CN109254095A

CN109254095A - 一种用于检测农副产品中棉酚含量的超高效液相色谱串联质谱检测方法

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Publication number: CN109254095A
Application number: CN201811226227.2A
Authority: CN
Inventors: 李凌慧; 魏月; 马晶军; 杨舒妍
Original assignee: Hebei Agricultural University
Current assignee: Hebei Agricultural University
Priority date: 2018-10-22
Filing date: 2018-10-22
Publication date: 2019-01-22

Abstract

本发明公开了一种农副产品中棉酚的悬浮固化分散液相微萃取‑超高效液相色谱串联质谱检测方法。本发明采用优化后的悬浮固化分散液相微萃取作为前处理方法提取农副产品中的棉酚，取得较高的加标回收率，然后采用超高效液相色谱串联质谱技术检测棉酚含量。方法简单、绿色、高效，可定性定量，可为食品安全监测提供科学的技术手段。

Description

一种用于检测农副产品中棉酚含量的超高效液相色谱串联质谱检测方法

技术领域

本发明涉及食品检测领域，具体涉及一种超高效液相色谱串联质谱检测方法，用于检测农副产品中棉酚的含量。

背景技术

棉酚，相对分子质量为518.54，是一种不溶于水，易溶于甲醇、丙酮、乙腈等有机溶剂中的天然萘系衍生物，广泛存在于棉籽中[1]。因其具有两个醛基六个酚羟基而具有较高的活性^[2]。自然界中，棉酚存在两种形式^[3]，一种是游离棉酚，此种形式具有毒性，大量存在于压榨提取棉籽油的副产品中，该种副产品以棉籽粕为主，其中富含丰富的蛋白质，是质优廉价的动物饲料蛋白质的主要来源；另一种是当游离棉酚与氨基酸、小肽等分子结合后形成的不具毒性的结合棉酚，也是棉酚在医学、药学、生物燃料等领域发挥重要作用的物质^[4]。棉酚衍生物不仅可以作为抗肿瘤药物，还具有改善糖尿病、抗生育、抗氧化活性、抗肿瘤、抗癌等医用价值^[5-9]。畜禽饲料中添加脱除棉酚不完全或未经脱棉酚的棉籽粕，导致棉酚以游离棉酚的形式存在于畜禽饲料中，棉籽粕作为质优价廉的动物饲料蛋白源之一^[10-11]，被畜禽大量摄入时，会使畜禽出现食欲减退、呼吸困难、受精率下降等症状^[12]，再通过食物链的作用，蓄积在肉、蛋、奶等食物中，间接威胁人类健康。因此，为保证我国农副产品的食用安全，建立快速、高效、准确的检测农副产品中棉酚含量的方法至关重要。

近年来，研究学者大多检测棉籽、棉籽油和动物肝脏等农副产品中的棉酚，通过与国外研究对比发现中国学者检测农副产品中棉酚的研究较多。实验室内提取棉酚的主要方法有间苯三酚法^[13]、有机溶剂浸提法^[14]、酸性溶剂萃取法^[15]以及超声提取法^[16]等，这些前处理方法有机溶剂用量大，方法检出限较高，而且在提取过程中，因棉酚易见光分解，导致痕量棉酚的检测方法受到限制。因此，试验拟采用悬浮固化分散液相微萃取的提取方法联合超高效液相色谱串联质谱技术（UPLC-MS/MS），实现对农副产品中痕量棉酚准确、高效地测定。

发明内容

本发明克服了上述现有技术的不足，提供了一种农副产品中棉酚的悬浮固化分散液相微萃取-超高效液相色谱串联质谱检测方法。本发明采用优化后的悬浮固化分散液相微萃取作为前处理方法提取农副产品中的棉酚，取得较高的加标回收率，然后采用超高效液相色谱串联质谱技术检测棉酚含量。方法简单、绿色、高效，可定性定量，可为食品安全监测提供科学的技术手段。

本发明的的技术方案为：其特征是，包括以下步骤：

1）样品前处理

准确称取样品后，加入水、分散剂（100）低温超声，再加入萃取剂（100）低温超声提取、离心、冰水浴取出固化液滴后乙腈溶解定容。

具体步骤如下：准确称取棉籽油样品1.00 g（准确称取蛋清蛋黄搅拌均匀的鸡蛋混合液0.20 g，准确称取牛奶1.00 g）于50 mL具塞刻度离心管中，加入100 μL乙腈后加纯净水至5 mL刻度处，剧烈震荡2 min，低温超声5 min，取上清液至10 mL离心管中，再加入100 μL正十二烷醇剧烈震荡2 min，低温超声提取30 min后离心5 min（4000 r/min），冰水浴5 min取出固化液滴，乙腈溶解后用0.22 μm有机微孔滤膜过滤，乙腈定容1 mL。

2）定性定量分析

得到的待测液采用超高效液相色谱串联质谱技术进行定性定量分析。

所述超高效液相色谱仪器参数条件如下：

色谱条件：对色谱柱、柱温、流动相、流动相梯度、流速等条件进行优化，确定最佳的LC条件。Agilent ZORBAX C18色谱柱（1.8 μm，2.1 mm×50 mm），柱温保持在25 ℃，流动相为0.1%甲酸水溶液（A）︰乙腈（B），等度洗脱泵A︰泵B=25︰75，流速为0.1 mL/min，进样量为2 μL，压力值为400 V。

质谱条件：电喷雾电离源（ESI），负离子扫描，锥孔电压40 V，毛细管电压4 kV，脱溶剂气温度350 ℃，脱溶剂气流量11 L/min。采用多反应监测扫描模式（MRM），选择m/z517.2为定量离子，m/z 231.1和m/z 471.1为定性离子；脱溶温度250 ℃，脱溶剂气流量120L/min；扫描时间0.2 s。

进一步的，本发明采用标准曲线Y =1.47×105X－1.88×106对棉籽油、鸡蛋、牛奶这三种农副产品中棉酚进行定量。

本发明的有益效果是：

(1)优化的前处理方法具有富集效果，前处理过程中加入分散剂的目的是使萃取剂迅速分散成无数小液滴，与样品溶液中目标物大面积混合，剧烈振荡和超声辅助可使待测物进入萃取剂，实现高效萃取和富集。富集倍数（EF）公式为：EF = C _f /C ₀，其中C _f为富集后萃取剂中待测物浓度；C ₀为样品溶液中待测物初始浓度。经计算，试验中棉酚的富集倍数为7倍，与该方法应用于检测水样中有毒有害物质相比，富集倍数低^[29]，可能由于萃取剂体积较大或食品基质复杂，导致富集倍数较小。

(2)本发明采用Agilent Technologies 1260 Infinty超高效液相色谱系统以及Agilent ZORBAX C₁₈色谱柱同时对超高效液相色谱-质谱检测参数（如流动相、定性离子对、定量离子对）进行优化，提高了分离效率，缩短了样品分析周期（保留时间2.3分钟）单个样品检测时间4分钟，适合于农副产品中棉酚的快速分析。该方法的加标回收率在78.25%~95.19%之间，方法的检出限（LOD）低至0.05 μg/kg，定量限（LOQ）为0.167 μg/kg，相关系数为0.999 960，RSD均小于12.00%。方法简单、绿色、高效、选择性好。

附图说明

图1为在相同试验条件下不同萃取剂及萃取剂体积的加标回收率；

图2为相同试验条件下不同分散剂及分散剂体积的加标回收率；

图3为相同试验条件下不同超声萃取时间的加标回收率；

图4为标准溶液总离子流图；

图5为典型阳性样品总离子流图。

具体实施方式

实施例1：

1实验部分

1.1仪器与试剂

超高效液相色谱仪（Agilent Technologies 1260 Infinty）、三重四级杆质谱仪（配电喷雾电离源（ESI））、C18反向色谱柱（1.8 μm，2.1 mm×50 mm）（美国安捷伦公司）；台式离心机（800 CENTRIFUGE）、超声波清洗器（JP3-120）、电子天平（FA1004N）（中国上海佐技机电设备公司）。

甲醇、甲酸、无水乙醇、乙腈、丙酮（色谱纯）、正十二烷醇、正十一烷醇（优级纯，均购于北京伯努利科技有限公司）；娃哈哈纯净水（购于河北省保定市屈臣氏超市）；棉酚标准品（纯度＞98%，购于北京普天同创生物科技有限公司）。

1.2色谱质谱条件

Agilent ZORBAX C18色谱柱（1.8 μm，2.1 mm×50 mm），柱温保持在25 ℃，流动相为0.1%甲酸水溶液（A）︰乙腈（B），等度洗脱泵A︰泵B=25︰75，流速为0.1 mL/min，进样量为2 μL，压力值为400 V。

电喷雾电离源（ESI），负离子扫描，锥孔电压40 V，毛细管电压4 kV，脱溶剂气温度350 ℃，脱溶剂气流量11 L/min。采用多反应监测扫描模式（MRM），选择m/z 517.2为定量离子，m/z 231.1和m/z 471.1为定性离子；脱溶温度250 ℃，脱溶剂气流量120 L/min；扫描时间0.2 s。

1.3标准溶液配制及标准曲线

准确称量5.000 mg棉酚标准品溶解在5.0 mL乙腈中，得到1.0 mg/mL标准贮备液。准确吸取1.0 mg/mL棉酚标准储备液依次进行梯度稀释，得到0.1，0.5，1，5和10 μg/mL五个浓度的标准溶液。各标准溶液用乙腈定容于棕色容量瓶，并储存于4 ℃冰箱中。用UPLC-MS/MS进样2μL测定，获得棉酚的标准曲线和线性相关系数。

1.4样品的采集

试验样品的来源分别是：棉籽油1，河北省保定市农贸市场；棉籽油2，河北省保定市某小型榨油作坊；棉籽油3，河北省保定市大型超市；棉籽油4，新疆某集市；鸡蛋1，河北省保定市农贸市场；鸡蛋2，用棉籽粕做饲料的养鸡散户；鸡蛋3，河北省保定市大型超市；鸡蛋4，河北省保定市某养鸡场；牛奶1，河北省保定市农贸市场；牛奶2，用棉籽粕做饲料的养奶牛散户（生牛乳）；牛奶3，河北省保定市大型超市；牛奶4，河北省保定市大型奶牛场。

2结果与讨论

2.1前处理方法的优化

GB 5009.148—2014“植物性食品中游离棉酚的测定”中给出了棉籽油中棉酚的提取方法：5 mL丙酮振荡提取24 h，4 000 r/min离心5 min。由于该标准中给出的前处理方法使用有机溶剂量较大，可能会对环境造成污染，为实现高效、绿色的试验目的，试验优化了棉酚的提取方法：将悬浮固化分散液相微萃取技术成功应用到农副产品中棉酚的提取。悬浮固化分散液相微萃取技术利用分散剂将待测物分散均匀，以便于充分与萃取剂结合，萃取剂密度小于水，且熔点低，冰水浴时形成凝固小液滴，利于分析检测。该方法适合分析不溶于水或难溶于水的目标物。由于食品基质较为复杂，悬浮固化分散液相微萃取技术在食品检测领域的应用受到限制，相关报道较少。

2.1.1萃取剂及其体积的选择

选择合适的萃取剂是优化前处理方法的关键。萃取剂既能溶解目标物，又能溶于水的有机溶剂，且溶解目标物的能力强于分散剂，密度小于水，且熔点接近室温。试验利用控制变量法，比较正十一烷醇和正十二烷醇的萃取能力。结果表明正十二烷醇的萃取效率更高（图1），试验中优化萃取剂的体积，分别检测了萃取剂体积为40，60，80，100和120 μL时的回收率，发现萃取剂体积为100 μL时的回收率最高。

2.1.2分散剂及其体积的选择

分散剂可以增加棉酚与水接触的面积，许多有机溶剂都可以作为分散剂。试验选取无水乙醇、甲醇、丙酮、乙腈作为分散剂，根据控制变量法进行试验。结果如图2所示，乙腈效果最优，棉酚具有一定的极性，溶解于乙腈，可能由于棉酚的极性与乙腈更相似，所以分散效果更好。同萃取剂优化体积方法，分散剂的最佳提取体积为100 μL。

2.1.3萃取时间的影响

棉酚的化学性质不稳定，长时间超声提取可能会导致棉酚分解，提取率下降，若提取时间较短，又会因样品基质复杂而干扰痕量棉酚的提取，因此试验优化选取10，20，30，40和50min作为变量，在其他试验条件相同的情况下，提取棉酚的回收率结果见图3。结果表明，30min的提取效果最佳。此外，试验在提取棉酚的过程中采用避光超声的方式，最大限度地降低棉酚因见光分解而影响回收率的可能性。

2.1.4富集倍数

前处理过程中加入分散剂的目的是使萃取剂迅速分散成无数小液滴，与样品溶液中目标物大面积混合，剧烈振荡和超声辅助可使待测物进入萃取剂，实现高效萃取和富集。富集倍数（EF）公式为：EF = C _f /C ₀，其中C _f为富集后萃取剂中待测物浓度；C ₀为样品溶液中待测物初始浓度。经计算，试验中棉酚的富集倍数为7倍，与该方法应用于检测水样中有毒有害物质相比，富集倍数低^[29]，可能由于萃取剂体积较大或食品基质复杂，导致富集倍数较小。

根据上述优化选择结果，最终的前处理方法为：准确称取棉籽油样品1.00 g（准确称取蛋清蛋黄搅拌均匀的鸡蛋混合液0.20 g，准确称取牛奶1.00 g）于50 mL具塞刻度离心管中，加入100 μL乙腈后加纯净水至5 mL刻度处，剧烈震荡2 min，低温超声5 min，取上清液至10 mL离心管中，再加入100 μL正十二烷醇剧烈震荡2 min，低温超声提取30 min后离心5 min（4000 r/min），冰水浴5 min取出固化液滴，乙腈溶解后用0.22 μm有机尼龙膜过滤，乙腈定容1 mL。

2.2 UPLC-MS/MS条件的优化

对痕量棉酚进行准确的定量分析，使用UPLC-MS/MS对样品进行测定，丰富检测棉酚的仪器方法，扩大检测应用范围。棉酚是多羟基化合物，在低pH下会抑制羟基解离，UPLC-MS/MS同样使用乙腈︰0.1%甲酸水溶液=85︰15作为流动相，由于UPLC-MS/MS的色谱柱选用5 cm的C18反向色谱柱（1.8 μm，2.1 mm×50 mm），因此为提高柱效，将流动相的流速降低至0.1mL/min，柱温为25 ℃，进样量为2 μL。这充分体现出UPLC-MS/MS低检出限、高灵敏度的特点。

试验中采用的质谱是三重四级杆质谱，分子进入质谱仪后被打碎，四级杆根据碎片质量和所带电荷不同，使不同碎片到达接收端的时间不同，因而定性物质更准确。质谱条件选用负离子模式，符合棉酚呈弱酸性、易失去质子的特点，并采用电喷雾ESI离子源，有效降低离子干扰。试验还对喷雾电压、碰撞气、离子源温度及碰撞能量等参数进行了优化，优化检测条件后检测棉酚，使定量结果更加准确可靠。

2.3线性关系、检出限和定量限

取棉酚标准液（高浓度组）于LC最佳检测条件下依次测定，得到棉酚的回归方程：Y=1.56×10⁵ X－1.85×10⁶，相关系数R=0.999 412，线性范围为1~20 μg/mL。在空白大豆油中加标准溶液，根据信噪比（S/N）＞3，LC的LOD为1 mg/kg；根据信噪比（S/N）＞10，得到LOQ为3mg/kg。取棉酚标准溶液（低浓度组），在UPLC-MS/MS的最佳检测条件下测定，得到棉酚的线性回归方程：Y =1.47×10⁵ X－1.88×10⁶，相关系数R=0.999 960，线性范围为1~10 μg/mL，方法的LOD为0.05 μg/kg，LOQ为0.167 μg/kg。

2.4方法稳定性和精密度

选用不含棉酚的棉籽油、鸡蛋和牛奶进行空白加标回收试验，棉酚的加标浓度分别为0.2，3和6 mg/kg，重复6次试验，每种样品中棉酚的加标回收率和精密度见表1。加标回收率在78.25%~95.19%之间，可能由于样品基质复杂，低浓度加标水平下的回收率均偏低。样品相对标准偏差均低于12.00%。试验的前处理方法对农副产品中棉酚含量的检测具有良好的稳定性与精密度。

2.5实际样品测定结果

2.5.1前处理方法

根据上述优化选择结果将棉籽油样品1.00 g（准确称取蛋清蛋黄搅拌均匀的鸡蛋混合液0.20 g，准确称取牛奶1.00 g）于50 mL具塞刻度离心管中，加入100 μL乙腈后加纯净水至5 mL刻度处，剧烈震荡2 min，低温超声5 min，取上清液至10 mL离心管中，再加入100 μL正十二烷醇剧烈震荡2 min，低温超声提取30 min后离心5 min（4000 r/min），冰水浴5 min取出固化液滴，乙腈溶解后用0.22 μm有机尼龙膜过滤，乙腈定容1 mL。

2.5.2检测

采用超高效液相色谱-三重四级杆质谱仪对农产品中棉酚含量进行测定。

2.5.3检测结果

选择棉籽油、鸡蛋和牛奶这三种农副产品做实际样品测定，分别采集了4份来源不同的样品进行测定。4份棉籽油分别采集自农贸市场、私人小型榨油作坊、大型超市和新疆地区某集市，小型榨油作坊由于缺乏监管，生产的棉籽油可能存在掺杂劣质棉籽油的问题，测定的鸡蛋和牛奶可能因采集地点不同而具有微小的差别，但按照悬浮固化分散液相微萃取方法制备样品，经UPLC-MS/MS分析，发现只有在小型榨油作坊购买的棉籽油中含有痕量棉酚，但符合国家标准限量^[30]，棉酚含量低于0.02%，其他样品中均未检出棉酚。棉酚标准品和阳性样品的总离子流图见图4和图5，检测结果见表2。结果表明市售的棉籽油、鸡蛋和牛奶中棉酚含量符合国家标准规定，不会对消费者健康构成危害。

Claims

1.一种农副产品中棉酚的悬浮固化分散液相微萃取-超高效液相色谱串联质谱检测方法，其特征是，包括以下步骤：

1）样品前处理

准确称取样品后，加入水、分散剂（100 μL）低温超声，再加入萃取剂（100 μL）低温超声提取、离心、冰水浴取出固化液滴后乙腈溶解定容；

2）定性定量分析

2.如权利要求1所述的一种农副产品中棉酚的悬浮固化分散液相微萃取-超高效液相色谱串联质谱检测方法，其特征是，

色谱条件：对色谱柱、柱温、流动相、流动相梯度、流速等条件进行优化，确定最佳的LC条件，Agilent ZORBAX C18色谱柱（1.8 μm，2.1 mm×50 mm），柱温保持在25 ℃，流动相为0.1%甲酸水溶液（A）︰乙腈（B），等度洗脱泵A︰泵B=25︰75，流速为0.1 mL/min，进样量为2 μL，压力值为400 V；

质谱条件：电喷雾电离源（ESI），负离子扫描，锥孔电压40 V，毛细管电压4 kV，脱溶剂气温度350 ℃，脱溶剂气流量11 L/min，采用多反应监测扫描模式（MRM），选择m/z 517.2为定量离子，m/z 231.1和m/z 471.1为定性离子；脱溶温度250 ℃，脱溶剂气流量120 L/min；扫描时间0.2 s。

3.如权利要求1所述的一种农副产品中棉酚的悬浮固化分散液相微萃取-超高效液相色谱串联质谱检测方法，其特征是，所述步骤1）具体为：

准确称取棉籽油样品1.00 g（准确称取蛋清蛋黄搅拌均匀的鸡蛋混合液0.20 g，准确称取牛奶1.00 g）于50 mL具塞刻度离心管中，加入100 μL乙腈后加纯净水至5 mL刻度处，剧烈震荡2 min，低温超声5 min，取上清液至10 mL离心管中，再加入100 μL正十二烷醇剧烈震荡2 min，低温超声提取30 min后离心5 min（4000 r/min），冰水浴5 min取出固化液滴，乙腈溶解后用0.22 μm有机微孔滤膜过滤，乙腈定容1 mL。

4.如权利要求2所述的一种农副产品中棉酚的悬浮固化分散液相微萃取-超高效液相色谱串联质谱检测方法，采用标准曲线Y =1.47×10⁵X－1.88×10⁶对棉籽油中棉酚进行定量。