CN109187999A - 一种用于泌乳素测定试剂盒的磁微粒缓冲液及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种用于泌乳素测定试剂盒的磁微粒缓冲液及其应用。该磁微粒缓冲液是由基础缓冲液、消泡剂和柠檬酸盐组成;其中,在1L基础缓冲液中,消泡剂的加入量按终浓度为0.001%~0.1%v/v加入,柠檬酸盐的加入量按终浓度为0.06~0.5mol/L加入。使用该缓冲液的磁微粒不仅在自然重力条件下分散性好,混匀过程中不易起泡,而且稳定性极好,有效地提高了磁微粒上泌乳素抗体的稳定性。
Description
技术领域
本发明涉及化学发光免疫分析领域,具体涉及一种用于泌乳素测定试剂盒的磁微粒缓冲液及其应用。
背景技术
泌乳素(Human Prolactin,Lactogenic Hormone,PRL)是垂体分泌的一种蛋白质激素,结构上与生长激素(hGH)和胎盘泌乳素(hPL)同属一个蛋白质家族,PRL含199个氨基酸,与hGH和hPL的氨基酸序列分别有26%和27%的同源性。PRL的测定可作为评定下丘脑-垂体功能的一项重要指标,特别是对垂体泌乳素瘤等各种因素引起的高泌乳素血症,以及下丘脑病症的诊断具有特殊重要的价值;并对月经异常和不孕的病因诊断与鉴别有极大的意义。
目前医院测定泌乳素的主流方法是化学发光免疫分析法,化学发光免疫技术经过了几代发展,现以磁微粒化学发光法为主流产品。磁微粒化学发光免疫分析法是指以磁微粒为固相载体,将抗体(或抗原)通过化学键链接到磁微粒上,与待检测物质以及标记了发光物质的抗体(或抗原)发生反应,通过洗涤除去未反应的物质,再利用仪器检测保留下来的结合物的信号,从而实现对待检物质的检测。国内外厂家在此基础上开发出一系列的全自动产品,如Roche公司Cobas系列,Abbott公司Architect系列,Maccura公司IS1200等。
但是,由于免疫磁微粒密度远大于水,在水相保存试剂中往往易出现沉淀及容器表面附着现象。检测过程中,若免疫磁微粒在保存体系中分散不均,经混匀操作又极易产生泡沫而极有可能导致后续测定结果产生明显偏差;因此,需要在磁微粒缓冲液中加入辅助剂,来解决磁微粒的互相聚集、沉降、易于起泡的问题。但是添加针对沉降和起泡的辅助剂往往又影响包被有抗体的磁微粒的稳定性;为了进一步提高抗体的稳定性,还需要添加新的辅助剂,使得磁微粒缓冲液成分复杂,成本偏高,增加风险。
发明内容
为解决上述现有技术问题,本发明提供了一种用于泌乳素测定试剂盒的磁微粒缓冲液及其应用,使用该缓冲液的磁微粒不仅在自然重力条件下分散性好,混匀过程中不易起泡,而且稳定性极好,有效地提高了磁微粒上泌乳素抗体的稳定性。
一种用于泌乳素测定试剂盒的磁微粒缓冲液,该磁微粒缓冲液是由基础缓冲液、消泡剂和柠檬酸盐组成;其中,在1L基础缓冲液中,消泡剂的加入量按终浓度为0.001%~0.1%v/v加入,柠檬酸盐的加入量按终浓度为0.06~0.5mol/L加入。
在一种实施方式中,所述消泡剂为有机硅或聚醚类消泡剂。
在一种优选实施方式中,所述消泡剂的加入量为0.005%~0.02%v/v。
在另一种实施方案中,所述柠檬酸盐为柠檬酸三钠、柠檬酸二钠、柠檬酸三钾或柠檬酸二钾。
在一种优选实施方式中,所述柠檬酸盐的加入量为0.06~0.1mol/L。
在另一种实施方式中,所述基础缓冲液是由缓冲盐、蛋白类物质、糖类物质、表面活性剂、防腐剂和水按比例组成。
在另一种实施方式中,在基础缓冲液中,所述缓冲盐选自磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氯化钠中的一种或多种,加入量为0.2~20g/L;所述蛋白类物质选自BSA、酪蛋白、牛血清、羊血清中的一种或多种,其中BSA、酪蛋白加入量为1~50g/L,牛血清、羊血清加入量为0.1%~5%v/v;所述糖类物质选自甘露醇、海藻糖、葡萄糖、果糖、乳糖、半乳糖或蔗糖,加入量为1~50g/L;所述表面活性剂为非离子表面活性剂,加入量为0.001%~0.1%v/v;所述防腐剂为ProClin系列防腐剂、KroVin系列防腐剂、Kathon或叠氮钠;当防腐剂为ProClin系列防腐剂、KroVin系列防腐剂或Kathon时,加入量为0.05%~1%v/v;当防腐剂为叠氮钠时,加入量为0.5~10g/L。
一种用于泌乳素测定试剂盒的磁微粒缓冲液,该磁微粒缓冲液是由基础缓冲液中加入有机硅或聚醚类消泡剂和柠檬酸盐制备而成;其中,所述有机硅或聚醚类消泡剂在磁微粒缓冲液中的终浓度为0.1%~0.001%v/v,所述柠檬酸盐在磁微粒缓冲液中的终浓度为0.06~0.5mol/L;所述基础缓冲液是由0.2~20g/L的缓冲盐、1~50g/L的甘露醇、1~50g/L的BSA、0.001%~0.1%v/v的非离子表面活性剂、0.05%~1%v/v的防腐剂组成,余量为水。
在一种优选实施方案中,所述柠檬酸盐为柠檬酸三钠、柠檬酸二钠、柠檬酸三钾或柠檬酸二钾;所述缓冲盐选自磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氯化钠中的一种或多种;所述防腐剂为ProClin系列防腐剂、KroVin系列防腐剂、Kathon或叠氮钠。
其中,非离子表面活性剂为Tween-20、Tween-80、Span-60、Triton X-45、TritonX-100或Triton X-305;ProClin系列防腐剂包括ProClin50、ProClin150、ProClin200、ProClin300、ProClin950、ProClin5000等;KroVin系列防腐剂包括KroVin 100、KroVin400、KroVin 500、KroVin 750。
上述磁微粒缓冲液应用于泌乳素测定试剂盒。
本发明中,基础缓冲液中的缓冲盐、蛋白类物质、糖类物质、表面活性剂和防腐剂是为了保证整个体系中磁微粒与抗体的稳定。然而仅仅使用基础缓冲液作为本发明包被有泌乳素抗体的磁微粒的缓冲液,该免疫磁微粒存在易于沉降、搅拌易产生气泡的技术缺陷。因此为了克服上述技术问题,本申请经过大量的实验筛选,意外地发现在仅使用基础缓冲液的情况下,添加适量消泡剂和柠檬酸盐,不仅仅解决了磁微粒互相聚集、沉降、易于起泡的问题;选择合适量的基础缓冲液、消泡剂和柠檬酸盐,在三者联合使用下,还可增加免疫磁微粒的热稳定性,尤其是包被泌乳素抗体的磁微粒的热稳定性。
柠檬酸三钠使磁微粒表面形成双电层,起到分散剂的作用,防止磁微粒聚集沉降,但是如果柠檬酸盐加入量过多会造成使用时磁分离不充分导致磁微粒丢失,加入量过少又不能保证磁微粒较好地分散。在加入合适量的柠檬酸盐的前提下,再加入适量的有机硅或聚醚类消泡剂,意外的发现该磁微粒缓冲液不仅仅使磁微粒具有较好的分散性和不起泡的优势,而且还有效地增加了磁微粒上泌乳素抗体的稳定性。而有机硅或聚醚类消泡剂加入量过多,会使多余的消泡剂漂在溶液表面,导致检测结果异常;加入量过少,又起不到消泡作用且热稳定性无法提高。综上,只有在磁微粒缓冲液中消泡剂按终浓度为0.001%~0.1%v/v加入,柠檬酸盐按终浓度为0.06~0.5mol/L加入时,才能使磁微粒不易沉降、不易起泡,并且免疫磁微粒的热稳定性还极好。
与现有技术相比,本发明缓冲液成分简单,使用本发明缓冲液保存的包被有泌乳素抗体的磁微粒在自然重力条件下分散性好,不易沉降,便于仪器取样,保证每一个测试中使用的磁微粒用量相同;在磁微粒混匀过程中不易起泡,或起泡后泡沫很快破裂,避免仪器空探导致的结果异常;此外,本发明使得包被有泌乳素抗体的磁微粒稳定性变好,能保证整体试剂盒的稳定性。
具体实施方式
为了使本领域技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案,下面将结合下面结合实施例对本发明作进一步说明,显然,所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例,都应当属于本申请保护的范围。
下述实施例中,使用的基础缓冲液按照表1配制而成。
表1为配制1L基础缓冲液的配方
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>·12H<sub>2</sub>O | 2.56g/L |
NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O | 0.436g/L |
氯化钠 | 9.00g/L |
甘露醇 | 20.00g/L |
BSA | 10.00g/L |
Triton X-100 | 0.10mL/L |
ProClin300 | 1.00mL/L |
纯化水 | 定容至1L |
实施例1:
一种用于泌乳素测定试剂盒的磁微粒缓冲液,该缓冲液按照表2配制而成。
表2为实施例1的磁微粒缓冲液配方
Antifoam SE-15 | 1mL/L |
柠檬酸三钠 | 0.5mol/L |
基础缓冲液 | 定容至1L |
实施例2:
一种用于泌乳素测定试剂盒的磁微粒缓冲液,该缓冲液按照表3配制而成。
表3为实施例2的磁微粒缓冲液配方
Antifoam SE-15 | 0.1mL/L |
柠檬酸三钠 | 0.06mol/L |
基础缓冲液 | 定容至1L |
实施例3:
一种用于泌乳素测定试剂盒的磁微粒缓冲液,该缓冲液按照表4配制而成。
表4为实施例3的磁微粒缓冲液配方
Antifoam SE-15 | 0.2mL/L |
柠檬酸三钠 | 0.3mol/L |
基础缓冲液 | 定容至1L |
对比实施例1:
一种用于泌乳素测定试剂盒的磁微粒缓冲液,该缓冲液按照表5配制而成。
表5为对比实施例1的磁微粒缓冲液配方
柠檬酸三钠 | 0.3mol/L |
基础缓冲液 | 定容至1L |
对比实施例2:
一种用于泌乳素测定试剂盒的磁微粒缓冲液,该缓冲液按照表6配制而成。
表6为对比实施例2的磁微粒缓冲液配方
Antifoam SE-15 | 0.2mL/L |
基础缓冲液 | 定容至1L |
对比实施例3
一种用于泌乳素测定试剂盒的磁微粒缓冲液,该缓冲液按照表7配制而成。
表7为对比实施例3的磁微粒缓冲液配方
Antifoam SE-15 | 1.2mL/L |
柠檬酸三钠 | 0.3mol/L |
基础缓冲液 | 定容至1L |
对比实施例4
一种用于泌乳素测定试剂盒的磁微粒缓冲液,该缓冲液按照表8配制而成。
表8为对比实施例4的磁微粒缓冲液配方
Antifoam SE-15 | 8μL/L |
柠檬酸三钠 | 0.3mol/L |
基础缓冲液 | 定容至1L |
对比实施例5
一种用于泌乳素测定试剂盒的磁微粒缓冲液,该缓冲液按照表9配制而成。
表9为对比实施例5的磁微粒缓冲液配方
Antifoam SE-15 | 0.2mL/L |
柠檬酸三钠 | 0.6mol/L |
基础缓冲液 | 定容至1L |
对比实施例6
一种用于泌乳素测定试剂盒的磁微粒缓冲液,该缓冲液按照表10配制而成。
表10为对比实施例6的磁微粒缓冲液配方
Antifoam SE-15 | 0.2mL/L |
柠檬酸三钠 | 0.05mol/L |
基础缓冲液 | 定容至1L |
实施例4:
将实施例1~3的缓冲液配制的磁微粒与仅用基础缓冲液配制的磁微粒、对比实施例1~6缓冲液配制的磁微粒对照,进行如下实验。
4.1自然重力下的沉降试验
取包被有泌乳素抗体的磁微粒7mL,分别使用基础缓冲液、实施例1~3、对比实施例3~6的缓冲液洗涤3次,每次待上清完全澄清后再移除上清,再以相应缓冲液重悬,混匀,平分为7份,每份1mL。隔一段时间取100μL上清液用多功能读数仪(Thermo)测定其在550nm处的吸光度值,具体结果如表11和表12所示。
表11为包被有泌乳素抗体的磁微粒在不同缓冲液的自然沉降速率测定
表12为磁微粒实施例3与对比实施例3~6的缓冲液中的自然沉降速率对比
从表11可以看出,包被有泌乳素抗体的磁微粒在基础缓冲液中的自然沉降速率较其在实施例1~3磁微粒缓冲液中快,且在30min时,可以清晰的观察到磁微粒在基础缓冲液中自然沉降30min时,接近液面的上层液已经澄清透明,而在实施例1磁微粒缓冲液中上层液仍是混悬液,没有明显的分层界线。综上,可以认为本申请的磁微粒缓冲液相对于基础缓冲液在自然重力下分散性好,不易沉降。
从表12可以看出,与其他磁微粒缓冲液相比,对比实施例6中加入的柠檬酸盐较少,该磁微粒缓冲液沉降明显更快,且在30min时,可以清晰的观察到对比实施例6磁微粒在自然沉降30min时,接近液面的上层液已经澄清透明,而其他磁微粒缓冲液上层液仍是混悬液。
4.2磁场作用下的磁分离试验
该试验方法基本同自然重力下的沉降试验,只是将平分后的包被有泌乳素抗体的磁微粒置于2800高斯的磁场下,磁分离0s、10s、20s、30s和45s时取100μL磁分离后的上清液,测定其在550nm处的吸光度值,具体结果如表13和表14所示。
表13为包被有泌乳素抗体的磁微粒在不同缓冲液中磁分离速度测定
表14为磁微粒在不同缓冲液中磁分离速度的对比
从表13和表14可以看出,在磁场环境下时,包被有泌乳素抗体的磁微粒在基础缓冲液和实施例1~3的磁微粒缓冲液中的磁分离速率差异不明显,30s时的磁分离率都在92%以上;对比实施例3、4、5在30s时的磁分离率在93%以上,而对比实施例5的缓冲液中柠檬酸盐添加量过大,其磁微粒的磁分离率在90%以下,在清洗过程中容易导致磁微粒丢失。
4.3免疫试验验证
将包被有泌乳素抗体的磁微粒分别分散于基础缓冲液和磁微粒缓冲液中,结合试剂盒其他组分,采用全自动免疫分析化学发光仪测定主校准品和50例临床样本,观察磁微粒缓冲液在免疫试验应用中是否有影响,结果如表15~表17所示。
表15为主校准品的免疫试验验证
表16为临床样本的免疫试验验证
表17为磁微粒用不同缓冲液对临床样本的免疫试验验证
免疫试验结果表明,与基础缓冲液相比,用实施例1~3配制的磁微粒缓冲液不影响免疫反应性;对比实施例3和对比实施例4的磁微粒由于加入过多或过少消泡剂,使用对比实施例3和4缓冲液的磁微粒在免疫测定时,均有样本测定结果偏低的结果,说明消泡剂加入过多或过少均可能会导致测定结果异常。
4.4消泡效果验证实验
对于大包装的化学发光磁微粒试剂,每次测定前均需对磁微粒组份进行混匀,当剩余体积较少时,磁微粒混匀后易产生气泡,导致随后测定过程中出现试剂针空探现象。为解决此类问题,我们以泌乳素免疫磁微粒为例,使用实施例1~3配制的磁微粒缓冲液,以基础缓冲液、对比实施例3~6配制的磁微粒缓冲液作对照,在迈克生物股份有限公司i 3000全自动化学发光免疫分析仪上执行磁微粒混匀程序,5秒内观察起泡比例,结果如表18和表19所示。
表18为缓冲液的起泡比例
表19对比实施例气泡比例比较
从表18中可以看出,与基础缓冲液相比,实施例1~3的磁微粒缓冲液在磁微粒混匀过程中产生起泡的比例明显低于基础缓冲液;
从表19中可以看出,当消泡剂加入量过少时,该磁微粒缓冲液在磁微粒混匀过程中容易起泡,其余均不起泡。
4.5对磁微粒稳定性的影响
将包被有泌乳素抗体的磁微粒分别分散于基础缓冲液和实施例1~3、对比实施例1~2的磁微粒缓冲液中,结合试剂盒其他组分,分别放置在2-8℃和37℃中,7天后取出采用全自动免疫分析化学发光仪测定主校准品,以基础缓冲液为对照,观察实施例1~3、对比实施例1~2的磁微粒缓冲液对免疫磁微粒热稳定的影响,具体结果如表20和表21所示。
表20为磁微粒缓冲液对免疫磁微粒稳定性的影响
表21为不同磁微粒缓冲液对免疫磁微粒稳定性的影响
从表20和21中可以看出,与基础缓冲液相比,用实施例1~3、对比实施例1~2配制的缓冲液均能不同程度的提高免疫磁微粒的热稳定性,但当柠檬酸钠与消泡剂同时存在时,包被有泌乳素抗体的磁微粒热稳定性显著提高;磁微粒缓冲液中消泡剂和柠檬酸盐过多或过少均会使磁微粒稳定性降低,其中对比实施例4、6稳定性下降较多,说明只有消泡剂和柠檬酸盐浓度都合适时试剂稳定性才会提高。
实施例5
针对5种不同项目免疫磁微粒(包被有非泌乳素抗体的磁微粒),使用基础缓冲液和实施例3的缓冲液分别配制免疫磁微粒,并测定稳定性,具体结果如表22和23所示。
表22基础缓冲液磁微粒信号保留率
表23实施例3缓冲液磁微粒信号保留率
从表22和23对比可以看出,使用实施例3的配方配制的5种包被非泌乳素抗体的磁微粒的热稳定性基本无影响,但是对于包被有泌乳素抗体的磁微粒的热稳定性有显著提高的作用。
应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质,因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的,而不是意欲限制本发明的范围,本发明的范围仅受限于所附的权利要求。
本领域的技术人员还将认识到,或者能够确认使用不超过常规实验,在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。
Claims (10)
1.一种用于泌乳素测定试剂盒的磁微粒缓冲液,其特征在于:该磁微粒缓冲液是由基础缓冲液、消泡剂和柠檬酸盐组成;其中,在1L基础缓冲液中,消泡剂的加入量按终浓度为0.001%~0.1%v/v加入,柠檬酸盐的加入量按终浓度为0.06~0.5mol/L加入。
2.根据权利要求1所述的用于泌乳素测定试剂盒的磁微粒缓冲液,其特征在于:所述消泡剂为有机硅或聚醚类消泡剂。
3.根据权利要求1或2所述的用于泌乳素测定试剂盒的磁微粒缓冲液,其特征在于:所述消泡剂的加入量为0.005%~0.02%v/v。
4.根据权利要求1所述的用于泌乳素测定试剂盒的磁微粒缓冲液,其特征在于:所述柠檬酸盐为柠檬酸三钠、柠檬酸二钠、柠檬酸三钾或柠檬酸二钾。
5.根据权利要求1~4任意一项所述的用于泌乳素测定试剂盒的磁微粒缓冲液,其特征在于:所述柠檬酸盐的加入量为0.06~0.1mol/L。
6.根据权利要求1~5任意一项所述用于泌乳素测定试剂盒的磁微粒缓冲液,其特征在于:所述基础缓冲液是由缓冲盐、蛋白类物质、糖类物质、表面活性剂、防腐剂和水按比例组成。
7.根据权利要求6所述的用于泌乳素测定试剂盒的磁微粒缓冲液,其特征在于:在基础缓冲液中,所述缓冲盐选自磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氯化钠中的一种或多种;所述蛋白类物质选自BSA、酪蛋白、牛血清、羊血清中的一种或多种;所述糖类物质选自甘露醇、海藻糖、葡萄糖、果糖、乳糖、半乳糖或蔗糖;所述表面活性剂为非离子表面活性剂;所述防腐剂为ProClin系列防腐剂、KroVin系列防腐剂、Kathon或叠氮钠。
8.一种用于泌乳素测定试剂盒的磁微粒缓冲液,其特征在于:该磁微粒缓冲液是由基础缓冲液中加入有机硅或聚醚类消泡剂和柠檬酸盐制备而成;其中,所述有机硅或聚醚类消泡剂在磁微粒缓冲液中的终浓度为0.1%~0.001%v/v,所述柠檬酸盐在磁微粒缓冲液中的终浓度为0.06~0.5mol/L;所述基础缓冲液是由0.2~20g/L的缓冲盐、1~50g/L的甘露醇、1~50g/L的BSA、0.001%~0.1%v/v的非离子表面活性剂、0.05%~1%v/v的防腐剂组成,余量为水。
9.根据权利要求8所述的用于泌乳素测定试剂盒的磁微粒缓冲液,其特征在于:所述柠檬酸盐为柠檬酸三钠、柠檬酸二钠、柠檬酸三钾或柠檬酸二钾;所述缓冲盐选自磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氯化钠中的一种或多种;所述防腐剂为ProClin系列防腐剂、KroVin系列防腐剂、Kathon或叠氮钠。
10.权利要求1~8任意一项所述的磁微粒缓冲液应用于泌乳素测定试剂盒。
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