JPH08501055A

JPH08501055A - 神経ペプチドチロシンの生物学的機能を抑制する新規な分子

Info

Publication number: JPH08501055A
Application number: JP5510467A
Authority: JP
Inventors: ツェン，アルバート; エスイングリス，アダム; セルビィ，リサ; ポッター，エリカ
Original assignee: ガーヴァンインスティチュートオブメディカルリサーチ; ピーオーダブリュエムアールアイリミテッド
Priority date: 1991-12-19
Filing date: 1992-12-21
Publication date: 1996-02-06
Also published as: EP0672054A4; WO1993012139A1; EP0672054A1; CA2126212A1

Abstract

(57)【要約】本発明は神経ペプチドロシン（ＮＰＹ）の生物学的活性を抑制する新規な分子を提供する。本発明の分子は、該分子が結台したＮＰＹはＮＰＹ−Ｙ₁レセプターに結台し得ないような手法でＮＰＹの螺旋鎖のひとつに、少なくとも１００ｎＭの親和力で結台する。本発明の分子はぺプチドが好ましく、Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−ＮＨ₂の配列のペプチドが好ましい。本発明はまた、この分子を含んだ組成物と疾患状態の治療の範囲におけるこれら組成物の使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】神経ぺプチドチロシンの生物学的機能を抑制する新規な分子発明の分野本発明は神経ペプチドチロシン（ＮＰＹ）の生物学的活性を抑制する分子に関する。また、本発明は、活性成分としてこの分子を含む調剤用組成物と、この組成物の投与を含む治療の方法とに関する。発明の背景神経ペプチドチロシン（ＮＰＹ）はタテモト(Tatemoto)らによって１９８２年に豚の脳から最初に単離され、配列決定された（タテモトら，Proc. Natl. Acad . Sci. 79, 5485-5489）。続いて、これは末梢神経から単離されており、ノルアドレナリンと共に局在化した(co-localised)最も交感的な神経節後のニユーロン中に見出される。これは交感神経系における活性が生理学的にあるいは病理学的に上昇したときにヒトの血漿中に高濃度で見出される。生理学的にとは例えば運動中であり（例、モリス(Horris)ら，Clin. Exp. Pharm. Physiol 13 [1986] 43 7-440）、病理学的にとは心筋梗塞の後（ハルティング(Hulting)ら，Cardiovas. Res. 24 [1990] 102-108）、心筋虚血やアンギナの際（アルマン(Ullman)，らJ . Int. Hed. 228 [1990] 583-589）、ある形態の高血圧の際（エドヴィンソン(E dvinsson)ら，Regul Pep. 32 [1991] 279-287）や、クロム親和性細胞腫等の交感神経系の腫瘍中（エイドリアン(Adrian)ら，ランセット(Lancet) ii [1983] 5 40-542）のことである。交感神経中でのそれの広範な存在と、交感神経系活性化に続くそれの放出のため、ＮＰＹは心臓血管系において重要な交感神経伝達物質であると考えられ、ＮＰＹはまた、膵島中の交感神経繊維中でも見出され（エクブラド(Ekblad)ら，フロントホルモン(Front hormone) Res. 12 [1984] 85-90 ）、そしてインシユリン放出を抑制することか示され（モルツ(Holtz)とマクドナルド(McDonald)，ペプチド(Peptides) 6 [1985] 1155-1159）、ある形態の糖尿病におけるＮＰＹの役割を示唆している。ＮＰＹは中枢神経系の多くの領域でも見出され、ある中枢のニユーロンにおけるＮＰＹのレベルの上昇がアルツハイマー病において見出される（アレン(Allen)ら，J. Neurol. Sci 64 [1984] 325-33 1；チャン-パレイ(Chan-Palay), J. C0mp. Neurol. 260 [1987], 201-223）。中枢神経系の別々の領域にＮＰＹを注射することにより、強力な動作及びホルモンの変化が誘発され得る。ある程度詳細に研究された効果としては、視床下部の室傍核にＮＰＹを注射することによる摂食の刺激がある。この様な注射の結果、体重の増加率は６倍上昇し、そして体脂肪は３倍上昇し（スタンレイ(Stanley)，らペプチド，7 [1986] 1189-1192）、このことから、過食症及び肥満症における神経ペプチドＹの役割が示唆された。心臓血管において神経ペプチドＹは、麻酔をかけられたラット中でのノルアドレナリン及びアセチルコリンの放出のシナプス前部抑制と同様に、直接的に及び他の昇圧剤の効果を増加することによって、有効な血管収縮薬活性を有することが示された（ポター・イー(Potter E)ら，調節ペプチド(Regulatory Peptide) ( 1989) 25, 167-177）。ＮＰＹは少なくとも２つのレセプター、Ｙ１及びＹ２、に特異的に結合する（フーレンドルフ・ジェイ(Fuhlendorff J)ら，Proc. Natl. Acad. Sc. (1990) 87: 182-186）。このＹ２レセプターは主にプレジャンクシヨン的に(prejunctionall y)発現することが示唆されており、減衰された心臓迷走神経作用のシナプス前部の効果を仲介するＮＰＹのＣ末端断片（２-３６から２２-３６まで）を必要とする。このＮＰＹ誘発された昇圧応答は、シナプス後部のあるいはＹ１のレセプターによって主に仲介される。ＮＰＹの完全なＮ及びＣ末端は、このＹ１レセプターによって昇圧応答を十分に活性化する必要がある。ＮＰＹ分子は３６のアミノ酸からなり、アミド化されたＣ末端チロシン残渣を有する。これの提案されている構造は、関連する膵臓ポリペプチドの結晶構造に基づくものであり、一方の側の一部としてポリ-プロリン螺旋構造を有し（残基２-８）、その他として両性親媒性のアルフア−螺旋を有する（残基１３-３２）。残基３３-３６はこの螺旋構造にはきっと含まれていないであろう。この２つの螺旋間の疎水性の相互作用は、分子全体の活性３次元構造に主な安定源を与える（ポター・イーら，調節ペプチド (1989) 25, 167-177）。米国特許第5026685号においてブーブリク(Boublik)らは、高投薬量でのフラグメントＮＰＹ１８-３６の血圧を下げる、すなわち血圧降下の作用を記載している。しかし、以来、この作用は反射的な血圧降下を引き起こす求心性の迷走神経繊維を刺激すること（多分、ＮＰＹ１８-３６誘発されたヒスタミン放出による）を仲介とするＮＰＹ１８-３６の間接的効果であることが示された。インビトロの実験では、ＮＰＹ１８-３６は細動脈への直接的効果を全く有しないことが示された（ポターら (1991) J Auto. Nerv. Syst．印刷中，ミチェル(Michel)他，(1990) Am. J. Physiol. 290 E131-139）。ＮＰＹ構造の機能的重要性はシユワルツ(Schwartz)らの最近の報告、”ＮＰＹ及びこれの関連するペプチドの中枢及び末梢の重要性(Central & Peripheral Si gnificance of NPY and its Related Peptides)”Annal N.Y. Acad. Sc Vol 611 (1990) 35-37 によって支持された。彼等は、ヘアビンのループ（残基８-１７）が８-アミノオクタン酸と置換され、２つの側の間のジスルフィド架橋の導入によってこの構造が安定化されるとき、ｃＡＭＰの刺激された形成を刺激する能力と同様に、ＮＰＹ分子がマウスの脳膜への十分な結合親和性を維持することを証明した。この実験により、レセプター表面での正しいプレゼンテーシヨン(prese ntation)に関する、従って生物学的活性に関する、天然のＮＰＹ分子に対するこの２つの螺旋肢部(limbs)の会合の重要性を補強する。しかし、疎水性の結合及び水素結合によって繋がり合っているこの２つの螺旋肢部の挙動を制限するジスルフィド結合は、天然の分子中には存在しない。これらは尿素などの過剰な変性分子の添加によって完全に解離され得る。本発明者等は、２つの螺旋が別々のペプチドとして溶液中に存在すれば、１つの螺旋中のアミノ酸も、第２の螺旋中の鎖の同じ断片（セグメント）と相互作用すると仮説をたてた。ＮＰＹの両端は昇圧応答のために必要であり、正確な３次構造を限定することはレセプターとのドッキングのためにたぶん重要であるので、天然の分子の螺旋領域の１つに対して高い親和性を有する高濃度の合成分子を添加することにより、Ｙ１レセプターの結合アミノ酸の配向を変えるように十分に相互作用が起り、そしてそのように昇圧応答が減少すると考えられる。一般にタンパク質は、アミノ酸配列と生物学的活性のための鎖の正しい折り重ねとの双方に従うので、本発明者等は、原則として、正しい機能的な確認を与えるために必須の構造やそれに類似するものの小さい断片も、活性部位に対するこれらの特異的親和性のため、これらがこのタンパク質の溶液中に過剰に存在する場合、この確認を歪めて活性を抑制するような潜在能力を有すると提案する。例として、合成ペプチドの化学を利用して、本発明者等は、ＮＰＹ分子の残基２２-２７、すなわちＮＰＹ中の両親媒性の螺旋の一部分、に対応するヘキサペプチドアミドＳＡＬＲＨＹ-ＮＨ₂（Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr アミド）を調製した。麻酔をかけられたラットにおける一連の実験において、ＳＡＬＲＨＹ-ＮＨ₂ の投与６０分後の安静時血圧レベルの減少とＮＰＹ誘発された昇圧応答の顕著な抑制とが観察された。ＳＡＬＲＨＹ-ＮＨ₂のこの抑制効果は、心臓迷走神経作用の減衰に関しては顕著な抑制効果が見られないので、シナプス後部又はＹ１レセプターに限られている。インビトロ実験により、ヘキサペプチドはＹ１レセプターでのＮＰＹの結合のためには競合しないことが証明された。さらに、ＳＡＬＲＨＹ-ＮＨ₂は、移入されたＹ１レセプターを発現する哺乳類の細胞中で、細胞内カルシウムの上昇を誘導するＮＰＹの能力を抑制する。発明の要約第１の態様において、本発明は、神経ペプチドＹの螺旋鎖のひとつに、少なくとも４００ｎＭの親和性で結合する分子に存し、その分子の神経ペプチドＹに対する結合は、それに結合した分子を伴うその神経ペプチドＹが、神経ペプチドＹ −Ｙ₁レセプターに結合しないようにされている。本発明の好ましい実施態様にあっては、その分子は線状または環状ペプチドである。本発明のさらに好ましい実施態様にあっては、その線状または環状ペプチドは次の一般式で表される：（Ｘ₁−Ｘ₂−Ｘ₃−Ｘ₄−Ｘ₅−Ｘ₆−Ｘ₇−Ｘ₈−Ｘ₉−Ｘ₁₀）_n ここで、Ｘ₁は、無(null)、Ｃｙｓ、またはＲ₁、Ｘ₂は、無、Ｃｙｓ、Ｒ₁、または、１あるいは２アミノ酸、Ｘ₃は、無、Ｃｙｓ、Ｒ₁、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、または、Ｇｌｙ、Ｘ₄は、Ｃｙｓ、Ｒ₁、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、または、Ｇ１ｙ、Ｘ₅は、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、または、ノルロイシン、Ｘ₆は、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、または、Ｈｉｓ、Ｘ₇は、Ａｒｇ、ＬｙｓあるいはＨｉｓ、または、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌあるいはノルロイシン、Ｘ₈は、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、または、Ａｒｇ、Ｘ₉は、ＮＨ₂、エステル、または、１あるいは２アミノ酸、Ｘ₁₀は、無、ＣｙＳ、またはＲ₂、Ｒ₁は、ＨまたはＲ−ＣＯであり、ここで、ＲはＨ、直鎖、分岐、または環状のＣ２０までのアルキルであり、このアルキルは任意に二重結合を含み、及び／またはハロケン、ニトロ、アミノ、ヒドロキシ、スルホ、ホスホ、またはカルボキシル基（それら自身が置換されていてもよい）で置換されている、またはアラルキルまたはアリルであり、これらは、アルキルについて挙げたように任意に置換され、また、さらにアルキルを含んでいてもよい。さもなくば、Ｒ₁はグリコシル、ヌクレオシル、またはリポイルである。Ｒ₂は、−ＮＲ₁₂Ｒ₁₃であり、ここで、Ｒ₁₂及びＲ₁₃は、各々Ｈ、直鎖、分岐、または環状のアルキル、アラルキル、またはアリルであり、これらは、Ｒ₁に対して定義したように任意に置換されていてもよい。あるいは、Ｒ₁₂及びＲ₁₃は、Ｎ−グリコシル、またはＮ−リポイル、または−ＯＲ₁₄である。ここで、Ｒ₁₄ はＨ、直鎖、分岐、または環状のアルキル、アラルキル、またはアリルであり、これらは、Ｒ₁について定義したように任意に置換されていてもよい。さもなくば、Ｒ₁₄は−Ｏ−グリコシル、または−Ｏ−リポイルである。ただし、Ｘ₂が無、Ｃｙｓ、またはＲ₁であるときは、Ｘ₁は常に無のみであり、Ｘ₃が無、Ｃｙｓ，またはＲ₁であるときは、Ｘ₂は常に無のみであり、Ｘ₄がＣｙｓまたはＲ₁であるときは、Ｘ₃は常に無のみであり、Ｘ₉がＮＨ₂またはエステルであるときは、Ｘ₁₀は常に無のみである。アミノ酸は、ＤあるいはＬ異性体でよいが、一般には、そのペプチドは主としてＬ−アミノ酸からなる。本発明のペプチドは、環状でもよいが、今のところ、そのペプチドは線状であるのが好ましい。本発明の好ましい実施態様にあっては、Ｘ₁は無、Ｘ₂は水素、Ｘ₉はＮＨ₂で、Ｘ₁₀は無である。本発明の好ましい実施態様にあっては、Ｘ₇はＡｒｇ、Ｌｙｓ、またはＨｉｓであり、Ｘ₈はＴｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、またはＨｉｓである。本発明のさらに好ましい実施態様にあっては、Ｘ₃はＳｅｒまたはＴｈｒ、Ｘ₄はＡｌａまたはＧ１ｙ、Ｘ₅はＬｅｕまたはＩｌｅまたはＶａｌ、Ｘ₆はＡｒｇまたはＬｙｓまたはＨｉｓ、Ｘ₇はＨｉｓまたはＡｒｇまたはＬｙｓで、Ｘ₈はＴｙｒである。本発明のさらに好ましい実施態様では、ペプチドは次式で表される：Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−ＮＨ₂ 第２の態様において、本発明は、抗高血圧症治療、心臓血管治療、抗肥満症治療、及び抗糖尿病治療において、または抗サイコチック(psychotic)として使用される組成物に存し、その組成物は、本発明の第１の態様の分子と、製薬上の担体からなる。第３の態様において、本発明は、本発明の第２の態様の組成物を被検者に投与することからなる、被検者の高血圧症、過剰な心臓迷走神経活性、例えば失神、肥満、糖尿病、あるいはアルツハイマー疾患を処理する方法に存する。本発明の分子がペプチドであるとき、そのペプチドの生物学的活性に有害な影響を与えることなく、そのぺプチドに対して多くの修飾を施してもよいことは、当業者に理解されるであろう。これは、挿入、削除、及び置換（例えば、硫酸化、燐酸化、硝酸化、ハロケン化）、保存的あるいは非−保存的（例えば、ω−アミノ酸、デサミノ(desamino)酸）のどちらか、のような種々の変換によって、そのような変換がペプチドの全生物学的活性を実質的に変化させないペプチド配列中で成し遂げられる。保守的置換によって意図された組合せは：Ｇ、Ａ；Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ；Ｄ、Ｅ；Ｎ、Ｑ；Ｓ、Ｔ；Ｋ、Ｒ、Ｈ；Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｈ；及びＰ、Ｎα−アルキルアミノ酸である。ペプチドの全生物学的活性を実質的に変化させることなしに、インビボにおける効力の増進や半減期の延長といった利点を与えるために、ペプチドに種々の基を付加することも可能である。ペプチドという用語は、ペプチド結合置換体(replacement)及び／またはペプチド模擬物（peptide mimetics）、即ち本技術で認められている擬ペプチド（ps eudopeptides）（例えば、２０回欧州ペプチド・シンポジウム会報、G. Jung. E . Bayer 編，pp. 289-336、及びその中の参考文献を参照）、と同様に、塩及び製薬的調合薬及び／または特にデリバリー（delivery）に好適な生活性ペプチドを与える製剤を包含すると理解されるべきである。そのような塩、製剤、アミノ酸置換体、及び擬ペプチド構造は、安定性、フォーミュレーション(formulation )、デリバリー性(deliverability)（例えば、緩慢な放出、プロドラッグ(prodru gs)）を向上させるため、あるいは製造の経済性を改善するために必要でかつ望ましく、それらは、そのペプチドの必要とされる生物学的活性に悪影響を与えない限り許容されうる。置換以外に、血液、組織、及び他の場所でのプロテイナーゼとペプチダーゼによる分解の危険がある間はレセプターに結合しなければならない生活性ペプチドを設計するときに特に関連するペプチド模模擬物体、及び／または類似体構造の３つの特別な形態は特筆されてもよく、以下の例で説明される。第１に、Ｄ−アミノ酸残基構造を導くバックボーンのキラル中心の反転は、特にＮ−末端において、タンパク質加水分解に対する安定性の向上を導くが、有害な活性は導かない。その一例が論文に与えられている。"Tritriated D-ala¹-Peptide T Binding", Smith,C.S. ら，Drug Deveropment Res. 15, pp. 371-379 (1988)．第２に、ＮからＣへの鎖間イミド及びラクタムのような、安定性のための環状構造（Edeら in Smith and Rivier (Eds) "Peptides: Chemistry and Biology", Escom,Leide n (1991), p268-270）、及び時々はレセプター結合もまた、環状類似体の形成により向上される。この一例が、"Confirmationally restricted thymopentin-Iik e compounds", U.S. pat. 4,457,489 (1985), Goldstein, G. らにより与えられている。最後に、置換ペプチド結合への、ケトメチレン、メチルスルフィド、またはレトロインバース(retroinverse)結合の導入、即ち、ＣＯとＮＨモイエティ (moieties)の交換は、安定性と効力の両方を大幅に向上させる。後者の型の一例が、論文に与えられている。"BioIogically active rotroinverso analoguesof thymopentin", sisto A. ら in River, J.E. と Marshall, G.R. (eds.) "Pe ptides) Chemistry, Structure and Biology”,Escom, Leiden (1990), P.722-7 73. 本発明の分子はペプチドであり、そのペプチドは化学的カップリング法（参照として、Wunsch,E.:"Methoden der organischen Chemie", Volume 15, babd 1+2 , Synthese von Peptiden, Thieme Verlag, Stuttgart (1974), と Barrany, G. ; Merrifield, R.B: "The Peptides", eds. E. Gross, J. Meienofer., Volume2 , Chapter 1, pp. 1-284, Academic press (1980)）により、または酵素カップリング法（参照として、Widmer, F., Johansen, J.T., Carlsberg Res. Commun. , Volume 44, pp. 37-46 (1979), と Kullmann, W.: "Enzymatic Peptide Synth esis", CRC Press Inc., Boca Raton, Florida (1987), と Widmer, F., Johans en, J.T. in "Synthetic Peptides in Biology and medicine":, eds., Alitalo , K., Partanen, P., Vatieri, A., PP. 79-86, Elsevier, Amsterdam (1985)）により、または、それがプロセス設計と経済性のために有利であるならば、化学的と酵素的方法の組み合わせによる、周知の原理である各種の方法によって合成可能である。上述されたような一般式において相互的に包含されるものの１つはペプチドのアミノ及びカルボキシ末端の両方で位置決めされたシスティン残基であると思われる。これは、ジ-スルフィド結合の形成によってペプチドのサイリゼーシヨン( cylisation)ができるであろう。本発明のペプチドに対するそのようは変更は、生物学的活性の減少を生じることがなければ、それは本発明の範囲内である。生物学的活性ペプチドの三次元構造と作用は、別な化合物、自然なしかしそのようなペプチドの活性を模擬する同等でないぺプチド的な何らかのものによって模擬することができる。この科学的な分野はグッドマン（Goodman, M (1990).）による評論において要約される。（Synthesis, spectroscopy and computer sim ulations in peptide research. Proc. 11th Amelican Peptide Synposium publ ished in Peptides-Chemistry, Structure and Biology pp 3-29. Ed Rivier,J. E. と Marshall, G.R. Publisher ESCOM.）当業者であれば識別されるように、この出願の開示に組み合わせて、本発明のペプチドのように同様の三次元構造を有するぺプチドと非ペプチド化合物とを生産することは可能であろう。これら”作用的に同等な構造”又は”ペプチド模擬物”は、本発明のペプチドに対して誘起される抗体と反応するであろう。そのような”ペプチド模擬物”は本発明の範囲内に包含される。製薬に関してより詳細には、ボリン（Bolin）らｐ150、ポリンスキー（Polin sky）らｐ287、及びスミス（Smith）らｐ485 in Smith と Rivier (Eds) "ept ides: Chemistry and Biology", Escom, Leiden (1991) において見出すことができる。本発明の詳細な説明本発明の特質は、以下の実施例に関連してここに記載されているその好適な形態によってより明確に理解されるであろう。ペプチド合成：ペプチドは、アップライドバイオシステム（Applied Biosystem (ABI)）のペプチドシンセサイザー４３０Ａ型（Peptide synthesizer Model 430A）によって合成した。Ｔ−ｂｏｃ（ｔ−ブチルオキシカルボニル）化学作用が使用される。ペプチド合成はＰＡｍ−レジン（ＰＡＭ−フェニルアセトアミドメチル）またはＡＢＩにより供されるＭＢＨＡ−レジン（ＭＢＨＡ＝ｐｐ−メチルベンズヒドリルアミノ）上の固相中で行った。ペプチド結合は、ビアシンメトリック無水物カップリング（viasymmetric anhydride coupling）またはＨＯＢ５（１−ヒドロキシベンヅトリアゾール）エステル活性化を経るいずれか一方で形成される。分割：固相からの十分に保護されたペプチドのフッ化水素（ＨＦ）分割はAuspep Pty Ltd，メルボルンにより行った。その樹脂はスカベンジャー（Scavenger）としてのフェノールを１．３ｇ入れた１０ｍｌのＨＦの中で６０分間処理した。ペプチドは水相の中に抽出し（３０％アセトニトリル／水、V/V）、かつスカベンジャーはエーテルで洗浄除去した。その水溶性の抽出物は凍結乾燥して粗生産物を得た。各々のアミノ酸のために選択された側鎖保護基は分割プロセスの間に除去される。精製化：粗合成生産物はＨＰＬＣ（イオン交換と逆相クロマトグラフィーの両方）にかけ、そして目的とするペプチドが示す主要なピークを観測した。純度測定：ペプチドの純度確認と同定のために、精製されたペプチドは、配列決定とアミノ酸分析の両方を行った。アミノ酸分析は、ＨＣｌの気相の加水分解と誘導化（derivatising）試薬としてのＰＩＴＣとを用いるミリポアウォータースピコタグシステム（Millip oreWaters Picotag system）によって慣例的に行った。最終生産物と同様に、ペプチド-レジン、粗ペプチドをチェックした。その手法はしばしばシスティンのために低い図形が与えられ、時としてチロシンの部分的酸化のために流れ状図形が与えられる。全ての他のアミノ酸のための良好な分析は理論値の１０％内の図形が与えられ、そのノイズが高いとき、結果は理論値から１５％まで逸脱することがある。血圧測定ラット成体（200-300g）はペントバルビタールナトリウム塩（Nembutal, Ab bott: 6omg/kg i.p.）で麻酔した。その気管にカニューレを施し、その動物を人工換気とした。その大腿の静脈を試験するペプチドのシナプス前の作用のためにカニューレを挿入した［９］。ペプチドのシナプス前に作用の測定として、我々は収縮期の血圧における増加と、ペプチドの静注に次いで起こる血圧の増加の持続とを用いた。るＮＰＹ効果のラットにおいて得られた結果を示す。アミノ酸配列Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−ＯＨをもつＮＰＹ分子（残基１−５）の異なる領域から得られた配列をもつペプチドの等価投薬は効果が無かった（第１ｃ図と第末端でアセチル化されたＳｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−ＮＨ₂（Ａｃ−ＳＡＬＲＨＹ）は活性であった（第１ｅ図と第１ｆ図、コントロー第１ａ図と第１ｂ図に示す顕著な効果に加え、１４±５ｍｍＨｇ（ラット５匹の平均値士標準偏差；範囲５−３０ｍｍＨｇ）の動物の安静時血圧の減少がペプチドの投与から１時間後に観測された。インビトロでのカルシウム放出実験：ヒトのＮＰＹ−Ｙ１レセプターｃＤＮＡ（Herzog ら，1992, Proc. Natl. Aca d. Sci.U.S.A. 89:5794-5798）発現チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）は負荷媒体（変形ＲＰＭＩ、１０ｍＭＨｅｐｅｓ、１％新生胎児子ウシ血清）に懸濁し、スピンナーフラスコ中、１×１０⁶細胞／ｍｌで、３７℃で２．５時間インキユベートした。細胞は、次いで１μＭのフラ−２−アセトキシメチルエステル（Ｆｕｒａ−２ＡＭ）と３７℃で３０分間処理し、負荷媒体で２回洗浄し、５×１０⁶細胞／ｍｌで再懸濁した。蛍光分光分析の使用直前に、細胞は１０００ｒｐｍでの遠心分離によって捕集し、１ｍＭのスルフィンピラゾンを含んだ変形クレブス緩衝液（１３５ｍＭＮａＣｌ、４．７ｍＭＫＣｌ、１．２ｍＭＭｇＳＯ₄、１．２ｍＭＫＨ₂ＰＯ₄、５ｎＭＮａＨＣＯ₃、１ｍＭＣａＣｌ₂、２．８ｍＭグルコースと１０ｍＭＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．４）中に１×１０⁶細胞／ｍｌで再懸濁した。蛍光の記録は日立蛍光スペクトロメーター（Ｆ４０１０）により３４０ｎｍ（励起）と、５０５ｎｍ（放射）で５ｎｍのスリット幅と２秒間の応答時間とともに１０分間以上行った。細胞内カルシウムレベルは、グリンキイウイクス（Grynkiewicz）ら，1985（J . Biol. Chem. 260:3440-3450）により開示された方程式を用いて定量される。Ｆｕｒａ−２ＡＭ負荷されたＮＰＹ１レセプターが発現したＣＨＯ細胞は、４０μｇ／ｍｌのＳＡＬＲＧＹ−ＮＨ２ヘキサペプチドの添加の後、５ｎＭまたは５０ｎＭのヒト神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）（Auspep）で刺激した。内因性ボンベシンレセプターによるカルシウム誘発の増加は５ｎＭのボンベシン（bombesin）の添加により測定した。その結果は第２図に示され、ＳＡＬＲＨＹペプチドを用いた前処理によってＮＰＹへの続発応答を抑制できることが示された。ＳＡＬＲＨＹぺプチドの作用は、第３図中に示したペプチドＳＡＬＲＨＹ−ＯＨ（４０μ ｇ／ｍｌ）がその応答を抑制しないように、Ｃ−末端でのアミド変異の存在によっている。細胞内カルシウムレベルは５ｎＭＮＰＹ（Ｎ）、５０ｎＭＮＰＹと、５ｎＭボンベシン（Ｂ）（二重測定から）に対する応答において観測された。５ｎＭＮＰＹは４３ｎＭと２２ｎＭのカルシウム増加を刺激し、５０ｎＭＮＰＹは０ｎＭと５ｎＭの増加を刺激し、かつ５ｎＭボンベシンは３０ｎＭと２２ｎＭの増加を刺激した（第３Ａ図）。ＳＡＬＲＨＹ−ＮＨ２（４０μｇ／ｍｌ）での前処理は、５ｎＭＮＰＹ（１５ｎＭと５ｎＭ）、５０ｎＭＮＰＹ（１０ｎｍと９ｎＭ）、及び５ｎＭボンベシン（２７ｎＭと１９ｎＭ）に応答してカルシウムを増加させる結果となり（第３Ｂ図）、一方、ＳＡＬＲＨＹ−ＯＨを用いた前処理は、５ｎＭＮＰＹ（２７ｎＭと２５ｎＭ）、５０ｎＭＮＰＹ（０ｎＭと２９ｎＭ）及びボンベシン（２２ｎＭ）に応答する結果となった（第３Ｃ図）。加えて、ＮＰＹ配列残基１−５のＹＰＳＫＰ−ＯＨ（４０μｇ／ｍｌ）から誘導されたペンタペプチドを用いた前処理もまた、５ｎＭＮＰＹが２５ｎＭカルシウム、５０ｎＭＮＰＹが０ｎＭカルシウム、及び５ｎＭボンベシンが２９ｎＭカルシウム（第３Ｄ図）に続いて応答するように、ＮＰＹへの続発応答を抑制していない。その抑制的効果は、ボンベシンが比較的影響が無いように、ＮＰＹ応答に特有である。上述した実施例から明白なように、本発明は、ＮＰＹ昇圧作用を抑制する新規のぺプチドを合成している。そのヘキサペプチドアミド、ＳＡＬＲＨＹ−ＮＨ２は未変成のＮＰＹ分子の一部である。かかるペプチドは、直ちに合成され、純化され及び特徴付けされる小さな分子である。モノクローナル抗体に類似して、それらは、その活性化に影響するタンパク質／ペプチドのための特有な領域と相互作用することができるが、精製するための調製がより容易である。ペプチドの相互作用は各種知られた非−共有結合の力とすることができ、他の類似したペプチドの多くもまた類似した効果をもつ。本発明のペプチドは、その小さいサイズのために免疫原性とならないであろうことも期待される。本発明によって発展された未変成ペプチド不活性化理論は、生物学的に活性なタンパク質または一般的なポリペプチドに適用して良い。相互作用をもつ陽性な役割を演じるペプチド断片、及びそれらが溶液中で遊離ペプチドの形態であるために完全なものにすることができるならば、負の方向と構造の歪みにおける活性であろう生物学的または酵素的な機能のための重要性は分子内構造の安定化であると思われる。また、この原理は一般的なレセプターに適用させることができることもまた予想され：生物学的に活性な分子との反応のためのレセプタードッキング部位の確認を維持する構造的な役割をはたす鎖の断片は、遊離ペプチド鎖のような溶液中であれば、負の役割をはたすことが期待されるであろう。明白に開示されたような発明の精神又は範囲から逸脱することなく、特有な実施態様において示したような本発明により各種の変更及び／又は変形が形成されるであろうことは当業者においては明らかとなるであろう。本発明の実施態様は、それ故、開示としての全ての関係において考慮されるものであり、それに限定されるものではない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｋ 38/00 ＡＢＮＡＢＵＡＣＮＡＤＰＣ０７Ｋ 5/12 8318−4ＨＡ６１Ｋ 37/02 ＡＣＮＡＤＰＡＡＰＡＡＭ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＳ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＵ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＵＡ，ＵＳ (72)発明者ツェン，アルバートオーストラリア国 2121 ニューサウスウェールズエッピングワイヴァンストリート６ (72)発明者イングリス，アダムエスオーストラリア国 3041 ヴィクトリアストラスモアヒルサイドパレイド 47 (72)発明者セルビィ，リサオーストラリア国 2060 ニューサウスウェールズノースシドニーマクマホンズポイントマンロウストリート２／８ (72)発明者ポッター，エリカオーストラリア国 2031 ニューサウスウェールズランドウィックヘンリーストリート３

Claims

【特許請求の範囲】１．神経ペプチドＹの螺旋鎖のひとつに、少なくとも１００ｎＭの親和力で結合する分子であって、該分子の神経ペプチドＹに対する結合は、それに結号した分子を伴うその神経ペプチドＹが、神経ペプチドＹ−Ｙ₁レセプターに結合しないようにされている上記の分子。２．該分子は線状または環状ペプチドであることを特徴とする請求の範囲第１項記載の分子。３．該線状または環状ペプチドは次の一般式：（Ｘ₁−Ｘ₂−Ｘ₃−Ｘ₄−Ｘ₅−Ｘ₆−Ｘ₇−Ｘ₈−Ｘ₉−Ｘ₁₀）_n ここで、Ｘ₁は、無、Ｃｙｓ、またはＲ₁、Ｘ₂は、無、Ｃｙｓ、Ｒ₁、または、１あるいは２アミノ酸、Ｘ₃は、無、Ｃｙｓ、Ｒ₁、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、またはＧｌｙ、Ｘ₄は、Ｃｙｓ、Ｒ₁、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＡｌａまたはＧｌｙ、Ｘ₅は、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌまたはノルロイシン、Ｘ₆は、Ａｒｇ、ＬｙｓまたはＨｉｓ、Ｘ₇は、Ａｒｇ、ＬｙｓあるいはＨｉｓ、またはＶａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌあるいはノルロイシン、Ｘ₈は、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、ＬｙｓまたはＡｒｇ、Ｘ₉は、ＮＨ₂、エステル、または、１あるいは２アミノ酸、Ｘ₁₀は、無、ＣｙｓまたはＲ₂、Ｒ₁は、ＨまたはＲ−ＣＯであり、ここで、ＲはＨ、直鎖、分岐、または環状のＣ₂₀までのアルキルであり、このアルキルは任意に二重結合を含み、及び／またはハロゲン、ニトロ、アミノ、ヒドロキシ、スルホ、ホスホ、またはカルボキシル基（それら自身が置換されていてもよい）で置換されている、またはアラルキルまたはアリルであり、これらは、アルキルについて挙げたように任意に置換され、また、さらにアルキルを含んでいてもよい、さもなくば、Ｒ₁はグリコシル、ヌクレオシル、またはリポイルである、Ｒ₂は、−ＮＲ₁₂Ｒ₁₃であり、ここで、Ｒ₁₂及びＲ₁₃は、各々ＨＮ直鎖、分岐、または環状のアルキル、アラルキル、またはアリルであり、これらは、Ｒ₁に対して定義したように任意に置換されていてもよい、あるいは、Ｒ₁₂及びＲ₁₃は、Ｎ−グリコシル、またはＮ−リポイル、または−ＯＲ₁₄であり、ここで、Ｒ₁₄ はＨ、直鎖、分岐、または環状のアルキル、アラルキル、またはアリルであり、これらは、Ｒ₁について定義したように任意に置換されていてもよい、さもなくばＲ₁₄は−Ｏ−グリコシル、または−Ｏ−リボイルである、ただし、Ｘ₂が無、Ｃｙｓ、またはＲ₁であるときは、Ｘ₁は常に無のみであり、Ｘ₃が無、Ｃｙｓ，またはＲ₁であるときは、Ｘ₂は常に無のみであり、Ｘ₄がＣｙｓまたはＲ₁であるときは、Ｘ₃は常に無のみであり、Ｘ₉がＮＨ₂またはエステルであるときは、Ｘ₁₀は常に無のみである、で表されることを特徴とする請求の範囲第２項記載の分子。４．該アミノ酸がＬ異性体であることを特徴とする請求の範囲第３項記載の分子。５．該ペプチドが線状であることを特徴とする請求の範囲第３項または第４項記載の分子。６．Ｘ₁は無、Ｘ₂は水素、Ｘ₉はＮＨ₂、及びＸ₁₀は無であることを特徴とする請求の範囲第３項から第５項のうちいずれか１項に記載の分子。７．Ｘ₇はＡｒｇ、Ｌｙｓ、またはＨｉｓであり、Ｘ₈はＴｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、またはＨｉｓであることを特徴とする請求の範囲第３項から第６項のうちいずれか１項に記載の分子。８．Ｘ₃はＳｅｒまたはＴｈｒ、Ｘ₄はＡｌａまたはＧｌｙ、Ｘ₅はＬｅｕまたはＩｌｅまたはＶａｌ、Ｘ₆はＡｒｇまたはＬｙｓまたはＨｉｓ、Ｘ₇はＨｉｓまたはＡｒｇまたはＬｙｓで、Ｘ₈はＴｙｒであることを特徴とする請求の範囲第３項から第７項のうちいずれか１項に記載の分子。９．該分子が式：Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−ＮＨ₂ であるペプチドであることを特徴とする請求の範囲第１項から第８項のうちいずれか１項に記載の分子。１０．抗高血圧症治療、心臓血管治療、抗肥満症治療、及び抗糖尿病治療または抗サイコチックとして使用される組成物であって、請求の範囲第１項から第８項のうちのいずれか１項記載の分子と、製薬上の担体とを備えた組成物。１１．請求の範囲第１０項記載の組成物を被検者に投与することからなる、被検者の高血圧症、過剰な心臓迷走神経活性、肥満、糖尿病、あるいはアルツハイマー疾患の治療方法。