JP5543359B2 - ペニシリウム・フニクロサム酵素を使用したバイオ増熱剤の調製 - Google Patents
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Description
1.酵素および基質
Rovabio(登録商標)LCは、ブダペスト条約に基づき番号IMI378536のもと国際菌学研究所に寄託されたペニシリウム・フニクロサムから得られた酵素のカクテルであり、その主要な既知の活性は、セルラーゼ、キシラナーゼおよびβ−グルカナーゼの活性である。
研究した基質のうちの2つでは、酵素の基質に対する接近性を最適化するために、混合工程が必要である。それらは一級品質コムギわらおよびコムギわらである。それらはミキサーを使用して縮小化し、最終的な粒子サイズをセンチメートルオーダーとした。
温和な条件下で行なわれる試験と平行して、コムギわらおよびコムギ糠を化学的前処理に供した。前処理の目的は、バイオマスの物理的構造を変化させ且つ様々な画分を分離することで、セルロースを酵素に対してより接近可能にし、発酵性糖への変換を可能にすることである。これらの基質を、3g/lで20mlの硫酸と接触させ、98℃で20分間ウォーターバスにてインキュベートする。それらを次に100mlの超純水で洗浄する。洗浄した水を除去し、前処理した基質をその他の基質と同様な方法で処理する(すなわち酢酸緩衝液を添加しオートクレーブ滅菌する)。
エルレンマイヤーフラスコを周囲の温度まで冷却させた後、酵素溶液を滅菌状態でそれらに添加する。各々の条件は二重で試験し、各々の試験にコントロールをたてる。コントロールは、酵素を添加しないエルレンマイヤーフラスコを含む。様々な濃度の酵素を試験し、最も効果のある酵素の量/基質の量の比率、すなわち最も可能性のある比率を決定した。Rovabio(登録商標)LC以外の酵素に関する試験では、セルラーゼおよび/またはキシラナーゼ活性がRovabio(登録商標)LCと等価となるように、使用する量を決定した。
インキュベーション後、様々なサンプルの不溶性画分を、4℃で15分間の10000gの遠心分離によって回収する。次に、上清を、HPLCによる分析のために小分けして−20℃で保存する。ペレットについては、最初に50mlの水で洗浄し、その後再び40mlの水で洗浄する。各々の洗浄の後、ペレットを遠心分離によって回収し(上記と同一の条件)、洗浄による上清もHPLCによる分析のために小分けする。
可溶性画分の糖組成の決定のために、遠心分離による上清およびさらに洗浄による上清をHPLC(Agilent 1100)によって分析する。クロマトグラフィーシステムは、イソクラティックポンプ装置、サンプルチェンジャー、プレカラム(Bio−Rad,Micro−Guard(登録商標)Carbo P)、Aminex(登録商標)HPX−87Pカラム(Bio−Rad)、RID(屈折率検出)検出器または屈折計およびデータ収集および処理システムを含む。クロマトグラフィーカラムに注入する前に、上清は、4℃で30分間16100gの遠心分離を行い、すべての不純物をペレットにする。次に、それらを0.45μmセルロース膜を通してろ過する。分析条件は次の通りである:クロマトグラフィーを80℃で行う、移動相は超純水である、流速は0.6ml/分である、および20μlのサンプルを注入する、その後、100μlの水で洗浄する。サンプルの構成分子は、あらかじめ測定されたキャリブレーション範囲を使用して、それらの保持時間によって同定する。この範囲は4つの糖からなり、その濃度は0.5g/lから25g/lにわたる。キャリブレーション範囲に使用される糖はセロビオース、D−グルコース、D−キシロースおよびL−アラビノースである。それらはリグノセルロースバイオマスの加水分解の際に主に放出される糖である。
酵素活性は、3,5−ジニトロサリチル酸(DNS)アッセイ方法(G.L.Miller,1959)によって測定する。セルラーゼまたはキシラナーゼ活性のユニットは、定義された酵素条件(すなわちセルラーゼ活性ではpH5、キシラナーゼではpH4、および温度50℃)において、1分当たりおよび1グラムの生成物当たりの、それぞれ1μmolのグルコース等価物またはキシロース等価物の放出に必要な酵素の量として定義される。
我々が使用する市販のセルロースは、実際には、真のセルロースおよびヘミセルロースの混合物である。セルロースはβ−1,4−結合D−グルコースのポリマーである。Rovabio(登録商標)LCは、そのセルラーゼ活性(エンド−1,4−β−グルコース、セロビオヒドラーゼおよびβ−グルコシダーゼ)によって、バイオエタノールの合成に基づいて、それを加水分解しグルコースモノマーを放出する。ヘミセルロースは、β−1,4−結合であるD−キシロースポリマーであり、様々な糖、例えばマンノース、ガラクトース、アラビノースなどによる分岐を有する。後者のキシラナーゼ活性(とりわけ、エンド−1,4−β−キシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、α−アラビノフラノシダーゼ)により、Rovabio(登録商標)LCによる加水分解が行われる。
加水分解収率は、反応後に残る乾燥したバイオマスのパーセンテージによって推定できる。
セルロースは99.5%の純度であるため、グルコースに相当する28%の加水分解物、より少ない量のセロビオースおよびヘミセルロース画分に由来するキシロースが予想される。図1Bは、セルロース加水分解の際に放出された様々な糖を示す。放出されたキシロースの量は、0.08g/g(最初の固体(Si))、すなわち100gのセルロースから8gの放出に達する。
以下の試験において、試験された基質の量は2gであり、Rovabio(登録商標)LCの濃度は100μl/g(基質)であり、加水分解条件は28℃で72時間である。バイオマス加水分解の結果は図2Aに示され、HPLC分析の結果は図2Bに示される。
コムギは、フランスにおけるバイオエタノール生産において最も広く使用される基質のうちの1つである。それは、さらに、Rovabio(登録商標)LCの加水分解において、最良の結果を与える基質である。我々は、コムギわらおよびコムギ糠という2つの異なる形態でそれを研究した。
それは、33〜43%のセルロース、20〜25%のヘミセルロースおよび15〜20%のリグニン(ソースIFP、2007年)から成る。鎖のサイズが大きすぎるため、それを混合によって縮小させた。最終的な粒子サイズは約1センチメートルである。
コムギ糠の各々の構成分子の比率を正確に決定するのは難しい。これは、この組成が、コムギの由来に応じて、および前記コムギの製粉に応じて異なり、更に、分析の方法に応じて異なるためである。しかしながら、それは、平均して3〜7%のリグニンを含み(Schwartzら,1988)、その可溶性糖の組成は次の通りであるようである:2.1%のガラクトース、23.7%のアラビノース、29.1%のグルコースおよび43.7%のキシロース(Benamroucheら,2002)。
この最適化は、3つの必須の因子を含む:酵素濃度、加水分解温度および酵素の基質に対する接近性を改善するための化学的前処理。
我々の基質からのグルコースの放出を増加させる方法は、理論的に推論すれば、酵素濃度を増加させることだろう。しかしながら、現在まで、バイオ燃料の開発における主な障害は、リグノセルロースバイオマスのために糖化工程で使用される酵素のコストである。この理由のため、最適酵素濃度を定義することが必要である。
以前の試験は28℃の温度で行なわれたが、これはRovabio(登録商標)LC活性のための最適温度ではない。実際、この酵素カクテルは、50℃の温度で通常分析される様々な活性からできている。さらに、Rovabio(登録商標)LCは第一に飼料として使用される栄養上の添加物である。それ故、動物の消化管の温度(種に依存して38から41℃で変化する)で活性を有する可能性があるに違いない。それ故、リグノセルロースバイオマスの加水分解における試験は、28℃より上の温度で行わなければならない。
バイオエタノールの生産に使用された基質は、相対的に未加工であり、酵素的加水分解の前に前処理を必要とする材料である。様々なタイプの前処理が存在し、それらのすべての目的は、粒子のサイズを減少することにより、またはヘミセルロースおよび/またはリグニン画分を減少することにより、酵素の基質に対する接近性を改善することである。多くの前処理が開発されている:物理的前処理(基質は加圧される)、加熱前処理(水蒸気爆発)(Mosier N.ら,2005)または化学的(酸性または塩基性)前処理。後者は、最も広く使用され、実験室スケールだけでなく、産業的開発段階においても使用される(Schell D.J.ら,2003)。
以下の試験はコムギ糠のみにて行った。分析条件は次の通りである:37℃(最も有効な温度)で72時間の加水分解。酵素濃度は次のように決定される:キシラナーゼについては、活性は200μlのRovabio(登録商標)LCの活性と等価であり、発酵液については、200μlのRovabio(登録商標)の活性と同等なセルラーゼ活性が維持される。結果は図7に示される。
Rovabio(登録商標)LCと等価な活性を有するために必要となるキシラナーゼBの濃度は150μl/g(基質)である。キシラナーゼBによる加水分解の後、79%のコムギ糠が回収され、それは加水分解が21%に達することを意味する。
これらの試験に使用されたキシラナーゼCの濃度は850μl/g(基質)である。18%のコムギ糠だけが、反応の72時間後にキシラナーゼCにより加水分解される。キシラナーゼCは、この種の基質を加水分解することに関して、キシラナーゼBほど有効ではないように思われる。
以下の試験は、50%のキシラナーゼ活性がRovabio(登録商標)LCによって提供され、残りの50%がキシラナーゼBまたはキシラナーゼCによる、コムギ糠の酵素的加水分解である。その反応は72時間間37℃で行なわれる。
それ故、我々は、587μlのP.フニクロサム発酵液による、37℃72時間のコムギ糠の加水分解を分析した。我々がこの試験に使用する発酵液は、4℃で1800gで遠心分離機にかけられた発酵上清に相当する。
本願発明の実施態様は、以下のとおりである。
1. 以下の工程を含む、バイオマスを処理する方法:
(a)少なくとも、ブダペスト条約に基づき番号IMI378536のもと国際菌学研究所に寄託されたペニシリウム・フニクロサムから得られた酵素混合物を提供すること;
(b)植物バイオマスを提供すること;
(c)工程(a)の前記酵素混合物および工程(b)の前記バイオマスを前記バイオマスの糖化が生じる条件下で接触させること。
2. 1に記載のバイオマスを処理する方法であって、前記バイオマスは、工程(a)の前記酵素混合物との接触の前に、少なくとも前処理工程を受ける方法。
3. 2に記載の方法であって、前記前処理工程は、前記バイオマスを98℃の硫酸バスに入れることから成る化学的前処理であり、前記硫酸は3g/リッターの濃度で存在する方法。
4. 2に記載の方法であって、前記前処理工程は、前記バイオマスを粉砕することから成る機械的前処理である方法。
5. 以下の工程を含む、バイオエタノールを生産する方法:
(a)少なくとも、ブダペスト条約に基づき番号IMI378536のもと国際菌学研究所に寄託されたペニシリウム・フニクロサムから得られた酵素混合物を提供すること;
(b)バイオマスを提供すること;
(c)工程(a)の前記酵素混合物および工程(b)の前記バイオマスを、植物廃棄物産物の糖化が生じる条件下で接触させること;
(d)工程(c)によって得られた生成物を発酵すること。
6. 1から5の何れか1項に記載の方法であって、前記酵素混合物は単離された純粋な酵素製剤として提供される方法。
7. 1から5の何れか1項に記載の方法であって、前記酵素混合物は粗製酵素製剤として提供される方法。
8. 1から7の何れか1項に記載の方法であって、バイオマスは、コムギわら、コムギ糠、麻繊維または皮をむいた麻の茎から選択される方法。
9. バイオマスの糖化における、ブダペスト条約に基づき番号IMI378536のもと国際菌学研究所に寄託されたペニシリウム・フニクロサムから得られた酵素混合物を含む組成物の使用。
10. ブダペスト条約に基づき番号IMI378536のもと国際菌学研究所に寄託されたペニシリウム・フニクロサムから得られた酵素混合物を含む加工されたバイオマス。
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Claims (10)
- 以下の工程を含む、バイオマスを処理する方法:
(a)少なくとも、ブダペスト条約に基づき番号IMI378536のもと国際菌学研究所に寄託されたペニシリウム・フニクロサムから得られた酵素混合物とキシラナーゼを提供すること;
(b)植物バイオマスを提供すること;
(c)工程(a)の前記酵素混合物および工程(b)の前記バイオマスを前記バイオマスの糖化が生じる条件下で接触させること。 - 前記キシラナーゼは、ブダペスト条約に基づき番号IMI378536のもと国際菌学研究所に寄託されたペニシリウム・フニクロサムに由来する、請求項1に記載の方法。
- 混合物中に存在するキシラナーゼの活性は、ペニシリウム・フニクロサムから供された酵素混合物により得られたキシラナーゼの活性量と同じである、請求項1または2に記載の方法。
- 酵素混合物は、単離された純粋な酵素製剤として供される、請求項1から3の何れか1項に記載の方法。
- 酵素混合物は、粗酵素製剤として供される、請求項1から3の何れか1項に記載の方法。
- バイオマスは、コムギわら、コムギ糠、麻繊維または皮をむいた麻の茎から選択される請求項1から5の何れか1項に記載の方法。
- 以下の工程を含む、バイオエタノールを生産する方法:
−請求項1から6の何れか1項に記載の工程を含むバイオマスの糖化、
−バイオマスの糖化にしたがって得られた生成物の発酵。 - 少なくとも、ブダペスト条約に基づき番号IMI378536のもと国際菌学研究所に寄託されたペニシリウム・フニクロサムとキシラナーゼから得られた酵素混合物およびキシラナーゼを含むバイオマスの糖化のための組成物。
- 混合物中に存在するキシラナーゼの活性は、ペニシリウム・フニクロサムから供された酵素混合物により得られたキシラナーゼの活性量と同じである、請求項8記載のバイオマスの糖化のための組成物。
- 請求項8または9記載の組成物のバイオマスの糖化のための使用。
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