CN109180800A - 新型生长激素释放激素类似肽二聚体及其应用 - Google Patents

新型生长激素释放激素类似肽二聚体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种新型生长激素释放激素类似肽二聚体及其应用。所述的生长激素释放激素类似肽二聚体，其氨基酸序列为：(NH2)X1‑ADAIFTNSYR‑X12‑VLGQLSAR‑X21‑LLQDIMS‑‑C32‑C32‑Φ‑SMIDQLL‑X21‑RASLQGLV‑X12‑RYSNTFIADA‑X1(NH2)，所述的为R、RG或RGG；Φ为GGR或GR、R。或(NH2)X1‑ADAIFTNSYR‑X12‑VLGQLSAR‑X21‑LLQDIMSRQQGESNQERGARAR‑‑C46‑C46‑Ω‑RARAGREQNSEGQQRSMIDQLL‑X21‑RASLQGLV‑X12‑RYSNTFIADA‑X1(NH2)，所述的为L、LG或LGG；Ω为GGL或GL、L。本发明的生长激素释放激素类似肽二聚体能够提高体内或体外生长激素释放活性，并具有更长的半衰期，因此具有广泛药理活性，如促进伤口愈合、促进心肌细胞重构、提高睡眠质量、促进生殖细胞的增殖和分化从而治疗不孕不育症、调节免疫、减肥和治疗糖尿病。

Description

新型生长激素释放激素类似肽二聚体及其应用
技术领域：
本发明属于医药生物领域，具体涉及多种人新型生长激素释放激素类似肽二聚体制备及其治疗中的应用。
背景技术：
中枢性生长激素释放激素(GHRH)是一种由下丘脑释放的神经肽激素，它能特异性刺激脑垂体合成和释放生长激素(GH)，生长激素刺激肝脏等器官产生胰岛素样生长因子(IGFs)，调节机体细胞生长。hGHRH在人下丘脑中以三种形式存在：hGHRH(1-44)NH2、hGHRH(1-40)OH和hGHRH(1-37)OH。在hGHRH分子中，具有51％生物活性的短序列hGHRH(1–29)为核心肽。根据hGHRH分子特异作用于垂体产生GH机制，我们设计了通过测定体外垂体GH分泌值来确定新型hGHRH类似肽及其二聚体的体外活性。
新的研究发现，外周组织的hGHRH分子与中枢性GHRH的作用机制有所不同，比如，如卵巢或睾丸，这些外周组织也含有GHRH、GHRH受体和GH分子信号，但是它们不一定因为GHRH分子的刺激产生特异自分泌GH，一些新型外源性GHRH类似肽或其二聚体分子的体内注射会产生生殖细胞GHRH受体上调增加受孕率，而不会促进垂体GH和生殖细胞GH的增加，显示受试动物的生殖与GH没有直接的关系。在体外，这类肽的体外垂体保温会诱导特异垂体GH的分泌。因此，通过测定受试动物体内血GH、体外垂体分泌GH值和用代表性GHRH二聚体测定受试动物的怀孕率，可以明显反应垂体GH、靶细胞GH信号与动物生殖能力和对外源性GHRH的反应特征：即在不影响GH的情况下，这些GHRH肽明显提高受孕率。外周注射发现的这个新药理机制突破了传统中枢性GHRH-GH-IGFs轴，显示这类肽在治疗上有新的可能性。
这类GHRH肽具有广泛药理活性，如促进伤口愈合、促进心肌细胞重构、提高睡眠质量、促进生殖细胞的增殖和分化从而治疗不孕不育症、调节免疫、减肥和治疗糖尿病等。虽然hGHRH类似物在生物医学和农学领域有着巨大的应用潜在，但是它们的短半衰期或低活性限制了它们的应用。
结构-活性关系表明，N-末端1Tyr是hGHRH体内垂体GH释放高活性所必需的，N端序列是活性的主要来源。随着序列向C端延伸，其活性和半衰期都逐渐增加。当GHRH分子的N端两个氨基酸残基被血中氨基二肽酶切除，剩余片段活性降低到原来的千分之一，这就是hGHRH分子降解的根源。天然hGHRH(1-44)OH的半衰期为13分钟，GHRH类似物的C端聚乙二醇化可增加分子稳定性和延长半衰期，但是活性也明显降低。到目前为止，hGHRH(1–44)NH2是这些类似物中活性最强的。
许多蛋白质前体在内质网内需要与长脂肪链结合，增加成熟加工能力，或分布在细胞膜、内质网膜或高尔基体膜等部位的一些蛋白质分子会通过长脂肪酸链锚定到这些膜相系统上，以增加定位能力。
发明内容：
本发明的目的是提供一类用于治疗不孕不育的生长激素释放激素类似肽二聚体。所述的生长激素释放激素类似肽二聚体，其氨基酸序列为：
(NH2)X1-ADAIFTNSYR-X12-VLGQLSAR-X21-LLQDIMS--C32-C32-Φ-SMIDQLL-X21-RASLQGLV-X12-RYSNTFIADA-X1(NH2)，所述的为R、RG或RGG；Φ为GGR或GR、R。
或
(NH2)X1-ADAIFTNSYR-X12-VLGQLSAR-X21-LLQDIMSRQQGESNQERGARAR--C46-C46-Ω-RARAGREQNSEGQQRSMIDQLL-X21-RASLQGLV-X12-RYSNTFIADA-X1(NH2)，所述的为L、LG或LGG；Ω为GGL或GL、L。
上述大写单字母为L-ɑ-氨基酸的缩写或氨基酸取代符号，阿拉伯数字为氨基酸残基排列顺序，NH2代表N末端或者C端酰胺基结构，半胱氨酸残基C32或C46的C末端为-COOH或CONH2；其中X1为Y或P；X12为K、A，或R；X21为具有K侧链ε氨基【γ-Glu(N-α-烷酸基)】修饰，其结构式如式1所示，其中n＝3-22，
或K侧连ε氨基的烷酸基修饰，其中n＝3-22，其结构式如式2所示：
上述氨基酸序列中的大写字母为氨基酸的简写，这属于公知常识。其中NH2代表氨基位于N端或者C端酰胺基结构，OH代表羧基COOH位于C端，这也属于本领域的公知常识。
本发明通过实验发现，所述的生长激素释放激素类似肽二聚体可提高体外或/和体内生长激素释放活性，具体如下：
1.体外生长激素释放活性：S-D雌鼠(体重200±20g)购自广州中医药大学实验动物中心，所有实验动物的护理和使用制度与实验动物指导方针一致。在饲养中，大鼠经过12:12小时明暗交替饲养，饲养温度26±1℃。大鼠经过脱臼猝死，在30分钟摘取脑垂体。用灭菌的lactated Ringer’s buffer(LRB)冲洗后，垂体立即放到内有1ml LRB的1×10cm玻璃管中，37℃保温。所有的玻璃管总保温5h(P1,P2,I3,I4和I5，代表5小时保温的不同时段，每个时段代表1小时)，同时每5min轻轻晃动一次。每1小时后，全部吸出缓冲液进行垂体GH激素测试，同时加入1毫升新鲜的不带有或带有GHRH类似肽的LRB到该垂体中保温。在前2小时(P1和P2)预保温后，随后在第3小时保温(I3、I4和I5)中，开始增加活性多肽。净GH释放水平为(I3+I4+I5)-P2，未加肽的P2做为空白对照和人天然hGHRH(1-44)NH2(S肽)做为阳性对照。大鼠垂体生长激素通过使用Rat Growth Hormone ELISA试剂盒(Millipore Co.,USA)进行测试。
2.体内生长激素释放活性：昆明雌性小鼠(体重18-22g)购自广州中医药大学实验动物中心。所有实验动物的护理和使用制度与动物饲养实验指导方针一致。在饲养中，小鼠经过12:12小时明暗交替饲养，饲养温度26±1℃。小鼠后腿肌肉注射1.92μmol/kg的肽，每种肽三只动物(n＝3),经过1小时，內眦取血,测定血清GH。实验中，注射生理盐水做空白对照和人天然S肽做阳性对照。小鼠GH激素通过使用Rat Growth Hormone ELISA试剂盒(Millipore Co.,USA)进行测试。
3.活性结果汇总：
体外垂体GH释放活性：(1)与标准S肽[人天然hGHRH(1-44)NH2]比较，具有N末端Y或P的GHRH类似肽二聚体显示了至少2倍以上的GH释放活性，N末端Y的GHRH二聚体肽释放GH值明显高过N末端P的GHRH二聚体；(2)虽然具有C末端C或GC，GGC延伸的GHRH二聚体类似肽GH释放值没有统计学差异，但是-GGC延伸显示更高释放值；(3)N末端为Y或P的30-33肽单体形成的二聚体肽的活性仅是45-47肽单体形成的二聚体肽的50％左右。
体内GH释放活性：(1)带有Y1--R12K13--K21{N-ε-[γ-Glu(N-α-烷酸基)]}修饰或烷酸修饰的序列和C末端为COOH的二聚体肽显示了成倍高的GH释放活性；(2)N末端带有P的各种二聚体肽没有显示统计学上增高的GH释放活性；(3)C末端-COHN2的二聚体肽没有显示统计学上增高的GH释放活性；(4)带有K21{N-ε-[γ-Glu(N-α-烷酸基)]}修饰的序列显示了比带有K21[N-ε-(烷酸基)]修饰序列更高的体内或体外GH释放活性。
本发明还通过实验发现，所述的生长激素释放激素类似肽二聚体可比单体肽具有更长的半衰期，或者K21修饰肽比不修饰肽具有更长半衰期，而且修饰的脂肪酸链越长，半衰期越长，具体测试方式如下：
1.半衰期测定方法：因为hGHRH分子N端两个氨基酸残基被血液中氨基二肽酶降解，分子即失去活性，而本研究使用的hGHRH测定试剂盒是通过人GHRH肽N端序列制备的ELISA试剂盒，所以通过测定hGHRH分子的N端序列，可以敏感地测定新型GHRH类似肽二聚体含量。取本研究GHRH肽样品，用6.7μM的磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)溶解成4.6μg/ml，取2微升肽溶液加入2ml人新鲜血浆中(外源GHRH肽在1000pg左右)，37度保温。根据预实验测定的肽半衰期时间范围，不同肽在0-25小时内取样。在接近半衰期时，密集到20分钟取样一次，其它时间1小时取样。每次取样60μl保温血浆，置-20度冰箱保存。
hGHRH测定(详细方法参见厂家说明书)：使用前，将所有试剂和标本均衡至室温(18-25℃)。标准品储备液浓度为1000pg/mL。使用时，用标准品稀释液3倍稀释成5个应用标准1000、333.33、111.11、37.04和12.35pg/mL，标准品稀释液直接作为空白孔。为保证实验结果有效性，每次实验使用新鲜配制的标准品溶液。分别设标准孔、待测样品孔和空白孔。标准孔为5孔，依次加入50μL的不同浓度的标准品，空白孔加50μL标准品稀释液，待测样品孔加入50μL的待测样品。立即每孔加检测溶液A工作液50μL，轻轻振动，混匀，注意不要有气泡，酶标板加上覆膜，37度温育1小时。弃去孔内液体，每孔用350μL洗涤液洗涤，每次洗涤浸泡2分钟，在吸水纸上轻拍酶标板移除孔内所有液体，重复洗板3次。最后一次洗涤后，倒出剩余的洗涤缓冲液，将酶标板倒扣在吸水纸上，将残留在孔内的液体全部吸干。每孔加检测溶液B工作液(临用前配制)100μL，加上覆膜，37度温育30分钟。弃去孔内液体，甩干，洗板5次，方法同前。每孔加底物溶液90μL，酶标板加上覆膜，37度避光显色(反应时间控制在15分钟)。每孔加终止溶液50μL终止反应，此时蓝色立转黄色。确保酶标板底无水滴及孔内无气泡，立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度(OD值)。GHRH测定ELISA试剂盒使用：ELISA-Kit-for-Growth-Hormone-Releasing-Hormone-CEA438Hu(Cloud-Clone Corp.,武汉)。
hGHRH结果计算：以450nm的吸光度为X轴，标准浓度的对数为Y轴，求得y＝ax2+bx+c方程，可精确获得各点的GHRH结果。
半衰期计算：以各点GHRH终浓度为X轴，取样时间为Y轴，求得y＝ax+b可精确获得50％GHRH残留的对应取样小时数，即为半衰期结果。
2.半衰期结果汇总：(1)序列越长，半衰期越长；(2)K21侧链越长的烷酸修饰，半衰期越长；(3)与单体比较，二聚体半衰期明显延长；(4)带有K21{N-ε-[γ-Glu(N-α-烷酸基)]}修饰肽比带有K21[N-ε-(烷酸基)]修饰肽有略长的的半衰期。
本发明通过实验发现，以新型GHRH二聚体肽为代表对其进行不孕不育模型治疗发现：对于雄性模型，与生理盐水组和单纯环磷酰胺对照组比较，二聚体肽组的曲细精管中细胞排列整齐，管中的精母细胞、精原细胞明显增生，曲细精管体积变粗，曲细精管腔变小，甚至消失，生殖细胞GHRH受体表达呈现细胞分化成熟依赖性。对于雌性模型鼠，二聚体肽组各级卵泡均有增加，卵组织间质细胞增加明显。这些说明，本发明的生长激素释放激素类似肽二聚体具有明显刺激精原细胞或卵组织细胞增殖和成熟作用，从而促进生殖，因此能够用于治疗不孕不育的药物。
因此，本发明的第二个目的是提供上述生长激素释放激素类似肽二聚体在制备治疗不孕不育药物、促进伤口愈合、心肌细胞重构、促进睡眠、调节免疫的药物、减肥药物或治疗糖尿病的药物中应用。
本发明的第三个目的是提供一种治疗不孕不育药物，其特征在于，以上述生长激素释放激素类似肽二聚体肽作为活性成份。
本发明的生长激素释放激素类似肽二聚体能够提高体内或体外生长激素释放活性，并具有更长的半衰期，因此具有广泛药理活性，如促进伤口愈合、促进心肌细胞重构、提高睡眠质量、促进生殖细胞的增殖和分化从而治疗不孕不育症、调节免疫、减肥和治疗糖尿病。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：
一、没有侧链修饰或者具有侧链修饰的30-33肽的人生长激素释放激素类似肽的合成：
(一)单体肽合成过程：手工固相多肽合成操作步骤。
1、树脂溶涨：将大王树脂(wang resin，购自天津市南开合成科技有限公司)放入反应锅中，加二氯甲烷(DCM，Dikma Technologies Inc.)15ml/g树脂，振荡30min。SYMPHONY型12通道多肽合成仪(SYMPHONY型号，软件Version.201，Protein Technologies Inc.)。
2、接第一个氨基酸：通过沙芯抽滤除去溶剂，加入3倍摩尔的C端第一个Fmoc-AA氨基酸(所有的Fmoc-氨基酸由苏州天马医药集团精细化学品有限公司提供)，再加入10倍摩尔量的4-二甲氨基吡啶(DMAP)和N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)，最后加入二甲基甲酰胺(DMF)(购自Dikma Technologies Inc.)溶解，振荡30min。用醋酸酐封闭。
3、脱保护：去掉DMF，加20％哌啶-DMF溶液(15ml/g)，5min，过滤去掉溶剂，再加20％哌啶-DMF溶液(15ml/g)，15min。哌啶由国药集团上海化学试剂公司提供。
4、检测：抽掉溶剂。取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮、KCN和苯酚溶液各一滴，105-110℃加热5min，变深蓝色为阳性反应。
5、洗树脂：依次DMF(10ml/g)洗两次，甲醇(10ml/g)洗两次，DMF(10ml/g)洗两次。
6、缩合：根据具体合成条件，以下方法可以在多台合成中单独或混搭使用：
方法a：三倍量的保护氨基酸和三倍量的2-(7-偶氮苯并三氮唑)-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU，苏州天马医药集团精细化学品有限公司)，均用尽量少DMF溶解，加入反应锅中。立刻加入十倍量的N-甲基吗啉(NMM，苏州天马医药集团精细化工有限公司).反应30min，检测呈阴性。
方法b：三倍量的保护氨基酸FMOC-AA和三倍量1-羟基苯并三唑(HOBt，苏州天马医药集团精细化学品有限公司)，均用尽量少DMF溶解，加入反应管，立刻加入三倍量的N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC).反应30min.，检测呈阴性。
7、洗树脂：依次DMF(10ml/g)洗一次，甲醇(10ml/g)洗两次，DMF(10ml/g)洗两次。
8、重复2至6步操作，如表1中氨基酸没有侧链修饰的GHRH肽，或者具有侧链修饰的30-33肽GHRH肽所示，从右到左依次连接相应氨基酸。带有K21修饰的，按照如下9方法合成。
9、合成K21【N-ε-(N-α-烷酸-L-γ-glutamyl)】：称取Dde-Lys(fmoc)-OH 1.6mmol于10ml的离心管中，加入5ml的DCM将其溶解，然后加入1ml的DIEA振荡摇匀1min，待溶液澄清后加入到反应器中，然后将反应器置于30℃的摇床中反应。2小时后，用甲醇溶液封头(甲醇：DIEA:DCM＝1：1：2)半小时，然后用DMF洗涤四次，抽干待用。向反应器中加入适量的20％哌啶溶液(哌啶/DMF＝1:4)，放在脱色摇床上摇晃20min，脱去Fmoc保护基团形成Dde-Lys-OH。脱完保护基后用DMF洗涤四次，然后抽干。
另称取Fmoc-γ-Glu(tbu)-OH 4.8mmol和4.8mmol HOBT于10ml的离心管中，加入5ml的DMF将其溶解，然后加入0.5ml的DIC振荡摇匀1min，待溶液澄清后加入到含有Dde-Lys-OH反应器中，然后将反应器置于30℃的摇床中反应。1小时后，取少量树脂检测，用茚三酮法检测，若树脂有颜色，则缩合不完全，继续反应；若树脂为无色，则反应完全。待反应完全后，用DMF洗涤树脂四次，然后抽干，向反应器中加入适量的20％哌啶(哌啶/DMF＝1:4)，放在脱色摇床上摇晃30min，以脱去Fmoc-γ-glutamyl残基的Fmoc保护基团，脱完保护后用DMF洗涤四次，然后抽干。按照步骤7-8接上烷酸基。
合成K21【N-ε-(N-α-烷酸)】：需要合成K【N-ε-(烷酸)】的，省略加入上述Fmoc-γ-Glu(tbu)-OH一系列反应步骤，在Dde-Lys(fmoc)脱fmoc基团后，直接接上烷酸基。
用含5％乙酸去除序列赖氨酸保护基dde，经过步骤8接上K21修饰残基。
10、将缩合完成的GHRH肽经过DMF(10ml/g)两次，DCM(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次，抽干10min。茚三酮检测阴性。
11、脱除肽链最后N端氨基酸的FMOC保护基，检测呈阳性，溶液抽干备用。
12、按照下列方法洗树脂，依次DMF(10ml/g)两次，甲醇(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次，DCM(10ml/g)两次，10min抽干。
13、从树脂上切割多肽：配制切割液(10毫升/g)：TFA 94.5％(J.T.BakerChemical Company)；水2.5％，ethanedithiol(EDT,Sigma-Aldrich Chemistry)2.5％和triisopropylsilane(TIS,Sigma-Aldrich Chemistry)1％。切割时间：120min。
14、吹干洗涤：将裂解液用氮气尽量吹干，用乙醚洗六次，然后常温挥干。
15、用如下方法HPLC纯化多肽、鉴定和-20度避光保存。
二、具有侧链修饰的45-47肽的人生长激素释放激素类似肽的合成：含有45-47氨基酸残基的GHRH多肽序列中，有X21(K)的侧链【N-ε-(N-α-烷酸-L-γ-glutamyl)】或【N-ε-(烷酸)】修饰的，采用分段合成方法，将序列分成3段合成：片段1：QGESNQERGARAR--C；片段2：QLSAR-K【N-ε-(N-α-烷酸-L-γ-glutamyl)】LLQDIMSRQ；片段3：X1-ADAI-FTNSYR-X12-VLG，X1为Y或P，为LGG或LG,L。
(一)合成K【N-ε-(N-α-烷酸-L-γ-glutamyl)】或K【N-ε-(烷酸)】原料
1、按照上述方法一的内容9，合成K【N-ε-(N-α-烷酸-L-γ-glutamyl)】或K【N-ε-(烷酸)】原料。
2、用切割试剂将修饰基团从树脂上切割下来，保留保护基团，送纯化。
3、通过高效液相色谱仪器(HPLC)将目标修饰基团Dde-Lys【N-ε-(N-α-烷酸基-L-γ-glutamyl)】或Dde-Lys【N-ε-(烷酸基)】纯化至95％以上，并冻干成粉末，中控检测MS，合格后保存备用。
(二)多肽片段的合成
1、合成片段1，根据理论计算值称取1g二氯树脂于150ml的反应器中，用50ml的DCM浸泡。
2、2小时后，用DMF洗涤树脂，然后抽干，如此重复四次，将树脂抽干后待用。
3、称取片段1的C端第一个氨基酸Fmoc-Cys(trt)-OH 0.4mmol于10ml的离心管中，加入5ml的DCM将其溶解，然后加入1ml的DIEA振荡摇匀1min，待溶液澄清后加入到反应器中，然后将反应器置于30℃的摇床中反应。
4、2小时后，用甲醇溶液封头(甲醇：DIEA:DCM＝1：1：2)半小时，然后用DMF洗涤四次，抽干待用。
5、向反应器中加入适量的20％哌啶溶液(哌啶/DMF＝1:4)，放在脱色摇床上摇晃20min，以此来脱去Fmoc保护基团。脱完保护后用DMF洗涤四次，然后抽干。
6、取少量树脂用茚三酮法检测，树脂有颜色，则脱保护成功。
7、称取片段1的C端第二个氨基酸Fmoc-AA-OH 1.2mmol(第一个氨基酸摩尔量的3倍)和1.2mmol HOBT于10ml的离心管中，加入5ml的DMF将其溶解，然后加入0.5ml的DIC振荡摇匀1min，待溶液澄清后加入到反应器中，然后将反应器置于30℃的摇床中反应。
8、1小时后，取少量树脂检测，用茚三酮法检测，若树脂有颜色，则缩合不完全，继续反应；若树脂为无色，则反应完全。
9、待反应完全后，用DMF洗涤树脂四次，然后抽干，向反应器中加入一定量的20％哌啶(哌啶/DMF＝1:4)，放在脱色摇床上摇晃20min,以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱完保护后用DMF洗涤四次，然后抽干。
10、取少量树脂用茚三酮法检测，树脂有颜色，说明脱保护成功。
11、按照步骤7-10依次接上片段1的剩余氨基酸
12、脱去片段1最后一个氨基酸N端的Fmoc保护。
13、按照步骤1-11合成出片段2。原料和试剂的投料量均为片段1的2倍，其中第10个位点(从右到左)投入制备的原料Dde-Lys【N-ε-(N-α-烷酸基-L-γ-glutamyl)】或Dde-Lys【N-ε-(烷酸基)】，并且dde保护是使用5％的弱酸脱去。
14、将片段2全保护切割(多肽侧链和N端的保护不脱除)，通过高效液相色谱仪器(HPLC)将片段2与杂质分离；将分离出的片段2冻干成粉末
15、称取片段2与1.2mmol HOBT于10ml的离心管中，加入5ml的DMF将其溶解，然后加入0.5ml的DIC振荡摇匀1min，待溶液澄清后投入片段1的合成反应器中，然后将反应器置于30℃的摇床中反应。
16、重复步骤8-10
17、按照步骤13-16，接上片段3
18、用切割试剂将多肽保护基团全部切除，并从树脂上切割下来，送纯化。
三、以上两类肽的检验方法如下：
1、用HPLC纯化多肽：将粗肽用纯水或者加少量乙腈溶解，按照下列条件纯化：
高效液相色谱仪(分析型；软件Class-VP.Sevial System；厂商日本SHIMADZU)和Venusi MRC-ODS C18色谱柱(30x250mm，天津Bonna-Agela Technologies)。流动相A液：0.1％三氟醋酸水溶液，流动相B液：0.1％三氟醋酸-99.9％乙腈溶液(乙腈FisherScientific公司购买)。流速：1.0ml/min，上样体积30μl，检测波长220nm。洗脱程序：0～5min：90％A液+10％B液；5～30min：90％A液/10％B液→20％A液/80％B液。
2、最后将纯化后的溶液上冻干机冻干成粉末(冻干机Freezone Plus 6型号，L
ABCONCO厂商)，既得到成品。
3、鉴定：分别取少量的成品多肽，做HPLC分析的纯度：高效液相色谱仪(厂商日本SHIMADZU)和Venusi MRC-ODS C18色谱柱(4.6x150mm，天津Bonna-Agela Technologies)。流动相A液：0.1％三氟醋酸水溶液，流动相B液：99.9％乙腈-0.1％三氟醋酸溶液，流速：1.0ml/min，上样体积10μl，检测波长220nm。洗脱程序：0～5min：100％A液；5～30min：100％A液→20％A液/80％B液。测定纯度>95％。具体方法参见我们授权专利(中国专利ZL201410612382.3)。
MS的分子量鉴定:取纯度合格的多肽加入水溶解，加入5％乙酸+8％乙腈+87水溶解测试电喷雾离子化质谱测定分子量，具体方法参见我们授权专利(中国专利ZL201410612382.3)。
4、将粉末状的多肽，密封包装，-20度避光保存。
四、二聚体的形成：当C端带有半胱氨酸-COOH的单体肽1mg/ml浓度，在pH＝9.5水溶液中，37℃保温4小时，形成绝大部分二聚体肽，二聚体肽通过Sephadex G-25层析分离获得或者鉴定(在2×60cm G25层析柱和自然流速下，二聚体组分为第一峰，残余单体组分为第二峰)。二聚体肽也可以通过无还原剂-巯基乙醇的特殊的肽PAGE电泳，加以鉴定，具体方法参见我们授权专利(中国专利ZL201410612382.3)。二聚体肽的氨基酸序列如表1所示。
五、肽种类：按照上述方法合成的GHRH二聚体类似肽的氨基酸序列如表1所示，其HPLC纯度>95％，天然人hGHRH(1-44)NH2(S)和2F、2Y肽(在已授权中国专利ZL201410612382.3中详细描述)被用作阳性对照。GHRH类似肽单体以及二聚体由本研究室和部分肽委托商业公司合成，发明人通过HPLC纯度、ESI质谱和和半胱氨酸氧化确认其结构。
实施例2：垂体生长激素释放活性
1、体外生长激素释放活性：S-D雌鼠(体重200±20g)购自广州中医药大学实验动物中心。所有实验动物的护理和使用制度与动物饲养指导方针一致。在饲养中，大鼠经过12:12小时明暗交替饲养，饲养温度26±1℃。大鼠经过脱臼猝死，在30分钟摘取脑垂体。用灭菌的lactated Ringer’s buffer(LRB)冲洗后，垂体立即放到内有1ml LRB的1×10cm玻璃管中，37℃保温。所有的玻璃管总保温5h(P1,P2,I3,I4和I5，代表5小时保温的不同时段，每个时段代表1小时)，同时每5min轻轻晃动一次。每1小时后，全部吸出缓冲液进行垂体GH激素测试，同时加入1毫升新鲜的不带有或带有GHRH类似肽的LRB到该垂体中保温。在前2小时(P1和P2)预保温后，随后在第3小时保温(I3、I4和I5)中，开始增加活性多肽。净GH释放水平为(I3+I4+I5)-P2。未加肽的P2做为空白对照和人天然hGHRH(1-44)NH2(S肽)值做为阳性对照。大鼠垂体激素通过使用Rat Growth Hormone ELISA试剂盒(Millipore Co.,USA)进行测试。
2、体内生长激素释放活性：昆明雌性小鼠(体重18-22g)购自广州中医药大学实验动物中心。所有实验动物的护理和使用制度与动物饲养指导方针一致。在饲养中，小鼠经过12:12小时明暗交替饲养，饲养温度26±1℃。小鼠皮下注射1.92μmol/kg的肽，每种肽三只动物(n＝3),经过1小时，內眦取血,测定血清GH。实验中，注射生理盐水做空白对照和人天然S肽做阳性对照。小鼠GH激素通过使用Rat Growth Hormone ELISA试剂盒(MilliporeCo.,USA)进行测试。
表1：GHRH肽和其二聚体肽的氨基酸序列、GH释放活性和半衰期
注：表中S为天然人hGHRH标准肽；2F和2Y肽为已授权专利的对照肽；7、12或16CAA分别代表含7或12、16碳的烷酸(CAA)；所述K21{N-ε-[γ-Glu(N-α-16CAA)]}、K21{N-ε-[γ-Glu(N-α-12CAA)]}和K21{N-ε-[γ-Glu(N-α-7CAA)]}为K的侧链ε氨基的烷酸谷氨酰修饰，具体结构见式3所示，K21{N-ε-[γ-Glu(N-α-16CAA)]}对应的n＝14、K21{N-ε-[γ-Glu(N-α-12CAA)]}对应的n＝10，K21{N-ε-[γ-Glu(N-α-7CAA)]}对应的n＝5；所述K21{N-ε-[16CAA]}、K21{N-ε-[12CAA]}和K21{N-ε-[7CAA)]}为K的侧链ε氨基的烷酸修饰，具体结构见式4所示，K21{N-ε-[16CAA]}对应的n＝14，K21{N-ε-[12CAA]}对应的n＝10，K21{N-ε-[7CAA)]}对应的n＝5。
式3：赖氨酸K21侧链ε氨基的烷酸谷氨酰修饰(n＝14,10或5)
式4：赖氨酸K21侧链ε氨基的烷酸修饰(n＝14,10或5)
结论：在体外垂体实验中，(1)与标准S肽[人天然hGHRH(1-44)NH2]比较，具有N末端Y或P的GHRH二聚体类似肽显示了至少2倍以上的GH释放活性，N末端Y的GHRH二聚体肽释放GH值明显高过N末端P的GHRH二聚体；(2)虽然具有C末端C或GC，GGC延伸的GHRH类似肽二聚体的GH释放值没有统计学差异，但是-GGC延伸显示更高活性；(3)N末端为Y或P的30-33肽单体形成的二聚体肽的活性仅是45-47肽单体形成的二聚体肽的50％左右。
在体内测试，(1)N末端带有Y1--R12K13-K21(16烷酸修饰)氨基酸组成和C末端为COOH的二聚体肽显示了成倍高的活性；(2)N末端带有P的各种二聚体肽没有显示活性；(3)C末端-COHN2的二聚体肽没有显示活性。
半衰期测试：(1)序列越长，半衰期越长；(2)K侧链越长的烷酸修饰，半衰期越长；(3)与单体比较，二聚体半衰期明显越长；(4)尽管序列略有差异，但是具有相同修饰的相同长度的肽有相似的半衰期。
实施例4：二聚体肽对不孕不育模型的治疗(用表1中的29、38、41和50号肽为代表)
一、不育不孕模型试验方法：取50只中华地鼠雄鼠和50只中华地鼠雌鼠(五周龄，由四川省实验动物中心提供)，按无差异性体重分组【二聚体肽剂量组(表1中的29、38、41和50号肽剂量组)、人促性腺激素hMG组、环磷酰胺对照组和生理盐水组】。每组起始设定n＝10，按20毫克/kg腹腔注射环磷酰胺(江苏恒瑞医药股份有限公司，国药准字H32020857，批号12032925)，每周一次，共五次。在第四周注射环磷酰胺后，根据地鼠体重将老鼠分组并标号，每次给药前根据体重计算给药量，二聚体肽剂量为0.04147μmol/kg，hMG组为200单位/kg，其它使用生理盐水作对照，每天给药一次，直到实验结束。在第6-8周，模型地鼠和正常地鼠异性同笼，此后只给予治疗药物，观察老鼠动情期间的生理变化(精神、活动、分泌物等)和观察老鼠是否怀孕。第十周结束，脱臼杀小鼠，解剖计数怀孕鼠。
怀孕判断：雌性鼠输卵管能看到红色串珠状颗粒；新生鼠：在十周前已经出生。
二、给药方式：环磷酰胺腹腔注射，二聚体肽和hMG肽后腿肌内注射。
三、检测指标：中华地鼠怀孕率统计：与仅给单纯环磷酰胺比较，二聚体肽组出生率有明显增加，有统计学意义，生理盐水组怀孕率100％(表2和3所示)
表2雌鼠模型组怀孕率统计
实验组 n(存活鼠) 怀孕率(％) 出生率(％) 总怀孕率(％)
环磷酰胺组 7 0 0 0
29号二聚体肽 9 33.3 11.1 44.4*
41号二聚体肽 8 37.5 12.5 50*
38号二聚体肽 7 28.6 14.3 42.9*
50号二聚体肽 8 37.5 0 37.5*
hMG 8 37.5 0.0 37.5*
生理盐水 10 10 90 100
*P<0.05，与单纯环磷酰胺组比较，卡方检验。
3.雄鼠模型组怀孕率统计
实验组 n(存活鼠) 怀孕率(％) 出生率(％) 总怀孕率(％)
环磷酰胺组 8 0 0 0
29号二聚体肽 7 28.6 0 28.6*
41号二聚体肽 8 25 0 25*
38号二聚体肽 8 12.5 12.5 25*
50号二聚体肽 9 22.2 0 22.2*
hMG 9 22.2 0.0 22.2*
生埋盐水 10 10 90 100
*P<0.05，与单纯环磷酰胺组比较，卡方检验。

Claims (4)

1.生长激素释放激素类似肽二聚体，其特征在于，氨基酸序列为：
(NH2)X1-ADAIFTNSYR-X12-VLGQLSAR-X21-LLQDIMS--C32-C32-Φ-SMIDQLL-X21-RASLQGLV-X12-RYSNTFIADA-X1(NH2)，所述的为R、RG或RGG；Φ为GGR或GR、R；
或
(NH2)X1-ADAIFTNSYR-X12-VLGQLSAR-X21-LLQDIMSRQQGESNQERGARAR--C46-C46-Ω-RARAGREQNSEGQQRSMIDQLL-X21-RASLQGLV-X12-RYSNTFIADA-X1(NH2)，所述的为L、LG或LGG；Ω为GGL或GL、L；
上述大写单字母为L-ɑ-氨基酸的缩写或氨基酸取代符号，阿拉伯数字为氨基酸残基排列顺序，NH2代表N末端或者C端酰胺基结构，半胱氨酸残基C32或C46的C末端为-COOH或CONH2；其中X1为Y或P；X12为K、A，或R；X21为具有K侧链ε氨基【γ-Glu(N-α-烷酸基)】修饰，其结构式如式1所示，其中n＝3-22，
或K侧连ε氨基的烷酸基修饰，其中n＝3-22，其结构式如式2所示：
2.根据权利要求1所述的生长激素释放激素类似肽二聚体，其特征在于，其为：
(NH2)YADAIFTNSYRKVLGQLSARK21{N-ε-[γ-Glu(N-α-16CAA)]}-LLQDIMSRQQGESNQERGARARLGGC(OH)-(HO)CGGLRARAGREQNSEGQQRSMIDQLLK21{N-ε-[γ-Glu(N-α-16CAA)]}-RASLQGLVKRYSNTFIADAY(NH2)；
或
(NH2)YADAIFTNSYRKVLGQLSARK21{N-ε-[16CAA]}-LLQDIMSRQQGESNQERGARARLGGC(OH)-(HO)CGGLRARAGREQNSEGQQRSMIDQLLK21{N-ε-[16CAA]}-RASLQGLVKRYSNTFIADAY(NH2)；
或
(NH2)PADAIFTNSYRKVLGQLSARK21{N-ε-[γ-Glu(N-α-16CAA)]}-LLQDIMSRQQGESNQERGARARLGGC(OH)-(HO)CGGLRARAGREQNSEGQQRSMIDQLLK21{N-ε-[γ-Glu(N-α-16CAA)]}-RASLQGLVKRYSNTFIADAP(NH2)；
或
(NH2)PADAIFTNSYRKVLGQLSARK21{N-ε-[16CAA]}-LLQDIMSRQQGESNQERGARARLGGC(OH)-(HO)CGGLRARAGREQNSEGQQRSMIDQLLK21{N-ε-[16CAA]}-RASLQGLVKRYSNTFIADAP(NH2)；
所述的K21{N-ε-[γ-Glu(N-α-16CAA)]}的结构如式3所示，其中n＝14：
所述的K21{N-ε-[16CAA]}的结构如式4所示，其中n＝14：
3.权利要求1或2所述的生长激素释放激素类似肽二聚体在制备治疗不孕不育药物、调节免疫的药物、促进伤口愈合、心肌细胞重构、提高睡眠质量、减肥药物或治疗糖尿病的药物中应用。
4.一种治疗不孕不育药物、促进伤口愈合、心肌细胞重构、提高睡眠质量、调节免疫的药物、减肥药物或治疗糖尿病的药物，其特征在于，以权利要求1或2所述的生长激素释放激素类似肽二聚体肽作为活性成份。
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