JP7001053B2

JP7001053B2 - 糖化反応液、糖化酵素組成物、糖の製造方法及びエタノールの製造方法

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Publication number: JP7001053B2
Application number: JP2018523905A
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Filing date: 2017-06-12
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Description

本発明は、糖化反応液、糖化酵素組成物、糖の製造方法及びエタノールの製造方法に関する。

従来、セルロース又はヘミセルロースを含むセルロース系バイオマスを原料に、エタノールを製造するセルロース系バイオエタノールが知られている。

セルロース又はヘミセルロースを含むセルロース系バイオマスからグルコースといった糖を生成する方法（糖化技術）としては、セルロース系バイオマスに硫酸を加えて加水分解する方法が知られているが、反応器の腐食や廃液処理の問題がある。また、例えば、カーボンやゼオライト等にスルホ基を担持させた固体酸触媒を用いてセルロース系バイオマスを糖化する方法も提案されているが、固体同士の反応であるが故に、反応速度が極めて遅い上、未反応残渣と固体酸触媒との分離が困難という問題がある。更に、上述のどの方法も加水分解の制御が難しく、反応が進行し過ぎた結果、糖自体が分解し、糖の収率が低下してしまう問題もある。

一方、酵素を用いて糖化を行う方法も知られている（特許文献１参照）。かかる方法は、原料を加圧熱水で処理する熱水処理工程、その熱水処理物を機械的粉砕処理する機械的粉砕処理工程、及びその機械的粉砕物を酵素で糖化処理する糖化処理工程を含む。しかしながら、かかる方法では、酵素で糖化する際の反応速度が遅く、得られる糖化液の濃度が十分とはいえないという問題があった。

そこで、酵素をシリカ系メソ多孔体に担持させて用いることにより、酵素を溶解した状態よりも高濃度に反応系中に存在させることができ、酵素反応をより効率的に進めるという方法が提案されている（特許文献２参照）。しかしながら、かかる方法では、酵素を担体に吸着固定化する工程が必要であるという問題があり、また、固定化された酵素は、固定化されていないものと比較して、反応効率が４０％～５０％程度に低下する虞があるという問題がある。更に、固体同士の反応であるが故に、未反応残渣と酵素が固定された担体との分離が困難という問題もある。

また、シリカゾルと酵素を混合し、シリカゲルとした後、粉末化した固定化酵素も知られている（特許文献３，４参照）。このような固定化酵素でも酵素の回収はできるものの、反応効率自体は低いものであった。他にも、０．５μｍ～１００μｍのシリカ粉末と酵素を混合してセルロースを含む植物繊維を加水分解する方法も知られているが、シリカ粉末を混合した効果が明確ではなく、未反応残渣と懸濁したシリカ粉末との分離が困難という問題がある（特許文献５参照）。

更に、酵素とグアニジンや尿素等を含んだ糖化反応促進剤を用いてセルロース系バイオマスを糖化する方法も提案されている（特許文献６参照）。しかしながら、この糖化反応促進剤は、糖化反応を促進させるものではなく、一定期間保管した後でもバイオマスの分解性能を低下させることがない、保存安定性に優れたものである。

特開２００６－１３６２６３号公報特開２００９－１２５００６号公報特公昭６３－２５９５号公報特公昭６３－２１４７５号公報特開平１０－６６５９４号公報特開２０１１－２３４７１５号公報

本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、簡便な工程で酵素による糖化反応効率を向上させることが可能な糖化反応液、糖化酵素組成物、糖の製造方法及びエタノールの製造方法を提供することを目的とする。

上記目的を達成する本発明の第１の態様は、セルロース及びヘミセルロースの少なくとも一方を糖化する糖化反応液であって、前記セルロース及び前記ヘミセルロースの少なくとも一方と、糖化酵素と、シリカ又はシリカ含有物質と、下記一般式（１）又は（２）で表される化合物及びその塩からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物（Ａ）とを含有することを特徴とする糖化反応液にある。

［前記一般式（１）及び（２）中のＲ_１～Ｒ_５は、水素原子又は炭素数１～４のアルキル基を表し、前記アルキル基中の水素原子の一部は、アリル基、ヒドロキシル基、エステル基、アミノ基、カルボキシル基、シアノ基、ニトロ基、スルホ基、ホスホノ基又はハロゲン原子によって置換されていてもよい。］

上記目的を達成する本発明の第２の態様は、前記シリカ含有物質が、珪藻土又は珪砂であることを特徴とする第１の態様の糖化反応液にある。

上記目的を達成する本発明の第３の態様は、前記シリカ又はシリカ含有物質中のシリカと前記化合物（Ａ）との質量比率（化合物（Ａ）／シリカ）が、０．００００１以上、０．１以下であることを特徴とする第１の態様又は第２の態様の糖化反応液にある。

上記目的を達成する本発明の第４の態様は、前記化合物（Ａ）が、チオ尿素、Ｎ－メチルチオ尿素、１，３－ジメチルチオ尿素、トリメチルチオ尿素、テトラメチルチオ尿素、１－アリル－３－（３－ヒドロキシエチル）－２－チオ尿素、エチレンチオ尿素、グアニルチオ尿素、Ｓ－メチルイソチオ尿素、Ｓ－エチルイソチオ尿素、Ｓ－［２－（ジメチルアミノ）エチル］イソチオ尿素、Ｓ－ベンジルイソチオ尿素、及びＳ－（２－アミノエチル）イソチオ尿素からなる群から選ばれる少なくとも１種を含有することを特徴とする第１の態様乃至第３の態様のいずれかの糖化反応液にある。

上記目的を達成する本発明の第５の態様は、セルロース及びヘミセルロースの少なくとも一方を糖化する糖化酵素組成物であって、糖化酵素と、シリカ又はシリカ含有物質と、下記一般式（１）又は（２）で表される化合物及びその塩からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物（Ａ）とを含有し、前記シリカ又はシリカ含有物質中のシリカと前記化合物（Ａ）との質量比率（化合物（Ａ）／シリカ）が、０．００００１以上、０．１以下であることを特徴とする糖化酵素組成物にある。

上記目的を達成する本発明の第６の態様は、前記シリカ含有物質が、珪藻土又は珪砂であることを特徴とする第５の態様の糖化酵素組成物にある。

上記目的を達成する本発明の第７の態様は、前記化合物（Ａ）が、チオ尿素、Ｎ－メチルチオ尿素、１，３－ジメチルチオ尿素、トリメチルチオ尿素、テトラメチルチオ尿素、１－アリル－３－（３－ヒドロキシエチル）－２－チオ尿素、エチレンチオ尿素、グアニルチオ尿素、Ｓ－メチルイソチオ尿素、Ｓ－エチルイソチオ尿素、Ｓ－［２－（ジメチルアミノ）エチル］イソチオ尿素、Ｓ－ベンジルイソチオ尿素、及びＳ－（２－アミノエチル）イソチオ尿素からなる群から選ばれる少なくとも１種を含有することを特徴とする第５の態様又は第６の態様の糖化酵素組成物にある。

上記目的を達成する本発明の第８の態様は、セルロース及びヘミセルロースの少なくとも一方を糖化する糖化反応液を用いて糖を製造する糖の製造方法であって、前記セルロース及び前記ヘミセルロースの少なくとも一方と、糖化酵素と、シリカ又はシリカ含有物質と、下記一般式（１）又は（２）で表される化合物及びその塩からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物（Ａ）とを含有する糖化反応液を用いて糖を製造することを特徴とする糖の製造方法にある。

上記目的を達成する本発明の第９の態様は、前記シリカ含有物質が、珪藻土又は珪砂であることを特徴とする第８の態様の糖の製造方法にある。

上記目的を達成する本発明の第１０の態様は、前記シリカ又はシリカ含有物質中のシリカと前記化合物（Ａ）との質量比率（化合物（Ａ）／シリカ）が、０．００００１以上、０．１以下であることを特徴とする第８の態様又は第９の態様の糖の製造方法にある。

上記目的を達成する本発明の第１１の態様は、前記化合物（Ａ）が、チオ尿素、Ｎ－メチルチオ尿素、１，３－ジメチルチオ尿素、トリメチルチオ尿素、テトラメチルチオ尿素、１－アリル－３－（３－ヒドロキシエチル）－２－チオ尿素、エチレンチオ尿素、グアニルチオ尿素、Ｓ－メチルイソチオ尿素、Ｓ－エチルイソチオ尿素、Ｓ－［２－（ジメチルアミノ）エチル］イソチオ尿素、Ｓ－ベンジルイソチオ尿素、及びＳ－（２－アミノエチル）イソチオ尿素からなる群から選ばれる少なくとも１種を含有することを特徴とする第８の態様乃至第１０の態様のいずれかの糖の製造方法にある。

上記目的を達成する本発明の第１２の態様は、第８の態様乃至第１１の態様のいずれかの製造方法により得られた糖を用いて、発酵微生物によるエタノール発酵を行い、エタノールを製造することを特徴とするエタノールの製造方法にある。

上記目的を達成する本発明の第１３の態様は、糖を製造する工程に発酵微生物を添加して、糖の製造とエタノール発酵とを同時に行うことを特徴とする第１２の態様のエタノールの製造方法にある。

上記目的を達成する本発明の第１４の態様は、前記発酵微生物が、酵母、カビ又は細菌であることを特徴とする第１２の態様又は第１３の態様のエタノールの製造方法にある。

上記目的を達成する本発明の第１５の態様は、前記発酵微生物が、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）属、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、クルイウェロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属又はエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属する微生物であることを特徴とする第１４の態様のエタノールの製造方法にある。

上記目的を達成する本発明の第１６の態様は、エタノール発酵を１５℃以上、３５℃以下で行うことを特徴とする第１２の態様乃至第１５の態様のいずれかのエタノールの製造方法にある。

本発明によれば、簡便な工程で酵素による糖化反応効率を向上させることが可能な糖化反応液、糖化酵素組成物、糖の製造方法及びエタノールの製造方法を提供することができる。

実施例４，７，８及び比較例１～３，７，１０～１４のチオ尿素の添加による糖化反応効率の向上効果の測定結果を示したグラフである。実施例１～６及び比較例１，４～９，１２のチオ尿素濃度による糖化反応効率の向上効果の測定結果を示したグラフである。実施例９～１８及び比較例１，１２のチオ尿素誘導体又はイソチオ尿素誘導体の添加による糖化反応効率の向上効果の測定結果を示したグラフである。実施例１９及び比較例１，７，１５のチオ尿素の添加による糖化反応効率の向上効果の測定結果を示したグラフである。実施例２０，２１及び比較例１６～１９のチオ尿素濃度によるエタノール発酵効率の向上効果の測定結果を示したグラフである。

本発明においては、グルコースといった糖を生成するための原料として、セルロース及びヘミセルロースの少なくとも一方が用いられる。

かかるセルロース又はヘミセルロースは、例えば、広葉樹、針葉樹等の農林水産物資源、又は当該農林水産物資源の廃棄物といったセルロース系バイオマスに含有されている。より具体的には、バガス、稲ワラ、コーンストーバー、アブラヤシ空果房、木材繊維、木材チップ、単板くず、木粉、パルプ類、古紙類、綿、ホヤ、酢酸菌等が挙げられる。また、これらの原料は、セルロース系バイオマス由来のものであれば特に限定されず、１種類を単独で用いても、２種類以上を混合して用いてもよい。

これらの中でも、ユーカリ木粉（広葉樹）、スギ木粉（針葉樹）、バガス、稲ワラ、コーンストーバー、アブラヤシ空果房、綿等に含有されるセルロース又はヘミセルロースであることが好ましい。これらの場合、理由は定かではないが、解繊しやすく、比較的高収率で糖を得ることができる。

ここで、セルロースとは、グルコースがβ－１，４グルコシド結合により重合した重合体をいう。ヘミセルロースは、グルコース、キシロース、マンノース、ガラクトース等がグルコシド結合により重合した重合体で、セルロース以外の水不溶性の多糖類をいう。

また、セルロースは、その部分分解物であるセロオリゴ糖、セロビオース等を含んでいてもよく、結晶性であっても非結晶性であってもよい。また、カルボキシメチル化、アルデヒド化又はエステル化した誘導体であってもよい。なお、セルロース又はヘミセルロースは、上述した通り、バイオマス由来のものであれば特に限定されず、植物由来、真菌由来、細菌由来等であってもよい。

本発明の糖化酵素としては、セルラーゼを主体としたものが用いられる。かかるセルラーゼは、セルロース又はヘミセルロースをグルコース等の糖にまで分解する酵素を意味している。

かかる糖化酵素を生産する微生物としては、特に限定されないが、例えば、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属菌、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属菌、ケトミウム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ）属菌、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属菌、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属菌、イルペックス（Ｉｒｐｅｘ）属菌、ファネロケーテ（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）属菌、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属菌、シゾフィラム（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）属菌、スポロトリクム（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ）属菌、トレメテス（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）属菌、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属菌等が挙げられる。これらの他にも、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属菌、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属菌、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）属菌、ルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属菌、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属菌等の細菌；スルフォロバス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ）属菌、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属菌、サーモアクチノマイセス（Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）属菌、サーモモノスポラ（Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）属菌等の放線菌が挙げられる。なお、これらの糖化酵素は、人工的に改変されていてもよい。また、これらの糖化酵素は、１種類を単独で用いても、２種類以上を混合して用いてもよい。

これらの中でも、特に、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属由来の糖化酵素及びトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属由来の糖化酵素が好ましい。これらの糖化酵素は、結晶性セルロースに対して活性が高いからである。

また、セルラーゼは、一連の酵素群であってもよい。かかる酵素群としては、エンドグルカナーゼ（ＥＣ３．２．１．７４）、セロビオヒドロラーゼ（ＥＣ３．２．１．９１）、β－グルコシダーゼ（ＥＣ２３．２．４．１，ＥＣ３．２．１．２１）等が挙げられる。本発明は、異なった微生物由来のセルラーゼを混合して用いることが好ましい。この場合、それらの相乗効果により、セルロース又はヘミセルロースの糖化をより促進させることができる。

上述のセルラーゼは、多くはｐＨ３以上、ｐＨ６以下の範囲で至適な酵素活性を有するものが一般的であるが、ｐＨ６～ｐＨ１０の範囲で至適な酵素活性を有するアルカリセルラーゼと呼ばれるものであってもよい。また、上述のセルラーゼは、多くは反応温度２５℃以上、５０℃以下の範囲で至適な酵素活性を有するものが多いが、７０℃以上、１００℃以下の範囲で至適な酵素活性を有する耐熱性セルラーゼと呼ばれるものであってもよい。

本発明ではシリカ又はシリカ含有物質として、シリカ、珪藻土又は珪砂を用いることができる。シリカ含有物質である珪藻土及び珪砂は、シリカが主成分の天然物である。シリカは少なくとも二酸化ケイ素を含有する化合物の総称であり、表面の一部にシラノール基が存在しているのが一般的である。このシリカは、粒子形状が球状でも非球状でも良く、粒子構造が中実構造でも多孔質構造でも良く、結晶性が非晶質でも結晶質でも良く、粉末状、懸濁液、分散液どの状態で使用しても良い。シリカ表面の一部がシラノール基以外の別の官能基で修飾されていても良い。また、シランカップリング剤やシリコンアルコキシド、又はケイ酸イオン等でシリカ以外の化合物の表面に反応させてシリカの層が存在する形でも良い。その中でも特にコロイダルシリカ、珪藻土及び珪砂の適用が好ましい。

本発明で、コロイダルシリカは、平均一次粒子径が１ｎｍ以上、４００ｎｍ以下、好ましくは、５ｎｍ以上、３５０ｎｍ以下であり、糖化反応液中に存在させて用いられる。平均一次粒子径は、窒素吸着法（ＢＥＴ法）により測定される比表面積Ｓ（ｍ^２／ｇ）から換算式（Ｄ（ｎｍ）＝２７２０／Ｓ）により算出されたものである。なお、コロイダルシリカは、水、メタノール、エタノール、アセトン、メチルエチルケトン、エチレングリコール等の分散媒に分散させた分散液として用いられ、分散液は、コロイド液、ゾル等と呼ばれる。本発明では、酵素の活性を阻害しない範囲で、分散媒を選択してよいが、水、エタノール等の分散媒の適用が好ましい。

コロイダルシリカの製造方法として、水ガラスを原料とする水ガラス法、金属アルコキシドを原料とするアルコキシド法、塩化珪素化合物を原料とする気相法等がある。どの製造法で得られたコロイダルシリカを用いてもよいが、水ガラス法により得られたコロイダルシリカの適用が好ましい。

本発明の下記一般式（１）及び（２）で表される化合物において、式中のＲ_１～Ｒ_５は、水素原子、又は炭素数１～４のアルキル基を表し、このアルキル基中の水素原子の一部は、アリル基、ヒドロキシル基、エステル基、アミノ基、カルボキシル基、シアノ基、ニトロ基、スルホ基、ホスホノ基又はハロゲン原子によって置換されていても良い。これらの置換基の数は、１～４が好ましく、さらに好ましくは１～３である。

上記一般式（１）又は（２）で表される化合物及びその塩からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物（Ａ）として、具体的には、チオ尿素、チオ尿素誘導体及びイソチオ尿素誘導体が挙げられる。チオ尿素誘導体としては、Ｎ－メチルチオ尿素、１，３－ジメチルチオ尿素、トリメチルチオ尿素、テトラメチルチオ尿素、１，３－ジエチル－２－チオ尿素、１，３－ジイソプロピルチオ尿素、１－アリル－２－チオ尿素、１－アリル－３－（３－ヒドロキシエチル）－２－チオ尿素、１－アセチル－２－チオ尿素、（２－メトキシエチル）チオ尿素、エチレンチオ尿素、グアニルチオ尿素等が挙げられる。イソチオ尿素誘導体としては、Ｓ－メチルイソチオ尿素、Ｓ－エチルイソチオ尿素、Ｓ－ベンジルイソチオ尿素、Ｓ－［２－（ジメチルアミノ）エチル］イソチオ尿素、Ｓ－（２－アミノエチル）イソチオ尿素、Ｓ－［４－［（４－ニトロベンジル）オキシ］フェネチル]イソチオ尿素等が挙げられる。一般式（１）又は（２）で表される化合物の塩としては、Ｓ－メチルイソチオ尿素の塩が挙げられる。塩としては塩酸塩、硫酸塩及び臭化水素酸塩等が挙げられ、例えばＳ－（２－アミノエチル）イソチオウロニウムブロミド等を用いることができる。必要に応じて１種類を単独で用いてもよいし、２種類以上を混合して用いてもよい。これらの中では、チオ尿素、Ｎ－メチルチオ尿素、１，３－ジメチルチオ尿素、トリメチルチオ尿素、テトラメチルチオ尿素、１－アリル－３－（３－ヒドロキシエチル）－２－チオ尿素、エチレンチオ尿素、グアニルチオ尿素、Ｓ－メチルイソチオ尿素、Ｓ－エチルイソチオ尿素、及びＳ－［２－（ジメチルアミノ）エチル］イソチオ尿素が好ましく、特に、チオ尿素、Ｎ－メチルチオ尿素、１，３－ジメチルチオ尿素、トリメチルチオ尿素、テトラメチルチオ尿素、エチレンチオ尿素、グアニルチオ尿素、Ｓ－メチルイソチオ尿素、Ｓ－エチルイソチオ尿素、及びＳ－［２－（ジメチルアミノ）エチル］イソチオ尿素が好ましい。

本発明の糖化反応液は、セルロース及びヘミセルロースの少なくとも一方を原料に、糖化酵素組成物である、糖化酵素、シリカ又はシリカ含有物質及び上記一般式（１）又は（２）で表される化合物及びその塩からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物（Ａ）を含有するものである。詳細は後述するが、糖化反応効率（単に反応効率ともいう）の向上効果を享受する観点から、糖化反応液において、シリカ又はシリカ含有物質及び化合物（Ａ）を併用させることが好ましい。

ここで、糖化反応液において、糖化酵素の濃度は、ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍａｌｂｕｍｉｎ；ウシ血清由来アルブミン）のタンパク質濃度に換算して、０．００１質量％以上、３．０質量％以下、好ましくは、０．００１質量％以上、１．０質量％以下である。糖化酵素の濃度がこの範囲より低いと反応効率が低下して好ましくなく、一方、これより高いと糖化酵素が溶液に溶解しにくくなるだけでなく、経済的に不適である。

また、糖化反応液において、シリカ又はシリカ含有物質中のシリカの濃度は、０．００１質量％以上、４０質量％以下、好ましくは、０．００５質量％以上、１０質量％以下である。シリカ又はシリカ含有物質中のシリカの濃度がこの範囲より低いと反応効率が低下して好ましくなく、一方、これより高いと分散性が悪化するだけでなく、経済的に不適である。

また、糖化反応液において、糖化酵素とシリカ又はシリカ含有物質中のシリカとの質量比率（糖化酵素／シリカ）は、０．０００２以上、３００以下、好ましくは、０．００２以上、３０以下である。両者の質量比率がこの範囲を外れると反応効率の向上が顕著ではなくなる。

また、糖化反応液において、化合物（Ａ）の濃度は、０．００００１質量％以上、１０質量％以下、好ましくは、０．０００１質量％以上、１質量％以下である。化合物（Ａ）の濃度がこの範囲より低いと反応効率が低下して好ましくなく、一方、これより高いと分散性が悪化するだけでなく、経済的に不適である。

また、糖化反応液において、シリカ又はシリカ含有物質中のシリカと化合物（Ａ）との質量比率（化合物（Ａ）／シリカ）が、０．００００１以上、０．１以下、好ましくは、０．０００１以上、０．０１以下である。両者の質量比率がこの範囲を外れると反応効率の向上が顕著ではなくなる。

また、糖化反応液のｐＨは、３以上、１１以下、好ましくは、３以上、６以下である。ｐＨが３より低いと、シリカ又はシリカ含有物質の凝集が生じて糖化酵素の反応効率が低下し、一方、ｐＨが１１より高いと、シリカ又はシリカ含有物質が溶解しやすくなるため、好ましくない。

糖化反応液のｐＨ調整剤として、硫酸、塩酸、硝酸といった鉱酸；酢酸、シュウ酸といったカルボン酸；クエン酸、酒石酸、リンゴ酸といったヒドロキシ酸；水酸化ナトリウムや水酸化カリウムといった水酸化物塩；アンモニア、尿素等が挙げられる。本発明の効果を阻害しない範囲であれば使用に特にその種類や濃度に制限はない。また、これらのｐＨ調整剤は、１種類を単独で用いても、２種類以上を混合して用いてもよい。更に緩衝作用を有する緩衝液の状態で使用してもよい。

また、本発明の糖化反応液は、反応温度を、５℃以上、１００℃以下、特に、２０℃以上、５５℃以下とするのが好ましい。糖化酵素の至適温度に合わせて反応温度を設定することが好ましい。一般的に、反応温度が５℃より低いと糖化反応の効率が著しく低下し、１００℃より高いと糖化酵素が失活する虞があり、好ましくない。

なお、セルロース又はヘミセルロースを含有するセルロース系バイオマスの前処理は、公知の範囲により行えばよい。一般には、カッターミル等による物理的な粉砕、及び酸又はアルカリ処理によってリグニンとセルロース及びヘミセルロースとの構造を化学的に破壊することにより、糖化反応用原料とすればよい。

糖化反応液を作製する際に、糖化酵素が分散している反応液にシリカ又はシリカ含有物質及び化合物（Ａ）を添加してもよく、シリカ又はシリカ含有物質及び化合物（Ａ）が分散している反応液に糖化酵素を添加してもよい。シリカ又はシリカ含有物質及び化合物（Ａ）を同時に添加してもよいし、別々に添加してもよく、糖化反応効率が低下しなければ添加順序は問わない。その際、化合物（Ａ）を粉末状態で添加してもよいし、溶液状態で添加してもよい。また、本発明の効果を阻害しない範囲であれば、ｐＨ調整剤等のその他の添加剤は任意の順序で添加することができる。

以上で説明した通り、本発明の糖化反応液は、セルロース及びヘミセルロースの少なくとも一方を原料に、糖化酵素組成物である、糖化酵素、シリカ又はシリカ含有物質及び一般式（１）又は（２）で表される化合物及びその塩からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物（Ａ）を含有することで得られる。この糖化反応液において、メカニズムは明らかでないが、シリカ又はシリカ含有物質及び化合物（Ａ）を併用させることで、セルロース又はヘミセルロースの糖化をより促進させることができる。

また、本発明の糖化反応液は、シリカ又はシリカ含有物質及び化合物（Ａ）の併用により、糖化酵素の使用量を減少させることができるので、コスト性にも優れている。

本発明で得られた糖を使用して、エタノール発酵を行う発酵微生物によりエタノール発酵させてエタノールを得ることもできる。糖を得た後に、エタノール発酵を行う発酵微生物を添加し、エタノール発酵させてエタノールを得ても良いし、前記糖化反応液を用いて糖を得る工程にエタノール発酵を行う発酵微生物を添加して、糖の製造とエタノール発酵とを同時に行い、エタノールを得ても良い。

本発明の発酵微生物は、酵母、カビ、細菌等が挙げられる。この中でも特に、酵母又は細菌であることが好ましい。また、これらの発酵微生物は、１種類を単独で用いても、２種類以上を混合して用いてもよい。用いられる発酵微生物としては、例えば、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）属、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、クルイウェロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属等に属する微生物が挙げられる。

エタノール発酵を行う際の好ましい発酵温度は１５℃以上、３５℃以下であり、２８℃以上、３２℃以下とするのがより好ましい。一般的に、発酵温度が１５℃より低いと発酵微生物の活動が活発でなくなるためエタノール発酵の効率が著しく低下し、また、３５℃より高いと発酵微生物が死滅する虞があり、好ましくない。

一般的に、微生物を用いてエタノール発酵を行う際には、グルコース等の糖が細胞増殖のための炭素源として用いられるほか、窒素源や他の栄養素も用いられる。本発明のエタノール発酵では、上述の通り糖化反応により得られた糖（グルコース）が炭素源となる。また、窒素源としては、尿素、アンモニア、アミノ酸等が挙げられ、他の栄養素としては、ビタミン、ミネラル等が挙げられ、これらは必要に応じて添加される。なお、本発明のエタノール発酵では、窒素源として尿素を用いた。

また、本発明のエタノール発酵を行う発酵微生物によるエタノールの製造方法は、シリカ又はシリカ含有物質及び化合物（Ａ）の併用により、エタノール発酵を行う際の好ましい発酵温度でも効率的に糖化酵素により糖を得ることができるため、得られる糖を利用したエタノール発酵も効率的に行うことが出来る。一般的には、糖を得る反応温度がエタノールを得る発酵温度よりも高いため、エタノール発酵工程の前に反応液を冷却する必要があり、エネルギーの浪費が生じるが、本発明の方法によれば、糖を得る反応温度とエタノールを得る発酵温度を同じ温度範囲とすることができ、エネルギーの浪費を避けることが出来るため、効率的である。

以下、実施例に基づいて更に詳述するが、本発明はこの実施例により何ら限定されるものではない。

［１．シリカ又はシリカ含有物質としてシリカを用いた糖の製造］
（１－１．平均一次粒子径）
シリカの平均一次粒子径は、以下の測定装置を用いて測定した。
窒素吸着法測定装置：ＭｏｎｏｓｏｒｂＭＳ－１６（カンタクローム・インスツルメンツ・ジャパン合同会社製）

（１－２．セルラーゼ水溶液）
以下の手順で、セルラーゼ水溶液を作製した。脱イオン交換水中に、所定量の混合セルラーゼの粉末を添加し、室温下、ローターで１００ｒｐｍ、３０分間回転させながら溶解してセルラーゼ水溶液を得た。なお、糖化酵素であるセルラーゼとしては、ｐＨ３以上、ｐＨ６以下の範囲で至適な酵素活性を有するトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ；Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）属由来のセルラーゼ（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ製）及びアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ；Ａ．ｎｉｇｅｒ）属由来のセルラーゼ（ＭＰｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ製）を７：３（ｗ／ｗ）の割合で混合した混合セルラーゼを用いた。

（１－３．糖化酵素水溶液）
以下の手順で、糖化酵素水溶液を作製した。脱イオン交換水中に、ｐＨ調整として最終的に０．０５Ｍになるよう１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）、及び上述のセルラーゼ水溶液を添加し、室温下、ローターで１００ｒｐｍ、３０分間回転させながら混合して、下記表１に示した糖化酵素濃度（本実施例ではセルラーゼ濃度）の糖化酵素水溶液をそれぞれ得た。これらの糖化酵素水溶液を、比較サンプル１～比較サンプル３とした。各比較サンプルの糖化酵素濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（ＣＢＢ法）を用い、ＢＳＡ（商品名：タンパク質標準物質、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ製）のタンパク質濃度に換算して算出した。糖化酵素濃度算出の具体的な手順は以下の通りである。

セル長１０ｍｍのディスポーザブルセルに、プロテインアッセイＣＢＢ溶液（５倍濃縮）（ナカライテスク製）を脱イオン交換水で５倍に希釈したものを２．５ｍＬ添加し、次いで、各比較サンプルを０．０５ｍＬ添加し、密栓した。この混合溶液を、上下反転を繰り返し均一に混合した。その後、３０分間静定し、分光光度計ＵＶ－３１５０（島津製作所製）を用い、波長５９５ｎｍの吸光度を測定した。既知のＢＳＡのタンパク質濃度の試料を作製し、同様に吸光度を測定して検量線を作成した。得られた検量線から各比較サンプルの糖化酵素濃度を算出した。なお、トリコデルマ・リーゼイ属由来のセルラーゼの粉末１ｇ中には０．２７ｇのタンパク質が含有していた。アスペルギルス・ニガー属由来のセルラーゼの粉末１ｇ中には０．０６ｇのタンパク質が含有していた。

（１－４．糖化酵素組成物）
以下の手順で、糖化酵素組成物を作製した。脱イオン交換水中に、ｐＨ調整として最終的に０．０５Ｍになるよう１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）、シリカとして水ガラス法で製造された中実で球状のコロイダルシリカ（平均一次粒子径：３５ｎｍ）が水に分散された酸性シリカゾル（ｐＨ２．１、シリカ濃度４０質量％）、化合物（Ａ）としてチオ尿素、及び上述のセルラーゼ水溶液を添加し、室温下、ローターで１００ｒｐｍ、３０分間回転させながら混合して、下記表２に示した糖化酵素濃度（本実施例ではセルラーゼ濃度）、シリカ濃度及び化合物（Ａ）濃度の糖化酵素組成物をそれぞれ得た。これらの糖化酵素組成物を、サンプル１～サンプル８とした。

また、化合物（Ａ）としてチオ尿素の替わりに、チオ尿素誘導体又はイソチオ尿素誘導体を用いたこと以外は、サンプル１～サンプル８と同様にして、下記表２に示した糖化酵素濃度（本実施例ではセルラーゼ濃度）、シリカ濃度及び化合物（Ａ）濃度の糖化酵素組成物をそれぞれ得た。これらの糖化酵素組成物を、サンプル９～サンプル１８とした。

なお、下記表２に示した化合物（Ａ）の種類は以下に示した通りである。
Ａ：チオ尿素
Ｂ：Ｎ－メチルチオ尿素
Ｃ：１，３－ジメチルチオ尿素
Ｄ：トリメチルチオ尿素
Ｅ：テトラメチルチオ尿素
Ｆ：１－アリル－３－（３－ヒドロキシエチル）－２－チオ尿素
Ｇ：エチレンチオ尿素
Ｈ：グアニルチオ尿素
Ｉ：Ｓ－メチルイソチオ尿素硫酸塩
Ｊ：Ｓ－ベンジルイソチオ尿素塩酸塩
Ｋ：Ｓ－（２－アミノエチル）イソチオウロニウムブロミド臭化水素酸塩

（１－５．チオ尿素含有糖化酵素水溶液）
以下の手順で、化合物（Ａ）としてチオ尿素を用いたチオ尿素含有糖化酵素水溶液を作製した。脱イオン交換水中に、ｐＨ調整として最終的に０．０５Ｍになるよう１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）、チオ尿素、及び上述のセルラーゼ水溶液を添加し、室温下、ローターで１００ｒｐｍ、３０分間回転させながら混合して、下記表３に示した糖化酵素濃度（本実施例ではセルラーゼ濃度）、及びチオ尿素濃度のチオ尿素含有糖化酵素水溶液をそれぞれ得た。これらのチオ尿素含有糖化酵素水溶液を、比較サンプル４～比較サンプル１１とした。

（１－６．シリカ含有糖化酵素水溶液）
以下の手順で、シリカ含有糖化酵素水溶液を作製した。脱イオン交換水中に、ｐＨ調整として最終的に０．０５Ｍになるよう１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）、シリカとして水ガラス法で製造された中実で球状のコロイダルシリカ（平均一次粒子径粒子径：３５ｎｍ）が水に分散された酸性シリカゾル（ｐＨ２．１、シリカ濃度４０質量％）、及び上述のセルラーゼ水溶液を添加し、室温下、ローターで１００ｒｐｍ、３０分間回転させながら混合して、下記表４に示した糖化酵素濃度（本実施例ではセルラーゼ濃度）、及びシリカ濃度のシリカ含有糖化酵素水溶液をそれぞれ得た。これらのシリカ含有糖化酵素水溶液を、比較サンプル１２～比較サンプル１４とした。

（１－７．糖化反応液）
サンプル１～サンプル１８の糖化酵素組成物に、微結晶セルロース粉末を添加し、分散させて各サンプルを用いた糖化反応液とした。具体的な手順は以下の通りである。

まず、１３．５ｍＬのガラス瓶に各サンプルを１０ｍＬ入れ、４ｍｍφで１０ｍｍのスターラーで撹拌した状態で、微結晶セルロース粉末（結晶型：Ｉ型、商品名：ＡｖｉｃｅｌＰＨ－１０１、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ製）を０．０５ｇ（５ｍｇ／ｍＬ相当）添加した後に密栓した。

また、比較サンプル１～比較サンプル３の糖化酵素水溶液、比較サンプル４～比較サンプル１１のチオ尿素含有糖化酵素水溶液、及び比較サンプル１２～比較サンプル１４のシリカ含有糖化酵素水溶液を用いたこと以外は、サンプル１～サンプル１８の糖化酵素組成物と同様にして、各比較サンプルの糖化反応液を得た。

（１－８．糖の製造）
上述の各サンプル及び各比較サンプルを用いた糖化反応液を、２５℃の恒温槽中で、撹拌下で２日間それぞれ酵素反応させた。この酵素反応により、糖（グルコース）を得た。

（１－９．グルコース生成量の算出）
（実施例１）
酵素法（ＧＯＤ法）を用いて、サンプル１の糖化酵素組成物から得られた糖化反応液（以下、実施例１の糖化反応液という）について、上述の酵素反応２日後のグルコース生成量を算出した。

２ｍＬマイクロチューブに、サンプル１の糖化反応液の試料を０．５ｍＬ採取し、１０５℃、１５分で酵素を失活させた。次に、未反応のセルロース、シリカを除去するため、絶対孔径０．１μｍのフィルターが付いた２ｍＬのマイクロチューブに試料を移し、高速冷却遠心分離機ＳＲＸ－２０１（トミー精工社製）で１０，０００Ｇ、５分の条件で遠心分離し、その後、ろ液を回収した。酵素法には、グルコースＣＩＩ－テストワコー（和光純薬工業製）を使用した。分光光度計ＵＶ－３１５０を用いて波長５０５ｎｍの吸光度（セル長１０ｍｍ）を測定した。具体的な手順は以下の通りである。

セル長１０ｍｍのディスポーザブルセルに発色試液を３．０ｍＬ添加し、次いで、上述のろ液を０．０２ｍＬ添加し、密栓した。次に、この混合溶液を、上下反転を繰り返し均一に混合した。その後、２４℃で１５分間静定し、波長５０５ｎｍの吸光度を、分光光度計を用いて測定し、Ｅｓとした。次に、セル長１０ｍｍのディスポーザブルセルに発色試液を３．０ｍＬ添加し、次いで、ブドウ糖標準液ＩＩ（５００ｍｇ／ｄＬ）を０．０２ｍＬ添加し、上下反転を繰り返し均一に混合した後、２４℃で１５分間静定し、波長５０５ｎｍの吸光度を、分光光度計を用いて測定し、Ｅｓｔｄとした。ここでは、発色試液３．０ｍＬの吸光度を対照として、実施例１の糖化反応液の吸光度Ｅｓ、及びブドウ糖標準液Ｉの吸光度Ｅｓｔｄを測定した。

次に、実施例１の糖化反応液のグルコース生成量（ｍｇ／ｍＬ）を、下記式（３）から求めた。その結果を下記表５に示した。

（実施例２～実施例１８）
実施例１と同様にして、サンプル２～サンプル１８の糖化酵素組成物から得られた各糖化反応液（以下、実施例２～実施例１８の糖化反応液という）について、酵素反応２日後のグルコース生成量を算出し、その結果を下記表５に示した。

（比較例１～比較例１４）
実施例１と同様にして、比較サンプル１～比較サンプル３の糖化酵素水溶液、比較サンプル４～比較サンプル１１のチオ尿素含有糖化酵素水溶液、及び比較サンプル１２～比較サンプル１４のシリカ含有糖化酵素水溶液から得られた各糖化反応液（以下、比較例１～比較例１４の糖化反応液という）について、酵素反応２日後のグルコース生成量を算出し、その結果を下記表６に示した。

（１－１０．糖化反応効率）
上記表５及び表６のグルコース生成量に基づき、各実施例及び各比較例の糖化反応効率について検討した。まず、実施例４、実施例７、実施例８、比較例１～比較例３、比較例７、及び比較例１０～比較例１４におけるグルコース生成量から、チオ尿素の添加による糖化反応効率の向上効果について検討した。

図１は、実施例４，７，８及び比較例１～３，７，１０～１４のチオ尿素の添加による糖化反応効率の向上効果の測定結果を示したグラフである。図１に示した通り、比較例１～比較例３の糖化反応液と、比較例１２～比較例１４の糖化反応液を比較すると、セルラーゼ水溶液にシリカを添加した比較例１２～比較例１４の方がグルコース生成量が増加しており、糖化反応効率の向上が見られた。また、比較例１２～比較例１４の糖化反応液と、実施例４、実施例７及び実施例８の糖化反応液を比較すると、セルラーゼ水溶液にシリカ及びチオ尿素を添加した実施例４、実施例７及び実施例８の方がグルコース生成量が増加しており、更なる糖化反応効率の向上が見られた。一方、比較例１～比較例３の糖化反応液と、比較例７、比較例１０、比較例１１の糖化反応液を比較すると、セルラーゼ水溶液にチオ尿素を添加しても糖化反応効率の向上はしなかった。従って、セルロースの糖化反応において、シリカとチオ尿素を併用することによって、糖化反応効率が向上することが確認できた。

また、この結果より、比較例１～比較例３の糖化反応液と、セルラーゼ水溶液にシリカを添加した比較例１２～比較例１４の糖化反応液において、セルラーゼの使用量を比較すると、比較例１２～比較例１４では、２０％程度の使用量を削減することができる。一方、比較例１～比較例３の糖化反応液と、セルラーゼ水溶液にシリカ及びチオ尿素を添加した実施例４、実施例７及び実施例８の糖化反応液において、セルラーゼの使用量を比較すると、実施例４、実施例７及び実施例８では、３０％程度の使用量の削減が期待でき、セルラーゼ水溶液にシリカを添加した場合より、糖化反応におけるセルラーゼの使用量を更に１０％程度削減することができると考えられる。

次に、実施例１～実施例６、比較例１、比較例４～９及び比較例１２におけるグルコースの生成量から、チオ尿素の添加量（チオ尿素濃度）による糖化反応効率の向上効果について検討した。図２は、実施例１，６及び比較例１，４～９，１２のチオ尿素濃度による糖化反応効率の向上効果の測定結果を示したグラフである。

図２に示した通り、シリカとチオ尿素の質量比率（チオ尿素／シリカ）が概ね０．００００１～０．１の範囲において、糖化反応効率が大幅に向上し、両者の併用効果を確認することができた。従って、この結果より、グルコース生成量は、特にチオ尿素の添加量に依存することが示唆された。なお、糖化酵素（セルラーゼ）にチオ尿素だけを組み合わせても、糖化反応効率の向上効果は見られなかった。

また、実施例９～実施例１８、比較例１及び比較例１２におけるグルコースの生成量から、チオ尿素以外の化合物（Ａ）であるチオ尿素誘導体又はイソチオ尿素誘導体の添加による糖化反応効率の向上効果について検討した。図３は、実施例９～１８及び比較例１，１２のチオ尿素誘導体又はイソチオ尿素誘導体の添加による糖化反応効率の向上効果の測定結果を示したグラフである。

図３に示した通り、実施例９～実施例１８の糖化反応液と、比較例１及び比較例１２の糖化反応液を比較すると、セルラーゼ水溶液にシリカ及びチオ尿素誘導体又はイソチオ尿素誘導体を添加した実施例９～実施例１８に糖化反応効率の向上効果が見られた。従って、セルロースの糖化反応において、シリカと化合物（Ａ）としてチオ尿素誘導体又はイソチオ尿素誘導体を併用することによって、糖化反応効率が向上することが確認できた。

［２．シリカ又はシリカ含有物質として珪藻土を用いた糖の製造］
（２－１．平均二次粒子径）
珪藻土の平均二次粒子径は、以下の測定装置を用いて測定した。
レーザ回折／散乱式粒子径分布測定装置：ＬＡ－３００（株式会社堀場製作所社製）

（２－２．糖化酵素組成物）
以下の手順で、糖化酵素組成物を作製した。脱イオン交換水中にｐＨ調整として最終的に０．０５Ｍになるよう１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）、シリカ含有物質として珪藻土（シリカ＃６００Ｓ、中央シリカ株式会社製、シリカ含有率：９０質量％、平均二次粒子径：３０μｍ）、化合物（Ａ）としてチオ尿素、及び上述のセルラーゼ水溶液を添加し、室温下、ローターで１００ｒｐｍ、３０分間回転させながら混合して、下記表７に示した糖化酵素濃度（本実施例ではセルラーゼ濃度）、珪藻土濃度及びチオ尿素濃度の糖化酵素組成物を得た。この糖化酵素組成物をサンプル１９とした。

（２－３．珪藻土含有糖化酵素水溶液）
以下の手順で、珪藻土含有糖化酵素水溶液を作製した。脱イオン交換水中にｐＨ調整として最終的に０．０５Ｍになるよう１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）、シリカ含有物質として珪藻土（シリカ＃６００Ｓ、中央シリカ株式会社製、シリカ含有率：９０質量％、平均粒子径：３０μｍ）、及び上述のセルラーゼ水溶液を添加し、室温下、ローターで１００ｒｐｍ、３０分間回転させながら混合して、下記表７に示した糖化酵素濃度（本実施例ではセルラーゼ濃度）、及び珪藻土濃度の珪藻土含有糖化酵素水溶液を得た。この珪藻土含有糖化酵素水溶液を、比較サンプル１５とした。

（２－４．糖化反応液）
サンプル１９の糖化酵素組成物及び比較サンプル１５の珪藻土含有糖化酵素水溶液を用いたこと以外はサンプル１～サンプル１８の糖化酵素組成物と同様にして、サンプル１９及び比較サンプル１５の糖化反応液を得た。

（２－５．グルコース生成量の算出）
（実施例１９）
実施例１と同様にして、サンプル１９の糖化酵素組成物から得られた糖化反応液（以下、実施例１９の糖化反応液という）について、酵素反応２日後のグルコース生成量を算出し、その結果を下記表８に示した。

（比較例１５）
実施例１と同様にして、比較サンプル１５の糖化酵素組成物から得られた糖化反応液（以下、比較例１５の糖化反応液という）について、酵素反応２日後のグルコース生成量を算出し、その結果を下記表８に示した。

（２－６．糖化反応効率）
上記表６及び表８のグルコース生成量に基づき、各サンプル及び各比較サンプルの糖化反応効率について検討した。まず、実施例１９、比較例１、比較例７、及び比較例１５におけるグルコース生成量から、チオ尿素の添加による糖化反応効率の向上効果について検討した。図４は、実施例１９及び比較例１，７，１５のチオ尿素の添加による糖化反応効率の向上効果の測定結果を示したグラフである。

図４に示した通り、比較例１の糖化反応液と、セルラーゼ水溶液にチオ尿素を添加した比較例７の糖化反応液と、セルラーゼ水溶液にシリカ含有物質として珪藻土を添加した比較例１５の糖化反応液、セルラーゼ水溶液に珪藻土及びチオ尿素を添加した実施例１９の糖化反応液を比較すると、セルラーゼ水溶液に珪藻土及びチオ尿素を添加した実施例１９の方がグルコース生成量が増加しており、糖化反応効率の向上が見られた。従って、セルロースの糖化反応において、シリカ含有物質として珪藻土を用い、更にチオ尿素を併用することによって、糖化反応効率が向上することが確認できた。

［３．糖を用いたエタノールの製造］
（３－１．酵母水溶液）
以下の手順で、酵母水溶液を作製した。予め３５℃に調整した脱イオン交換水４０ｇ中に酵母の粉末０．２ｇを添加し、３５℃に保持したままマグネティックスターラーを用いて、２０分間撹拌させながら溶解して０．５質量％（＝酵母粉末０．２ｇ／脱イオン交換水４０ｇ）の酵母水溶液を得た。なお、酵母としては、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属のサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ；Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＹＰ２（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ製）を用いた。

（３－２．エタノール発酵水溶液）
以下の手順で、エタノール発酵水溶液を作製した。脱イオン交換水中に、ｐＨ調整として最終的にｐＨ５前後になるよう硫酸、窒素源として最終的に０．２１ｍｇ／ｍＬとなるよう尿素、上述のセルラーゼ水溶液及び上述の酵母水溶液を添加し、室温下、マグネティックスターラーで、１０分間回転させながら混合して、下記表９に示した糖化酵素濃度（本実施例ではセルラーゼ濃度）、及び酵母濃度のエタノール発酵水溶液を得た。このエタノール発酵水溶液を比較サンプル１６とした。

（３－３．エタノール発酵組成物）
以下の手順で、エタノール酵素組成物を作製した。脱イオン交換水中に、ｐＨ調整として最終的にｐＨ５前後になるよう硫酸、窒素源として最終的に０．２１ｍｇ／ｍＬとなるよう尿素、シリカ含有物質として水ガラス法で製造された中実で球状のコロイダルシリカ（平均一次粒子径：８５ｎｍ）が水に分散されたアルカリ性シリカゾル（ｐＨ９．５、シリカ濃度４０質量％）、化合物（Ａ）としてチオ尿素、上述のセルラーゼ水溶液及び上述の酵母水溶液を添加し、室温下、マグネティックスターラーで、１０分間回転させながら混合して、下記表９に示した糖化酵素濃度（本実施例ではセルラーゼ濃度）、シリカ濃度、チオ尿素濃度、及び酵母濃度のエタノール発酵組成物をそれぞれ得た。これらのエタノール発酵組成物をサンプル２０及びサンプル２１とした。

（３－４．チオ尿素含有エタノール発酵水溶液）
以下の手順で、チオ尿素含有エタノール発酵水溶液を作製した。脱イオン交換水中に、ｐＨ調整として最終的にｐＨ５前後になるよう硫酸、窒素源として最終的に０．２１ｍｇ／ｍＬとなるよう尿素、化合物（Ａ）としてチオ尿素、上述のセルラーゼ水溶液及び上述の酵母水溶液を添加し、室温下、マグネティックスターラーで、１０分間回転させながら混合して、下記表９に示した糖化酵素濃度、チオ尿素濃度、及び酵母濃度のチオ尿素含有エタノール発酵水溶液を得た。このチオ尿素含有エタノール発酵水溶液を比較サンプル１７及び比較サンプル１８とした。

（３－５．シリカ含有エタノール発酵水溶液）
以下の手順で、シリカ含有エタノール発酵水溶液を作製した。脱イオン交換水中に、ｐＨ調整として最終的にｐＨ５前後になるよう硫酸、窒素源として最終的に０．２１ｍｇ／ｍＬとなるよう尿素、シリカとして水ガラス法で製造された中実で球状のコロイダルシリカ（平均一次粒子径粒子径８５ｎｍ）が水に分散されたアルカリ性シリカゾル（ｐＨ９．５、シリカ濃度４０質量％）、上述のセルラーゼ水溶液及び上述の酵母水溶液を添加し、室温下、ローターで１００ｒｐｍ、３０分間回転させながら混合して、下記表９に示した糖化酵素濃度（本実施例ではセルラーゼ濃度）、シリカ濃度、及び酵母濃度のシリカ含有エタノール発酵水溶液を得た。このシリカ含有エタノール発酵水溶液を、比較サンプル１９とした。

（３－６．糖化反応及びエタノール発酵液）
サンプル２０のエタノール発酵組成物に、微結晶セルロース粉末を添加し、分散させて各サンプルを用いた糖化反応及びエタノール発酵液とした。具体的な手順は以下の通りである。

まず、１３．５ｍＬのガラス瓶に各サンプルを１０ｍＬ入れ、４ｍｍφで１０ｍｍのスターラーで撹拌した状態で、微結晶セルロース粉末（結晶型：Ｉ型、商品名：ＡｖｉｃｅｌＰＨ－１０１、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ製）を０．２０ｇ（２０ｍｇ／ｍＬ相当）添加した後に、絶対孔径０．２２μｍの疎水性ＰＴＥＦ製メンブレンフィルターを付けたシリコン栓で栓をした。

また、サンプル２１のエタノール発酵組成物、比較サンプル１６のエタノール発酵水溶液、比較サンプル１７及び比較サンプル１８のチオ尿素含有エタノール発酵水溶液、及び比較サンプル１９のシリカ含有物質含有エタノール発酵水溶液を用いたこと以外は、サンプル２０のエタノール発酵組成物と同様にして、各糖化反応及びエタノール発酵液を得た。

（３－７．エタノールの製造）
上述の各サンプル及び各比較サンプルを用いた糖化反応及びエタノール発酵液を、３１℃の恒温槽中で、撹拌下で２日間それぞれ酵素反応及びエタノール発酵を同時にさせた。この酵素反応により得られた糖（グルコース）を用いてエタノール発酵させ、エタノールを得た。

（３－８．エタノール生成量の算出）
（実施例２０）
ガスクロマトグラフィ（ＧＣ）を用いて、サンプル２０のエタノール発酵組成物から得られた糖化反応及びエタノール発酵液（以下、実施例２０の糖化反応及びエタノール発酵液という）の酵素反応及びエタノール発酵後のエタノール生成量を算出した。

２ｍＬマイクロチューブに、実施例２０の糖化反応及びエタノール発酵液の試料を０．５ｍＬ採取し、１０５℃、１５分で酵素及び酵母を失活させた。次に、未反応のセルロース、シリカ含有物質及び酵母を除去するため、高速冷却遠心分離機ＳＲＸ－２０１（トミー精工社製）で１５，０００Ｇ、３０分の条件で遠心分離し、その後、上澄み液を回収した。エタノール生成量の定量には、ガスクロマトグラフＧＣ－２０１４ｓ（島津製作所社製）を用いて１点検量線法で測定し、エタノール生成量（ｍｇ／ｍＬ）の測定結果を下記表１０に示した。具体的な分析条件は以下の通りである。

＜分析条件＞
カラム：ポーラパックＱ、長さ１ｍ、内径３．２ｍｍ（ジーエルサイエンス社製）
検出器：ＦＩＤ
カラム温度：１５０℃
流量：４０ｍＬ／ｍｉｎ
サンプル量：２μＬ
検量線用標品：エタノール１０ｍｇ／ｍＬ水溶液

（実施例２１）
実施例２０と同様にして、サンプル２１のエタノール発酵組成物から得られた糖化反応及びエタノール発酵液（以下、実施例２１の糖化反応及びエタノール発酵液という）について、酵素反応及びエタノール発酵２日後のエタノール生成量を算出し、その結果を下記表１０に示した。

（比較例１６～比較例１９）
実施例２０と同様にして、比較サンプル１６のエタノール発酵水溶液、比較サンプル１７及び比較サンプル１８のチオ尿素含有エタノール発酵水溶液、及び比較サンプル１９のシリカ含有物質含有エタノール発酵水溶液から得られた各糖化反応及び各エタノール発酵液（以下、比較例１６～比較例１９の糖化反応及びエタノール発酵液という）について、糖化反応及びエタノール発酵２日後のエタノール生成量を算出し、その結果を下記表１０に示した。

（３－９．エタノール発酵効率）
上記表１０のエタノール生成量に基づき、各実施例及び各比較例のエタノール発酵効率について検討した。まず、実施例２０、実施例２１及び比較例１６～比較例１９におけるエタノール生成量から、チオ尿素の添加量（チオ尿素濃度）による糖化反応効率の向上効果について検討した。図５は、実施例２０，２１及び比較例１６～１９のチオ尿素濃度によるエタノール発酵効率の向上効果の測定結果を示したグラフである。

図５に示した通り、比較例１６、比較例１９の糖化反応及びエタノール発酵液を比較すると、セルラーゼ水溶液及び酵母水溶液にシリカを添加した比較例１９の方がエタノール生成量は増加しており、エタノール生成効率の向上が見られた。また、実施例２０、実施例２１及び比較例１９の糖化反応及びエタノール発酵液を比較すると、セルラーゼ水溶液及び酵母水溶液にシリカ及びチオ尿素を添加した実施例２０、実施例２１の方がエタノール生成量が増加しており、更なるエタノール生成効率の向上が見られた。一方、比較例１６、比較例１７、比較例１８の糖化反応及びエタノール発酵液を比較すると、セルラーゼ水溶液及び酵母水溶液にチオ尿素を添加してもエタノール生成効率の向上はしなかった。従って、セルロースの糖化反応及びエタノール発酵において、シリカ含有物質とチオ尿素を併用することによって、エタノール生成効率が向上することが確認できた。

本発明は、セルロース又はヘミセルロースを含むセルロース系バイオマスからグルコースといった糖を生成する糖化技術が適用される産業分野、例えば、セルロース系バイオエタノールの製造等で利用することができる。

Claims

セルロース及びヘミセルロースの少なくとも一方を糖化する糖化反応液であって、前記セルロース及び前記ヘミセルロースの少なくとも一方と、糖化酵素と、シリカ又はシリカ含有物質と、下記一般式（１）又は（２）で表される化合物及びその塩からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物（Ａ）とを含有し、前記シリカ又はシリカ含有物質中のシリカと前記化合物（Ａ）との質量比率（化合物（Ａ）／シリカ）が、０．００００１以上、０．１以下であることを特徴とする糖化反応液。

［前記一般式（１）及び（２）中のＲ_１～Ｒ_５は、水素原子、又は炭素数１～４のアルキル基を表し、前記アルキル基中の水素原子の一部は、アリル基、ヒドロキシル基、エステル基、アミノ基、カルボキシル基、シアノ基、ニトロ基、スルホ基、ホスホノ基又はハロゲン原子によって置換されていてもよい。］
前記シリカ含有物質は、珪藻土又は珪砂であることを特徴とする請求項１に記載の糖化反応液。
前記化合物（Ａ）は、チオ尿素、Ｎ－メチルチオ尿素、１，３－ジメチルチオ尿素、トリメチルチオ尿素、テトラメチルチオ尿素、１－アリル－３－（３－ヒドロキシエチル）－２－チオ尿素、エチレンチオ尿素、グアニルチオ尿素、Ｓ－メチルイソチオ尿素、Ｓ－エチルイソチオ尿素、Ｓ－［２－（ジメチルアミノ）エチル］イソチオ尿素、Ｓ－ベンジルイソチオ尿素、及びＳ－（２－アミノエチル）イソチオ尿素からなる群から選ばれる少なくとも１種を含有することを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の糖化反応液。
セルロース及びヘミセルロースの少なくとも一方を糖化する糖化酵素組成物であって、糖化酵素と、シリカ又はシリカ含有物質と、下記一般式（１）又は（２）で表される化合物及びその塩からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物（Ａ）とを含有し、前記シリカ又はシリカ含有物質のシリカと前記化合物（Ａ）との質量比率（化合物（Ａ）／シリカ）が、０．００００１以上、０．１以下であることを特徴とする糖化酵素組成物。

［前記一般式（１）及び（２）中のＲ_１～Ｒ_５は、水素原子、又は炭素数１～４のアルキル基を表し、前記アルキル基中の水素原子の一部は、アリル基、ヒドロキシル基、エステル基、アミノ基、カルボキシル基、シアノ基、ニトロ基、スルホ基、ホスホノ基又はハロゲン原子によって置換されていてもよい。］
前記シリカ含有物質は、珪藻土又は珪砂であることを特徴とする請求項４に記載の糖化酵素組成物。
前記化合物（Ａ）は、チオ尿素、Ｎ－メチルチオ尿素、１，３－ジメチルチオ尿素、トリメチルチオ尿素、テトラメチルチオ尿素、１－アリル－３－（３－ヒドロキシエチル）－２－チオ尿素、エチレンチオ尿素、グアニルチオ尿素、Ｓ－メチルイソチオ尿素、Ｓ－エチルイソチオ尿素、Ｓ－［２－（ジメチルアミノ）エチル］イソチオ尿素、Ｓ－ベンジルイソチオ尿素、及びＳ－（２－アミノエチル）イソチオ尿素からなる群から選ばれる少なくとも１種を含有することを特徴とする請求項４又は請求項５に記載の糖化酵素組成物。
セルロース及びヘミセルロースの少なくとも一方を糖化する糖化反応液を用いて糖を製造する糖の製造方法であって、前記セルロース及び前記ヘミセルロースの少なくとも一方と、糖化酵素と、シリカ又はシリカ含有物質と、下記一般式（１）又は（２）で表される化合物及びその塩からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物（Ａ）とを含有し、前記シリカ又はシリカ含有物質のシリカと前記化合物（Ａ）との質量比率（化合物（Ａ）／シリカ）が、０．００００１以上、０．１以下である糖化反応液を用いて糖を製造することを特徴とする糖の製造方法。

［前記一般式（１）及び（２）中のＲ_１～Ｒ_５は、水素原子、又は炭素数１～４のアルキル基を表し、前記アルキル基中の水素原子の一部は、アリル基、ヒドロキシル基、エステル基、アミノ基、カルボキシル基、シアノ基、ニトロ基、スルホ基、ホスホノ基又はハロゲン原子によって置換されていてもよい。］
前記シリカ含有物質は、珪藻土又は珪砂であることを特徴とする請求項７に記載の糖の製造方法。
前記化合物（Ａ）は、チオ尿素、Ｎ－メチルチオ尿素、１，３－ジメチルチオ尿素、トリメチルチオ尿素、テトラメチルチオ尿素、１－アリル－３－（３－ヒドロキシエチル）－２－チオ尿素、エチレンチオ尿素、グアニルチオ尿素、Ｓ－メチルイソチオ尿素、Ｓ－エチルイソチオ尿素、Ｓ－［２－（ジメチルアミノ）エチル］イソチオ尿素、Ｓ－ベンジルイソチオ尿素、及びＳ－（２－アミノエチル）イソチオ尿素からなる群から選ばれる少なくとも１種を含有することを特徴とする請求項７又は請求項８に記載の糖の製造方法。
請求項７乃至請求項９のいずれか一項に記載の糖の製造方法により糖を製造し、得られた糖を用いて、発酵微生物によるエタノール発酵を行い、エタノールを製造することを特徴とするエタノールの製造方法。
糖を製造する工程に発酵微生物を添加して、糖の製造とエタノール発酵とを同時に行うことを特徴とする請求項１０に記載のエタノールの製造方法。
前記発酵微生物は、酵母、カビ又は細菌であることを特徴とする請求項１０又は請求項１１に記載のエタノールの製造方法。
前記発酵微生物は、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）属、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、クルイウェロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属又はエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属する微生物であることを特徴とする請求項１２に記載のエタノールの製造方法。
エタノール発酵を１５℃以上、３５℃以下で行うことを特徴とする請求項１０乃至請求項１３のいずれか一項に記載のエタノールの製造方法。