TW201812006A - 糖化反應液、糖化酵素組成物、糖之製造方法及乙醇之製造方法 - Google Patents

糖化反應液、糖化酵素組成物、糖之製造方法及乙醇之製造方法 Download PDF

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Abstract

本發明提供能以簡便的步驟使酵素的糖化反應效率提升之糖化反應液、糖化酵素組成物、糖之製造方法及乙醇之製造方法。本發明為將纖維素及半纖維素的至少一者糖化之糖化反應液，且含有纖維素及半纖維素的至少一者、糖化酵素、二氧化矽或含有二氧化矽之物質、與選自由硫脲、硫脲衍生物及異硫脲衍生物或及此等的鹽所成群之至少一種的化合物(A)。

Description

糖化反應液、糖化酵素組成物、糖之製造方法及乙醇之製造方法
本發明與糖化反應液、糖化酵素組成物、糖之製造方法及乙醇之製造方法有關。
傳統上為人所知的是以包含纖維素或半纖維素之纖維素系生質物作為原料，以製造乙醇之纖維系生質乙醇。
作為從包含纖維素或半纖維素之纖維素系生質物生成葡萄糖這種糖的方法(糖化技術)，以對纖維素系生質物添加硫酸進行水解的方法為人所知，但存在反應器腐蝕及廢液處理的問題。此外，例如還有利用使碳或沸石等擔載磺酸基之固體酸觸媒將纖維素系生質物糖化的方法被提出，然而由於這是固體彼此之間的反應，所以不但反應速度極慢，而且還有難以將未反應殘渣與固體酸觸媒分離的問題。此外，上述無論任何方法皆難以控制水解，反應進行過頭的結果是還存在糖本身分解，糖的產率下降的問題。
另一方面，使用酵素進行糖化的方法液亦為 人所知(參見專利文獻1)。此方法包含以加壓熱水處理原料之熱水處理步驟、機械性粉碎處理該熱水處理物之機械性粉碎處理步驟、以及以酵素糖化處理該機械性粉碎物之糖化處理步驟。然而，此方法中以酵素進行糖化處理時反應速度慢，存在所得到之糖化液的濃度不能說足夠的問題。
於此，還有經由使用使二氧化矽介孔多孔體擔載酵素，可使酵素以比溶解狀態更高的濃度存在於反應系中，而更有效率地進行酵素反應的方法被提出(參見專利文獻2)。然而，此方法中存在需要將酵素吸附並固定在載體上之步驟的問題，而且，與沒有被固定的酵素相比，被固定的酵素還存在反應效率有下降40%~50%左右之虞的問題。此外，由於是固體彼此之間的反應，所以還有難以將未反應殘渣與固定有酵素之載體分離的問題。
此外，混合二氧化矽溶膠與酵素，製成二氧化矽凝膠後再粉末化之固定化酵素亦為人所知(參見專利文獻3,4)。雖然這種固定化酵素亦可進行酵素回收，但反應效率本身是低的。其他還有將0.5μm~100μm的二氧化矽粉末與酵素混合以水解含纖維素之植物纖維的方法為人所知，但混合二氧化矽粉末的效果不明確，並存在難以將未反應殘渣與懸浮之二氧化矽粉末分離的問題(參見專利文獻5)。
此外，也有使用含酵素與胍或尿素等的糖化反應促進劑以糖化纖維素系生質物的方法被提出(參見專 利文獻6)。然而，此糖化反應促進劑並非促進糖化反應，而是即使保管一定期間後生質物分解性能也不會下降之保存安定性優異的糖化反應促進劑。
[先前技術文獻] [專利文獻]
專利文獻1：日本特開2006-136263號公報
專利文獻2：日本特開2009-125006號公報
專利文獻3：日本特公昭63-2595號公報
專利文獻4：日本特公昭63-21475號公報
專利文獻5：日本特開平10-66594號公報
專利文獻6：日本特開2011-234715號公報
本發明為有鑑於上述情形而完成者，以提供能以簡便的步驟使酵素的糖化反應效率提升之糖化反應液、糖化酵素組成物、糖之製造方法及乙醇之製造方法為目的。
達成上述目的之本發明之第1態樣為一種糖化反應液，其係將纖維素及半纖維素的至少一者糖化之糖化反應液，其特徵係含有前述纖維素及前述半纖維素的至少 一者、糖化酵素、二氧化矽或含有二氧化矽之物質、與選自由下列通式(1)或(2)中所示化合物及其鹽所成群之至少一種的化合物(A)。
[前述通式(1)及(2)中的R1~R5代表氫原子或碳數1~4之烷基，前述烷基中的氫原子的一部份亦可被烯丙基、羥基、酯基、胺基、羧基、氰基、硝基、磺基、膦醯基或鹵素原子取代。]
達成上述目的之本發明之第2態樣如第1態樣之糖化反應液，其特徵係前述含有二氧化矽之物質為矽藻土或矽砂。
達成上述目的之本發明之第3態樣如第1態樣 或第2態樣之糖化反應液，其特徵係前述二氧化矽或含有二氧化矽之物質中的二氧化矽與前述化合物(A)的質量比例(化合物(A)/二氧化矽)為0.00001以上，0.1以下。
達成上述目的之本發明之第4態樣如第1態樣乃至於第3態樣之任何糖化反應液，其特徵係前述化合物(A)含有選自由硫脲、N-甲基硫脲、1,3-二甲基硫脲、三甲基硫脲、四甲基硫脲、1-烯丙基-3-(3-羥乙基)-2-硫脲、乙烯硫脲、甲脒硫脲、S-甲基異硫脲、S-乙基異硫脲、S-[2-(二甲胺基)乙基]異硫脲、S-苄基異硫脲、及S-(2-胺乙基)異硫脲所成群之至少一種。
達成上述目的之本發明之第5態樣為一種糖化酵素組成物，其係將纖維素及半纖維素的至少一者糖化之糖化酵素組成物，其特徵係含有糖化酵素、二氧化矽或含有二氧化矽之物質、與選自由下列通式(1)或(2)中所示化合物及其鹽所成群之至少一種的化合物(A)，且前述二氧化矽或含有二氧化矽之物質的二氧化矽與前述化合物(A)的質量比例(化合物(A)/二氧化矽)為0.00001以上，0.1以下。
[前述通式(1)及(2)中的R1~R5代表氫原子或碳數1~4之烷基，前述烷基中的氫原子的一部份亦可被烯丙基、羥基、酯基、胺基、羧基、氰基、硝基、磺基、膦醯基或鹵素原子取代。]
達成上述目的之本發明之第6態樣如第5態樣之糖化酵素組成物，其特徵係前述含有二氧化矽之物質為矽藻土或矽砂。
達成上述目的之本發明之第7態樣如第5態樣或第6態樣之糖化酵素組成物，其特徵係前述化合物(A)含有選自由硫脲、N-甲基硫脲、1,3-二甲基硫脲、三甲基硫脲、四甲基硫脲、1-烯丙基-3-(3-羥乙基)-2-硫脲、乙烯硫脲、甲脒硫脲、S-甲基異硫脲、S-乙基異硫脲、S-[2-(二甲胺基)乙基]異硫脲、S-苄基異硫脲、及S-(2-胺乙基)異硫脲所成群之至少一種。
達成上述目的之本發明之第8態樣為一種糖之製造方法，其係使用將纖維素及半纖維素的至少一者糖化之糖化反應液以製造糖的糖之製造方法，其特徵係使用含有前述纖維素及前述半纖維素的至少一者、糖化酵素、二 氧化矽或含有二氧化矽之物質、與選自由下列通式(1)或(2)中所示化合物及其鹽所成群之至少一種的化合物(A)之糖化反應液以製造糖。
[前述通式(1)及(2)中的R1~R5代表氫原子或碳數1~4之烷基，前述烷基中的氫原子的一部份亦可被烯丙基、羥基、酯基、胺基、羧基、氰基、硝基、磺基、膦醯基或鹵素原子取代。]
達成上述目的之本發明之第9態樣如第8態樣之糖之製造方法，其特徵係前述含有二氧化矽之物質為矽藻土或矽砂。
達成上述目的之本發明之第10態樣如第8態樣或第9態樣之糖之製造方法，其特徵係前述二氧化矽或含 有二氧化矽之物質的二氧化矽與前述化合物(A)的質量比例(化合物(A)/二氧化矽)為0.00001以上，0.1以下。
達成上述目的之本發明之第11態樣如第8態樣乃至於10態樣之任何糖之製造方法，其特徵係前述化合物(A)含有選自由硫脲、N-甲基硫脲、1,3-二甲基硫脲、三甲基硫脲、四甲基硫脲、1-烯丙基-3-(3-羥乙基)-2-硫脲、乙烯硫脲、甲脒硫脲、S-甲基異硫脲、S-乙基異硫脲、S-[2-(二甲胺基)乙基]異硫脲、S-苄基異硫脲、及S-(2-胺乙基)異硫脲所成群之至少一種。
達成上述目的之本發明之第12態樣為一種乙醇之製造方法，其特徵係使用經由第8態樣乃至第11態樣之任何製造方法所得到的糖，進行發酵微生物的乙醇發酵以製造乙醇。
達成上述目的之本發明之第13態樣如第12態樣之乙醇之製造方法，其特徵係在製造糖的步驟中添加發酵微生物，同時進行糖的製造與乙醇發酵。
達成上述目的之本發明之第14態樣如第12態樣或第13態樣之乙醇之製造方法，其特徵係前述發酵微生物為酵母、黴菌或細菌。
達成上述目的之本發明之第15態樣如第14項之乙醇之製造方法，其特徵係前述發酵微生物為屬於酵母菌(Saccharomyces)屬、發酵單孢菌(Zymomonas)屬、畢赤酵母菌(Pichia)屬、念珠菌(Candida)屬、發酵桿菌(Zymobacter)屬、棒狀桿菌(Corynebacterium)屬、克魯維 酵母菌(Kluyveromyces)屬或大腸桿菌(Escherichia)屬之微生物。
達成上述目的之本發明之第16態樣如第12態樣乃至於第15態樣之任何乙醇之製造方法，其特徵係在15℃以上，35℃以下進行乙醇發酵。
藉由本發明，可提供能以簡便的步驟使酵素的糖化反應效率提升之糖化反應液、糖化酵素組成物、糖之製造方法及乙醇之製造方法。
[圖1]圖示實施例4、7、8及比較例1~3、7、10~14之硫脲的添加所帶來的糖化反應效率提升效果的測定結果之圖。
[圖2]圖示實施例1~6及比較例1、4~9、12之硫脲濃度所帶來的糖化反應效率提升效果的測定結果之圖。
[圖3]圖示實施例9~18及比較例1、12之硫脲衍生物或異硫脲衍生物的添加所帶來的糖化反應效率提升效果的測定結果之圖。
[圖4]圖示實施例19及比較例1、7、15之硫脲的添加所帶來的糖化反應效率提升效果的測定結果之圖。
[圖5]圖示實施例20、21及比較例16~19之硫脲濃度 所帶來的乙醇發酵效率提升效果的測定結果之圖。
於本發明，使用纖維素及半纖維素的至少一者作為生成葡萄糖這種糖的原料。
此纖維素或半纖維素，被含有於例如闊葉樹、針葉樹等的農林水產物資源、或該農林水產物資源之廢棄物這些纖維素系生質物。更具體地來說，可舉出甘蔗渣、稻草、玉米穗稈、油棕空果叢、木材纖維、木材碎屑、膠合板廢料、木粉、紙漿類、廢紙類、棉、海鞘、醋酸菌等。此外，這些原料只要是來自纖維素系生質物即無特殊限制，可單獨使用1種，亦可混合2種以上使用。
此等之中又以被含有於尤加利木粉(闊葉樹)、杉木粉(針葉樹)、甘蔗渣、稻草、玉米穗桿、油棕空果叢、棉等之纖維素或半纖維素為佳。雖然理由不明，但在這些原料的情況下，纖維容易解離，能以較高的產率得到糖。
於此，所謂纖維素是指葡萄糖以β-1,4葡萄糖苷鍵聚合而成之聚合物。半纖維素是指葡萄糖、木糖、甘露醇、半乳糖等以葡萄糖苷鍵聚合而成之聚合物，為除了纖維素以外的水不溶性多糖類。
此外，纖維素亦可包含作為其部分分解物之纖維寡糖、纖維二糖等，且可為結晶性亦可為非結晶性。而且，亦可為羧甲基化的，醛化的或酯化的衍生物。再 者，纖維素或半纖維素只要是如上所述來自生質體者即無特殊限制，亦可來自植物、來自真菌、來自細菌等。
使用以纖維素酶為主體的糖化酵素作為本發明之糖化酵素。此纖維素酶意指將纖維素或半纖維素分解至葡萄糖等糖之酵素。
作為生產此糖化酵素之微生物雖無特殊限制，但例如可舉出頂孢黴菌(Acremonium)屬菌、麴菌(Aspergillus)屬菌、毛殼菌(Chaetomium)屬菌、梭菌(Fusarium)屬菌、腐質黴(Humicola)屬菌、無柄帽蕈(Irpex)屬菌、顯絲菌(Phanerochaete)屬菌、青黴(Penicillium)屬菌、裂褶菌(Schizophyllum)屬菌、孢子絲菌(Sporotrichum)屬菌、栓菌(Trametes)屬菌、木黴(Trichoderma)屬菌等。除此等之外，可舉出梭孢桿菌(Clostridium)屬菌、假單孢菌(Pseudomonas)屬菌、纖維桿菌(Cellulomonas)屬菌、瘤胃球菌(Ruminococcus)屬菌、芽孢桿菌(Bacillus)屬菌等的細菌；硫化葉菌(Sulfolobus)屬菌、鏈黴菌(Streptomyces)屬菌、高溫放線菌(Thermoactinomyces)屬菌、高溫單孢菌(Thermomonospora)屬菌等的放線菌。再者，此等糖化酵素亦可被人工修飾。此外，此等糖化酵素可單獨使用1種，亦可混合2種以上使用。
此等之中，以來自麴菌(Aspergillus)屬之糖化酵素及來自木黴(Trichoderma)屬之糖化酵素為特佳。這是因為此等糖化酵素對結晶性纖維素活性高。
此外，纖維素酶亦可為一系列之酵素群。作為此酵素群，可舉出內葡聚醣酶(EC 3.2.1.74)、纖維二糖水解酶(EC 3.2.1.91)、β-葡萄糖苷酶(EC 23.2.4.1,EC 3.2.1.21)等。本發明以混合使用來自不同微生物之纖維素酶為佳。在此情況下，因彼等之協同作用而能更進一步促進纖維素或半纖維素之糖化。
通常上述纖維素酶大多數為在pH3以上，pH6以下的範圍內具有最佳酵素活性的酶，但亦可為在pH6~pH10的範圍內具有最佳酵素活性之被稱為鹼性纖維素酶的酶。此外，大部分的上述纖維素酶大多數為在反應溫度25℃以上，50℃以下的範圍內具有最佳酵素活性的酶，但亦可為在70℃以上，100℃以下的範圍內具有最佳酵素活性之被稱為耐熱性纖維素酶的酶。
本發明中可使用二氧化矽、矽藻土或矽砂作為二氧化矽或含有二氧化矽之物質。作為含有二氧化矽之物質的矽藻土及矽砂，是以二氧化矽為主成分之天然物。二氧化矽是至少含有二氧化矽之化合物的統稱，通常在表面的一部分存在矽烷醇基。此二氧化矽的粒子形狀可為球狀亦可為非球狀，粒子結構可為實心結構亦可為多孔質結構，結晶性可為非晶體亦可為晶體，亦可在粉末狀、懸浮液、分散液之任何狀態下使用。二氧化矽表面的一部分亦可被矽烷醇基以外的其他官能基修飾。此外，亦可為在二氧化矽以外的化合物表面以矽烷偶合劑、矽氧烷或矽酸根離子等使之反應而存在二氧化矽層的形式。其中又以使用 膠態二氧化矽、矽藻土及矽砂為特佳。
於本發明，膠態二氧化矽的平均一次粒徑為1nm以上，400nm以下，以5nm以上350nm以下為佳，使之存在於糖化反應液中使用。平均一次粒徑是從以氮吸附法(BET法)測定之比表面積S(m2/g)經過換算式(D(nm)=2720/S)算出的。再者，膠態二氧化矽，以被水、甲醇、乙醇、丙酮、甲基乙基酮、乙二酮等的分散介質分散之分散液的形式使用，而分散液被稱為膠態溶液、溶膠等。於本發明，雖然可在不阻礙酵素活性的範圍內選擇分散介質，但以使用水、乙醇等的分散介質為佳。
作為膠態二氧化矽之製造方法，有以水玻璃為原料之水玻璃法、以金屬醇鹽為原料之醇鹽法、以氯化矽化合物為原料之氣相法等。雖可使用以任何製造法得到之膠態二氧化矽，但以使用經由水玻璃法得到的膠態二氧化矽為佳。
於本發明之下列通式(1)及(2)中所示的化合物，式中的R1~R5代表氫原子或碳數1~4之烷基，此烷基中的氫原子的一部份亦可被烯丙基、羥基、酯基、胺基、羧基、氰基、硝基、磺基、膦醯基或鹵素原子取代。此等取代基的數目以1~4為佳，以1~3為更佳。
作為選自由上述通式(1)或(2)中所示的化合物及其鹽所成群之至少一種的化合物(A)，具體來說可舉出硫脲、硫脲衍生物及異硫脲衍生物。作為硫脲衍生物，可舉出N-甲基硫脲、1,3-二甲基硫脲、三甲基硫脲、四甲基硫脲、1,3-二乙基-2-硫脲、1,3-二異丙基硫脲、1-烯丙基-2-硫脲、1-烯丙基-3-(3-羥乙基)-2-硫脲、1-乙醯基-2-硫脲、(2-甲氧基乙基)硫脲、乙烯硫脲、甲脒硫脲等。作為異硫脲衍生物，可舉出S-甲基異硫脲、S-乙基異硫脲、S-苄基異硫脲、S-[2-(二甲胺基)乙基]異硫脲、及S-(2-胺乙基)異硫脲、S-[4-[(4-硝基苄基)氧基]苯乙基]異硫脲等。作為通式(1)或(2)中所示化合物的鹽，可舉出S-甲基異硫脲的鹽。作為鹽可舉出鹽酸鹽、硫酸鹽及氫溴酸鹽等，例如可使用S-(2-胺乙基)異硫脲溴化物等。可視需要單獨使 用1種，亦可混合2種以上使用。此等之中以硫脲、N-甲基硫脲、1,3-二甲基硫脲、三甲基硫脲、四甲基硫脲、1-烯丙基-3-(3-羥乙基)-2-硫脲、乙烯硫脲、甲脒硫脲、S-甲基異硫脲、S-乙基異硫脲、及S-[2-(二甲胺基)乙基]異硫脲為佳，以硫脲、N-甲基硫脲、1,3-二甲基硫脲、三甲基硫脲、四甲基硫脲、乙烯硫脲、甲脒硫脲、S-甲基異硫脲、S-乙基異硫脲、及S-[2-(二甲胺基)乙基]異硫脲為特佳。
本發明之糖化反應液為以纖維素及半纖維素的至少一者為原料之糖化酵素組成物，且為含有糖化酵素、二氧化矽或含有二氧化矽之物質、及選自由上述通式(1)或(2)中所示化合物及其鹽所成群之至少一種的化合物(A)者。詳細稍後再述，但從享受糖化反應效率(亦簡稱為反應效率)的提升效果的觀點來看，糖化反應液中以並用二氧化矽或含有二氧化矽之物質及化合物(A)為佳。
於此，糖化反應液中的糖化酵素濃度換算成BSA(Bovine serum albumin；牛血清白蛋白)的蛋白質濃度為0.001質量%以上、3.0質量%以下，以0.001質量%以上、1.0質量%以下為佳。若糖化酵素的濃度低於此範圍則反應效率下降所以不佳；另一方面，若高於此範圍則不僅糖化酵素會變得難以溶解於溶液中，而且在經濟上也是不適合的。
此外，糖化反應液中二氧化矽或含有二氧化矽之物質中的二氧化矽濃度為0.001質量%以上、40質量%以下，以0.005質量%以上、10質量%以下為佳。若二氧化 矽或含有二氧化矽之物質中的二氧化矽濃度低於此範圍則反應效率下降所以不佳；另一方面，若高於此範圍則不僅分散性會惡化，而且在經濟上也是不適合的。
此外，糖化反應液中糖化酵素與二氧化矽或含有二氧化矽之物質中的二氧化矽的質量比例(糖化酵素/二氧化矽)，為0.0002以上、300以下，以0.002以上、30以下為佳。若兩者的質量比例離開此範圍則反應效率的提升會變得不顯著。
此外，糖化反應液中化合物(A)的濃度為0.00001質量%以上、10質量%以下，以0.0001質量%以上、1質量%以下為佳。若化合物(A)的濃度低於此範圍則反應效率下降所以不佳；另一方面，若高於此範圍則不僅分散性會惡化，而且在經濟上也是不適合的。
此外，糖化反應液中二氧化矽或含有二氧化矽之物質中的二氧化矽與化合物(A)的質量比例(化合物(A)/二氧化矽)，為0.00001以上、0.1以下，以0.0001以上、0.01以下為佳。若兩者的質量比例離開此範圍則反應效率的提升會變得不顯著。
此外，糖化反應液的pH為3以上、11以下，以3以上、6以下為佳。若pH低於3即會產生二氧化矽或含有二氧化矽之物質的凝集且糖化酵素的反應效率下降；另一方面，若pH高於11則由於二氧化矽或含有二氧化矽之物質會變得容易溶解所以不佳。
作為糖化反應液的pH調整劑，可舉出硫酸、 鹽酸、硝酸這些無機酸；醋酸、草酸這些羧酸；檸檬酸、酒石酸、蘋果酸這些羥酸；氫氧化鈉和氫氧化鉀這些氫氧化物鹽；氨、尿素等。只要是在不阻礙本發明之效果的範圍內，在使用上其種類和濃度即無特殊限制。而且此等pH調整劑可單獨使用1種，亦可混合2種以上使用。此外亦可在具有緩衝作用之緩衝液的狀態下使用。
此外，本發明之糖化反應液將反應溫度設為5℃以上、100℃以下，以設為20℃以上、55℃以下為特佳。以配合糖化酵素的最適溫度以設定反應溫度為佳。一般來說，若反應溫度低於5℃則糖化反應的效率會顯著下降，若比100℃高則糖化酵素有失活之虞所以不佳。
此外，含有纖維素或半纖維素之纖維素系生質物的前處理以公眾所知的範圍進行即可。一般來說，經由切碎機等的物理性粉碎、及經由酸或鹼處理而化學性地破壞木質素與纖維素及半纖維素的結構，做成糖化反應用原料即可。
製作糖化反應液時，可在分散著糖化酵素的反應液中添加二氧化矽或含有二氧化矽之物質及化合物(A)，亦可在分散著二氧化矽或含有二氧化矽之物質及化合物(A)的反應液中添加糖化酵素。可同時添加二氧化矽或含有二氧化矽之物質及化合物(A)，亦可分別添加，只要糖化反應效率不下降則不拘添加順序。此時，化合物(A)可以在粉末狀態下添加，亦可以在溶液狀態下添加。此外，只要是在不阻礙本發明之效果的範圍內，pH調整劑 等的其他添加劑能夠以任意的順序添加。
如以上說明，本發明之糖化反應液為以纖維素及半纖維素的至少一者為原料之糖化酵素組成物，經由含有糖化酵素、二氧化矽或含有二氧化矽之物質及選自由通式(1)或(2)中所示化合物及其鹽所成群之至少一種的化合物(A)而得。於此糖化反應液，雖然機制不明，但可藉由並用二氧化矽或含有二氧化矽之物質及化合物(A)，而更進一步促進纖維素或半纖維素的糖化。
此外，本發明之糖化反應液可藉由並用二氧化矽或含有二氧化矽之物質及化合物(A)，而減少糖化酵素的使用量，因此成本性亦優良。
亦可使用藉本發明所得到的糖，以進行乙醇發酵之發酵微生物使之進行乙醇發酵而得到乙醇。可在得到糖之後添加進行乙醇發酵之發酵微生物，使之進行乙醇發酵而得到乙醇，亦可在使用前述糖化反應液而得到糖的步驟中添加進行乙醇發酵之發酵微生物，同時進行糖的製造與乙醇發酵以得到乙醇。
本發明之發酵微生物可舉出酵母、黴菌、細菌等。其中又以酵母或細菌為特佳。而且，此等發酵微生物可單獨使用1種，亦可混合2種以上使用。作為所使用之發酵微生物，例如可舉出屬於酵母菌(Saccharomyces)屬、發酵單孢菌(Zymomonas)屬、畢赤酵母菌(Pichia)屬、念珠菌(Candida)屬、發酵桿菌(Zymobacter)屬、棒狀桿菌(Coryncbacterium)屬、克魯維酵母菌(Kluyveromyces)屬、 大腸桿菌(Escherichia)屬等之微生物。
進行乙醇發酵時的理想發酵溫度為15℃以上、35℃以下，以28℃以上、32℃以下為更佳。一般來說，若發酵溫度低於15℃，由於發酵微生物的活動會變得不活潑，所以乙醇發酵的效率會顯著下降，此外，若高於35℃則發酵微生物有死亡之虞所以不佳。
一般來說，使用微生物進行乙醇發酵時，除了使用葡萄糖等的糖作為細胞增殖用碳源以外，亦使用氮源和其他營養素。於本發明之乙醇發酵，如上述經由糖化反應而得到的糖(葡萄糖)為碳源。此外，作為氮源可舉出尿素、氨、胺基酸等，作為其他營養素可舉出維生素、礦物質等，此等視需要添加。再者，於本發明之乙醇發酵，使用尿素作為氮源。
此外，由於本發明之進行乙醇發酵之發酵微生物的乙醇製造方法，經由並用二氧化矽或含有二氧化矽之物質及化合物(A)，即使在進行乙醇發酵時的理想發酵溫度下亦可有效率地以糖化酵素得到糖，所以利用所得到的糖的乙醇發酵亦可有效率地進行。一般來說，由於得到糖的反應溫度比得到乙醇的發酵溫度還高，所以在乙醇發酵步驟之前有需要冷卻反應液，而產生能源的浪費，但由於藉由本發明可將得到糖的反應溫度和得到乙醇的發酵溫度設為同樣的溫度範圍，而可避免能源的浪費，所以是有效率的。
[實施例]
以下，基於實施例更詳細地敘述，但本發明不受此實施例的任何限制。
[1.使用二氧化矽作為二氧化矽或含有二氧化矽之物質的糖之製造] (1-1.平均一次粒徑)
二氧化矽的平均一次粒徑使用以下的測定設備測定。
氮吸附法測定設備：Monosorb MS-16(Quantachrome Instruments Japan G.K.製)
(1-2.纖維素酶水溶液)
按照以下的步驟，製作纖維素酶水溶液。在去離子交換水中添加預訂量的混合纖維素酶粉末，在室溫下使用轉子一邊以100rpm旋轉30分鐘，一邊溶解以得到纖維素酶水溶液。此外，作為糖化酵素之纖維素酶，使用以7：3(w/w)的比例混合在pH3以上、pH6以下的範圍內有最適酵素活性之來自理氏木黴(Trichoderma reesei；T.reesei)屬的纖維素酶(Sigma Aldrich製)及來自黑麴黴(Aspergillus niger；A.niger)屬的纖維素酶(MP Biomedicals製)之混合纖維素酶。
(1-3.糖化酵素水溶液)
按照以下的步驟，製作糖化酵素水溶液。在去離子交 換水中以最終達到0.05M的方式添加1M醋酸緩衝液(pH5.0)作為pH調整，及添加上述之纖維素酶水溶液，在室溫下使用轉子一邊以100rpm旋轉30分鐘一邊混合，分別得到下列表1中所示之糖化酵素濃度(於本實施例為纖維素酶濃度)的糖化酵素水溶液。以此等糖化酵素水溶液為比較樣品1~比較樣品3。各比較樣本的糖化酵素濃度是使用Bradford法(CBB法)，換算成BSA(商品名：蛋白質標準物質，Sigma Aldrich製)的蛋白質濃度而算出的。算出糖化酵素濃度的具體步驟如下。
在管長10mm之拋棄式光析管中添加2.5mL之以去離子交換水稀釋5倍的Protein Assay CBB溶液(5倍濃縮)(Nacalai Tesque,Inc製)，接下來，添加0.05mL之各比較樣品並封栓。將此混合溶液反覆上下翻轉以均勻混合。其後，靜置30分鐘，使用分光光度計UV-3150(Shimadzu Corporation製)測定波長595nm之吸光度。製作BSA蛋白質濃度已知之試樣，以同樣方式測定吸光度並做成檢量曲線。從所得到的檢量曲線算出各個比較樣品的糖化酵素濃度。再者，1g來自理氏木黴屬之纖維素酶粉末中含有0.27g之蛋白質。1g來自黑麴黴屬之纖維素酶粉末中含有0.06g之蛋白質。
(1-4.糖化酵素組成物)
按照以下的步驟，製作糖化酵素組成物。在去離子交換水中以最終達到0.05M的方式添加1M醋酸緩衝液(pH5.0)作為pH調整，添加在水中分散著以水玻璃法製造之實心球狀膠態二氧化矽(平均一次粒徑：35nm)的酸性二氧化矽溶膠(pH2.1，二氧化矽濃度40質量%)作為二氧化矽，添加硫脲作為化合物(A)，及添加上述之纖維素酶水溶液，在室溫下使用轉子一邊以100rpm旋轉30分鐘一邊混合，分別得到下列表2中所示之糖化酵素濃度(於本實施例為纖維素酶濃度)、二氧化矽濃度及化合物(A)濃度的糖化酵素組成物。以此等糖化酵素組成物為樣品1~樣品8。
此外，除了使用硫脲衍生物或異硫脲衍生物取代硫脲作為化合物(A)以外，以和樣品1~樣品8同樣的方式分別得到下列表2中所示之糖化酵素濃度(於本實施例為纖維素酶濃度)、二氧化矽濃度及化合物(A)濃度的糖化酵素組成物。以此等糖化酵素組成物為樣品9~樣品18。
再者，下列表2中所示之化合物(A)的種類如 下所示。
A：硫脲
B：N-甲基硫脲
C：1,3-二甲基硫脲
D：三甲基硫脲
E：四甲基硫脲
F：1-烯丙基-3-(3-羥乙基)-2-硫脲
G：乙烯硫脲
H：甲脒硫脲
I：S-甲基異硫脲硫酸鹽
J：S-苄基異硫脲鹽酸鹽
K：S-(2-胺乙基)異硫脲氫溴酸鹽
(1-5.含有硫脲的糖化酵素水溶液)
按照以下的步驟，製作使用硫脲作為化合物(A)之含有硫脲的糖化酵素水溶液。在去離子交換水中以最終達到 0.05M的方式添加1M醋酸緩衝液(pH5.0)作為pH調整，添加硫脲及上述之纖維素酶水溶液，在室溫下使用轉子一邊以100rpm旋轉30分鐘一邊混合，分別得到下列表3中所示之糖化酵素濃度(於本實施例為纖維素酶濃度)、及硫脲濃度的含有硫脲的糖化酵素水溶液。以此等含有硫脲的糖化酵素水溶液為比較樣品4~比較樣品11。
(1-6.含有二氧化矽的糖化酵素水溶液)
按照以下的步驟，製作含有二氧化矽的糖化酵素水溶液。在去離子交換水中以最終達到0.05M的方式添加1M醋酸緩衝液(pH5.0)作為pH調整，添加在水中分散著以水玻 璃法製造之實心球狀膠態二氧化矽(平均一次粒徑：35nm)的酸性二氧化矽溶膠(pH2.1，二氧化矽濃度40質量%)作為二氧化矽，及添加上述之纖維素酶水溶液，在室溫下使用轉子一邊以100rpm旋轉30分鐘一邊混合，分別得到下列表4中所示之糖化酵素濃度(於本實施例為纖維素酶濃度)、及二氧化矽濃度的含有二氧化矽的糖化酵素水溶液。以此等含有二氧化矽的糖化酵素水溶液為比較樣品12~比較樣品14。
(1-7.糖化反應液)
在樣品1~樣品18之糖化酵素組成物中添加微結晶纖維粉末，使之分散並作為使用各樣品之糖化反應液。具體的步驟如下。
首先，在13.5mL的玻璃瓶中放入10mL之各樣品，在以4mm 10mm的攪拌子攪拌的狀態下，添加0.05g(相當於5mg/mL)微結晶纖維粉末(結晶型：I型，商品 名：Avicel PH-101,Sigma Aldrich製)之後封栓。
此外，除了使用比較樣品1~比較樣品3之糖化酵素水溶液、比較樣品4~比較樣品11之含有硫脲的糖化酵素水溶液、及比較樣品12~比較樣品14之含有二氧化矽的糖化酵素水溶液以外，以和樣品1~樣品18之糖化酵素組成物同樣的方式得到各比較樣品的糖化反應液。
(1-8.糖之製造)
於25℃的恆溫槽中，分別使上述之使用各樣品及各比較樣品之糖化反應液，在攪拌下進行酵素反應2天。經由此酵素反應而得到糖(葡萄糖)。
(1-9.葡萄糖生成量的算出) (實施例1)
使用酵素法(GOD法)，針對從樣品1的糖化酵素組成物得到之糖化反應液(以下，稱為實施例1的糖化反應液)，算出上述酵素反應2天後的葡萄糖生成量。
採取0.5mL樣品1之糖化反應液試樣至2mL之微量離心管，在105℃、15分鐘下使酵素失活。接著為了去除未反應之纖維素和二氧化矽，將試樣移至附有絕對孔徑0.1μm的過濾器之2mL微量離心管，使用高速冷卻離心分離機SRX-201(TOMY SEIKO CO.,LTD.製)在10,000G、5分鐘的條件下進行離心分離，其後回收濾液。酵素法中使用Glucose CII-Test Wako(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.製)。使用分光光度計UV-3150測定波長505nm之吸光度(管長10mm)。具體的步驟如下。
在管長10mm之拋棄式光析管中添加3.0mL之顯色試液，接下來，添加0.02mL之上述濾液並封栓。接著，將此混合溶液反覆上下翻轉以均勻混合。其後，在24℃下靜置15分鐘，使用分光光度計測定波長505nm之吸光度作為Es。接著，在管長10mm之拋棄式光析管中添加3.0mL之顯色試液，接下來，添加0.02mL之葡萄糖標準液II(500mg/dL)，反覆上下翻轉以均勻混合後，在24℃下靜置15分鐘，使用分光光度計測定波長505nm之吸光度作為Estd。於此，以3.0mL之顯色試液的吸光度作為對照，以測定實施例1之糖化反應液的吸光度Es及葡萄糖標準液I的吸光度Estd。
接著，從下列算式(3)求出實施例1之糖化反應液的葡萄糖生成量(mg/mL)。其結果示於下列表5。
(實施例2~實施例18)
以和實施例1同樣的方式，針對從樣品2~樣品18的糖化酵素組成物得到之各糖化反應液(以下，稱為實施例2~實施例18的糖化反應液)，算出酵素反應2天後的葡萄糖生 成量，其結果示於下列表5。
(比較例1~比較例14)
以和實施例1同樣的方式，針對從比較樣品1~比較樣品3的糖化酵素水溶液、比較樣品4~比較樣品11的含有硫脲的糖化酵素水溶液、及比較樣品12~比較樣品14的含有二氧化矽的糖化酵素水溶液得到之各糖化反應液(以下，稱為比較例1~比較例14的糖化反應液)，算出酵素反應2天後的葡萄糖生成量，其結果示於下列表6。
(1-10.糖化反應效率)
根據上述表5及表6之葡萄糖生成量，探討各實施例及各比較例之糖化反應效率。首先，從實施例4、實施例7、實施例8、比較例1~比較例3、比較例7、及比較例10~比較例14之葡萄糖生成量，探討硫脲的添加所帶來的糖化反應效率提升效果。
圖1為圖示實施例4、7、8及比較例1~3、7、10~14之硫脲的添加所帶來的糖化反應效率提升效果的測定結果之圖。如圖1所示，比較比較例1~比較例3之糖化反應液、比較例12~比較例14之糖化反應液後，在纖維素酶水溶液中添加了二氧化矽之比較例12~比較例14中觀察到葡萄糖生成量增加，糖化反應率提升。而且，比較比較 例12~比較例14之糖化反應液，與實施例4、實施例7及實施例8之糖化反應液後，在纖維素酶水溶液中添加了二氧化矽及硫脲之實施例4、實施例7及實施例8中觀察到葡萄糖生成量增加，糖化反應率更進一步提升。另一方面，比較比較例1~比較例3之糖化反應液，與比較例7、比較例10、比較例11之糖化反應液後發現，即使在纖維素酶水溶液中添加硫脲，糖化反應效率仍無提升。從而確認了在纖維素的糖化反應中，糖化反應效率經由並用二氧化矽與硫脲而提升。
此外，根據此結果，比較比較例1~比較例3之糖化反應液，與在纖維素酶水溶液中添加了二氧化矽之比較例12~比較例14之糖化反應液中纖維素酶的使用量後發現，比較例12~比較例14可減少20%左右的使用量。另一方面，比較比較例1~比較例3之糖化反應液，與在纖維素酶水溶液中添加了二氧化矽及硫脲之實施例4、實施例7及實施例8之糖化反應液中纖維素酶的使用量後發現，在實施例4、實施例7及實施例8可期待減少30%左右的使用量，推測可以比在纖維素酶水溶液中添加二氧化矽時更進一步減少10%左右的糖化反應中纖維素酶的使用量。
接著，從實施例1~實施例6、比較例1、比較例4~9及比較例12之葡萄糖生成量，探討硫脲的添加量(硫脲濃度)所帶來的糖化反應效率提升效果。圖2為圖示實施例1、6及比較例1、4~9、12之硫脲濃度所帶來的糖化反應效率提升效果的測定結果之圖。
如圖2所示，當二氧化矽與硫脲的質量比例(硫脲/二氧化矽)在約0.00001~0.1的範圍中，糖化反應效率大幅提升，可確認兩者的並用效果。因此，此結果暗示葡萄糖生成量特別取決於硫脲的添加量。再者，即使僅將硫脲與糖化酵素(纖維素酶)組合也不會觀察到糖化反應效率的提升效果。
此外，從實施例9~實施例18、比較例1及比較例12之葡萄糖生成量，探討作為硫脲以外之化合物(A)的硫脲衍生物或異硫脲衍生物的添加所帶來的糖化反應效率提升效果。圖3為圖示實施例9~18及比較例1、12之硫脲衍生物或異硫脲衍生物的添加所帶來的糖化反應效率提升效果的測定結果之圖。
如圖3所示，比較實施例9~實施例18之糖化反應液、與比較例1及比較例12之糖化反應液後，在纖維素水溶液中添加了二氧化矽及硫脲衍生物或異硫脲衍生物之實施例9~實施例18中觀察到糖化反應效率提升效果。從而確認了在纖維素的糖化反應中，糖化反應效率經由並用二氧化矽與作為化合物(A)的硫脲衍生物或異硫脲衍生物而提升。
[2.使用矽藻土作為二氧化矽或含有二氧化矽之物質的糖之製造] (2-1.平均二次粒徑)
矽藻土的平均二次粒徑使用以下的測定設備測定。
雷射繞射/散射式粒徑分布測定設備：LA-300(HORIBA,Ltd.製)
(2-2.糖化酵素組成物)
按照以下的步驟，製作糖化酵素組成物。在去離子交換水中以最終達到0.05M的方式添加1M醋酸緩衝液(pH5.0)作為pH調整，添加矽藻土(Silika#600S，Chuo Silika Co.,Ltd.製，二氧化矽含有率：90質量%，平均二次粒徑：30μm)作為含有二氧化矽之物質，添加硫脲作為化合物(A)，及添加上述之纖維素酶水溶液，在室溫下使用轉子一邊以100rpm旋轉30分鐘一邊混合，得到下列表7中所示之糖化酵素濃度(於本實施例為纖維素酶濃度)、矽藻土濃度及硫脲濃度的糖化酵素組成物。以此糖化酵素組成物為樣品19。
(2-3.含有矽藻土的糖化酵素水溶液)
按照以下的步驟，製作含有矽藻土的糖化酵素水溶液。在去離子交換水中以最終達到0.05M的方式添加1M醋酸緩衝液(pH5.0)作為pH調整，添加矽藻土(Silika#600S，Chuo Silika Co.,Ltd.製，二氧化矽含有率：90質量%，平均二次粒徑：30μm)作為含有二氧化矽之物質，及添加上述之纖維素酶水溶液，在室溫下使用轉子一邊以100rpm旋轉30分鐘一邊混合，得到下列表7中所示之糖化酵素濃度(於本實施例為纖維素酶濃度)、及矽藻土濃度的含有矽 藻土的糖化酵素水溶液。以此含有矽藻土的糖化酵素水溶液為比較樣品15。
(2-4.糖化反應液)
除了使用樣品19之糖化酵素組成物及比較樣品15之含有矽藻土的糖化酵素水溶液以外，以和樣品1~樣品18之糖化酵素組成物同樣的方式得到樣品19及比較樣品15之糖化反應液。
(2-5.葡萄糖生成量的算出) (實施例19)
以和實施例1同樣的方式，針對從樣品19的糖化酵素組成物得到之糖化反應液(以下，稱為實施例19的糖化反應液)，算出酵素反應2天後的葡萄糖生成量，其結果示於下列表8。
(比較例15)
以和實施例1同樣的方式，針對從比較例15的糖化酵素組成物得到之糖化反應液(以下，稱為比較例15的糖化反應液)，算出酵素反應2天後的葡萄糖生成量，其結果示於下列表8。
(2-6.糖化反應效率)
根據上述表6及表8之葡萄糖生成量，探討各樣品及各比較樣品之糖化反應效率。首先，從實施例19、比較例1、比較例7、及比較例15之葡萄糖生成量，探討硫脲的添加所帶來的糖化反應效率提升效果。圖4為圖示實施例19及比較例1、7、15之硫脲的添加所帶來的糖化反應效率提升效果的測定結果之圖。
如圖4所示，比較比較例1之糖化反應液、在纖維素酶水溶液中添加了硫脲之比較例7之糖化反應液、在纖維素水溶液中添加了矽藻土作為含有二氧化矽之物質之比較例15之糖化反應液、在纖維素水溶液中添加了矽藻 土及硫脲之實施例19之糖化反應液後，在纖維素水溶液中添加了矽藻土及硫脲之實施例19中觀察到葡萄糖生成量增加，糖化反應率提升。從而確認了在纖維素的糖化反應中，糖化反應效率經由使用矽藻土作為含有二氧化矽之物質，且更進一步並用硫脲而提升。
[3.使用糖的乙醇之製造] (3-1.酵母水溶液)
按照以下的步驟，製作酵母水溶液。在預先調整至35℃之40g去離子交換水中添加0.2g酵母粉末，維持35℃的狀態，使用磁力攪拌器一邊攪拌20分鐘一邊溶解以得到0.5質量%(=酵母粉末0.2g/去離子水交換水40g)之酵母水溶液。再者，使用酵母菌(Saccharomyces)屬之(Saccharomyces cerevisiae；S.cerevisiae)YP2(Sigma Aldrich製)作為酵母。
(3-2.乙醇發酵水溶液)
按照以下的步驟，製作乙醇發酵水溶液。在去離子交換水中以最終達到pH5左右的方式添加硫酸作為pH調整，以最終達到0.21mg/mL的方式添加尿素作為氮源，添加上述之纖維素酶水溶液及上述之酵母水溶液，在室溫下使用磁力攪拌器一邊旋轉10分鐘一邊混合，得到下列表9中所示之糖化酵素濃度(於本實施例為纖維素酶濃度)、及酵母濃度的乙醇發酵水溶液。以此乙醇發酵水溶液為比較樣品 16。
(3-3.乙醇發酵組成物)
按照以下的步驟，製作乙醇發酵組成物。在去離子交換水中以最終達到pH5左右的方式添加硫酸作為pH調整，以最終達到0.21mg/mL的方式添加尿素作為氮源，添加在水中分散著以水玻璃法製造之實心球狀膠態二氧化矽(平均一次粒徑：85nm)的鹼性二氧化矽溶膠(pH9.5，二氧化矽濃度40質量%)作為含有二氧化矽之物質，添加硫脲作為化合物(A)，添加上述之纖維素酶水溶液及上述之酵母水溶液，在室溫下使用磁力攪拌器一邊旋轉10分鐘一邊混合，分別得到下列表9中所示之糖化酵素濃度(於本實施例為纖維素酶濃度)、二氧化矽濃度、硫脲濃度、及酵母濃度的乙醇發酵組成物。以此等乙醇發酵組成物為樣品20及樣品21。
(3-4.含有硫脲的乙醇發酵水溶液)
按照以下的步驟，製作含有硫脲的乙醇發酵水溶液。在去離子交換水中以最終達到pH5左右的方式添加硫酸作為pH調整，以最終達到0.21mg/mL的方式添加尿素作為氮源，添加硫脲作為化合物(A)，添加上述之纖維素酶水溶液及上述之酵母水溶液，在室溫下使用磁力攪拌器一邊旋轉10分鐘一邊混合，得到下列表9中所示之糖化酵素濃度、硫脲濃度、及酵母濃度的含有硫脲的乙醇發酵水溶 液。以此含有硫脲的乙醇發酵水溶液為比較樣品17及比較樣品18。
(3-5.含有二氧化矽的乙醇發酵水溶液)
按照以下的步驟，製作含有二氧化矽的乙醇發酵水溶液。在去離子交換水中以最終達到pH5左右的方式添加硫酸作為pH調整，以最終達到0.21mg/mL的方式添加尿素作為氮源，添加在水中分散著以水玻璃法製造之實心球狀膠態二氧化矽(平均一次粒徑：85nm)的鹼性二氧化矽溶膠(pH9.5，二氧化矽濃度40質量%)作為二氧化矽，添加上述之纖維素酶水溶液及上述之酵母水溶液，在室溫下使用轉子一邊以100rpm旋轉30分鐘一邊混合，得到下列表9中所示之糖化酵素濃度(於本實施例為纖維素酶濃度)、二氧化矽濃度、及酵母濃度的含有二氧化矽的乙醇發酵水溶液。以此含有二氧化矽的乙醇發酵水溶液為比較樣品19。
(3-6.糖化反應及乙醇發酵液)
在樣品20之乙醇發酵組成物中添加微結晶纖維粉末，使之分散並作為使用各樣品之糖化反應及乙醇發酵液。具體的步驟如下。
首先，在13.5mL的玻璃瓶中放入10mL之各樣品，在以4mm 10mm的攪拌子攪拌的狀態下，添加 0.20g(相當於20mg/mL)微結晶纖維粉末(結晶型：I型，商品名：Avicel PH-101,Sigma Aldrich製)之後，以附有絕對孔徑0.22μm的疏水性PTEF製薄膜過濾器之矽塞封栓。
此外，除了使用樣品21之乙醇發酵組成物、比較樣品16之乙醇發酵水溶液、比較樣品17及比較樣品18之含有硫脲的乙醇發酵水溶液、及比較樣品19之含有含有二氧化矽之物質的乙醇發酵水溶液以外，以和樣品20之乙醇發酵組成物同樣的方式得到各糖化反應及乙醇發酵液。
(3-7.乙醇之製造)
於31℃的恆溫槽中，分別使上述之使用各樣品及各比較樣品之糖化反應液及乙醇發酵液，在攪拌下同時進行酵素反應及乙醇發酵2天。使用經由此酵素反應而得到的糖(葡萄糖)進行乙醇發酵，而得到乙醇。
(3-8.乙醇生成量的算出) (實施例20)
利用氣相層析法(GC)，算出從樣品20之乙醇發酵組成物得到之糖化反應及乙醇發酵液(以下，稱為實施例20的糖化反應及乙醇發酵液)的酵素反應及乙醇發酵後的乙醇生成量。
採取0.5mL實施例20的糖化反應及乙醇發酵液試樣至2mL微量離心管，在105℃、15分鐘下使酵素及酵母失活。接著為了去除未反應之纖維素、含有二氧化矽之 物質及酵母，使用高速冷卻離心分離機SRX-201(TOMY SEIKO CO.,LTD.製)在15,000G、30分鐘的條件下進行離心分離，其後回收上清液。乙醇生成量的定量使用氣相層析GC-2014s(Shimadzu Corporation製)以1點檢量曲線法測定，乙醇生成量(mg/mL)的測定結果示於下列表10。具體的分析條件如下。
<分析條件>
管柱：Porapak Q，長度1m，內徑3.2mm(GL Sciences Inc.製)
檢測器：FID
管柱溫度：150℃
流量：40mL/min
樣品量：2μL
檢量曲線用標準品：乙醇10mg/mL水溶液
(實施例21)
以和實施例20同樣的方式，針對從樣品21的乙醇發酵組成物得到之糖化反應及乙醇發酵液(以下，稱為實施例21的糖化反應及乙醇發酵液)，算出酵素反應及乙醇發酵2天後的乙醇生成量，其結果示於下列表10。
(比較例16~比較例19)
以和實施例20同樣的方式，針對從比較樣品16的乙醇 發酵水溶液、比較樣品17及比較樣品18之含有硫脲的乙醇發酵水溶液、及比較樣品19之含有含有二氧化矽之物質的乙醇發酵水溶液得到之各糖化反應及各乙醇發酵液(以下，稱為比較例16~比較例19的糖化反應及乙醇發酵液)，算出糖化反應及乙醇發酵2天後的乙醇生成量，其結果示於下列表10。
(3-9.乙醇發酵效率)
根據上述表10之乙醇生成量，探討各實施例及各比較例之乙醇發酵效率。首先，從實施例20、實施例21及比較例16~比較例19之乙醇生成量，探討硫脲的添加量(硫脲濃度)所帶來的糖化反應效率提升效果。圖5為圖示實施例20、21及比較例16~19之硫脲濃度所帶來的乙醇發酵效率提升效果的測定結果之圖。
如圖5所示，比較比較例16、比較例19之糖化反應及乙醇發酵液後，在纖維素酶水溶液及酵母水溶液中添加了二氧化矽之比較例19中觀察到乙醇生成量增加，乙醇生成效率提升。而且，比較實施例20、實施例21及比較例19之糖化反應及乙醇發酵液後，在纖維素酶水溶液及酵母水溶液中添加了二氧化矽及硫脲之實施例20、實施例21中觀察到乙醇生成量增加，乙醇生成效率更進一步提升。另一方面，比較比較例16、比較例17、比較例18之糖化反應液及乙醇發酵液後發現，即使在纖維素酶水溶液及酵母水溶液中添加硫脲，乙醇生成效率仍無提升。從而確認了在纖維素的糖化反應及乙醇發酵中，乙醇生成效率經由併用含有二氧化矽之物質與硫脲而提升。
[產業上的利用可能性]
本發明可利用在適用從包含纖維素或半纖維素之纖維素系生質物生成葡萄糖這種糖的糖化技術之產業領域，例如，纖維素系生質乙醇的製造等。

Claims (20)

  1. 一種糖化反應液，其係將纖維素及半纖維素的至少一者糖化之糖化反應液，其特徵係含有前述纖維素及前述半纖維素的至少一者、糖化酵素、二氧化矽或含有二氧化矽之物質、與選自由下列通式(1)或(2)中所示化合物及其鹽所成群之至少一種的化合物(A)， [前述通式(1)及(2)中的R 1~R 5代表氫原子或碳數1~4之烷基，前述烷基中的氫原子的一部份亦可被烯丙基、羥基、酯基、胺基、羧基、氰基、硝基、磺基、膦醯基或鹵素原子取代]。
  2. 如請求項1之糖化反應液，其特徵係前述含有二氧化 矽之物質為矽藻土或矽砂。
  3. 如請求項1或請求項2之糖化反應液，其特徵係前述二氧化矽或含有二氧化矽之物質中的二氧化矽與前述化合物(A)的質量比例(化合物(A)/二氧化矽)為0.00001以上，0.1以下。
  4. 如請求項1或請求項2之糖化反應液，其特徵係前述化合物(A)含有選自由硫脲、N-甲基硫脲、1,3-二甲基硫脲、三甲基硫脲、四甲基硫脲、1-烯丙基-3-(3-羥乙基)-2-硫脲、乙烯硫脲、甲脒硫脲、S-甲基異硫脲、S-乙基異硫脲、S-[2-(二甲胺基)乙基]異硫脲、S-苄基異硫脲、及S-(2-胺乙基)異硫脲所成群之至少一種。
  5. 如請求項3之糖化反應液，其特徵係前述化合物(A)含有選自由硫脲、N-甲基硫脲、1,3-二甲基硫脲、三甲基硫脲、四甲基硫脲、1-烯丙基-3-(3-羥乙基)-2-硫脲、乙烯硫脲、甲脒硫脲、S-甲基異硫脲、S-乙基異硫脲、S-[2-(二甲胺基)乙基]異硫脲、S-苄基異硫脲、及S-(2-胺乙基)異硫脲所成群之至少一種。
  6. 一種糖化酵素組成物，其係將纖維素及半纖維素的至少一者糖化之糖化酵素組成物，其特徵係含有糖化酵素、二氧化矽或含有二氧化矽之物質、與選自由下列通式(1) 或(2)中所示化合物及其鹽所成群之至少一種的化合物(A)，且前述二氧化矽或含有二氧化矽之物質的二氧化矽與前述化合物(A)的質量比例(化合物(A)/二氧化矽)為0.00001以上，0.1以下， [前述通式(1)及(2)中的R 1~R 5代表氫原子或碳數1~4之烷基，前述烷基中的氫原子的一部份亦可被烯丙基、羥基、酯基、胺基、羧基、氰基、硝基、磺基、膦醯基或鹵素原子取代]。
  7. 如請求項6之糖化酵素組成物，其特徵係前述含有二氧化矽之物質為矽藻土或矽砂。
  8. 如請求項6或請求項7之糖化酵素組成物，其特徵係前 述化合物(A)含有選自由硫脲、N-甲基硫脲、1,3-二甲基硫脲、三甲基硫脲、四甲基硫脲、1-烯丙基-3-(3-羥乙基)-2-硫脲、乙烯硫脲、甲脒硫脲、S-甲基異硫脲、S-乙基異硫脲、S-[2-(二甲胺基)乙基]異硫脲、S-苄基異硫脲、及S-(2-胺乙基)異硫脲所成群之至少一種。
  9. 一種糖之製造方法，其係使用將纖維素及半纖維素的至少一者糖化之糖化反應液以製造糖的糖之製造方法，其特徵係使用含有前述纖維素及前述半纖維素的至少一者、糖化酵素、二氧化矽或含有二氧化矽之物質、與選自由下列通式(1)或(2)中所示化合物及其鹽所成群之至少一種的化合物(A)之糖化反應液以製造糖， [前述通式(1)及(2)中的R 1~R 5代表氫原子或碳數1~4 之烷基，前述烷基中的氫原子的一部份亦可被烯丙基、羥基、酯基、胺基、羧基、氰基、硝基、磺基、膦醯基或鹵素原子取代]。
  10. 如請求項9之糖之製造方法，其特徵係前述含有二氧化矽之物質為矽藻土或矽砂。
  11. 如請求項9或請求項10之糖之製造方法，其特徵係前述二氧化矽或含有二氧化矽之物質的二氧化矽與前述化合物(A)的質量比例(化合物(A)/二氧化矽)為0.00001以上，0.1以下。
  12. 如請求項9或請求項10之糖之製造方法，其特徵係前述化合物(A)含有選自由硫脲、N-甲基硫脲、1,3-二甲基硫脲、三甲基硫脲、四甲基硫脲、1-烯丙基-3-(3-羥乙基)-2-硫脲、乙烯硫脲、甲脒硫脲、S-甲基異硫脲、S-乙基異硫脲、S-[2-(二甲胺基)乙基]異硫脲、S-苄基異硫脲、及S-(2-胺乙基)異硫脲所成群之至少一種。
  13. 如請求項11之糖之製造方法，其特徵係前述化合物(A)含有選自由硫脲、N-甲基硫脲、1,3-二甲基硫脲、三甲基硫脲、四甲基硫脲、1-烯丙基-3-(3-羥乙基)-2-硫脲、乙烯硫脲、甲脒硫脲、S-甲基異硫脲、S-乙基異硫脲、S-[2-(二甲胺基)乙基]異硫脲、S-苄基異硫脲、及S-(2-胺乙基) 異硫脲所成群之至少一種。
  14. 一種乙醇之製造方法，其係使用將纖維素及半纖維素的至少一者糖化之糖化反應液以製造糖的糖之製造方法，其特徵係使用含有前述纖維素及前述半纖維素的至少一者、糖化酵素、二氧化矽或含有二氧化矽之物質、與選自由下列通式(1)或(2)中所示化合物及其鹽所成群之至少一種的化合物(A)之糖化反應液以製造糖，並使用所得到的前述糖進行發酵微生物的乙醇發酵以製造乙醇， [前述通式(1)及(2)中的R 1~R 5代表氫原子或碳數1~4之烷基，前述烷基中的氫原子的一部份亦可被烯丙基、羥基、酯基、胺基、羧基、氰基、硝基、磺基、膦醯基或鹵素原子取代]。
  15. 如請求項14之乙醇之製造方法，其特徵係在製造糖的步驟中添加發酵微生物，同時進行糖的製造與乙醇發酵。
  16. 如請求項14或請求項15之乙醇之製造方法，其特徵係前述發酵微生物為酵母、黴菌或細菌。
  17. 如請求項16之乙醇之製造方法，其特徵係前述發酵微生物為屬於酵母菌(Saccharomyces)屬、發酵單孢菌(Zymomonas)屬、畢赤酵母菌(Pichia)屬、念珠菌(Candida)屬、發酵桿菌(Zymobacter)屬、棒狀桿菌(Corynebacterium)屬、克魯維酵母菌(Kluyveromyces)屬或大腸桿菌(Escherichia)屬之微生物。
  18. 如請求項14或請求項15之乙醇之製造方法，其特徵係在15℃以上，35℃以下進行乙醇發酵。
  19. 如請求項16之乙醇之製造方法，其特徵係在15℃以上，35℃以下進行乙醇發酵。
  20. 如請求項17之乙醇之製造方法，其特徵係在15℃以上，35℃以下進行乙醇發酵。
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