一步详述,但本发明不受该实施例任何限定。
[1.使用了二氧化硅作为二氧化硅或含有二氧化硅的物质的糖的制造]
(1-1.平均一次粒径)
二氧化硅的平均一次粒径使用以下的测定装置测定。
氮吸附法测定装置:Monosorb MS-16(カンタクローム·インスツルメンツ·ジャパン合同会社制)
(1-2.纤维素酶水溶液)
通过以下步骤,制作出纤维素酶水溶液。在去离子交换水中,添加规定量的混合纤维素酶的粉末,在室温下,用转子以100rpm旋转30分钟而进行溶解从而获得了纤维素酶水溶液。需要说明的是,作为为糖化酶的纤维素酶,使用了将在pH3以上且pH6以下的范围具有最适的酶活性的里氏木霉(Trichoderma reesei;T.reesei)属来源的纤维素酶(SigmaAldrich制)和黑曲霉(Aspergillus niger;A.niger)属来源的纤维素酶(MP biomedicals制)以7:3(w/w)的比例混合而得的混合纤维素酶。
(1-3.糖化酶水溶液)
通过以下步骤,制作出糖化酶水溶液。在去离子交换水中,作为pH调节以最终成为0.05M的方式添加1M乙酸缓冲液(pH5.0),并添加上述的纤维素酶水溶液,在室温下,用转子以100rpm旋转30分钟而进行混合,分别获得了下述表1所示的糖化酶浓度(本实施例中为纤维素酶浓度)的糖化酶水溶液。将这些糖化酶水溶液设为比较样品1~比较样品3。各比较样品的糖化酶浓度使用Bradford法(CBB法),换算成BSA(商品名:蛋白质标准物质,SigmaAldrich制)的蛋白质浓度而算出。糖化酶浓度算出的具体步骤如下所述。
在比色皿(cell)长度10mm的一次性比色皿中,添加将蛋白质测定CBB溶液(5倍浓缩)(ナカライテスク制)用去离子交换水稀释成5倍而得的稀释液2.5mL,接着,添加各比较样品0.05mL,盖严。将该混合溶液反复进行上下翻转而均匀地混合。然后,静定30分钟,使用分光光度计UV-3150(岛津制作所制),测定了波长595nm的吸光度。制作已知的BSA的蛋白质浓度的试样,同样地测定吸光度而制作出标准曲线。从所得的标准曲线算出各比较样品的糖化酶浓度。需要说明的是,在里氏木霉属来源的纤维素酶的粉末1g中含有0.27g的蛋白质。在黑曲霉属来源的纤维素酶的粉末1g中含有0.06g的蛋白质。
[表1]
(1-4.糖化酶组合物)
通过以下步骤,制作出糖化酶组合物。在去离子交换水中,作为pH调节以最终成为0.05M的方式添加1M乙酸缓冲液(pH5.0),并添加作为二氧化硅的将通过水玻璃法制造的实心且球状的胶态二氧化硅(平均一次粒径:35nm)分散于水而得的酸性二氧化硅溶胶(pH2.1,二氧化硅浓度40质量%)、作为化合物(A)的硫脲、和上述的纤维素酶水溶液,在室温下,用转子以100rpm旋转30分钟而进行混合,分别获得了下述表2所示的糖化酶浓度(本实施例中为纤维素酶浓度)、二氧化硅浓度和化合物(A)浓度的糖化酶组合物。将这些糖化酶组合物设为样品1~样品8。
此外,作为化合物(A),代替硫脲,使用了硫脲衍生物或异硫脲衍生物,除此以外,与样品1~样品8同样地操作,分别获得了下述表2所示的糖化酶浓度(本实施例中为纤维素酶浓度)、二氧化硅浓度和化合物(A)浓度的糖化酶组合物。将这些糖化酶组合物设为样品9~样品18。
需要说明的是,下述表2所示的化合物(A)的种类如下所示。
A:硫脲
B:N-甲基硫脲
C:1,3-二甲基硫脲
D:三甲基硫脲
E:四甲基硫脲
F:1-烯丙基-3-(3-羟基乙基)-2-硫脲
G:亚乙基硫脲
H:脒基硫脲
I:S-甲基异硫脲硫酸盐
J:S-苄基异硫脲盐酸盐
K:S-(2-氨基乙基)异硫脲溴化物氢溴酸盐
[表2]
(1-5.含有硫脲的糖化酶水溶液)
通过以下步骤,使用了硫脲作为化合物(A)而制作出含有硫脲的糖化酶水溶液。在去离子交换水中,作为pH调节以最终成为0.05M的方式添加1M乙酸缓冲液(pH5.0),并添加硫脲、和上述的纤维素酶水溶液,在室温下,用转子以100rpm旋转30分钟而进行混合,分别获得了下述表3所示的糖化酶浓度(本实施例中为纤维素酶浓度)、和硫脲浓度的含有硫脲的糖化酶水溶液。将这些含有硫脲的糖化酶水溶液设为比较样品4~比较样品11。
[表3]
(1-6.含有二氧化硅的糖化酶水溶液)
通过以下步骤,制作出含有二氧化硅的糖化酶水溶液。在去离子交换水中,作为pH调节以最终成为0.05M的方式添加1M乙酸缓冲液(pH5.0),并添加作为二氧化硅的将通过水玻璃法制造的实心且球状的胶态二氧化硅(平均一次粒径粒径:35nm)分散于水而得的酸性二氧化硅溶胶(pH2.1,二氧化硅浓度40质量%)、和上述的纤维素酶水溶液,在室温下,用转子以100rpm旋转30分钟而进行混合,分别获得了下述表4所示的糖化酶浓度(本实施例中为纤维素酶浓度)、和二氧化硅浓度的含有二氧化硅的糖化酶水溶液。将这些含有二氧化硅的糖化酶水溶液设为比较样品12~比较样品14。
[表4]
(1-7.糖化反应液)
在样品1~样品18的糖化酶组合物中,添加微晶纤维素粉末,使其分散而制成使用了各样品的糖化反应液。具体的步骤如下所述。
首先,在13.5mL的玻璃瓶中加入各样品10mL,在用4mmφ且10mm的搅拌器搅拌的状态下,添加微晶纤维素粉末(结晶型:I型,商品名:Avicel PH-101,Sigma Aldrich制)0.05g(相当于5mg/mL),然后盖严。
此外,使用了比较样品1~比较样品3的糖化酶水溶液、比较样品4~比较样品11的含有硫脲的糖化酶水溶液、和比较样品12~比较样品14的含有二氧化硅的糖化酶水溶液,除此以外,与样品1~样品18的糖化酶组合物同样地操作,获得了各比较样品的糖化反应液。
(1-8.糖的制造)
将上述的使用了各样品和各比较样品的糖化反应液在25℃的恒温槽中,在搅拌下分别进行2天酶反应。通过该酶反应,获得了糖(葡萄糖)。
(1-9.葡萄糖生成量的算出)
(实施例1)
使用酶法(GOD法),对由样品1的糖化酶组合物获得的糖化反应液(以下,称为实施例1的糖化反应液),算出上述的酶反应2天后的葡萄糖生成量。
在2mL微型管中,采集样品1的糖化反应液的试样0.5mL,以105℃、15分钟使酶失活。接下来,为了除去未反应的纤维素、二氧化硅,将试样转移到带有绝对孔径0.1μm的过滤器的2mL微型管中,用高速冷却离心分离机SRX-201(トミー精工社制)在10,000G、5分钟的条件下离心分离,然后,回收了滤液。酶法使用了葡萄糖CII-Test Wako(和光纯药工业制)。使用分光光度计UV-3150测定了波长505nm的吸光度(比色皿长度10mm)。具体的步骤如下所述。
在比色皿长度10mm的一次性比色皿中添加发色试液3.0mL,接着,添加上述的滤液0.02mL,盖严。接下来,将该混合溶液反复进行上下翻转而均匀地混合。然后,在24℃下静定15分钟,使用分光光度计测定波长505nm的吸光度,设为Es。接下来,在比色皿长度10mm的一次性比色皿中添加发色试液3.0mL,接着,添加葡萄糖标准液II(500mg/dL)0.02mL,反复进行上下翻转而均匀地混合后,在24℃下静定15分钟,使用分光光度计测定波长505nm的吸光度,设为Estd。这里,以发色试液3.0mL的吸光度作为对照,测定了实施例1的糖化反应液的吸光度Es、和葡萄糖标准液II的吸光度Estd。
接下来,由下述式(3)求出实施例1的糖化反应液的葡萄糖生成量(mg/mL)。将其结果示于下述表5中。
(实施例2~实施例18)
与实施例1同样地操作,对由样品2~样品18的糖化酶组合物获得的各糖化反应液(以下,称为实施例2~实施例18的糖化反应液),算出酶反应2天后的葡萄糖生成量,将其结果示于下述表5中。
[表5]
(比较例1~比较例14)
与实施例1同样地操作,对由比较样品1~比较样品3的糖化酶水溶液、比较样品4~比较样品11的含有硫脲的糖化酶水溶液、和比较样品12~比较样品14的含有二氧化硅的糖化酶水溶液获得的各糖化反应液(以下,称为比较例1~比较例14的糖化反应液),算出酶反应2天后的葡萄糖生成量,将其结果示于下述表6中。
[表6]
(1-10.糖化反应效率)
基于上述表5和表6的葡萄糖生成量,对各实施例和各比较例的糖化反应效率进行了研究。首先,根据实施例4、实施例7、实施例8、比较例1~比较例3、比较例7、和比较例10~比较例14中的葡萄糖生成量,对由硫脲的添加带来的糖化反应效率的提高效果进行了研究。
图1是表示实施例4、7、8和比较例1~3、7、10~14的由硫脲的添加带来的糖化反应效率的提高效果的测定结果的图。如图1所示那样,如果将比较例1~比较例3的糖化反应液、与比较例12~比较例14的糖化反应液进行比较,则在纤维素酶水溶液中添加了二氧化硅的比较例12~比较例14的葡萄糖生成量增加,可见糖化反应效率的提高。此外,如果将比较例12~比较例14的糖化反应液、与实施例4、实施例7和实施例8的糖化反应液进行比较,则在纤维素酶水溶液中添加了二氧化硅和硫脲的实施例4、实施例7和实施例8的葡萄糖生成量增加,可见进一步的糖化反应效率的提高。另一方面,如果将比较例1~比较例3的糖化反应液、与比较例7、比较例10、比较例11的糖化反应液进行比较,则即使在纤维素酶水溶液中添加硫脲,糖化反应效率也不提高。因此可以确认到,在纤维素的糖化反应中,通过将二氧化硅与硫脲并用,从而糖化反应效率提高。
此外,根据该结果,如果将比较例1~比较例3的糖化反应液、和在纤维素酶水溶液中添加了二氧化硅的比较例12~比较例14的糖化反应液中的纤维素酶的使用量进行比较,则比较例12~比较例14中,可以减少20%左右的使用量。另一方面,如果将比较例1~比较例3的糖化反应液、和在纤维素酶水溶液中添加了二氧化硅和硫脲的实施例4、实施例7和实施例8的糖化反应液中的纤维素酶的使用量进行比较,则实施例4、实施例7和实施例8中,可以期待30%左右的使用量的减少,认为与在纤维素酶水溶液中添加了二氧化硅的情况相比,可以将糖化反应中的纤维素酶的使用量进一步减少10%左右。
接下来,根据实施例1~实施例6、比较例1、比较例4~9和比较例12中的葡萄糖的生成量,对由硫脲的添加量(硫脲浓度)带来的糖化反应效率的提高效果进行了研究。图2是表示实施例1、6和比较例1、4~9、12的由硫脲浓度带来的糖化反应效率的提高效果的测定结果的图。
如图2所示那样,在硫脲与二氧化硅的质量比率(硫脲/二氧化硅)大约在0.00001~0.1的范围的情况下,糖化反应效率大幅提高,可以确认到两者的并用效果。因此,由该结果暗示出,葡萄糖生成量特别依赖于硫脲的添加量。需要说明的是,在糖化酶(纤维素酶)中仅组合硫脲时,未观察到糖化反应效率的提高效果。
此外,根据实施例9~实施例18、比较例1和比较例12中的葡萄糖的生成量,对由硫脲以外的作为化合物(A)的硫脲衍生物或异硫脲衍生物的添加带来的糖化反应效率的提高效果进行了研究。图3是表示实施例9~18和比较例1、12的由硫脲衍生物或异硫脲衍生物的添加带来的糖化反应效率的提高效果的测定结果的图。
如图3所示那样,如果将实施例9~实施例18的糖化反应液、与比较例1和比较例12的糖化反应液进行比较,则在纤维素酶水溶液中添加了二氧化硅和硫脲衍生物或异硫脲衍生物的实施例9~实施例18中观察到糖化反应效率的提高效果。因此可以确认到,在纤维素的糖化反应中,通过将二氧化硅与作为化合物(A)的硫脲衍生物或异硫脲衍生物并用,从而糖化反应效率提高。
[2.使用了硅藻土作为二氧化硅或含有二氧化硅的物质的糖的制造]
(2-1.平均二次粒径)
硅藻土的平均二次粒径使用以下的测定装置测定。
激光衍射/散射式粒径分布测定装置:LA-300(株式会社堀场制作所社制)
(2-2.糖化酶组合物)
通过以下步骤,制作出糖化酶组合物。在去离子交换水中,作为pH调节以最终成为0.05M的方式添加1M乙酸缓冲液(pH5.0),并添加作为含有二氧化硅的物质的硅藻土(二氧化硅#600S,中央シリカ株式会社制,二氧化硅含有率:90质量%,平均二次粒径:30μm)、作为化合物(A)的硫脲、和上述的纤维素酶水溶液,在室温下,用转子以100rpm旋转30分钟而进行混合,获得了下述表7所示的糖化酶浓度(本实施例中为纤维素酶浓度)、硅藻土浓度和硫脲浓度的糖化酶组合物。将该糖化酶组合物设为样品19。
(2-3.含有硅藻土的糖化酶水溶液)
通过以下步骤,制作出含有硅藻土的糖化酶水溶液。在去离子交换水中,作为pH调节以最终成为0.05M的方式添加1M乙酸缓冲液(pH5.0),并添加作为含有二氧化硅的物质的硅藻土(二氧化硅#600S,中央シリカ株式会社制,二氧化硅含有率:90质量%,平均粒径:30μm)、和上述的纤维素酶水溶液,在室温下,用转子以100rpm旋转30分钟而进行混合,获得了下述表7所示的糖化酶浓度(本实施例中为纤维素酶浓度)、和硅藻土浓度的含有硅藻土的糖化酶水溶液。将该含有硅藻土的糖化酶水溶液设为比较样品15。
[表7]
(2-4.糖化反应液)
使用了样品19的糖化酶组合物和比较样品15的含有硅藻土的糖化酶水溶液,除此以外,与样品1~样品18的糖化酶组合物同样地操作,获得了样品19和比较样品15的糖化反应液。
(2-5.葡萄糖生成量的算出)
(实施例19)
与实施例1同样地操作,对由样品19的糖化酶组合物获得的糖化反应液(以下,称为实施例19的糖化反应液),算出酶反应2天后的葡萄糖生成量,将其结果示于下述表8中。
(比较例15)
与实施例1同样地操作,对由比较样品15的糖化酶组合物获得的糖化反应液(以下,称为比较例15的糖化反应液),算出酶反应2天后的葡萄糖生成量,将其结果示于下述表8中。
[表8]
(2-6.糖化反应效率)
基于上述表6和表8的葡萄糖生成量,对各样品和各比较样品的糖化反应效率进行了研究。首先,根据实施例19、比较例1、比较例7、和比较例15中的葡萄糖生成量,对由硫脲的添加带来的糖化反应效率的提高效果进行了研究。图4是表示实施例19和比较例1、7、15的由硫脲的添加带来的糖化反应效率的提高效果的测定结果的图。
如图4所示那样,如果将比较例1的糖化反应液、在纤维素酶水溶液中添加了硫脲的比较例7的糖化反应液、在纤维素酶水溶液中添加了作为含有二氧化硅的物质的硅藻土的比较例15的糖化反应液、和在纤维素酶水溶液中添加了硅藻土和硫脲的实施例19的糖化反应液进行比较,则在纤维素酶水溶液中添加了硅藻土和硫脲的实施例19的葡萄糖生成量增加,可见糖化反应效率的提高。因此可以确认到,在纤维素的糖化反应中,通过使用作为含有二氧化硅的物质的硅藻土,进一步并用硫脲,从而糖化反应效率提高。
[3.使用了糖的乙醇的制造]
(3-1.酵母水溶液)
通过以下步骤,制作出酵母水溶液。在预先调整为35℃的去离子交换水40g中添加酵母的粉末0.2g,在保持35℃的状态下使用磁力搅拌器搅拌20分钟而进行溶解,从而获得了0.5质量%(=酵母粉末0.2g/去离子交换水40g)的酵母水溶液。需要说明的是,作为酵母,使用了酵母(Saccharomyces)属的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae;S.cerevisiae)YP2(Sigma Aldrich制)。
(3-2.乙醇发酵水溶液)
通过以下步骤,制作出乙醇发酵水溶液。在去离子交换水中,作为pH调节以最终成为pH5左右的方式添加硫酸,作为氮源以最终成为0.21mg/mL的方式添加尿素,并添加上述的纤维素酶水溶液和上述的酵母水溶液,在室温下,用磁力搅拌器旋转10分钟而进行混合,获得了下述表9所示的糖化酶浓度(本实施例中为纤维素酶浓度)、和酵母浓度的乙醇发酵水溶液。将该乙醇发酵水溶液设为比较样品16。
(3-3.乙醇发酵组合物)
通过以下步骤,制作出乙醇酶组合物。在去离子交换水中,作为pH调节以最终成为pH5左右的方式添加硫酸,作为氮源以最终成为0.21mg/mL的方式添加尿素,并添加作为含有二氧化硅的物质的将通过水玻璃法制造的实心且球状的胶态二氧化硅(平均一次粒径:85nm)分散于水中而得的碱性二氧化硅溶胶(pH9.5,二氧化硅浓度40质量%)、作为化合物(A)的硫脲、上述的纤维素酶水溶液和上述的酵母水溶液,在室温下,用磁力搅拌器旋转10分钟而进行混合,分别获得了下述表9所示的糖化酶浓度(本实施例中为纤维素酶浓度)、二氧化硅浓度、硫脲浓度、和酵母浓度的乙醇发酵组合物。将这些乙醇发酵组合物设为样品20和样品21。
(3-4.含有硫脲的乙醇发酵水溶液)
通过以下步骤,制作出含有硫脲的乙醇发酵水溶液。在去离子交换水中,作为pH调节以最终成为pH5左右的方式添加硫酸,作为氮源以最终成为0.21mg/mL的方式添加尿素,并添加作为化合物(A)的硫脲、上述的纤维素酶水溶液和上述的酵母水溶液,在室温下,用磁力搅拌器旋转10分钟而进行混合,获得了下述表9所示的糖化酶浓度、硫脲浓度、和酵母浓度的含有硫脲的乙醇发酵水溶液。将该含有硫脲的乙醇发酵水溶液设为比较样品17和比较样品18。
(3-5.含有二氧化硅的乙醇发酵水溶液)
通过以下步骤,制作出含有二氧化硅的乙醇发酵水溶液。在去离子交换水中,作为pH调节以最终成为pH5左右的方式添加硫酸,作为氮源以最终成为0.21mg/mL的方式添加尿素,并添加作为二氧化硅的将通过水玻璃法制造的实心且球状的胶态二氧化硅(平均一次粒径85nm)分散于水而得的碱性二氧化硅溶胶(pH9.5,二氧化硅浓度40质量%)、上述的纤维素酶水溶液和上述的酵母水溶液,在室温下,用转子以100rpm旋转30分钟而进行混合,获得了下述表9所示的糖化酶浓度(本实施例中为纤维素酶浓度)、二氧化硅浓度、和酵母浓度的含有二氧化硅的乙醇发酵水溶液。将该含有二氧化硅的乙醇发酵水溶液设为比较样品19。
[表9]
(3-6.糖化反应和乙醇发酵液)
在样品20的乙醇发酵组合物中,添加微晶纤维素粉末,使其分散而制成使用了各样品的糖化反应和乙醇发酵液。具体的步骤如下所述。
首先,在13.5mL的玻璃瓶中加入各样品10mL,在用4mmφ且10mm的搅拌器搅拌的状态下,添加微晶纤维素粉末(结晶型:I型,商品名:Avicel PH-101,Sigma Aldrich制)0.20g(相当于20mg/mL),然后用带有绝对孔径0.22μm的疏水性PTEF制膜滤器的硅塞将其盖上。
此外,使用了样品21的乙醇发酵组合物、比较样品16的乙醇发酵水溶液、比较样品17和比较样品18的含有硫脲的乙醇发酵水溶液、和比较样品19的含有含有二氧化硅的物质的乙醇发酵水溶液,除此以外,与样品20的乙醇发酵组合物同样地操作,获得了各糖化反应和乙醇发酵液。
(3-7.乙醇的制造)
将上述的使用了各样品和各比较样品的糖化反应和乙醇发酵液,在31℃的恒温槽中在搅拌下使酶反应和乙醇发酵同时各进行2天。使用通过该酶反应而获得的糖(葡萄糖)进行乙醇发酵,获得了乙醇。
(3-8.乙醇生成量的算出)
(实施例20)
使用气相色谱(GC),算出由样品20的乙醇发酵组合物获得的糖化反应和乙醇发酵液(以下,称为实施例20的糖化反应和乙醇发酵液)的酶反应和乙醇发酵后的乙醇生成量。
在2mL微型管中采集实施例20的糖化反应和乙醇发酵液的试样0.5mL,以105℃、15分钟使酶和酵母失活。接下来,为了除去未反应的纤维素、含有二氧化硅的物质和酵母,用高速冷却离心分离机SRX-201(トミー精工社制)在15,000G、30分钟的条件下离心分离,然后,回收了上清液。乙醇生成量的定量中,使用气相色谱GC-2014s(岛津制作所社制)通过1点标准曲线法进行测定,将乙醇生成量(mg/mL)的测定结果示于下述表10中。具体的分析条件如下所述。
<分析条件>
柱:ポーラパックQ,长度1m,内径3.2mm(ジーエルサイエンス社制)
检测器:FID
柱温度:150℃
流量:40mL/min
样品量:2μL
标准曲线用标准品:乙醇10mg/mL水溶液
(实施例21)
与实施例20同样地操作,对由样品21的乙醇发酵组合物获得的糖化反应和乙醇发酵液(以下,称为实施例21的糖化反应和乙醇发酵液),算出酶反应和乙醇发酵2天后的乙醇生成量,将其结果示于下述表10中。
(比较例16~比较例19)
与实施例20同样地操作,对比较样品16的乙醇发酵水溶液、比较样品17和比较样品18的含有硫脲的乙醇发酵水溶液、和比较样品19的含有含有二氧化硅的物质的乙醇发酵水溶液获得的各糖化反应和各乙醇发酵液(以下,称为比较例16~比较例19的糖化反应和乙醇发酵液),算出糖化反应和乙醇发酵2天后的乙醇生成量,将其结果示于下述表10中。
[表10]
(3-9.乙醇发酵效率)
基于上述表10的乙醇生成量,对各实施例和各比较例的乙醇发酵效率进行了研究。首先,根据实施例20、实施例21和比较例16~比较例19中的乙醇生成量,对由硫脲的添加量(硫脲浓度)带来的糖化反应效率的提高效果进行了研究。图5是表示实施例20、21和比较例16~19的由硫脲浓度带来的乙醇发酵效率的提高效果的测定结果的图。
如图5所示那样,如果将比较例16、比较例19的糖化反应和乙醇发酵液进行比较,则在纤维素酶水溶液和酵母水溶液中添加了二氧化硅的比较例19的乙醇生成量增加,观察到乙醇生成效率的提高。此外,如果将实施例20、实施例21和比较例19的糖化反应和乙醇发酵液进行比较,则在纤维素酶水溶液和酵母水溶液中添加了二氧化硅和硫脲的实施例20、实施例21的乙醇生成量增加,可见进一步的乙醇生成效率的提高。另一方面,如果将比较例16、比较例17、比较例18的糖化反应和乙醇发酵液进行比较,则即使在纤维素酶水溶液和酵母水溶液中添加硫脲,乙醇生成效率也不提高。因此可以确认到,在纤维素的糖化反应和乙醇发酵中,通过将含有二氧化硅的物质与硫脲并用,从而乙醇生成效率提高。
产业可利用性
本发明可以在应用由包含纤维素或半纤维素的纤维素系生物质生成葡萄糖这样的糖的糖化技术的产业领域,例如,纤维素系生物乙醇的制造等中利用。
Claims (15)
2.根据权利要求1所述的糖化反应液,其特征在于,所述含有二氧化硅的物质为硅藻土或硅砂。
3.根据权利要求1或2所述的糖化反应液,其特征在于,所述化合物(A)包含选自硫脲、N-甲基硫脲、1,3-二甲基硫脲、三甲基硫脲、四甲基硫脲、1-烯丙基-3-(3-羟基乙基)-2-硫脲、亚乙基硫脲、脒基硫脲、S-甲基异硫脲、S-乙基异硫脲、S-[2-(二甲基氨基)乙基]异硫脲、S-苄基异硫脲、和S-(2-氨基乙基)异硫脲中的至少1种。
5.根据权利要求4所述的糖化酶组合物,其特征在于,所述含有二氧化硅的物质为硅藻土或硅砂。
6.根据权利要求4或5所述的糖化酶组合物,其特征在于,所述化合物(A)包含选自硫脲、N-甲基硫脲、1,3-二甲基硫脲、三甲基硫脲、四甲基硫脲、1-烯丙基-3-(3-羟基乙基)-2-硫脲、亚乙基硫脲、脒基硫脲、S-甲基异硫脲、S-乙基异硫脲、S-[2-(二甲基氨基)乙基]异硫脲、S-苄基异硫脲、和S-(2-氨基乙基)异硫脲中的至少1种。
7.一种糖的制造方法,是使用将纤维素和半纤维素中的至少一者进行糖化的糖化反应液来制造糖的糖的制造方法,其特征在于,所述糖化反应液含有:
所述纤维素和所述半纤维素中的至少一者、
糖化酶、
二氧化硅或含有二氧化硅的物质、和
选自下述通式(1)和(2)所示的化合物及其盐中的至少1种的化合物(A),
所述化合物(A)与所述二氧化硅或含有二氧化硅的物质中的二氧化硅的质量比率即化合物(A)/二氧化硅为0.00001以上且0.1以下,
所述通式(1)和通式(2)中的R1~R5表示氢原子、或碳原子数1~4的烷基,所述烷基中的氢原子的一部分可以被烯丙基、羟基、酯基、氨基、羧基、氰基、硝基、磺基、膦酰基或卤原子取代。
8.根据权利要求7所述的糖的制造方法,其特征在于,所述含有二氧化硅的物质为硅藻土或硅砂。
9.根据权利要求7或8所述的糖的制造方法,其特征在于,所述化合物(A)包含选自硫脲、N-甲基硫脲、1,3-二甲基硫脲、三甲基硫脲、四甲基硫脲、1-烯丙基-3-(3-羟基乙基)-2-硫脲、亚乙基硫脲、脒基硫脲、S-甲基异硫脲、S-乙基异硫脲、S-[2-(二甲基氨基)乙基]异硫脲、S-苄基异硫脲、和S-(2-氨基乙基)异硫脲中的至少1种。
10.一种乙醇的制造方法,其特征在于,通过权利要求7~9中任一项所述的糖的制造方法制造糖,使用获得的糖,利用发酵微生物进行乙醇发酵,来制造乙醇。
11.根据权利要求10所述的乙醇的制造方法,其特征在于,在制造糖的工序中添加发酵微生物,从而同时进行糖的制造和乙醇发酵。
12.根据权利要求10或11所述的乙醇的制造方法,其特征在于,所述发酵微生物为酵母、霉或细菌。
13.根据权利要求12所述的乙醇的制造方法,其特征在于,所述发酵微生物为属于酵母属(Saccharomyces)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、发酵细菌属(Zymobacter)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)或埃希氏菌属(Escherichia)的微生物。
14.根据权利要求12所述的乙醇的制造方法,其特征在于,所述发酵微生物为属于毕赤酵母属(Pichia)或假丝酵母属(Candida)的微生物。
15.根据权利要求10或11所述的乙醇的制造方法,其特征在于,在15℃以上且35℃以下进行乙醇发酵。
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