CN109310783A - 环糊精-帕比司他加合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于制备环糊精‑帕比司他加合物的方法，其包括：a)提供包含缓冲剂的第一水溶液，所述溶液的pH在2.0至4.0的范围内；b)将帕比司他溶解于所述第一水溶液中以提供第二水溶液；以及c)将包含帕比司他的所述第二水溶液与包含环糊精的第三水溶液混合，以形成包含环糊精‑帕比司他加合物的第四水溶液。还提供了一种包含所述环糊精‑帕比司他加合物的人工脑脊液(CSF)溶液以及所述环糊精‑帕比司他加合物的医学用途，包括在治疗脑肿瘤方面的医学用途。

Description

环糊精-帕比司他加合物
技术领域
本发明涉及组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂的药物制剂、用于制备此类制剂的方法和这些制剂在治疗脑肿瘤(特别是胶质瘤)方面的用途。
背景技术
本发明涉及药物组合物和制剂，以及制备和施用此类组合物和产品用于治疗脑肿瘤(包括胶质瘤诸如弥漫性内生性脑桥胶质瘤(DIPG))的方法。
组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂显示出治疗各种癌症的巨大潜力。“帕比司他”(LBH-589，2-(E)-N-羟基-3-[4[[[2-(2-甲基-1H-吲哚-3-基)乙基]氨基]甲基]苯基]-2-丙烯酰胺)是一种用于治疗多发性骨髓瘤的非选择性HDAC抑制剂。已经提出使用帕比司他和放射的联合疗法治疗实体瘤(WO2007/050655)。然而，包括帕比司他在内的氧肟酸盐化合物表现出差的水溶性和稳定性(WO2009/039226)。已经提出采用至少一种醇来降低氧化和水解的帕比司他制剂(WO2008/086330)。
Wehrmann等人，PLOS ONE，2012年第7卷第10期e48561描述了通过伏立诺他、帕比司他、β-环糊精及其组合来降低C型Niemann-Pick病成纤维细胞中的细胞内胆固醇水平。
Grasso等人，Nature Medicine，2015年第21卷第6期第555-559页报道，多组蛋白去乙酰化酶抑制剂帕比司他在体外和DIPG原位异种移植模型中均表现出治疗效果。但是，将帕比司他配制在二甲基亚砜(DMSO)中用于对流增强型递送(CED)给携带异种移植肿瘤的小鼠。DMSO是一种温和的氧化剂，并且在人的临床应用中具有许多缺点。
WO2015/191931描述了这样一些药物组合物及其医学用途(包括用于治疗脑疾病)，所述药物组合物包含：疏水性药物(其可以是HDAC抑制剂)、其前药、其盐、其同种型或其组合；环糊精、其前药、其盐、或其组合；聚乙二醇、丙二醇或其组合；以及药学上可接受的载体。
WO2008/002862描述了包含组蛋白去乙酰化酶抑制剂和B族维生素的药物组合物及其医学用途，包括用于治疗增殖性疾病。
Hockly等人，PNAS，2003年第100(4)卷第2041-2046页描述了使用HDAC抑制剂辛二酰苯胺氧肟酸(SAHA)经口服施用治疗患亨廷顿氏病(Huntington’s disease)的小鼠模型。
US2013177499提出使用细菌来源的微细胞作为抗脑肿瘤活性剂的递送媒介物。
WO2013/135727描述了通过对流增强型递送(CED)使用卡铂在人工脑脊液(CSF)中的组合物治疗胶质瘤的方法。
仍然存在对于治疗脑肿瘤(包括胶质瘤)稳定且易于经中枢施用(例如，通过CED)的药物制剂的未满足的需求。本发明致力于满足这些和其他需求。
发明内容
概括地讲，本发明涉及适用于通过对流增强型递送(CED)施用于脑部的HDAC抑制剂帕比司他的组合物和制剂。本发明人惊奇地发现，“pH桥接(pH bridging)”方法提供了制备水溶性且稳定的2-羟丙基-β-环糊精和帕比司他的复合物或加合物的便利途径。继而已发现2-羟丙基-β-环糊精-帕比司他加合物可溶于人工脑脊液(CSF)中。如在本文的实例中所述，环糊精-帕比司他加合物表现出优异的HDAC抑制活性、体外肿瘤细胞杀伤活性以及在初步人临床研究中对弥漫性内生性脑桥胶质瘤(DIPG)的潜在体内治疗活性。本发明的环糊精-帕比司他加合物和制备方法的一个特别优点在于它们避免了不期望的试剂，诸如二甲基亚砜(DMSO)。DMSO，尤其是高浓度的DMSO，在供人使用的药物中是不期望的，并且是一种可能对帕比司他的稳定性产生负面作用的温和氧化剂。
因此，在第一方面，本发明提供了一种制备环糊精-帕比司他加合物的方法，其包括：
a)提供包含缓冲剂的第一水溶液，所述溶液的pH在2.0至4.0的范围内；
b)将帕比司他溶解于所述第一水溶液中以提供第二水溶液；以及
c)将包含帕比司他的所述第二水溶液与包含环糊精的第三水溶液混合，以形成包含环糊精-帕比司他加合物的第四水溶液。
环糊精可以是适用于药学用途的任何环糊精，例如，α-、β-或γ-环糊精。在特定情况下，环糊精是β-环糊精。优选地，环糊精是2-羟丙基-β-环糊精。
缓冲剂可包括任何药学上可接受的酸(和其共轭碱)。优选地，缓冲剂包括柠檬酸和柠檬酸盐，例如柠檬酸和柠檬酸钠。缓冲剂的浓度可以在0.01M至1M的范围内，例如0.1M。
第一水溶液的pH在2.0至4.0的范围内，例如2.5至3.5。优选地，第一水溶液的pH为约3.0。在该pH下，帕比司他游离碱表现出良好的水溶性。事实上，第二水溶液中帕比司他的浓度在1mM至20mM的范围内。例如，帕比司他游离碱可以10mM的浓度溶于pH3.0的柠檬酸盐缓冲液中。将帕比司他溶解于第一水溶液的步骤可涉及摇动和/或混合1分钟至20分钟的时间段，例如10分钟。
在一些情况下，所述第三水溶液中环糊精(例如，2-羟丙基-β-环糊精)的浓度可以在10mg/mL至200mg/mL的范围内。例如，第三溶液可以是100mg/mL 2-羟丙基-β-环糊精的水溶液。
在一些情况下，本发明的第一方面的方法还包括：
d)向包含所述环糊精-帕比司他加合物的所述第四水溶液中加入足量的碱，以便提供pH在6.0至8.0范围内的第五水溶液。
在一些情况下，本发明的第一方面的方法还包括干燥所述第五水溶液以形成包含所述环糊精-帕比司他加合物的固体。以这种方式，经干燥的固体(例如，冻干块状物(lyophilised cake))具有约中性的pH，以准备好复原至或接近中性pH。
在一些情况下，本发明的第一方面的方法还包括干燥所述第四水溶液以形成包含所述环糊精-帕比司他加合物的固体。以这种方式，经干燥的固体(例如，冻干块状物)具有相对酸性的pH，其可例如在任何复原、再水化或溶解步骤之前、期间或之后调节或不调节至或接近中性pH(约7)。
在任一情况下(即干燥第五水溶液或第四水溶液)，所述干燥可包括在减压下冷冻干燥(冻干)以形成包含所述环糊精-帕比司他加合物的冻干固体。合适的冷冻干燥条件包括：在真空(0.053毫巴)下冷却至-52℃持续2小时。然而，应当理解，用于冷冻干燥/冻干的各种技术和条件是已知的，并且会发现已将这些技术和条件用于本文设想的一个或多个干燥步骤中。一般来讲，冻干包括冷冻步骤，其中将溶液冷却直至溶液中的所有组分被冷冻。这可包括将温度降低至低于-40℃，诸如低于-50℃。冷冻之后进行初步干燥步骤。在初步干燥步骤中，通过升华除去冷冻期间形成的冰。初步干燥步骤可以在减压(诸如<10毫巴(1kPa)或<0.1毫巴(10Pa))下进行。初步干燥步骤可以在温度高于用于冷冻步骤的温度下进行。初步干燥步骤之后可进行二次干燥步骤。二次干燥步骤的温度可高于初步干燥步骤的温度。在一些情况下，冻干可能需要超过1小时，例如2小时或3小时或甚至更长。
在一些情况下，将溶液干燥成冻干固体，例如，水含量小于10％w/w(任选地小于5％w/w)的块状物、粉末或颗粒状物质。冻干固体可以是药学上可接受的固体，例如药学上可接受的块状物。
在一些情况下，本发明的该方面的方法还包括通过溶解于复原溶液中复原包含环糊精-帕比司他加合物的干燥固体(例如冻干固体)。复原溶液优选地是药学上可接受的环糊精-帕比司他加合物可溶于其中的溶液。具体地讲，复原溶液可以选自由以下组成的组：人工脑脊液(CSF)、林格氏溶液、注射用水(WFI)和缓冲盐溶液。在某些情况下，例如当预期施用于中枢神经系统(CNS)时，复原溶液可包括人工CSF。
在一些情况下，在冷冻干燥步骤和随后的复原步骤之间可能存在相当长的延迟。包含环糊精-帕比司他加合物的冻干固体可表现出良好的稳定性，从而具有显著的保质期。相比于对应的水溶液，冻干固体的稳定性和/或相对紧密性使得冻干固体在储存和/或运输方面更具吸引力。复原步骤可在施用于患者之前立即进行。在一些情况下，复原可在施用于患者之前最多24、48或72小时进行。通过接近施用时间进行复原，由受环糊精影响的成核作用或其他成核事件导致形成人工CSF溶液的一种或多种盐结晶的可能性将较小。
在一些情况下，该方法还包括在复原之前、期间或之后调节溶液的pH。具体地，在没有首先中和pH(即，干燥第四水溶液时)的情况下冷冻干燥环糊精-帕比司他加合物时，可能需要增加调节pH的步骤，例如通过添加足够量的碱使pH进入6.0到8.0的范围。
在一些情况下，本发明的该方面的方法还包括将包含环糊精-帕比司他加合物的第五水溶液与人工脑脊液(CSF)溶液混合，以提供包含人工CSF中的环糊精-帕比司他加合物的第六水溶液。
在一些情况下，人工CSF(无论是第六水溶液还是固体复原成的人工CSF)中帕比司他的浓度在1μM至100μM的范围内，例如1μM至20μM。认为该浓度范围对应于药物的有效抗肿瘤浓度。第六水溶液或在人工CSF中复原的包含环糊精-帕比司他加合物的冻干固体可方便地作为施用于待治疗患者(例如，患有或怀疑患有胶质瘤的人或其他哺乳动物)的溶液。
在一些情况下，本发明的第一方面的方法还包括过滤和/或灭菌包含环糊精-帕比司他加合物的所述溶液和/或冷冻干燥固体中的至少一者的步骤。通常，该方法可涉及无菌过滤第六水溶液或通过在人工CSF中复原包含环糊精-帕比司他加合物的冷冻干燥固体而形成的溶液，例如以准备好用于治疗性施用。
在一些情况下，该方法还包括将第六水溶液或通过在人工CSF中复原包含环糊精-帕比司他加合物的冷冻干燥固体而形成的溶液的至少一部分引入到至少一根对流增强型递送(CED)导管中。该一根或多根CED导管可以是用于植入(或预植入)到待治疗患者的头部的微导管。
在第二方面，本发明提供了一种通过或可通过本发明的第一方面的方法制备的环糊精-帕比司他加合物。
据报道，环糊精复合物可呈纳米颗粒的形式(参见，例如，He等人，Micron 2008年第39卷第495-516页)。实际上，原子力显微镜(AFM)和电子显微镜研究表明，包括β-环糊精在内的环糊精在溶液中形成具有约60nm的流体动力学半径的浓度依赖性聚集体。因此，在一些情况下，本发明的第二方面的环糊精-帕比司他加合物可以呈纳米颗粒或纳米管的形式。具体地讲，环糊精-帕比司他加合物可以是直径在10nm至500nm范围内(例如，10nm至100nm或甚至50nm至100nm)的纳米颗粒的形式。纳米颗粒和/或纳米管可以自组装的(例如在溶液中)。纳米颗粒和/或纳米管可以是可逆的，例如，在溶液中形成单体环糊精-帕比司他加合物。在一些情况下，纳米颗粒和/或纳米管的自组装性和可逆性可以是浓度依赖性和/或温度依赖性的。
在第三方面，本发明提供了一种包含环糊精-帕比司他加合物(例如，本发明的第二方面的环糊精-帕比司他加合物)的人工脑脊液(CSF)溶液。该人工CSF溶液通过或可以通过本发明的第一方面的方法制备。在一些情况下，环糊精-帕比司他加合物是2-羟丙基-β-环糊精-帕比司他。
优选地，本发明的第二方面的环糊精-帕比司他加合物和/或本发明的第三方面的包含环糊精-帕比司他加合物的人工脑脊液(CSF)溶液基本上不含二甲基亚砜(DMSO)。具体地讲，该溶液中DMSO(v/v)的浓度可小于百万分之1000(ppm)，例如小于100ppm、小于10ppm或甚至小于1ppm。
具体地讲，本发明的第二方面的环糊精-帕比司他加合物和/或本发明的第三方面的人工脑脊液(CSF)溶液可以基本上不含有机溶剂(例如，丙酮、四氢呋喃，二氯甲烷、乙腈、二甲基甲酰胺和DMSO)。例如，该溶液中有机溶剂的浓度或任何有机溶剂的总浓度(v/v)可小于百万分之1000(ppm)，例如小于100ppm、小于10ppm或甚至小于1ppm。
在第四方面，本发明提供了一种包含本发明的第三方面的人工CSF溶液的对流增强型递送(CED)导管。
在第五方面，本发明提供了本发明的第三方面的人工脑脊液(CSF)溶液或本发明的第二方面的环糊精-帕比司他加合物以用于医学用途。
在第六方面，本发明提供了本发明的第三方面的人工脑脊液(CSF)溶液或本发明的第二方面的环糊精-帕比司他加合物以用于治疗哺乳动物受试者的脑肿瘤的方法中。
在一些情况下，脑肿瘤可包括胶质瘤，诸如脑干胶质瘤、星形细胞瘤(例如，多形性胶质母细胞瘤)、少突胶质细胞瘤、少突星形细胞瘤或弥漫性内生性脑桥胶质瘤(DIPG)。
在一些情况下，该治疗方法包括通过对流增强型递送(CED)将人工CSF溶液施用于所述哺乳动物受试者的脑部。
在第七方面，本发明提供了治疗哺乳动物受试者的脑肿瘤的方法，其包括将治疗有效量的本发明的第三方面的人工脑脊液(CSF)溶液或本发明的第二方面的环糊精-帕比司他加合物施用于有需要的哺乳动物受试者。
在一些情况下，脑肿瘤可包括胶质瘤，诸如脑干胶质瘤、星形细胞瘤(例如，多形性胶质母细胞瘤)、少突胶质细胞瘤、少突星形细胞瘤或弥漫性内生性脑桥胶质瘤(DIPG)。
在一些情况下，该方法包括通过对流增强型递送(CED)将人工CSF溶液施用于所述哺乳动物受试者的脑部。
根据本发明，受试者可以是人、伴侣动物(例如，狗或猫)、实验动物(例如，小鼠、大鼠、兔、猪或非人灵长类动物)、家畜或农场动物(例如，猪、牛、马或羊)。优选地，受试者是人。在某些情况下，特别是如果肿瘤是DIPG肿瘤，受试者可以是人类儿童，例如10岁以下(诸如1至5岁)的儿童。
本发明包括所述方面和优选特征的组合，除了这种组合明显不允许或被声明明确避免的情况。下面将参照所附实施例和附图进一步详细描述本发明的这些和其他方面和实施方案。
附图说明
图1示出了针对药物浓度(μM)作图的经MTT评估的细胞活力(％)，其中A)为HP-β-CD帕比司他(正方形)、环糊精(三角形)和人工CSF(圆形)处理72小时后的U87MG细胞；B)为HP-β-CD帕比司他(正方形)、环糊精(三角形)和人工CSF(圆形)处理48小时后的U87MG细胞；C)为HP-β-CD帕比司他(正方形)、环糊精(三角形)和人工CSF(圆形)处理72小时后的HEPG2细胞；以及D)为HP-β-CD帕比司他处理72小时后的U87MG细胞(圆圈)、HEPG2细胞(菱形)和h19细胞(三角形)。误差线指示一式三份样品的正或负标准偏差。N＝1个实验重复。
图2示出了A)针对HP-β-CD帕比司他浓度(μM)作图的处理72小时后SF8628DIPG细胞的细胞活力(％)；B)针对log10剂量的HP-β-CD帕比司他浓度作图的处理72小时后(圆圈)、处理6小时后(正方形)和处理30分钟后(菱形)的细胞活力(活细胞％)。误差线指示一式三份样品的正或负标准偏差。
图3示出了在15℃-25℃下的24周储存测试中帕比司他浓度(μM)随时间的变化。测得的存储HP-β-CD帕比司他加合物中的帕比司他浓度即使在研究的整个24周期间也非常稳定。
图4示出了在15℃-25℃下的24周储存测试中针对时间作图的总杂质百分比(菱形)。相对保留时间(RRT)0.86(正方形)和RRT 1.12(三角形)是指帕比司他药物主峰两侧的色谱峰。该图显示在整个研究期间RRT峰值和总杂质％保持稳定且低，这意味着帕比司他降解产物的形成可忽略不计。
具体实施方式
在描述本发明时，将采用以下术语并且旨在如下所示进行定义。
“帕比司他”(LBH-589，2-(E)-N-羟基-3-[4[[[2-(2-甲基-1H-吲哚-3-基)乙基]氨基]甲基]苯基]-2-丙烯酰胺)是一种非选择性HDAC抑制剂，其具有如下所示的化学结构：
如本文所用，除非上下文另有说明(诸如当描述为“游离碱帕比司他”时)，“帕比司他”包括盐形式(例如，帕比司他柠檬酸盐、帕比司他乳酸盐等)。制备用作去乙酰化酶抑制剂的氧肟酸盐衍生物(包括帕比司他)的方法在WO2002/022577中有详细描述，其全部内容以引用方式明确并入本文。
“环糊精”是一种环状低聚糖，并且具体地包括α-环糊精、β-环糊精和γ-环糊精。环糊精通常是药学上可接受的环糊精。在特定情况下，环糊精是2-羟丙基-β-环糊精。
“对流增强型递送(CED)”是一种通过一根或多根非常小的导管将药物直接递送到脑部的方法，这些导管通过外科手术放置在脑肿瘤中或脑肿瘤周围。导管的放置可以是立体定向的，例如以最小化脱靶效应。WO2013/135727(其全部内容以引用方式明确并入本文)描述了通过对流增强型递送(CED)使用卡铂在人工脑脊液(CSF)中的组合物治疗胶质瘤的方法。CED通常采用在线灭菌过滤器。许多灭菌过滤器与DMSO不相容(例如，醋酸纤维素、硝酸纤维素、聚碳酸酯、聚醚砜、Sartobran P、某些PVDF、PVC、Metricet、尼龙和PES)。因此，期望用于CED递送的帕比司他人工CSF制剂应基本上不含某些有机溶剂，诸如DMSO。因此，在通常使用在线灭菌过滤器的情形中，本发明的环糊精-帕比司他制剂用于CED递送是有利的。
“人工脑脊液(CSF)”
人工脑脊液(CSF)旨在与CSF的电解质浓度相匹配。优选地，人工CSF由高纯度水和分析级试剂制备，或者可从医学和商业供应商(例如，South Devon Healthcare NHSFoundation Trust,UK或Tocris Bioscience,Bristol,UK)处获得。人工CSF中的最终离子浓度可以如下(以mM计)：
Na 150；
K 3.0；
Ca 1.4；
Mg 0.8；
P 1.0；
Cl 155。
任选地，每种离子成分的浓度可以是上面列出的浓度值的加或减(±)10％、±5％、±2％、±1％或±0.5％。进一步任选地，人工CSF还可包含葡萄糖和/或一种或多种蛋白质，其浓度通常为在人CSF中发现的浓度。在优选的情况下，人工CSF不包含葡萄糖或蛋白质。
以下以实例的方式呈现，并且不应解释为对权利要求范围的限制。
实施例
实施例1-制备帕比司他-2-羟丙基-β-环糊精加合物的程序
帕比司他游离碱难溶于水。它同样不溶于2-羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)的浓缩水溶液(450mg/mL)。但是，帕比司他可溶于pH3.0的柠檬酸盐缓冲液中。
溶液A：0.1M柠檬酸水溶液
称取柠檬酸(Sigma Aldrich C-0759；批号21K0042)(2.101g)并溶解于100mL超纯水中。
溶液B：0.1M柠檬酸钠水溶液
称取柠檬酸钠(三碱)(Sigma Aldrich C3434；批号1304640/41807230)(2.944g)并溶解于100mL超纯水中。
溶液C：0.1M柠檬酸盐缓冲液
将溶液A(82mL)和溶液B(18mL)加入到250mL杜兰烧瓶(Duran flask)中并短暂混合以形成[C]。测量柠檬酸盐缓冲液的pH，发现pH为3.0。
溶液D：10mM的帕比司他的柠檬酸盐缓冲溶液(25mL)
浓度＝10mM＝0.01M
体积＝25mL＝0.025L
因此，所需的摩尔数＝2.5x10-4
帕比司他分子量＝349.43g/mol
因此，所需的帕比司他质量＝82.36mg
因此，称取帕比司他游离碱(81.0mg)并溶解于溶液C(24.59mL)中。将该混合物在回旋振荡器上振荡10分钟，得到无色澄清的溶液[D]。
溶液E：100mg/mL2-羟丙基-β-环糊精的水溶液(20mL)
2-羟丙基-β-环糊精的平均分子量为1460g/mol。为简单起见，如下进行制备。
浓度＝100mg/mL。
称取2-羟丙基-β-环糊精(Sigma Aldrich H107；批号048K0672)(2.004g)并溶解于20.04mL超纯水中。将该混合物在回旋振荡器上振荡10分钟，得到无色澄清的溶液[E]。
溶液F：帕比司他-2-羟丙基-β-环糊精加合物(5mM)
将等体积的溶液D(2mL)和溶液E(2mL)在Falcon管中混合。短暂涡旋该无色澄清的溶液以匀化。
溶液G：帕比司他-2-羟丙基-β-环糊精加合物(3.125mM)
为了制备用于注射的中性溶液(约pH7)，将样品[F](1mL)与NaOH(水溶液)(0.6mL，0.2M)混合，得到无色澄清的溶液(体积1.6mL)。
溶液H：帕比司他-2-羟丙基-β-环糊精加合物在aCSF(人工脑脊液)中的无菌溶液 (10μM)
将aCSF的第1部分溶液(South Devon Healthcare；批号1407292)(155.5mL)加入到250mL杜兰烧瓶中。通过移液管加入溶液[G](0.5mL)，得到aCSF中帕比司他浓度为10μM的最终溶液。短暂混合该溶液，然后使用SteriFlip无菌过滤器滤芯在层流罩中过滤灭菌。然后将该无色的澄清溶液储存于4℃。
实施例2-HDAC酶测定
针对1-11号HDAC，比较了溶解于DMSO中的帕比司他的抑制活性和HP-β-CD帕比司他加合物(如实施例1中所述制备)的抑制活性。两者均针对11种HDAC以单次10剂量的IC50模式进行测试，其中以10μM为起始进行3倍连续稀释。HDAC参照化合物，曲古抑菌素A((R,2E,4E)-6-(4-(二甲基氨基)苯甲酰)-N-羟基-4-甲基庚-2,4-二烯酰胺)和TMP 269(N-((4-(4-苯基噻唑-2-基)四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-3-(5-(三氟甲基)
-1,2,4-恶二唑-3-基)苯甲酰胺)，以10剂量的IC50进行测试，其中以10μM为起始进行3倍连续稀释。
底物如下：
HDAC 1、2、3、6、10的底物：来自p53残基379-382(RHKK(Ac)AMC)的荧光肽
HDAC 4、5、7、9和11的底物：荧光HDAC Class2a底物(三氟乙酰赖氨酸)
HDAC 8的底物：来自p53残基379-382(RHK(Ac)K(Ac)AMC)的荧光肽
使用GraphPad Prism 4程序基于S形型剂量反应方程计算IC50值。空白(DMSO)值输入1.00E-012的浓度，用于曲线拟合。
各种化合物针对各种HDAC酶的IC50值如下所示。
ND表示化合物没有针对酶进行测试。
结果显示，在整个1-11号HDAC酶的范围内，HP-β-CD帕比司他等效于帕比司他的DMSO溶液。
实施例3-体外细胞毒性
在肝细胞癌和胶质母细胞瘤中评估HP-β-CD帕比司他的细胞毒性。
将U87MG(胶质母细胞瘤)和HEPG2(肝细胞癌)细胞系暴露于增加剂量的HP-β-CD帕比司他、单独的环糊精或单独的人工脑脊液(人工CSF)持续48或72小时。然后使用MTT试剂评估细胞活力。测得HP-β-CD帕比司他的IC50约为0.01μM(参见图1A-D)。单独的环糊精和单独的人工CSF在测试条件下基本上是无毒的。
在人SF8628DIPG细胞(来自美国UCSF的Gupta集团的馈赠)中评估HP-β-CD帕比司他的细胞毒性。
采用荧光活死细胞活力测定(Invitrogen)。细胞在以10μM、5μM、3μM、1μM、0.3μM、0.1μM、0.03μM和0.01μM剂量(一式三份)的人工CSF中的HP-β-CD帕比司他的存在下培养72小时。在三个不同的通道中重复测定三次。将细胞活力与活死对照(和仅媒介物对照)相比较。使用GraphPad Prism软件绘制剂量反应曲线(参见图2A)。计算出的IC50值为0.01μM。
这些结果表明，制成HP-β-CD帕比司他加合物的帕比司他可溶于中性pH的人工CSF，并且显示出针对体外一系列肿瘤细胞系(包括胶质瘤，特别是DIPG细胞)的强效癌细胞杀伤活性。
为了研究HP-β-CD帕比司他对DIPG细胞作用的时间进程，细胞在以5μM、3μM、1μM、0.3μM、0.1μM、0.03μM、0.01μM剂量(一式三份，具有三个独立的细胞通道)存在的HP-β-CD帕比司他下培养72小时、6小时和30分钟。在给药后72小时测定短时间点孵育结果(6小时和30分钟)。结果示于图2B中。以下示出了各个时间点的IC50值：
孵育时间 IC<sub>50</sub>(μM)
72小时 0.01
6小时 0.04
30分钟 0.06
这些结果表明，即使短暂暴露于细胞毒性浓度也足以产生抗肿瘤效果。药代动力学数据表明，用于基于CED递送的人工CSF中的HP-β-CD帕比司他从导管尖端迅速扩散出来。
实施例4-帕比司他制剂的溶解度和稳定性
从文献研究中已经确定帕比司他可溶解于DMSO/水混合相中。为了通过CED方法将药物直接施用于患者的脑部，必须使用过滤的人工脑脊液(CSF)作为稀释剂。
在基于CED递送的情形下，通常在计划施用的前一天制备药物溶液。如果患者计划在周一接受CED治疗，则药物溶液将在周五准备好并存放在冰箱中直到周一。因此，在人工CSF中制备的帕比司他溶液必须在4℃下稳定至少48小时。
该研究旨在确定可在DMSO/aCSF混合物中成功实现的帕比司他浓度及其在4℃和室温下的稳定性。
制备70mg/mL＝0.2M＝200mM的帕比司他的DMSO储备溶液。
通过在DMSO中稀释，由该溶液制备20mM、10mM、5mM、2mM和1mM的多种DMSO工作溶液。
用人工CSF(aCSF)以50:50的比例稀释这些溶液，得到以下结果。
用aCSF以1/2稀释后得到 100mM 20mM 10mM 5mM 2mM 1mM
可溶/均质 否 否 否 是 是 是
用aCSF进一步稀释20mM溶液得到以下浓度。通过涡旋混合后，将样品离心60秒。
用aCSF稀释20mM溶液得到 10mM 5mM 2mM
可溶/均质 否(颗粒) 否(颗粒) 否(颗粒)
用aCSF进一步稀释10mM溶液得到以下浓度。通过涡旋混合后，将样品离心60秒。
用aCSF稀释20mM溶液得到 5mM 2mM 1mM 0.5mM
可溶/均质 是 否(颗粒) 否(颗粒) 否(颗粒)
显而易见的是，DMSO:aCSF比率很重要。可将有用的工作浓度制备在5mM和1mM之间，但仅限于DMSO比率为约50％v/v时。对于人体内使用，DMSO的存在(尤其是高达50％v/v的浓度)是不期望的。
相比之下，HP-β-CD帕比司他加合物在4℃下于人工CSF中可溶且稳定至少48小时。
制备帕比司他的储备溶液(10mM)并将其溶解于DMSO或柠檬酸盐缓冲液(pH3)中。对样品进行稀释以允许通过HPLC进行分析(避免系统过载)。在制备后0小时、100小时和150小时测量两种溶液的峰面积。样品在整个分析过程中储存于室温下。基于峰面积并与零时的分析进行比较计算百分比变化。重复分析一次，各样品进样7.2μl(相当于柱上0.25μg)。估计储备溶液的浓度为10mM。
色谱柱：Ascentis Express Peptide，ES-C18，10cm×4.6mm
流动相：0.1％三氟乙酸(TFA)的乙腈溶液(有机)和0.1％三氟乙酸的水溶液
HPLC：Agilent 1260infinity
HPLC使用条件：
结果：
在100小时时，DMSO溶液显示出帕比司他浓度降低了2.8％，而柠檬酸盐溶液中的帕比司他降低了0.4％。类似地，在150小时时，DMSO溶液中的帕比司他降低了4.4％，而柠檬酸盐溶液中的帕比司他仅降低了1％。
不希望受任何特定理论的束缚，本发明人认为，与在柠檬酸盐溶液中的稳定性相比，帕比司他在DMSO中相对较低的稳定性可能是由DMSO的氧化性质及其对帕比司他的作用引起的。有鉴于此，期望在基本上不含DMSO的溶液中配制帕比司他。
以40μM帕比司他的初始浓度制备人工CSF中的HP-β-CD-帕比司他溶液，并将几个等分试样储存于5℃下的直立密封小瓶中。在不同时间点(t＝0、第1天、第8天、第18天和第22天)取样并通过HPLC测量帕比司他浓度。余下的帕比司他以t＝0时起始浓度的百分比表示。结果如下：
天数 帕比司他浓度
0 100％
1 &gt;99％
8 &gt;99％
18 &gt;99％
22 &gt;99％
在测量的所有时间点(多达并包括第22天)，帕比司他的浓度基本上没有变化：大于初始浓度的99％。这些结果表明，在人工CSF中配制的HP-β-CD-帕比司他非常稳定。
实施例5-通过CED用HP-β-CD帕比司他治疗人DIPG患者
通过直接CED输注人工CSF中的HP-β-CD-帕比司他治疗患有DIPG的单名患者(5岁女性)。
该患者具有预植入的包含安装在颅骨上的经皮端口的药物递送系统，其允许通过CED重复施用药物。
如上所述制备人工CSF中的HP-β-CD-帕比司他。将HP-β-CD-帕比司他通过四根导管以10μM的浓度输注/对流约8小时，总输注量为12mL。提供了会诊医生引导的儿科麻醉护理。进行连续生理监测，并获得神经功能的每小时评估。这包括准确记录肢体和颅神经功能。
发现通过CED施用人工CSF中的HP-β-CD-帕比司他的耐受性良好，并且未观察到不良事件。
实施例6-HP-β-CD-帕比司他加合物的冻干
根据实施例1中所列的方法制备两批HP-β-CD-帕比司他加合物。
第一批被释放并放置在4℃下以进行长期稳定性测试。在第42天，在许多(但不是全部)产品小瓶中观察到可见颗粒。对这些颗粒的分析表明它们仅包含无机盐(即它们即不含环糊精也不含帕比司他化合物)。能量色散X射线光谱(EDX)分析表明存在镁和磷，因此得出结论，这些可见颗粒为磷酸镁晶体。
不希望受任何特定理论的束缚，本发明人认为，人工CSF(aCSF)中以纳米微粒形式存在的环糊精-加合物可促进aCSF中存在的某些盐的成核作用。人工CSF含有不同浓度的盐的混合物。这些盐中的一些盐本质上具有比其他盐更低的溶解度，因此随着时间的推移更可能成核。向该溶液中添加被认为已经是固体的纳米颗粒形式的相对大质量的环糊精可很好地加速这种成核作用。
本发明人理论上认为，可通过引入冷冻干燥步骤实现改进。也就是说，通过最小化这些较低溶解度的盐在HP-β-CD-帕比司他加合物溶液中存在的时间(即通过在施用前即刻复原)，发明人期望避免无机盐逐渐结晶的问题。
在本实施例中，冻干过程包括将含有HP-β-CD-帕比司他加合物的样品在真空(0.053毫巴)下冷却至-52℃持续约2小时。然而，设想了其他冻干程序，前提是它们产生基本上干燥的固体(例如，水含量低于10％w/w、低于5％w/w或甚至低于2％w/w)。本领域技术人员将意识到许多可与本发明结合使用的冷冻干燥工艺。
制备人工CSF中的HP-β-CD-帕比司他加合物的改良方法如下所述，其中在aCSF中复原以在递送时得到即用型注射溶液之前HP-β-CD-帕比司他加合物被冻干用于储存/运输。
溶液A：0.1M柠檬酸水溶液
称取柠檬酸(Sigma Aldrich C-0759；批号21K0042)(2.101g)并溶解于100mL超纯水中。
溶液B：0.1M柠檬酸钠水溶液
称取柠檬酸钠(三碱)(Sigma Aldrich C3434；批号1304640/41807230)(2.944g)并溶解于100mL超纯水中。
溶液C：0.1M柠檬酸盐缓冲液
将溶液A(82mL)和溶液B(18mL)加入到250mL杜兰烧瓶中并短暂混合以形成溶液[C]。测量柠檬酸盐缓冲液的pH，发现pH为3.0。
溶液D：10mM的帕比司他的柠檬酸盐缓冲溶液(25mL)
浓度＝10mM＝0.01M
体积＝25mL＝0.025L
因此，所需的摩尔数＝2.5x10-4
帕比司他分子量＝349.43g/mol
因此，所需的帕比司他质量＝82.36mg
因此，称取帕比司他游离碱(81.0mg)并溶解于溶液C(24.59mL)中。
将该混合物在回旋振荡器上振荡10分钟，得到无色澄清的溶液[D]。
溶液E：100mg/mL2-羟丙基-β-环糊精的水溶液(20mL)
2-羟丙基-β-环糊精的平均分子量为1460g/mol。为简单起见，如下进行制备。
浓度＝100mg/mL。称取2-羟丙基-β-环糊精(Sigma Aldrich H107；批号048K0672)(2.004g)并溶解于20.04mL超纯水中。将该混合物在回旋振荡器上振荡10分钟，得到无色澄清的溶液[E]。
溶液F：帕比司他-2-羟丙基-β-环糊精加合物(5mM)
将等体积的溶液D(2mL)和溶液E(2mL)在Falcon管中混合。短暂涡旋该无色澄清的溶液以均匀化。
溶液G：帕比司他-2-羟丙基-β-环糊精加合物(3.125mM)
为了制备中性溶液(约pH7)，将样品[F](1mL)与NaOH(水溶液)(0.6mL，0.2M)混合，得到无色澄清的溶液(体积1.6mL)。
冻干溶液G：通过在真空(0.053毫巴)下冷却约2小时至-52℃使2mL加合物溶液G冻干，以产生固体块状物。然后可以根据需要储存冻干的固体，例如用于运输到递送地点。
溶液H：帕比司他-2-羟丙基-β-环糊精加合物在aCSF(人工脑脊液)中的无菌溶液 (40μM)
通过加入10mL aCSF复原由2mL上述溶液G形成的冻干固体块状物，得到40μM的帕比司他的aCSF溶液。该溶液可以根据治疗所需的剂量或体积进一步稀释。
实施例7-HP-β-CD-帕比司他加合物的长期储存稳定性
HP-β-CD-帕比司他加合物的长期稳定性通过测量存储于-25℃--15℃(数据未示出)、2℃-8℃(数据未示出)和15℃-25℃(图3和图4)下的从t＝0到总共24周的间隔期间帕比司他的浓度和杂质的百分比来评估。
如图3所示，发现帕比司他浓度在15℃-25℃下的整个24周期间内非常稳定。-25℃--15℃和2℃-8℃下的等效浓度曲线也显示出类似的特性，其中测得的浓度保持在38μM至45μM的范围内。
通过HPLC测量帕比司他化合物主峰任一侧的峰值来评估帕比司他在15℃至25℃下随时间推移的可能降解(参见图4中的RRT 0.86和RRT 1.12)。以百分比计的总杂质也示于图4中。图4的图表显示，在研究的24周持续时间内，杂质保持在非常低的水平(约1％或更低)。在同一时间段内储存于-25℃--15℃和2℃-8℃下的结果非常相似。
总之，帕比司他浓度和杂质测量结果表明，即使在室温下HP-β-CD-帕比司他加合物在至少长达24周的时间内也是稳定的。
本文所引用的所有参考文献全文以引用方式并入本文并且用于所有目的，其程度如同各个单独的出版物或专利或专利申请被具体地和单独地指示其全文以引用方式并入本文以用于所有目的。
本文所述的具体实施方案以实例而非限制的方式提供。本文包括的任何子标题仅出于便利的目的，并且不应被解释为以任何方式限制本公开。

Claims (39)

1.一种用于制备环糊精-帕比司他加合物的方法，其包括：
a)提供包含缓冲剂的第一水溶液，所述溶液的pH在2.0至4.0的范围内；
b)将帕比司他溶解于所述第一水溶液中以提供第二水溶液；以及
c)将包含帕比司他的所述第二水溶液与包含环糊精的第三水溶液混合，以形成包含环糊精-帕比司他加合物的第四水溶液。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述环糊精是2-羟丙基-β-环糊精。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述缓冲剂包括柠檬酸和柠檬酸盐。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第二水溶液中帕比司他的浓度在1mM至20mM的范围内。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第三水溶液中环糊精的浓度在10mg/mL至200mg/mL的范围内。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括：
d)向包含所述环糊精-帕比司他加合物的所述第四水溶液中加入足量的碱，以便提供pH在6.0至8.0范围内的第五水溶液。
7.根据权利要求6所述的方法，其还包括干燥所述第五水溶液以形成包含所述环糊精-帕比司他加合物的固体。
8.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其还包括干燥所述第四水溶液以形成包含所述环糊精-帕比司他加合物的固体。
9.根据权利要求7或权利要求8所述的方法，其中所述干燥包括在减压下冷冻干燥以形成包含所述环糊精-帕比司他加合物的冻干固体。
10.根据权利要求7至9中任一项所述的方法，其中所述固体的水含量小于10％w/w，任选地小于5％w/w。
11.根据权利要求7至10中任一项所述的方法，其还包括通过溶解于复原溶液中复原所述固体。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述复原溶液包括：人工脑脊液(CSF)、林格氏溶液、注射用水(WFI)或缓冲盐溶液。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述复原溶液包括人工CSF。
14.根据权利要求12或权利要求13所述的方法，其还包括在复原之前、期间或之后调节所述溶液的pH。
15.根据权利要求6所述的方法，其还包括将包含所述环糊精-帕比司他加合物的所述第五水溶液与人工脑脊液(CSF)溶液混合，以提供包含在人工CSF中的所述环糊精-帕比司他加合物的第六水溶液。
16.根据权利要求13至15中任一项所述的方法，其中所述人工CSF中所述帕比司他的浓度在1μM至20μM的范围内。
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括过滤和/或灭菌包含所述环糊精-帕比司他加合物的所述溶液和/或所述固体中的至少一者的步骤。
18.根据权利要求17所述的方法，其包括无菌过滤人工CSF中的所述环糊精-帕比司他加合物。
19.根据权利要求13至18中任一项所述的方法，其还包括将人工CSF中的所述环糊精-帕比司他加合物的至少一部分引入到至少一根对流增强型递送(CED)导管中。
20.一种环糊精-帕比司他加合物，其通过或可通过根据权利要求1至18中任一项所定义的方法制备。
21.根据权利要求20所述的环糊精-帕比司他加合物，其中所述环糊精-帕比司他加合物呈纳米颗粒或纳米管的形式。
22.根据权利要求21所述的环糊精-帕比司他加合物，其中所述环糊精-帕比司他加合物呈直径在10nm至100nm范围内的纳米颗粒的形式。
23.一种人工脑脊液(CSF)溶液，其包含环糊精-帕比司他加合物。
24.根据权利要求24所述的人工脑脊液(CSF)溶液，其中所述环糊精-帕比司他加合物呈纳米颗粒或纳米管的形式。
25.根据权利要求25所述的人工脑脊液(CSF)溶液，其中所述环糊精-帕比司他加合物呈直径在10nm至100nm范围内的纳米颗粒的形式。
26.根据权利要求24至26中任一项所述的人工CSF溶液，其中所述溶液通过或可通过根据权利要求13至19中任一项所定义的方法制备。
27.根据权利要求24至27中任一项所述的人工CSF溶液，其中所述环糊精-帕比司他加合物是2-羟丙基-β-环糊精-帕比司他。
28.根据权利要求24至28中任一项所述的人工CSF溶液，其中所述溶液基本上不含二甲基亚砜(DMSO)。
29.根据权利要求24至29中任一项所述的人工CSF溶液，其中所述溶液基本上不含任何有机溶剂。
30.根据权利要求24至30中任一项所述的人工CSF溶液，其中以mM计的离子浓度如下：Na+为150；K+为3.0；Ca2+为1.4；Mg2+为0.8；PO4 -为1.0；以及Cl-为155。
31.一种对流增强型递送(CED)导管，其包含根据权利要求24至31中任一项所述的人工CSF溶液。
32.一种根据权利要求24至31中任一项所定义的人工脑脊液(CSF)溶液，其用于治疗哺乳动物受试者的脑肿瘤的方法中。
33.根据权利要求33所述使用的溶液，其中所述脑肿瘤包括胶质瘤。
34.根据权利要求34所述使用的溶液，其中所述胶质瘤包括弥漫性内生性脑桥胶质瘤(DIPG)。
35.根据权利要求33至35中任一项所述使用的溶液，其中所述治疗方法包括通过对流增强型递送(CED)将所述人工CSF溶液施用于所述哺乳动物受试者的所述脑部。
36.一种治疗哺乳动物受试者的脑肿瘤的方法，其包括向有需要的哺乳动物受试者施用治疗有效量的根据权利要求24至31中任一项所定义的人工脑脊液(CSF)溶液。
37.根据权利要求37所述的方法，其中所述脑肿瘤包括胶质瘤。
38.根据权利要求38所述的方法，其中所述胶质瘤包括弥漫性内生性脑桥胶质瘤(DIPG)。
39.根据权利要求37至39中任一项所述的方法，其中所述方法包括通过对流增强型递送(CED)将所述人工CSF溶液施用于所述哺乳动物受试者的所述脑部。
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