CN109265397A - 一种窿缘桉内生真菌次生代谢产物的快速分离方法及用途 - Google Patents

一种窿缘桉内生真菌次生代谢产物的快速分离方法及用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种窿缘桉内生真菌次生代谢产物的快速分离方法及用途，该方法包含：(1)将从窿缘桉内分离的内生真菌Lophiostoma sp.采用大米培养基进行固体发酵；(2)将发酵产物用甲醇冷浸提取，浓缩后水混悬，而后用石油醚萃取，减压浓缩得到石油醚层粗提物；(3)利用减压柱层析、葡聚糖凝胶柱层析和高效液相色谱对石油醚层粗提物进行分离和纯化，快速得到化合物A和化合物B。本发明的方法对窿缘桉内生真菌进行了固体发酵、快速分离和纯化，得到其次生代谢产物，为窿缘桉内生真菌及次生代谢产物的综合开发和利用提供了重要的理论依据。

Description

一种窿缘桉内生真菌次生代谢产物的快速分离方法及用途
技术领域
本发明涉及一种内生真菌的次生代谢产物的快速分离方法，具体涉及一种窿缘桉内生真菌次生代谢产物的快速分离方法及用途。
背景技术
窿缘桉(Eucalyptus exserta F.Muell)又名小叶桉、风吹柳，是较早从澳大利亚引入我国的桉树树种之一，在广东、海南和广西等地广泛栽种。窿缘桉除作为重要经济用材林之外，其叶片在民间可作为中草药，具有降压消炎的作用，其树皮的甲醇提取物具有杀虫作用。
随着桉树大面积种植，病害发生的范围和程度也随之增加。灰腐病、青枯病、焦枯病、溃疡病以及根腐病的发生对桉树的栽培产生了巨大损失。如目前危害最为严重的青枯病，会导致桉树叶片失水萎蔫，病部变褐坏死，根系变黑腐烂，严重时导致整株枯萎死亡，对于林业生产造成严重的经济损失。目前，对于桉树病害防治的主要方法是使用化学农药，然而化学农药的持续大量使用对环境中非靶标有益生物产生巨大危害，严重破坏了生态系统环境的结构和功能，同时带来了严重的环境污染，导致土壤特别是耕地地力的基础生产能力下降；部分易残留，毒性高的传统药剂也成为影响人畜健康及微生物群落的重要因素。
植物内生真菌(Endophyticfungi)是指那些在其生活史中的部分时期或全部时期生活于健康植物的组织或器官内部的真菌。植物内生真菌种类繁多，是微生物中一个庞大的类群。内生真菌与宿主植物一般为互利共生的关系，植物内生真菌能产生多种次生代谢产物来促进植物生长发育、提高宿主植物抗性，是处理各个产业中日益严重的微生物多重耐药性的问题绿色途径，而且这些天然来源的生物活性物质副作用小，成本效益高。因此，有望利用生防菌、菌根以及基因工程技术进行桉树病害的生物防治技术，但目前尚未取得深入的研究结果。
2016年冯皓从窿缘桉中分离出了8株内生真菌(冯皓，桉树内生真菌及其次生代谢产物生物活性研究，2016年)，Eef-B1、Eef-B2、Eef-B4、Eef-B5、Eef-B8、Eef-B9、Eef-B14、Eef-B17分离自窿缘桉枝条，2株内生真菌Eef-S1和Eef-S10分离自窿缘桉种子，经鉴定内生真菌Eef-B14菌落为Lophiostoma sp.。目前，对桉树内生真菌研究较少，且在窿缘桉中首次发现Lophiostoma sp.，尚未有对窿缘桉中Lophiostoma sp.的次生代谢产物的研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种窿缘桉内生真菌次生代谢产物的快速分离方法及用途，该方法解决了现有技术对桉树内生真菌及次生代谢产物研究较少的问题，为窿缘桉内生真菌及次生代谢产物的综合开发和利用提供了重要的理论依据。
为了达到上述目的，本发明提供了一种窿缘桉内生真菌次生代谢产物的快速分离方法，该方法包含：
(1)将从窿缘桉内分离的内生真菌Lophiostoma sp.采用大米固体培养基进行固体发酵；
(2)将发酵产物用甲醇冷浸提取，浓缩后水混悬，而后用石油醚萃取，减压浓缩得到石油醚层粗提物；
(3)利用减压柱层析、葡聚糖凝胶柱层析和高效液相色谱对石油醚层粗提物进行分离和纯化，快速得到化合物A和化合物B，所述化合物A和化合物B分别具有如下式(Ⅰ)和(Ⅱ)结构：
优选地，在步骤(1)中，所述固体发酵采用大米固体培养基。
优选地，所述固体发酵的过程为：将内生真菌Lophiostoma sp.的菌丝接种到PDA培养基平板上活化培养，然后挑取菌饼接种到含有PDB培养基的容器中，在25℃，150rpm条件下培养，取带有Lophiostoma sp.菌丝球的发酵液转接到已灭菌的大米培养基上，在25℃条件下培养90天。
优选地，在步骤(2)中，将发酵产物用甲醇在室温下冷浸提取，过滤，浓缩后水混悬，用石油醚萃取3次，浓缩得到石油醚层粗提物。
优选地，在步骤(3)中，将所述的石油醚层粗提物，采用丙酮溶解，60～100目硅胶拌样，200～300目硅胶装柱，石油醚-丙酮梯度洗脱，石油醚-丙酮的体积比依次为1000：0、1000：1、1000：3、1000：10、1000：15、1000：25、1000：30、1000：50、1000：70、1000：100、1000：200、1000：300、1000：500，通过薄层层析合并相同的馏分，而后经过Sephadex LH-20凝胶柱层析，采用体积比为1:1的氯仿：甲醇作为洗脱液，将流出液经过半制备高效液相色谱得到化合物A。
优选地，所述半制备高效液相色谱的条件为：甲醇：水＝70:30，流速：5mL/min，λ＝237nm，进样体积：2mL。
优选地，在步骤(3)中，将所述的石油醚层粗提物，采用丙酮溶解，60～100目硅胶拌样，200～300目硅胶装柱，石油醚-丙酮梯度洗脱，石油醚-丙酮的体积比依次为1000：0、1000：1、1000：3、1000：10、1000：15、1000：25、1000：30、1000：50、1000：70、1000：100、1000：200、1000：300、1000：500，通过薄层层析合并相同的馏分，而后经过Sephadex LH-20凝胶柱层析，采用体积比为1:1的氯仿：甲醇作为洗脱液，将流出液经过半制备高效液相色谱得到化合物B。
其中，所述高效液相色谱的条件为：甲醇：水＝70：30，流速：5mL/min，λ＝237nm，进样体积：2mL。
本发明还提供了一种窿缘桉内生真菌次生代谢产物的用途，该次生代谢产物包含：具有式(Ⅱ)所示结构的化合物B：
所述的化合物B具有抗细菌活性。
优选地，所述的化合物B用于抗黄瓜角斑病菌、桉树青枯病菌、溶血葡萄球菌、番茄疮痂菌和大肠杆菌。
本发明的窿缘桉内生真菌次生代谢产物的快速分离方法及用途，解决了现有技术对桉树内生真菌及次生代谢产物研究较少的问题，具有以下优点：
本发明的方法对窿缘桉内生真菌进行了固体发酵、分离和纯化，首次从内生真菌Lophiostoma sp.中得到次生代谢产物化合物A和B，且化合物B具有较好的抑菌作用，对番茄疮痂菌和大肠杆菌均具有很好的抑制作用，为窿缘桉内生真菌及次生代谢产物的综合开发和利用提供了重要的理论依据。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实验材料：
LB固体培养基(Luria-BertaniAgar)：氯化钠5g、酵母膏5g、蛋白胨10g、琼脂15g、水1L；
LB液体培养基(Luria-Bertani Broth)：氯化钠5g、酵母浸膏5g、蛋白胨10g、水1L；
PDA培养基(Potato DextroseAgar)：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15g、水1L；
PDB培养基(Potato Dextrose Broth)：马铃薯200g、葡萄糖20g、水1L；
大米培养基(Rice Medium)：大米30g、水35mL。
实验例1内生真菌Lophiostoma sp.次生代谢产物粗提物的制备
从冻存管中挑取少许内生真菌Lophiostoma sp.(内生真菌Lophiostoma sp.采用2016年冯皓论文“桉树内生真菌及其次生代谢产物生物活性研究”中的方法获得)的菌丝接种到PDA培养基平板上活化培养7d，然后挑取直径5mm的菌饼接种到500mL装有200mL PDB培养基的三角瓶中，在25℃，150rpm条件下培养6d后，取带有2～3个带Lophiostoma sp.菌丝球的发酵液转接到盛有30g已灭菌的大米的250mL菌种瓶中，共接种200瓶。
在25℃条件下培养90d后，将发酵好的培养物加入适量甲醇，室温下冷浸提取3次，每次7天。使用四层纱布过滤后，减压浓缩得到甲醇提取物。
将甲醇提取物水混悬，用等体积的石油醚萃取3次，然后合并萃取液，减压浓缩得到石油醚层粗提物，后将粗提物转入4℃冰箱中储存备用。
实验例2次生代谢产物的分离和纯化
(1)石油醚层粗提物的分离和纯化
称取石油醚层粗提物20.03g，丙酮溶解后用24.04g的60～100目硅胶拌样，待溶剂挥发至干，称取200～300目硅胶200.00g一次性装柱(80mm×300mm)，将柱内硅胶掂实，保持硅胶界面成水平状态。将拌好的样品均匀的缓缓加到硅胶柱上，始终保持界面水平。然后在样品平面上平铺2～3cm 200～300目的硅胶，掂平后在上方再添加一层脱脂棉，并在脱脂棉上纱布包裹小石块，防止洗脱剂在添加和冲洗过程中将界面破坏。
柱子装好后，用石油醚-丙酮梯度洗脱，石油醚-丙酮的体积比依次为1000：0、1000：1、1000：3、1000：10、1000：15、1000：25、1000：30、1000：50、1000：70、1000：100、1000：200、1000：300、1000：500，收集流出液，每个馏分500mL，通过薄层层析合并相同的馏分，得到12个馏分，标记为Fr.1～Fr.12。
(2)各流出液的分离纯化
以上各馏分(Fr.)反复通过葡聚糖凝胶LH-20柱层析，半制备高效液相色谱后，得到化合物A和化合物B，化合物A和化合物B分别具有如下式(Ⅰ)和(Ⅱ)结构：
(2.1)化合物A的具体分离纯化过程如下：
称取125mg的Fr.9，经过Sephadex LH-20(氯仿：甲醇＝1:1，v/v)凝胶柱层析，得到Fr.9-1～Fr.9-4四个组分。
其中，79mg的Fr.9-2经过半制备HPLC(甲醇：水＝70:30，流速：5mL/min，λ＝237nm，进样体积：2mL)，得到化合物A(6.3mg)。
(2.2)化合物B的具体分离纯化过程如下：
称取122mg的Fr.11，经过Sephadex LH-20(氯仿：甲醇＝1:1，v/v)凝胶柱层析，得到Fr.11-1～Fr.11-4四个组分。其中，Fr.11-2(16mg)经过高效液相色谱(甲醇：水＝70：30，流速：5mL/min，λ＝237nm，进样体积：2mL)得到化合物B(5.2mg)。
实验例3单体化合物结构鉴定
通过1H-NMR、13C-NMR、COSY、HMBC、HSQC、HR-ESI-MS等光谱数据，对化合物A和B的结构进行鉴定。
(1)化合物A的鉴定
化合物A为浅黄色粉末，通过HR-ESI-MS(m/z 268.061917[M-H]-，C15H10NO4)，得到分子式C15H11NO4，Ω＝11。
化合物A的核磁共振数据为1H NMR(600MHz,CDCl3)δ12.76(s,1H),9.41(s,1H),7.86(s,1H),7.34(d,J＝2.5Hz,1H),6.74(d,J＝2.5Hz,1H),3.94(s,3H),2.77(s,3H)；13CNMR(151MHz,CDCl3)δ186.31,182.42,166.58,166.01,165.69,149.20,138.74,134.61,124.28,118.67,110.56,108.34,107.53,56.28,25.43。
根据核磁共振氢谱与碳谱，确定化合物的主要基团，进而结合COSY谱、HSQC谱和HMBC谱图确定化合物的结构并进一步验证。
1H NMR信号(δ2.77，3H)和13C NMR信号(δ25.43)表明其结构中含有一个甲基；1HNMR信号(δ3.94，3H)和13C NMR信号(δ56.28)和表明其结构中含有一个与甲氧基；1H NMR信号(δ12.76)表明化合物中含有一个活泼氢，说明含有-OH或-CHO。
1H NMR信号与13C NMR信号表明化合物含有芳环结构；13C NMR信号(δ166.58,166.01,165.69)则是连接其他官能团或取代基导致芳环碳向低场移动的结果；COSY谱图中1H NMR的两处信号(δ7.34,6.74)有明显W的相关，证明其中两个芳环氢在芳环中的位置是间位相邻；1HNMR信号(δ9.41)与信号(δ7.86,2.77)两处有相关，且与信号(δ2.77)相关更大，表明另外两个芳环氢之间有甲基基团的存在。
HSQC谱的信号证实了甲基、甲氧基和苯环的存在，1H NMR信号(δ12.76)并没有对应的碳原子信号，表明此处的活泼氢是-OH而不是-CHO。
13C NMR信号(δ186.31,182.42)在低场，在HSQC谱中未发现相关的氢，初步确定为羰基碳，然后再分析HMBC谱，1H NMR信号(δ2.77)与13C NMR信号(δ165.69,118.67)有明显的相关，且信号十分强烈，证实此处为甲基上的H-15与环上的C-4、C-3有相关。
用类似的方法，检验其他的氢原子与碳原子的相关性，确定了化合物A的结构。
(2)化合物B的鉴定
化合物B为黄色针状结晶，通过HR-ESI-MS(m/z 284.092445[M+H]+，C16H14NO4；306.074175[M+Na]+，C16H13NNaO4)，得到分子式C16H13NO4，Ω＝11。
化合物B的核磁共振数据为1H NMR(600MHz,CDCl3)δ9.40(s,1H),7.80(s,1H),7.42(d,J＝2.4Hz,1H),6.83(d,J＝2.4Hz,1H),4.01(s,3H),3.99(s,3H),2.74(s,3H),2.61(s,19H)；13C NMR(151MHz,CDCl3)δ183.64,180.61,165.14,164.26,162.94,149.89,137.70,137.16,125.62,117.57,115.87,105.64,103.74,56.75,56.19,25.17。
1H NMR信号和13C NMR信号表明其结构中含有一个甲基，含有两个甲氧基；化合物B的核磁共振谱图与化合物A的谱图数据相似，断定两个化合物具有相同的骨架。
根据1H NMR信号与13C NMR信号表明化合物含有芳环结构；13C NMR信号表明化合物同样含有两个羰基碳。
结合COSY谱和HSQC谱，确定化合物的结构，并借助HMBC谱图进一步进行验证。由于化合物B与化合物A骨架相同，对于相似信号不再赘述，COSY谱图中1H NMR的信号(δ6.83)与两处信号(δ4.01,3.99)有明显相关，证明其中一个芳环氢在在两个甲氧基之间；HSQC谱的信号也证实了两个甲氧基的存在。使用HMBC谱图进行验证，1H NMR信号(δ4.01,3.99)与13CNMR信号(δ165.14,164.26,105.74,56.49,56.75)有明显的相关性证实此为两个甲氧基为间位。
实验例4抗细菌活性的测定
采用多孔板-MTT显色法测定化合物A和B对细菌的半抑制浓度(IC50)，具体过程如下：
(1)样品溶液配制：
精密称取1mg的样品(化合物A、B)溶于0.3mL的丙酮中，再加入0.7mL的蒸馏水，配成1mg/mL的母液，然后用30％的丙酮依次稀释成系列浓度，浓度范围为1000μg/mL至7.8125μg/mL。
(2)阳性对照溶液配制：
阳性对照为硫酸链霉素，精密称取2.0mg的硫酸链霉素，加入0.7mL的蒸馏水，完全溶解后再加入0.3mL的丙酮，混匀，配成浓度为2000μg/mL的母液，而后用30％的丙酮依次稀释成浓度为1000、750、500、250、125、62.5、31.25、15.625μg/mL的阳性对照溶液。
(3)测定过程：
使用LB平板在28℃暗环境下活化培养供试细菌48h，然后挑取供试细菌的单菌落，在LB液体培养基中28℃暗环境150rpm培养9～12h，将菌液浓度稀释到106cfu/mL(OD620＝1.0)备用。供试细菌为：根癌土壤杆菌(A.tumefacines)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、大肠杆菌(E.coli)、黄瓜角斑病菌(P.lachrymans)、桉树青枯病菌(R.solanacearum)、溶血葡萄球菌(S.haemolyticus)或番茄疮痂病菌(X.vesicatoria)。
在洁净无菌的96微孔板中加入90μL浓度为106cfu/mL的供试菌液，然后加入不同浓度的测试样品溶液10μL。其中，阳性对照为不同浓度的硫酸链霉素溶液。同时，设空白对照(H2O)和溶剂对照(30％丙酮)，每个处理3个重复。
用封口膜将96微孔板四周封口，在28℃暗环境15rpm振荡培养24h，然后向每孔中加入10μLMTT溶液(5mg/mL)，继续培养4h后，1500g离心20min后吸出上清，每孔加入DMSO150μL，15rpm振荡30min，Formazane溶解后每孔取100μL转移到新的洁净的96微孔板上，于510nm下测定吸光值。
MTT能与活细胞体内的线粒体脱氢酶反应，淡黄色的MTT被还原成蓝紫色的化合物Formazane，而死亡的细胞不能将MTT转化为Formazane，Formazane不溶于水，可溶于多种有机溶剂，向多孔板反应体系中加入MTT产生蓝紫色沉淀后，离心去上清后，使用有机溶剂将Formazane溶解，通过多孔板分光光度计通过测定吸光值反映活细胞的数量和活力水平，间接反映化合物对供试菌细胞的抑制作用。
按下面公式计算待测样品对供试细菌的抑制率(％)：
所得数据采用Origin软件进行作图分析，供试样品浓度取对数(X)，抑制率换算成机率值(Y)，初步求得抑菌活性回归方程(Y＝aX+b)和IC50，如表1所示，为各化合物对供试细菌的抑菌结果表。
表1各化合物对供试细菌的抑菌结果表
注：“-”表示IC50值大于200μg/mL。
综上所述，本发明的窿缘桉内生真菌次生代谢产物的快速分离方法为窿缘桉内生真菌及次生代谢产物的综合开发和利用提供了重要的理论依据。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

Claims (9)

1.一种窿缘桉内生真菌次生代谢产物的快速分离方法，其特征在于，该方法包含：
(1)将从窿缘桉内分离的内生真菌Lophiostoma sp.采用大米固体培养基进行固体发酵；
(2)将发酵产物用甲醇冷浸提取，浓缩后水混悬，而后用石油醚萃取，减压浓缩得到石油醚层粗提物；
(3)利用减压柱层析、葡聚糖凝胶柱层析和高效液相色谱对石油醚层粗提物进行分离和纯化，快速得到化合物A和化合物B，所述化合物A和化合物B分别具有如下式(Ⅰ)和(Ⅱ)结构：
2.根据权利要求1所述的窿缘桉内生真菌次生代谢产物的快速分离方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述固体发酵采用大米固体培养基。
3.根据权利要求2所述的窿缘桉内生真菌次生代谢产物的快速分离方法，其特征在于，所述固体发酵的过程为：将内生真菌Lophiostoma sp.的菌丝接种到PDA培养基平板上活化培养，然后挑取菌饼接种到含有PDB培养基的容器中，在25℃，150rpm条件下培养，取带有Lophiostoma sp.菌丝球的发酵液转接到已灭菌的大米培养基上，在25℃条件下培养90天。
4.根据权利要求1所述的窿缘桉内生真菌次生代谢产物的快速分离方法，其特征在于，在步骤(2)中，将发酵产物用甲醇在室温下冷浸提取，过滤，浓缩后水混悬，用石油醚萃取3次，浓缩得到石油醚层粗提物。
5.根据权利要求1所述的窿缘桉内生真菌次生代谢产物的快速分离方法，其特征在于，在步骤(3)中，将所述的石油醚层粗提物，采用丙酮溶解，60～100目硅胶拌样，200～300目硅胶装柱，石油醚-丙酮梯度洗脱，石油醚-丙酮的体积比依次为1000：0、1000：1、1000：3、1000：10、1000：15、1000：25、1000：30、1000：50、1000：70、1000：100、1000：200、1000：300、1000：500，通过薄层层析合并相同的馏分，而后经过Sephadex LH-20凝胶柱层析，采用体积比为1:1的氯仿：甲醇作为洗脱液，将流出液经过半制备高效液相色谱得到化合物A。
6.根据权利要求5所述的窿缘桉内生真菌次生代谢产物的快速分离方法，其特征在于，所述半制备高效液相色谱的条件为：甲醇：水＝70:30，流速：5mL/min，λ＝237nm，进样体积：2mL。
7.根据权利要求1所述的窿缘桉内生真菌次生代谢产物的快速分离方法，其特征在于，在步骤(3)中，将所述的石油醚层粗提物，采用丙酮溶解，60～100目硅胶拌样，200～300目硅胶装柱，石油醚-丙酮梯度洗脱，石油醚-丙酮的体积比依次为1000：0、1000：1、1000：3、1000：10、1000：15、1000：25、1000：30、1000：50、1000：70、1000：100、1000：200、1000：300、1000：500，通过薄层层析合并相同的馏分，而后经过Sephadex LH-20凝胶柱层析，采用体积比为1:1的氯仿：甲醇作为洗脱液，将流出液经过半制备高效液相色谱得到化合物B；
其中，所述高效液相色谱的条件为：甲醇：水＝70：30，流速：5mL/min，λ＝237nm，进样体积：2mL。
8.一种窿缘桉内生真菌次生代谢产物的用途，其特征在于，该次生代谢产物包含：具有式(Ⅱ)所示结构的化合物B：
所述的化合物B具有抗细菌活性。
9.根据权利要求8所述的窿缘桉内生真菌次生代谢产物的用途，其特征在于，所述的化合物B用于抗黄瓜角斑病菌、桉树青枯病菌、溶血葡萄球菌、番茄疮痂菌和大肠杆菌。
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