KR20230106616A - 타키키닌 수용체 매개 장애의 치료에 있어서의 화합물 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 타키키닌 수용체 2와 같은 타키키닌 수용체에 의해 매개되는 장애의 치료에서의 화합물 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

타키키닌 수용체 매개 장애의 치료에 있어서의 화합물 및 이의 용도
본 발명은 타키키닌 수용체 2와 같은 타키키닌 수용체에 의해 매개되는 장애의 치료에서의 화합물 및 이의 용도에 관한 것이다.
타키키닌 신경펩티드 수용체 패밀리는 3개의 G 단백질-커플링된 수용체(GPCR): 타키키닌 수용체(Tacr) 1, Tacr2 및 Tacr3(또한 뉴로키닌 수용체 1-3(NK1-3R)이라고도 한다)으로 이루어진다. 타키키닌 수용체에 대한 내인성 리간드는 NK1R에 대해 바람직한 리간드인 신경펩티드 물질 P(SP), NK2R에 대해 바람직한 리간드인 뉴로키닌 A(NKA) 및 NK3R에 대해 바람직한 리간드인 뉴로키닌 B이다. 상기 내인성 리간드 중 어느 것도 그들의 수용체에 대해 특이적이지 않다. 따라서 각 펩티드 리간드는 이의 바람직한 수용체의 효능에 가까운 효능으로 타키키닌 수용체 패밀리의 모든 구성원을 교차-활성화할 수 있다. 활성화 시, 타키키닌 수용체는 Gq에 우선적으로 커플링하여 세포내 이노시톨 트리스포스페이트(IP3) 신호전달 반응을 생성시킨다. 추가로, 모든 수용체는 또한 Gq-활성화 보다 효능이 낮지만 Gs에 커플링하여 cAMP 축적을 유도할 수 있다.
비만, 인슐린 저항성 및 2형 당뇨병은 다요인성 질환이다. 상기 질환들은 모두 상호연결되어 있으며 정확한 병리학적 기전은 알려져 있지 않다.
비만은 에너지 섭취와 에너지 소비(EE) 사이의 불균형으로 인해 발생하는 것으로 널리 받아들여지고 있다. 따라서 무활동을 통한 증가된 고열량 섭취가 비만의 주요 원인으로 여겨진다. 에너지 불균형 외에도, 인슐린 저항성에서 보이는 바와 같은 높은 순환 인슐린 수준은 증가된 인슐린 매개 영양소 저장으로 인해 체중 증가를 증대시키는 것으로 여겨진다.
인슐린 저항성은 신체의 세포가 내분비 호르몬인 인슐린에 적절하게 반응하지 않는 상태이다. 인슐린의 역할은 신체 세포가 글루코스를 에너지 연료로 사용하거나 지방으로서의 저장을 위해 흡수하게 하는 것이다. 이는 인슐린 저항성에 직면했을 때 신체가 혈액 중에 글루코스를 축적하여 혈당 상승(고혈당증)으로 이어지게 될 가능성이 더 높다는 것을 의미한다. 결과적으로 신체는 고혈당증에 대처하기 위해 더 많은 인슐린을 생성하므로 인슐린 저항성이 있는 개인은 종종 건강한 개인에 비해 더 많은 인슐린을 생성한다.
당뇨병은 신체의 인슐린 생성 세포가 혈당 조절을 위해 인슐린 수요를 충족시키지 못하는 질환이다. 일반적으로 당뇨병은 세 가지 상이한 유형으로 계층화될 수 있다: 임신 중에 발생하는 당뇨병인 임신성 당뇨병. 베타 세포가 파괴되고 개인이 인슐린을 생성할 수 없는 자가면역 질환인 1형 당뇨병. 당뇨병의 가장 흔한 형태이며 진행성 베타 세포 손실과 인슐린 저항성에 의해 발생하는 2형 당뇨병. 2형 당뇨병의 베타 세포 손실은 인슐린 요구 증가로 인한 베타 세포 고갈과, 상승된 혈당 및 순환 지방산의 결과로 인한 세포 손상의 조합으로 인해 발생하는 것으로 여겨진다.
비만, 인슐린 저항성 및 당뇨병의 상호연결성으로 인해, 에너지 소비를 표적으로 하는 치료, 즉 B/BAT 활성화에 의한 치료는 상기 세 가지 모두를 치료할 수 있는 잠재력이 있다. 따라서 증가된 에너지 소비는 에너지 저장량을 감소시킴으로써 비만을 치료하고, 공복 혈당 감소를 통해 인슐린 저항성을 치료하며, 공복 혈당 자체를 감소시켜 당뇨병을 치료하고, 감소된 인슐린 요구를 통해 베타-세포를 고갈로부터 보호할 잠재력이 있다.
갈색 및 베이지색 지방 조직(B/BAT)은 저온 노출에 의해 생리학적으로 자극되어 혈액으로부터 글루코스 및 트리글리세라이드-유래된 지방산을 상당히 소비하고 에너지 소비를 증가시킬 수 있다. 고전적으로, 갈색 및 베이지색 지방 조직은 Gs-커플링된 베타-아드레날린성 GPCR의 자극시 활성화되어, 지방분해, 말초로부터 글루코스 및 지질 흡수, 및 커플링되지 않은 단백질 1의 활성화에 의한 미토콘드리아내 전자 수송 쇄의 커플링해제를 활성화하는 세포내 cAMP 반응을 유도한다. 활성화된 갈색 및 베이지색 지방 조직에 의한 지질 및 글루코스의 흡수는 임의의 다른 조직보다 우수하므로 이러한 조직의 활성화는 비만, 인슐린 저항성 및 당뇨병에 대한 치료법 개발에 매력적이다.
인간에서 B/BAT를 활성화하려는 현재의 시도는 베타-아드레날린성/cAMP 경로에 초점을 맞추고 있다. 이 경로는 실제로 상당한 EE를 유도할 수 있지만 심박수, 혈압 및 혈당(고혈당증)과 같은 원치 않는 부작용이 동시에 증가하는 것으로 입증되었다.
B/BAT 활성화 외에, NK2R 및 리간드 NKA는 내장 평활근에서 NK2R을 활성화하고 결장 및 방광의 수축을 자극할 수 있다. NK2R 활성화의 수축 활성은 래트, 개, 돼지 및 인간을 포함한 종 전체에 걸쳐 보존된다.
마우스, 래트, 개 및 마카크에서의 여러 연구는 NK2R 효능제가 평활근 세포에 위치한 NK2R을 활성화하여 용량-의존적인 평활근 수축을 유발하는 위장 및 방광 운동촉진제임을 보여주었다. NK1R 교차 활성화에 의해 유발되는 흔한 부작용으로 구토 및 저혈압이 있으며, 상기 치료법에서 부작용을 감소시키는 NK2R 특이적 효능제의 개발이 요구된다.
본 발명자는 타키키닌/뉴로키닌 수용체 2(NK2R)를 표적으로 하는 일련의 화합물을 개발하였다. NK2R은, 타키키닌/뉴로키닌 수용체 1 및 3(NK1R 및 NK3R)을 또한 함유하는 타키키닌 G-단백질 결합 수용체(GPCR) 패밀리의 한 구성원이다. NK2R의 내인성 리간드는 뉴로키닌 A(NKA)인 반면, 물질 P와 뉴로키닌 B는 각각 NK1R과 NK3R의 내인성 리간드이다. NKA는 주로 장크롬친화성 세포에서 생성되는, 10개 아미노산의 국소 작용 신경펩티드이며, 평활근 수축을 활성화시키는 것으로 공지되어 있다. NK2R은 Gq-단백질에 우선적으로 커플링하지만 Gs와 G베타-감마 및 베타-아레스틴을 또한 모집할 수도 있다. 주요 Tacr2 mRNA 발현 기관은 부신(마우스) 및 위장관(인간 및 마우스)이다.
본 발명자는 NK2R 매개 장애, 예를 들어 비만, 기능장애성 배뇨(dysfunctional voiding), 당뇨병, 예를 들어 II형 당뇨병, 및 당뇨병-관련된 장애로 이루어진 그룹 중에서 선택된 NK2R 매개 장애의 치료를 위한 에너지 소비의 활성제로서 NK2R의 화학적으로 안정한 효능제의 합성을 제공한다.
첫 번째 태양에서, 하기 화학식 I에 따른 화합물을 제공한다:
[화학식 I]
(A)-(B)
여기서;
(A)는 화학식 X1X2X3X4X5X6X7의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드이고, 여기서
X1은 아스파트산(D) 및 글루탐산(E)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
X2는 리신(K), 아르기닌(R) 및 히스티딘(H)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
X3은 티로신(Y), 페닐알라닌(F), 메타-티로신(m-Y), 발린(V), 트립토판(W), 메티오닌(M), 류신(L), 이소류신(I) 및 알라닌(A)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
X4는 발린(V), 쓰레오닌(T), 세린(S), 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 글리신(G) 및 알라닌(A)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
X5는 글리신(G), 2-아미노이소부티르산(Aib), 세린(S), 알라닌(A), 발린(V), 류신(L), 베타-알라닌(bA) 및 이소류신(I)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
X6은 류신(L), 이소류신(I) 알라닌(A) 및 N-메틸 류신(Me-Leu)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
X7은 노르류신(Nle), 메톡시닌(Mox), 메티오닌(M), 4-플루오로페닐알라닌(4fF) 및 4-메톡시페닐알라닌(4MeOF)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
(B)는 하기 일반식 II의 공액화 모이어티(conjugated moiety)이고:
[화학식 II]
Fa-Lg
여기서;
Fa는 하나 이상의 카복실산기로 임의로 치환된 C10-C20 지방산이고,
Lg는 펩티드 (A)에 (B)를 공유 결합시키는 연결기이고,
여기서 (B)는 말단 아미노산 또는 비-말단 아미노산에 공유 결합된다.
두 번째 태양에서, 본원에 정의된 바와 같은 화합물 및 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 보조제(adjuvant), 부형제(excipient), 담체, 완충제 및/또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
세 번째 태양에서, 약제(medicament)로서 사용하기 위한, 본원에 정의된 바와 같은 화합물을 제공한다.
네 번째 태양에서, NK2R 매개 장애의 치료를 위해 본원에 정의된 바와 같은 화합물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체(subject)에서 질환을 치료하기 위한 방법을 제공한다.
다섯 번째 태양에서, NK2R을 본원에 정의된 바와 같은 화합물과 접촉시키는 단계를 포함하는, NK2R의 활성을 조절하기 위한 방법을 제공한다.
여섯 번째 태양에서, 대사 장애의 치료를 위한 약제의 제조를 위한, 본원에 정의된 바와 같은 화합물의 용도를 제공한다.
도 1: 6번 위치(X3): Phe-Tyr 돌연변이. NKA(4-10) 유사체에서 티로신으로의 치환은 hNK2R 선택성을 촉진한다. 6번 위치(X3) 돌연변이로부터의 데이터. 수용체 활성화가 인간 (h)NK1R(도 1, A), hNK2R(도 1, B) 또는 hNK3R(도 1, C)상의 화합물 304 및 305에 대한 IP3-분석에 의해 측정되었고, 효능제(리간드)로서 표시된 펩티드 화합물을 사용하여 IP3-분석이 수행되었다. 뉴로키닌 A(NKA)는 비교로서 모든 수용체와 함께 사용된 반면, 물질 P(SP) 및 뉴로키닌 B(NKB)는 각각 hNK1R 및 hNK3R하고만 사용되었다. 그래프는 화합물 농도의 함수(log[리간드])로서 펩티드 화합물 배양 후의 표시된 수용체의 수용체 활성화(3H-미오이노시톨 신호)를 나타낸다. 데이터는 평균 3H-미오이노시톨 신호 +/- SD로서 나타낸다. 비선형 회귀는 Graphpad Prism 8에서 S자, 4PL, X is log(농도) 방정식으로 수행되었다.
도 2: 7번 위치(X4): Val-Thr 돌연변이. 7번 위치에서 쓰레오닌 치환은 NKA(4-10) 유사체에서 Tyr6과 독립적인 선택성 드라이버로서 작용한다. 7번 위치(X4) 돌연변이로부터의 데이터. 수용체 활성화가 화합물 344, 366, 381, 382, 383 및 384 인간 (h)NK1R(도 2, A), hNK2R(도 2, B) 또는 hNK3R(도 2, C)에 대한 IP3-분석에 의해 측정되었고, 효능제(리간드)로서 표시된 펩티드 화합물을 사용하여 IP3-분석이 수행되었다. 뉴로키닌 A(NKA)는 비교로서 모든 수용체와 함께 사용된 반면, 물질 P(SP) 및 뉴로키닌 B(NKB)는 각각 hNK1R 및 hNK3R하고만 사용되었다. 화합물 농도의 함수(log[리간드])로서 펩티드 화합물 배양 후의 표시된 수용체의 수용체 활성화(10-6 M NKA의 퍼센트로서 3H-미오이노시톨 신호). 데이터는 평균 수용체 활성화(퍼센트) +/- SD로서 나타낸다. 비선형 회귀는 Graphpad Prism 8에서 S자, 4PL, X is log(농도) 방정식으로 수행되었다.
도 3: 10번 위치(X7) 돌연변이. Met 치환. 노르류신 또는 메톡시닌에 의한 메티오닌 치환은 선택성-드라이버와 독립적인 hNK2R 선택성을 개선시키지만 hNK2R 효능을 약간 감소시킨다. 10번 위치(X7) 돌연변이로부터의 데이터. 수용체 활성화가 인간 (h)NK1R(도 3, A), hNK2R(도 3, B) 또는 hNK3R(도 3, C)상의 화합물 395, 316, 305, 344 및 394에 대한 IP3-분석에 의해 측정되었고, 효능제(리간드)로서 표시된 펩티드 화합물을 사용하여 IP3-분석이 수행되었다. 뉴로키닌 A(NKA)는 비교로서 모든 수용체와 함께 사용된 반면, 물질 P(SP) 및 뉴로키닌 B(NKB)는 각각 hNK1R 및 hNK3R하고만 사용되었다. 화합물 농도의 함수(log[리간드])로서 펩티드 화합물 배양 후의 표시된 수용체의 수용체 활성화(10-6 M NKA의 퍼센트로서 3H-미오이노시톨 신호). 데이터는 평균 수용체 활성화(퍼센트) +/- SD로서 나타낸다. 비선형 회귀는 Graphpad Prism 8에서 S자, 4PL, X is log(농도) 방정식으로 수행되었다.
도 4: 중성 및 양으로 하전(positively charging)된 링커를 갖는 펩티드 유사체가 바람직하다. 연장기(protractor) 링커 전하 분석으로부터의 데이터. 수용체 활성화가 인간 (h)NK1R(도 4, A), hNK2R(도 4, B) 또는 hNK3R(도 4, C)상의 화합물 305, 318, 319 및 321에 대한 IP3-분석에 의해 측정되었고, 효능제(리간드)로서 표시된 펩티드 화합물을 사용하여 IP3-분석이 수행되었다. 뉴로키닌 A(NKA)는 비교로서 모든 수용체와 함께 사용된 반면, 물질 P(SP) 및 뉴로키닌 B(NKB)는 각각 hNK1R 및 hNK3R하고만 사용되었다. 화합물 농도의 함수(log[리간드])로서 펩티드 화합물 배양 후의 표시된 수용체의 수용체 활성화(10-6 M NKA의 퍼센트로서 3H-미오이노시톨 신호). 데이터는 평균 수용체 활성화(퍼센트) +/- SD로서 나타낸다. 비선형 회귀는 Graphpad Prism 8에서 S자, 4PL, X is log(농도) 방정식으로 수행되었다.
도 5: 연장기의 조성이 N-말단 연장된 NKA(4-10) 유사체의 수용체 선택성 및 생체내 반감기에 중요하다. 일- 및 이-지방산 분석으로부터의 데이터. 수용체 활성화가 인간 (h)NK1R(도 5, A), hNK2R(도 5, B) 또는 hNK3R(도 5, C)상의 화합물 305, 344, 390 및 391에 대한 IP3-분석에 의해 측정되었고, 효능제(리간드)로서 표시된 펩티드 화합물을 사용하여 IP3-분석이 수행되었다. 뉴로키닌 A(NKA)는 비교로서 모든 수용체와 함께 사용된 반면, 물질 P(SP) 및 뉴로키닌 B(NKB)는 각각 hNK1R 및 hNK3R하고만 사용되었다. 화합물 농도의 함수(log[리간드])로서 펩티드 화합물 배양 후의 표시된 수용체의 수용체 활성화(10-6 M NKA의 퍼센트로서 3H-미오이노시톨 신호). 데이터는 평균 수용체 활성화(퍼센트) +/- SD로서 나타낸다. 비선형 회귀는 Graphpad Prism 8에서 S자, 4PL, X is log(농도) 방정식으로 수행되었다.
도 6: NK2R 효능작용은 사망-유도된 비만 마우스에서 글루코스 및 인슐린 내성뿐만 아니라 공복 혈당을 개선시킨다. 야생형 식단 유도된 비만 C57BL/6NRj 마우스를 344(325 nmol/㎏)의 피하 주사로 1회 처리하고 처리 후 24시간째에 복강내 글루코스 내성 시험(ipGTT; 도 6, A.) 또는 복강내 인슐린 내성 시험(ipITT; 도 6, B.)을 수행하였다. 데이터는 평균 +/- SEM, n=5-7로 나타내며, Bonferroni의 사후 검정과 함께 2원 ANOVA에 의해 분석되었다, *p<0.05, **p<0.01, ****p<0.0001.
도 7: NK2R은 마우스의 기능장애성 배뇨를 교정한다. 상이한 용량의 선택적 NK2R 효능제, 화합물 344를 피하 투여하기 30분 전에 로페라미드(LP; 5 ㎎/㎏)의 경구 위관 영양법으로 기능장애성 배뇨를 유발하였다. 비히클(Veh) 처리된 마우스를 정상 배뇨에 대한 대조군으로서 사용하였다. 배뇨는 6시간 동안 생성된 분변 펠릿의 수로서 평가되었다. 데이터는 평균 +/- SEM, n=5-7로서 나타내며, 화합물 344 처리 대 LP의 다중 비교 검정을 사용하여 일원 ANOVA에 의해 분석된다, **p<0.01.
용어 및 정의
하기 설명의 이해를 돕기 위해서 하기 단락에 다수의 정의가 제공된다.
"알킬"이라는 용어는 단독으로 사용되든 또는 치환기의 일부로서 사용되는 간에, 1 내지 8개의 탄소 원자, 예를 들어 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 및 분지된 탄소 쇄를 지칭한다. 따라서 지정된 탄소 원자의 수(예를 들어, C1-8)는 독립적으로 알킬 모이어티 또는 더 큰 알킬-함유 치환체의 알킬 부분 중의 탄소 원자 수를 지칭한다.
(C1-6알킬)2아미노-와 같은 다중 알킬기를 갖는 치환기에서, 디알킬아미노의 C1-6알킬기는 동일하거나 상이할 수 있다. 본원에 정의된 바와 같은 알킬은 할로겐 또는 하나 이상의 할로겐과 같은 하나 이상의 치환체에 의해 치환될 수 있다. 하나의 구현예에서, 알킬은 1, 2 또는 3개의 불소 원자에 의해 치환된다. 하나의 구현예에서, 알킬은 카복시 메틸(CO2Me)과 같은 카복시기(CO2)에 의해 치환된다.
본 발명의 화합물상의 치환체 및 치환 패턴은, 화학적으로 안정성이고 당업계에 공지된 기법뿐만 아니라 본원에 제시된 방법에 의해 용이하게 합성될 수 있는 화합물을 제공하기 위해 당업자에 의해 선택될 수 있음이 이해된다.
"대상체"라는 용어는 동물, 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간을 지칭한다.
단백질생성 "아미노산"(AA)은 본원에서 IUPAC의 권장 사항에 따라 1문자 또는 3문자 코드를 사용하여 명명된다, 예를 들어 http://www.chem.qmul.ac.uk/iupac/AminoAcid/을 참조하시오. 대문자 약어는 L-아미노산을 가리키는 반면, 소문자 약어는 D-아미노산을 가리킨다.
일련의 비-단백질생성 아미노산이 본원에서 언급된다. 사용된 명칭은 명확해하며 숙련가가 이해할 수 있어야 한다. 메타-티로신(m-Y)은 3-하이드록시페닐알라닌이다. 메톡시닌(Mox)의 구조를 하기에 나타낸다:
Figure pct00001
(Mox)
본원에서 사용되는 바와 같은 아미노산, 베타-알라닌(bA)은 또한 3-아미노프로판산으로도 공지되어 있다. 아미노산, N-메틸-류신은 본원에서 (NmLeu)로서 지칭된다.
"말단 지방산"은 카복실산 기가 지방 쇄의 말단 탄소 원자상에 위치한 지방산이다. 따라서 "말단 C16-C20 지방산"은 16 내지 20개의 탄소 원자로 이루어진 지방산 쇄이며, 여기서 산 기는 말단에 위치하고 카복실산 기의 탄소 원자는 말단 쇄 탄소이다.
타키키닌 수용체 활성
효능제-유도된 G-단백질 커플링된 수용체(GPCR) 활성화를 실시예 1에 기재된 바와 같이 이노시톨-1,4,5-트리스포스페이트[3H] 방사성수용체 분석(IP3 분석)에 의해 측정할 수 있다. IP3 분석은 초기 3H-이노시톨 표지화 기간 후 수용체 발현 세포에 효능제(리간드) 결합시 상기 이노시톨 트리스포스페이트(IP3) 2차 메신저의 생성을 유도하는 타키키닌 수용체의 능력을 이용한다. 사실상 이는 수용체 활성의 척도로서 2차 메신저 IP3의 생성이 3H-활성을 카운팅함으로써 평가될 수 있음을 의미한다.
"NK2R 효능제"는 본원에 제시된 IP3 분석과 같은 생물학적 분석에서 측정된 바와 같이 NK1 수용체 및/또는 NK3 수용체에서의 활성에 대해 다양한 정도의 선택성을 가질 수 있다. "선택적 NK2R 효능제"는 본원에서 NK1 및/또는 NK3 수용체에 결합하거나 이들을 활성화시키는 것보다 적어도 약 10배 이상의 효능으로 NK2 수용체에 결합하거나 이를 활성화시키는 리간드로서 정의된다. 선택적 NK2R 작용제가 되기 위해 분자가 결합 및 기능(활성화) 분석 모두에서 선택적인 것으로 간주될 필요는 없다. 결합 효능은 통상적으로 EC50으로서 보고되며, 이때 EC50 값이 낮을수록 효능이 더 크다. 따라서, 선택적 NK2R 효능제는 이의 NK1 및/또는 NK3 결합 EC50보다 적어도 약 10배 이상 더 낮은 NK2R 결합 EC50을 갖는다. 수용체를 활성화하는 효능은 또한 통상적으로 Ki로서 보고되며, 이때 Ki 값이 낮을수록 효능이 더 크다.
바람직한 구현예에서, 본원에 제공된 화합물은 뉴로키닌 수용체 2(NK2R) 효능제이다. 하나의 구현예에서, 화합물은 선택적 뉴로키닌 수용체 2(NK2R) 효능제이다.
하나의 구현예에서, 화합물은 300 nM 이하, 예를 들어 250 nm 이하, 예를 들어 200 nm 이하, 예를 들어 150 nM 이하, 예를 들어 100 nM 이하, 예를 들어 90 nM 이하, 예를 들어 80 nM 이하, 예를 들어 70 nM 이하, 예를 들어 60 nM 이하, 예를 들어 50 nM 이하의 인간 NK2R에 대한 EC50을 갖는다.
하나의 구현예에서, 화합물은 50 nM 이하, 예를 들어 40 nm 이하, 예를 들어 30 nm 이하, 예를 들어 20 nM 이하, 예를 들어 15 nM 이하, 예를 들어 14 nM 이하, 예를 들어 13 nM 이하, 예를 들어 12 nM 이하, 예를 들어 11 nM 이하, 예를 들어 10 nM 이하의 인간 NK2R에 대한 EC50을 갖는다.
하나의 구현예에서, 화합물은 적어도 100 nM, 예를 들어 적어도 200 nM, 예를 들어 적어도 300 nM, 예를 들어 적어도 400 nM, 예를 들어 적어도 500 nM의 인간 NK1R에 대한 EC50을 갖는다.
하나의 구현예에서, 화합물은 적어도 100 nM, 예를 들어 적어도 200 nM, 예를 들어 적어도 300 nM, 예를 들어 적어도 400 nM, 예를 들어 적어도 500 nM의 인간 NK3R에 대한 EC50을 갖는다.
타키키닌 수용체 매개 장애
하나의 구현예에서, 약제로서 사용하기 위한, 본원에 정의된 바와 같은 화합물을 제공한다. 본 발명자는 비만과 같은 대사 장애의 치료 및 기능장애성 배뇨의 치료를 위한 에너지 소비 활성제로서 화학적으로 안정한 NK2R 효능제의 합성을 제공한다.
하나의 구현예에서, NK2R 매개 장애의 치료를 위해 본원에서와 같은 화합물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환을 치료하기 위한 방법을 제공한다.
하나의 구현예에서, NK2R 매개 장애는 비만, 기능장애성 배뇨, II형 당뇨병과 같은 당뇨병, 및 당뇨병-관련된 장애로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
하나의 구현예에서, NK2R 매개 장애는 대사 장애이다. 하나의 구현예에서, 대사 장애는 당뇨병-관련된 장애이다. 특히, 당뇨병-관련된 장애는 인슐린 내성 장애(impaired insulin tolerance) 및 내당능 장애(impaired glucose tolerance)로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
추가로, 하나의 구현예에서, NK2R을 본원에 정의된 바와 같은 화합물과 접촉시키는 단계를 포함하는, NK2R의 활성을 조절하기 위한 방법을 제공한다.
하나의 구현예에서, 대사 장애의 치료를 위한 약제의 제조를 위한, 본원에 정의된 바와 같은 화합물의 용도를 제공한다.
펩티드 - (A)
첫 번째 구현예에서, 하기 화학식 I에 따른 화합물을 제공한다:
화학식 I
(A)-(B)
여기서;
(A)는 화학식 X1X2X3X4X5X6X7의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드이고, 여기서
X1은 아스파트산(D) 및 글루탐산(E)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
X2는 리신(K), 아르기닌(R) 및 히스티딘(H)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
X3은 티로신(Y), 페닐알라닌(F), 메타-티로신(m-Y), 발린(V), 트립토판(W), 메티오닌(M), 류신(L), 이소류신(I) 및 알라닌(A)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
X4는 발린(V), 쓰레오닌(T), 세린(S), 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 글리신(G) 및 알라닌(A)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
X5는 글리신(G), 2-아미노이소부티르산(Aib), 세린(S), 알라닌(A), 발린(V), 류신(L), 베타-알라닌(bA) 및 이소류신(I)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
X6은 류신(L), 이소류신(I) 알라닌(A) 및 N-메틸 류신(Me-Leu)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
X7은 노르류신(Nle), 메톡시닌(Mox), 메티오닌(M), 4-플루오로페닐알라닌(4fF) 및 4-메톡시페닐알라닌(4MeOF)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
(B)는 하기 일반식 II의 공액화 모이어티이고:
화학식 II
Fa-Lg
여기서;
Fa는 하나 이상의 카복실산기로 임의로 치환된 C10-C20 지방산이고,
Lg는 펩티드 (A)에 (B)를 공유 결합시키는 연결기이고,
여기서 (B)는 말단 아미노산 또는 비-말단 아미노산에 공유 결합된다.
두 번째 구현예에서, 펩티드 (A)가 화학식 X1X2X3X4X5X6X7을 갖는 화합물을 제공하고, 여기서
X1은 아스파트산(D) 및 글루탐산(E)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
X2는 리신(K) 및 아르기닌(R)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
X3은 티로신(Y) 및 메타-티로신(m-Y)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
X4는 발린(V) 및 쓰레오닌(T)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
X5는 글리신(G), 2-아미노이소부티르산(Aib), 베타-알라닌(bA) 및 세린(S)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
X6은 류신(L) 및 N-메틸 류신(Me-Leu)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
X7은 노르류신(Nle), 메톡시닌(Mox), 메티오닌(M), 4-플루오로페닐알라닌(4fF) 및 4-메톡시페닐알라닌(4MeOF)으로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
세 번째 구현예에서, 펩티드 (A)가 화학식 X1X2X3X4X5X6X7을 갖는 화합물을 제공하며, 여기서
X1은 아스파트산(D) 및 글루탐산(E)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
X2는 리신(K) 및 아르기닌(R)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
X3은 티로신(Y) 및 페닐알라닌(F) 및 메타-티로신(m-Y)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
X4는 발린(V) 및 쓰레오닌(T)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
X5는 글리신(G), 2-아미노이소부티르산(Aib), 베타-알라닌(bA) 및 세린(S)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
X6은 류신(L) 및 N-메틸 류신(Me-Leu)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
X7은 노르류신(Nle), 메톡시닌(Mox), 메티오닌(M), 4-플루오로페닐알라닌(4fF) 및 4-메톡시페닐알라닌(4MeOF)으로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
하나의 구현예에서, X2가 아르기닌(R)인 화합물을 제공한다.
하나의 구현예에서, X3이 티로신(Y)인 화합물을 제공한다. 하나의 구현예에서, X3이 티로신(Y)이고 X2가 아르기닌(R)인 화합물을 제공한다. 하나의 구현예에서, X3이 티로신(Y)이고, X2가 아르기닌(R)이고, X5가 2-아미노이소부티르산(Aib)인 화합물을 제공한다.
하나의 구현예에서, X4가 쓰레오닌(T)인 화합물을 제공한다.
하나의 구현예에서, X5가 2-아미노이소부티르산(Aib) 및 세린(S)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 화합물을 제공한다.
하나의 구현예에서, X6이 N-메틸-류신(Me-Leu)인 화합물을 제공한다.
하나의 구현예에서, X7이 메톡시닌(Mox)인 화합물을 제공한다. 하나의 구현예에서, X7이 메톡시닌(Mox)이고 X2가 아르기닌(R)인 화합물을 제공한다. 하나의 구현예에서, X7이 메톡시닌(Mox)이고, X2가 아르기닌(R)이고, X3이 티로신(Y)인 화합물을 제공한다.
하나의 구현예에서, 펩티드 (A)는 C-말단상에서 아미드화된다.
하나의 구현예에서, 펩티드 (A)는 7 내지 15개의 아미노산, 예를 들어 7 내지 14개의 아미노산, 예를 들어 7 내지 13개의 아미노산, 예를 들어 7 내지 12개의 아미노산, 예를 들어 7 내지 11개의 아미노산, 예를 들어 7 내지 11개의 아미노산, 예를 들어 7 내지 10개의 아미노산, 예를 들어 7 내지 9개의 아미노산, 예를 들어 7 내지 8개의 아미노산을 포함하며, 바람직하게 상기 펩티드는 7개의 아미노산을 포함한다.
하나의 구현예에서, 펩티드 (A)는 15개 이하의 아미노산, 예를 들어 14개 이하의 아미노산, 예를 들어 13개 이하의 아미노산, 예를 들어 12개 이하의 아미노산, 예를 들어 11개 이하의 아미노산, 예를 들어 10개 이하의 아미노산, 예를 들어 9개 이하의 아미노산, 예를 들어 8개 이하의 아미노산, 예를 들어 7개 이하의 아미노산을 포함한다.
하나의 구현예에서, 펩티드 (A)는 화학식 X1X2X3X4X5X6X7의 7개 아미노산으로 이루어진다. 펩티드는 바람직하게는 C-말단상에서 아미드화된다.
하나의 특정 구현예에서,
(A)가 Asp;Lys;Phe;Val;Gly;NmLeu;Nle;NH2(화합물 305)이고,
(B)가 (A)의 N-말단 아스파테이트에 공유 결합된 화학식 (B1)의 것인,
화합물을 제공한다.
하나의 특정 구현예에서,
(A)가 Asp;Lys;Tyr;Val;Gly;NmLeu;Metox;NH2(화합물 344)이고,
(B)가 (A)의 N-말단 아스파테이트에 공유 결합된 화학식 (B1)의 것인,
화합물을 제공한다.
하나의 구현예에서, 화합물은 서열번호 1 내지 서열번호 57 중 어느 하나의 서열로 이루어진다.
하나의 특정 구현예에서, 화합물은 하기와 같다:
Figure pct00002
Figure pct00003
본 개시내용의 맥락에서 달리 언급되지 않는 한, 결합이 하나의 원자로부터 1 또는 3 문자 코드로 축약된 아미노산까지 그려질 때, 상기 결합은 상기 아미노산 주쇄(backbone)의 α-아미노기 또는 카보닐 탄소에 연결된다. 예를 들어 ID가 398인 화합물의 경우 "Lys"는 이의 α-아미노기를 통해 인접한 카보닐에 연결되고 "Thr"은 이의 주쇄 카보닐 탄소를 통해 "NH"에 연결된다.
Figure pct00004
공액화 모이어티 - (B)
공액화 모이어티는 또한 본원에서 연장기(protractor)로도 지칭된다. 하나의 구현예에서, Lg가 하기 화학식 Lg-1의 것인, 본원에 정의된 바와 같은 화합물을 제공한다:
Figure pct00005
여기서 Z는 C, O 및 N으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 주쇄 중에 18 내지 23개의 원자를 포함하는 쇄이고,
R은 H 및 C1-6알킬로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
당업자는 C, O 및 N이 특정 원자의 원자가에 따라 수소로 치환될 수 있음을 안다. 주쇄는 1, 2, 3 또는 4개의 카보닐기와 같은 하나 이상의 카보닐기를 포함할 수 있다. 주쇄는 또한 1개 또는 2개와 같은 하나 이상의 카복실산기를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, Z는 하나 이상의 아미드 작용기에 의해 중단된 에틸렌 글리콜의 단편을 포함한다. 일례를, 지방산 Fa는 화학식 Fa-1의 것이고, Lg-1의 R이 H이고, Z의 주쇄가 C, O, 및 N으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 21개의 원자를 포함하는 화학식 (B1)에 나타낸다.
하나의 구현예에서, Fa가 말단 C16-C20 지방산인 화합물을 제공한다.
하나의 구현예에서, Fa는 하기 화학식 Fa-1의 것인 화합물을 제공한다:
Figure pct00006
여기서 n은 11 내지 20, 예를 들어 12 내지 19, 예를 들어 13 내지 18, 예를 들어 14 내지 17이고, 바람직하게는 여기서 n은 15이고;
여기서 X는 -OH, -OC1-6, -NH2, -NHC1-6 및 N(C1-6)2로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 특정 구현예에서, n은 15이고 X는 -OH이다.
하나의 구현예에서, 공액화 모이어티의 Lg가 pH = 7.4에서 양으로 하전되는 작용기를 포함하지 않는 화합물을 제공한다. 하나의 구현예에서, 공액화 모이어티의 Lg는 pH = 7.4에서 음으로 하전되는 하나 초과의 작용기를 포함하지 않는다. 하나의 구현예에서, 공액화 모이어티의 Lg는 pH = 7.4에서 순 중성 전하(net neutral charge) 또는 -1을 갖는다.
하나의 바람직한 구현예에서, 공액화 모이어티가 하기 화학식 B1의 것인, 본원에 정의된 바와 같은 화합물을 제공한다:
Figure pct00007
특히 바람직한 구현예에서, 공액화 모이어티가 하기 화학식을 갖는, 본원에 정의된 바와 같은 화합물을 제공한다:
Figure pct00008
하나의 구현예에서, 공액화 모이어티 (B)는 임의로 아미드 결합을 통해 (A)의 N-말단에 공유 결합된다.
하나의 구현예에서, 공액화 모이어티 (B)는 N-말단 α-NH2 기와의 아미드 결합을 통해 (A)의 N-말단에 공유 결합된다.
약제학적 조성물
하나의 구현예에서, 본원에 정의된 바와 같은 화합물 및 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 보조제, 부형제, 담체, 완충제 및/또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
항목
1. 하기 화학식 I에 따른 화합물:
화학식 I
(A)-(B)
여기서;
(A)는 화학식 X1X2X3X4X5X6X7의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드이고, 여기서
X1은 아스파트산(D) 및 글루탐산(E)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
X2는 리신(K), 아르기닌(R) 및 히스티딘(H)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
X3은 티로신(Y), 페닐알라닌(F), 메타-티로신(m-Y), 발린(V), 트립토판(W), 메티오닌(M), 류신(L), 이소류신(I) 및 알라닌(A)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
X4는 발린(V), 쓰레오닌(T), 세린(S), 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 글리신(G) 및 알라닌(A)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
X5는 글리신(G), 2-아미노이소부티르산(Aib), 세린(S), 알라닌(A), 발린(V), 류신(L), 베타-알라닌(bA) 및 이소류신(I)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
X6은 류신(L), 이소류신(I) 알라닌(A) 및 N-메틸 류신(Me-Leu)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
X7은 노르류신(Nle), 메톡시닌(Mox), 메티오닌(M), 4-플루오로페닐알라닌(4fF) 및 4-메톡시페닐알라닌(4MeOF)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
(B)는 하기 일반식 II의 공액화 모이어티이고:
화학식 II
Fa-Lg
여기서;
Fa는 하나 이상의 카복실산기로 임의로 치환된 C10-C20 지방산이고,
Lg는 펩티드 (A)에 (B)를 공유 결합시키는 연결기이고,
여기서 (B)는 말단 아미노산 또는 비-말단 아미노산에 공유 결합된다.
2. 1항에 따른 화합물에서, 펩티드 (A)가 화학식 X1X2X3X4X5X6X7을 갖고, 여기서
X1은 아스파트산(D) 및 글루탐산(E)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
X2는 리신(K) 및 아르기닌(R)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
X3은 티로신(Y) 및 페닐알라닌(F) 및 메타-티로신(m-Y)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
X4는 발린(V) 및 쓰레오닌(T)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
X5는 글리신(G), 2-아미노이소부티르산(Aib), 베타-알라닌(bA) 및 세린(S)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
X6은 류신(L) 및 N-메틸 류신(Me-Leu)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
X7은 노르류신(Nle), 메톡시닌(Mox), 메티오닌(M), 4-플루오로페닐알라닌(4fF) 및 4-메톡시페닐알라닌(4MeOF)으로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
3. 1항 또는 2항에 따른 화합물에서, X2가 아르기닌(R)인 화합물.
4. 1항 내지 3항 중 어느 한 항에 따른 화합물에서, X3이 티로신(Y)인 화합물.
5. 1항 내지 4항 중 어느 한 항에 따른 화합물에서, X4가 쓰레오닌(T)인 화합물.
6. 1항 내지 5항 중 어느 한 항에 따른 화합물에서, X5가 2-아미노이소부티르산(Aib) 및 세린(S)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 화합물.
7. 1항 내지 6항 중 어느 한 항에 따른 화합물에서, X6이 N-메틸-류신(Me-Leu)인 화합물.
8. 1항 내지 7항 중 어느 한 항에 따른 화합물에서, X7이 메톡시닌(Mox)인 화합물.
9. 1항 내지 8항 중 어느 한 항에 따른 화합물에서, Lg가 하기 화학식 Lg-1의 것인 화합물:
Figure pct00009
여기서 Z는 C, O 및 N으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 주쇄 중에 18 내지 23개의 원자를 포함하는 쇄이고,
R은 H 및 C1-6알킬로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
10. 1항 내지 9항 중 어느 한 항에 따른 화합물에서, Fa가 말단 C16-C20 지방산인 화합물.
11. 1항 내지 10항 중 어느 한 항에 따른 화합물에서, Fa는 하기 화학식 Fa-1의 것인 화합물:
Figure pct00010
여기서 n은 11 내지 20, 예를 들어 12 내지 19, 예를 들어 13 내지 18, 예를 들어 14 내지 17이고, 바람직하게는 여기서 n은 15이고;
여기서 X는 -OH, -OC1-6, -NH2, -NHC1-6 및 N(C1-6)2로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
12. 11항에 따른 화합물에서, n은 15이고 X는 -OH이다.
13. 1항 내지 12항 중 어느 한 항에 따른 화합물에서, 공액화 모이어티의 Lg가 pH = 7.4에서 양으로 하전되는 작용기를 포함하지 않는 화합물.
14. 1항 내지 13항 중 어느 한 항에 따른 화합물에서, 공액화 모이어티의 Lg가 pH = 7.4에서 순 중성 전하 또는 -1을 갖는 화합물.
15. 1항 내지 14항 중 어느 한 항에 따른 화합물에서, 공액화 모이어티가 하기 화학식 B1의 것인, 화합물:
Figure pct00011
16. 1항 내지 15항 중 어느 한 항에 따른 화합물에서, 공액화 모이어티 (B)가, 임의로 아미드 결합을 통해, (A)의 N-말단에 공유 결합되는 화합물.
17. 1항 내지 16항 중 어느 한 항에 따른 화합물에서, 공액화 모이어티 (B)가 N-말단 α-NH2 기와의 아미드 결합을 통해 (A)의 N-말단에 공유 결합되는 화합물.
18. 1항 내지 17항 중 어느 한 항에 따른 화합물에서, 펩티드 (A)가 C-말단상에서 아미드화되는 화합물.
19. 1항 내지 18항 중 어느 한 항에 따른 화합물에서, 펩티드 (A)가 7 내지 15개의 아미노산, 예를 들어 7 내지 14개의 아미노산, 예를 들어 7 내지 13개의 아미노산, 예를 들어 7 내지 12개의 아미노산, 예를 들어 7 내지 11개의 아미노산, 예를 들어 7 내지 11개의 아미노산, 예를 들어 7 내지 10개의 아미노산, 예를 들어 7 내지 9개의 아미노산, 예를 들어 7 내지 8개의 아미노산을 포함하며, 바람직하게 상기 펩티드가 7개의 아미노산을 포함하는 화합물.
20. 1항 내지 19항 중 어느 한 항에 따른 화합물에서, 펩티드 (A)가 15개 이하의 아미노산, 예를 들어 14개 이하의 아미노산, 예를 들어 13개 이하의 아미노산, 예를 들어 12개 이하의 아미노산, 예를 들어 11개 이하의 아미노산, 예를 들어 10개 이하의 아미노산, 예를 들어 9개 이하의 아미노산, 예를 들어 8개 이하의 아미노산, 예를 들어 7개 이하의 아미노산을 포함하는 화합물.
21. 1항 내지 20항 중 어느 한 항에 따른 화합물에서, 펩티드 (A)가 화학식 X1X2X3X4X5X6X7의 7개 아미노산으로 이루어진 화합물.
22. 1항 내지 21항 중 어느 한 항에 따른 화합물에서,
(A)가 Asp;Lys;Phe;Val;Gly;NmLeu;Nle;NH2(화합물 305)이고,
(B)가 (A)의 N-말단 아스파테이트에 공유 결합된 화학식 (B1)의 것인,
화합물.
23. 1항 내지 22항 중 어느 한 항에 따른 화합물에서,
(A)가 Asp;Lys;Tyr;Val;Gly;NmLeu;Metox;NH2(화합물 344)이고,
(B)가 (A)의 N-말단 아스파테이트에 공유 결합된 화학식 (B1)의 것인,
화합물.
24. 1항 내지 23항 중 어느 한 항에 따른 화합물에서, 서열번호 1 내지 서열번호 57 중 어느 하나의 서열로 이루어진, 화합물.
25. 1항 내지 24항 중 어느 한 항에 따른 화합물에서, 하기와 같은 화합물:
Figure pct00012
Figure pct00013
26. 1항 내지 25항 중 어느 한 항에 따른 화합물에서, 뉴로키닌 수용체 2(NK2R) 효능제인 화합물.
27. 1항 내지 26항 중 어느 한 항에 따른 화합물에서, 선택적 뉴로키닌 수용체 2(NK2R) 효능제인 화합물.
28. 1항 내지 27항 중 어느 한 항에 따른 화합물에서, 300 nM 이하, 예를 들어 250 nm 이하, 예를 들어 200 nm 이하, 예를 들어 150 nM 이하, 예를 들어 100 nM 이하, 예를 들어 90 nM 이하, 예를 들어 80 nM 이하, 예를 들어 70 nM 이하, 예를 들어 60 nM 이하, 예를 들어 50 nM 이하의 인간 NK2R에 대한 EC50을 갖는 화합물.
29. 1항 내지 28항 중 어느 한 항에 따른 화합물에서, 50 nM 이하, 예를 들어 40 nm 이하, 예를 들어 30 nm 이하, 예를 들어 20 nM 이하, 예를 들어 15 nM 이하, 예를 들어 14 nM 이하, 예를 들어 13 nM 이하, 예를 들어 12 nM 이하, 예를 들어 11 nM 이하, 예를 들어 10 nM 이하의 인간 NK2R에 대한 EC50을 갖는 화합물.
30. 1항 내지 29항 중 어느 한 항에 따른 화합물에서, 적어도 100 nM, 예를 들어 적어도 200 nM, 예를 들어 적어도 300 nM, 예를 들어 적어도 400 nM, 예를 들어 적어도 500 nM의 인간 NK1R에 대한 EC50을 갖는 화합물.
31. 1항 내지 30항 중 어느 한 항에 따른 화합물에서, 적어도 100 nM, 예를 들어 적어도 200 nM, 예를 들어 적어도 300 nM, 예를 들어 적어도 400 nM, 예를 들어 적어도 500 nM의 인간 NK3R에 대한 EC50을 갖는 화합물.
32. 1항 내지 31항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 화합물, 및 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 보조제, 부형제, 담체, 완충제 및/또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물.
33. 약제로서 사용하기 위한, 1항 내지 31항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 화합물.
34. NK2R 매개 장애의 치료를 위한 1항 내지 31항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 화합물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환을 치료하기 위한 방법.
35. 1항 내지 34항 중 어느 한 항에 따른 방법에서, NK2R 매개 장애가 비만, 기능장애성 배뇨, II형 당뇨병과 같은 당뇨병, 및 당뇨병-관련된 장애로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
36. 1항 내지 35항 중 어느 한 항에 따른 방법에서, NK2R 매개 장애가 대사 장애인 방법.
37. 1항 내지 36항 중 어느 한 항에 따른 방법에서, 대사 장애가 당뇨병-관련된 장애인 방법.
38. 35항에 따른 방법에서, 당뇨병-관련된 장애가 인슐린 내성 장애 및 내당능 장애로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
39. 1항 내지 31항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 화합물과 NK2R을 접촉시키는 단계를 포함하는, NK2R의 활성을 조절하기 위한 방법.
40. 대사 장애의 치료를 위한 약제의 제조를 위한, 1항 내지 31항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 화합물의 용도.
항목 II
1. 하기 화학식 I에 따른 화합물:
화학식 I
(A)-(B)
여기서;
(A)는 화학식 X1X2X3X4X5X6X7의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드이고, 여기서
X1은 아스파트산(D) 및 글루탐산(E)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
X2는 리신(K), 아르기닌(R) 및 히스티딘(H)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
X3은 티로신(Y), 페닐알라닌(F), 메타-티로신(m-Y), 발린(V), 트립토판(W), 메티오닌(M), 류신(L), 이소류신(I) 및 알라닌(A)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
X4는 발린(V), 쓰레오닌(T), 세린(S), 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 글리신(G) 및 알라닌(A)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
X5는 글리신(G), 2-아미노이소부티르산(Aib), 세린(S), 알라닌(A), 발린(V), 류신(L), 베타-알라닌(bA) 및 이소류신(I)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
X6은 류신(L), 이소류신(I) 알라닌(A) 및 N-메틸 류신(Me-Leu)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
X7은 노르류신(Nle), 메톡시닌(Mox), 메티오닌(M), 4-플루오로페닐알라닌(4fF) 및 4-메톡시페닐알라닌(4MeOF)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
(B)는 하기 일반식 II의 공액화 모이어티이고:
화학식 II
Fa-Lg
여기서;
Fa는 하나 이상의 카복실산기로 임의로 치환된 C10-C20 지방산이고,
Lg는 펩티드 (A)에 (B)를 공유 결합시키는 연결기이고,
여기서 (B)는 말단 아미노산 또는 비-말단 아미노산에 공유 결합된다.
2. 1항에 따른 화합물에서, 펩티드 (A)가 화학식 X1X2X3X4X5X6X7을 갖고, 여기서
X1은 아스파트산(D) 및 글루탐산(E)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
X2는 리신(K) 및 아르기닌(R)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
X3은 티로신(Y) 및 페닐알라닌(F) 및 메타-티로신(m-Y)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
X4는 발린(V) 및 쓰레오닌(T)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
X5는 글리신(G), 2-아미노이소부티르산(Aib), 베타-알라닌(bA) 및 세린(S)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
X6은 류신(L) 및 N-메틸 류신(Me-Leu)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
X7은 노르류신(Nle), 메톡시닌(Mox), 메티오닌(M), 4-플루오로페닐알라닌(4fF) 및 4-메톡시페닐알라닌(4MeOF)으로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
3. 1항 또는 2항에 따른 화합물에서,
X2가 아르기닌(R)이고;
X3이 티로신(Y)이고;
X4가 쓰레오닌(T)이고;
X5가 2-아미노이소부티르산(Aib) 및 세린(S)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
X6이 N-메틸-류신(Me-Leu)이고;
X7이 메톡시닌(Mox)인 화합물.
4. 1항 내지 3항 중 어느 한 항에 따른 화합물에서, Lg가 하기 화학식 Lg-1의 것인 화합물:
Figure pct00014
여기서 Z는 C, O 및 N으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 주쇄 중에 18 내지 23개의 원자를 포함하는 쇄이고,
R은 H 및 C1-6알킬로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
5. 1항 내지 4항 중 어느 한 항에 따른 화합물에서, Fa가 말단 C16-C20 지방산인 화합물.
6. 1항 내지 5항 중 어느 한 항에 따른 화합물에서, Fa는 하기 화학식 Fa-1의 것인 화합물:
Figure pct00015
여기서 n은 11 내지 20, 예를 들어 12 내지 19, 예를 들어 13 내지 18, 예를 들어 14 내지 17이고, 바람직하게는 여기서 n은 15이고;
여기서 X는 -OH, -OC1-6, -NH2, -NHC1-6 및 N(C1-6)2로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
7. 1항 내지 6항 중 어느 한 항에 따른 화합물에서, 공액화 모이어티가 하기 화학식 B1의 것인, 화합물:
Figure pct00016
8. 1항 내지 7항 중 어느 한 항에 따른 화합물에서, 공액화 모이어티 (B)가 N-말단 α-NH2 기와의 아미드 결합을 통해 (A)의 N-말단에 공유 결합되는 화합물.
9. 1항 내지 8항 중 어느 한 항에 따른 화합물에서, 펩티드 (A)가 C-말단상에서 아미드화되는 화합물.
10. 1항 내지 9항 중 어느 한 항에 따른 화합물에서, 펩티드 (A)가 7 내지 15개의 아미노산, 예를 들어 7 내지 14개의 아미노산, 예를 들어 7 내지 13개의 아미노산, 예를 들어 7 내지 12개의 아미노산, 예를 들어 7 내지 11개의 아미노산, 예를 들어 7 내지 11개의 아미노산, 예를 들어 7 내지 10개의 아미노산, 예를 들어 7 내지 9개의 아미노산, 예를 들어 7 내지 8개의 아미노산을 포함하며, 바람직하게 상기 펩티드가 7개의 아미노산을 포함하는 화합물.
11. 1항 내지 10항 중 어느 한 항에 따른 화합물에서, 펩티드 (A)가 화학식 X1X2X3X4X5X6X7의 7개 아미노산으로 이루어진 화합물.
12. 1항 내지 11항 중 어느 한 항에 따른 화합물에서, 서열번호 1 내지 서열번호 57 중 어느 하나의 서열로 이루어진, 화합물.
13. 1항 내지 12항 중 어느 한 항에 따른 화합물에서,
(A)가 Asp;Lys;Tyr;Val;Gly;NmLeu;Metox;NH2(화합물 344)이고,
(B)가 (A)의 N-말단 아스파테이트에 공유 결합된 화학식 (B1)의 것인,
화합물.
14. 1항 내지 13항 중 어느 한 항에 따른 화합물에서, 하기와 같은 화합물:
Figure pct00017
15. 1항 내지 14항 중 어느 한 항에 따른 화합물에서, 뉴로키닌 수용체 2(NK2R) 효능제, 예를 들어 선택적 뉴로키닌 수용체 2(NK2R) 효능제인 화합물.
실시예
실시예 1: 이노시톨 트리스포스페이트(P 3 ) 측정에 의한 효능 및 효험 측정을 통한 화합물 선택성 측정
물질:
포름산, LiCl, CaCl2, 트리스-HCl, EDTA, HEPES, NaCl, 클로로퀸 및 오브알부민(계란의 알부민)(Sigma Aldrich). COS-7 원숭이 신장 세포주를 ATCC로부터 수득하였다. DMEM 1885, FBS, 페니실린/스트렙토마이신(P/S) 및 HBSS를 Thermo Scientific/Gibco로부터 수득하였다. Clear Costar 96웰 조직 배양물-처리된 플레이트 및 고형 백색 96웰 플레이트를 Corning으로부터 수득하였다. 폴리리신 코팅된 이트륨 실리케이트 SPA 비드(#RPNQ0010) 및 Myo-[2-3H(N)]-이노시톨-(#NET114A[005MC])을 Perkin Elmer로부터 수득하였다. 이노시톨-1,4,5-트리스포스페이트 [3H]방사성수용체 분석(IP3 분석)을 Perkin Elmer로부터 수득하였다. 인간 및 마우스 타키키닌 수용체 1,2,3 mRNA의 암호화 서열을 함유하는 pcDNA3.1(+)을 Genscript(맞춤 주문)로부터 수득하였다. 합성된 펩티드를 염수 + 0.2%(w/v) 오브알부민에 희석하였다.
mRNA ID
인간 Tacr1: NM_001058.4
인간 Tacr2: NM_001057.3
인간 Tacr3: NM_001059.2
방법:
효능제-유도된 G-단백질 커플링된 수용체(GPCR) 활성화를 이노시톨-1,4,5-트리스포스페이트[3H] 방사성수용체 분석(IP3 분석)에 의해 측정하였다. 표시된 수용체 중 하나를 암호화하는 벡터 pcDNA3.1(+)(Genscript)로 인산칼슘 형질감염에 의해 일시적으로 형질감염된 COS-7 세포를 사용하여 분석을 수행하였다. 간략하게, CaCl2(2 M) 및 TE-완충제(10 mM 트리스-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5)와 혼합된 DNA를 2xHBS(50 mM HEPES, 280 mM NaCl, 1.5 mM NaH2PO4, pH 7.2)에 첨가하고 실온(22±2℃)에서 45분 동안 배양하였다. 혼합물 및 최종 농도 100 μM의 클로로퀸을 세포에 첨가하고 표준 세포 배양 조건(10% CO2) 하에 37℃에서 5시간 동안 방치하여 배양한 후에 배지를 5 ㎕/㎖ Myo-[2-3H(N)]-이노시톨(표지화 배지)을 함유하는 신선한 배지로 교체하였다.
IP3 분석은 초기 3H-이노시톨 표지화 기간 후 수용체 발현 세포에 효능제(리간드) 결합 시 이노시톨 트리스포스페이트(IP3) 2차 메신저의 생성을 유도하는 타키키닌 수용체의 능력을 이용한다. 사실상 이는 수용체 활성의 척도로서 2차 메신저 IP3의 생성이 3H-활성을 카운팅으로써 평가될 수 있음을 의미한다.
분석 용액은 세척 완충제(HBSS), 분석 완충제(HBSS + 10 mM LiCl 및 0,2% w/v 오브알부민), 용해 완충제(10 mM 포름산) 및 SPA YSI 비드(H2O 중 12.5 ㎎/㎖)를 사용하였다. 분석을 형질감염 다음날에 수행하였다. 간략하게, 표지화 배지를 흡출하고, 플레이트를 세척 완충제로 1회 세척한 후 분석 완충제 100 ㎕를 첨가하고, 30분 동안 사전 배양한 후 효능제와 함께 120분 동안 배양하였다(모두 37℃). 배양 후, 즉시 플레이트를 얼음 상에 놓고 배양 배지를 흡출하고 웰당 40 ㎕의 10 mM 포름산을 첨가하였다. 플레이트를 얼음 상에서 적어도 30분 동안 배양하였다. 60 ㎕(1 ㎎/웰) SPA YSI 비드/웰을 고형 백색 96웰 플레이트에 피펫팅하고 35 ㎕의 용해 용액을 플레이트로 옮긴 후 상기 플레이트를 밀봉 덮개로 덮고 10분 동안 진탕시켰다(최대 속도). MicroBeta 플레이트 카운터(Perkin Elmer)에서 플레이트를 카운팅하기 전에 플레이트를 원심분리하고 실온에 8시간 동안 둔다.
실시예 2: 이노시톨 트리스포스페이트(IP 3 ) 정량분석을 사용하여 수용체 활성을 측정함에 의한 인간 혈청 알부민(HSA) 결합의 측정
물질:
포름산, LiCl, CaCl2, 트리스-HCl, EDTA, HEPES, NaCl, NaH2PO4, 클로로퀸, 오브알부민(계란의 알부민), 및 인간 혈청 알부민(HSA)(Sigma Aldrich). COS-7 원숭이 신장 세포주를 ATCC로부터 수득하였다. DMEM 1885, FBS, 페니실린/스트렙토마이신(P/S) 및 HBSS를 Thermo Scientific/Gibco로부터 수득하였다. Clear Costar 96웰 조직 배양물-처리된 플레이트 및 고형 백색 96웰 플레이트를 Corning으로부터 수득하였다. 폴리리신 코팅된 이트륨 실리케이트 SPA 비드(#RPNQ0010) 및 Myo-[2-3H(N)]-이노시톨-(#NET114A[005MC])을 Perkin Elmer로부터 수득하였다. 이노시톨-1,4,5-트리스포스페이트 [3H]방사성수용체 분석(IP3 분석)을 Perkin Elmer로부터 수득하였다. 인간 타키키닌 수용체 1,2,3 mRNA의 암호화 서열을 함유하는 pcDNA3.1(+)을 Genscript(맞춤 주문)로부터 수득하였다. 합성된 펩티드를 염수 + 0.2%(w/v) 오브알부민 또는 염수 + 1%(w/v) HSA에 희석하였다.
인간 Tacr1: NM_001058.4
인간 Tacr2: NM_001057.3
인간 Tacr3: NM_001059.2
방법:
효능제-유도된 G-단백질 커플링된 수용체(GPCR) 활성화를 이노시톨-1,4,5-트리스포스페이트[3H] 방사성수용체 분석(IP3 분석)에 의해 측정하였다. 표시된 수용체 중 하나를 암호화하는 벡터 pcDNA3.1(+)(Genscript)로 인산칼슘 형질감염에 의해 일시적으로 형질감염된 COS-7 세포를 사용하여 분석을 수행하였다. 간략하게, CaCl2(2 M) 및 TE-완충제(10 mM 트리스-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5)와 혼합된 DNA를 2xHBS(50 mM HEPES, 280 mM NaCl, 1.5 mM NaH2PO4, pH 7.2)에 첨가하고 실온(22±2℃)에서 45분 동안 배양하였다. 혼합물 및 최종 농도 100 μM의 클로로퀸을 세포에 첨가하고 표준 세포 배양 조건(10% CO2) 하에 37℃에서 5시간 동안 방치하여 배양한 후에 배지를 5 ㎕/㎖ Myo-[2-3H(N)]-이노시톨(표지화 배지)을 함유하는 신선한 배지로 교체하였다.
간접 HSA 결합 IP3 분석은 초기 3H-이노시톨 표지화 기간 후 수용체 발현 세포에 효능제(리간드) 결합 시 이노시톨 트리스포스페이트(IP3) 2차 메신저의 생성을 유도하는 타키키닌 수용체의 능력을 이용한다. 상기 분석은 높은 펩티드 HSA 결합이 2차 메신저 IP3의 낮은 수용체-매개 생성을 초래할 것이라는 가정에 의존한다. 따라서, 상기 분석은 간접적인 평가 HSA 결합이다.
분석 용액은 세척 완충제(HBSS), 분석 완충제 0.2% OvAlb(HBSS + 10 mM LiCl 및 0,2% w/v 오브알부민) 또는 분석 완충제 1% HSA(HBSS + 10 mM LiCl 및 1% w/v HSA), 용해 완충제(10 mM 포름산) 및 SPA YSI 비드(H2O 중 12.5 ㎎/㎖)를 사용하였다. 분석을 형질감염 다음날에 수행하였다. 간략하게, 표지화 배지를 흡출하고, 플레이트를 세척 완충제로 1회 세척한 후 분석 완충제 0.2% OvAlb 100 ㎕ 또는 분석 완충제 1% HSA를 첨가하고, 30분 동안 사전 배양한 후 효능제와 함께 120분 동안 배양하였다(모두 37℃에서). 배양 후, 즉시 플레이트를 얼음 상에 놓고 배양 배지를 흡출하고 웰당 40 ㎕의 10 mM 포름산을 첨가하였다. 플레이트를 얼음 상에서 적어도 30분 동안 배양하였다. 60 ㎕(1 ㎎/웰) SPA YSI 비드/웰을 고형 백색 96웰 플레이트에 피펫팅하고 35 ㎕의 용해 용액을 플레이트로 옮긴 후 상기 플레이트를 밀봉 덮개로 덮고 10분 동안 진탕시켰다(최대 속도). MicroBeta 플레이트 카운터(Perkin Elmer)에서 플레이트를 카운팅하기 전에 플레이트를 원심분리하고 실온에 8시간 동안 둔다.
실시예 3: 3 H-NKA 경쟁 결합 측정에 의한 펩티드-NK2R 결합의 측정
물질:
CaCl2, 트리스-HCl, EDTA, HEPES, NaCl, NaH2PO4, 클로로퀸, 오브알부민(계란의 알부민), MnCl2·4H2O, 및 바시트라신(Sigma Aldrich). COS-7 원숭이 신장 세포주를 ATCC로부터 수득하였다. DMEM 1885, FBS, 페니실린/스트렙토마이신(P/S), HBSS 및 1 M 트리스/HCl을 Thermo Scientific/Gibco로부터 수득하였다. 백색/투명 바닥 96웰 플레이트를 Costar로부터 수득하였다. 3H-NKA(Novo Nordisk #NNC0392-0000-0497). Ultima Gold XR을 Perkin Elmer로부터 수득하였다. 인간 및 마우스 타키키닌 수용체 1,2,3 mRNA의 암호화 서열을 함유하는 pcDNA3.1(+)을 Genscript(맞춤 주문)로부터 수득하였다. 합성된 펩티드를 염수 + 0.2%(w/v) 오브알부민(OvAlb)에 희석하였다.
인간 Tacr1: NM_001058.4
인간 Tacr2: NM_001057.3
인간 Tacr3: NM_001059.2
방법:
표시된 수용체 중 하나를 암호화하는 벡터 pcDNA3.1(+)(Genscript)로 인산칼슘 형질감염에 의해 일시적으로 형질감염된 COS-7 세포를 사용하여 분석을 수행하였다. 간략하게, CaCl2(2 M) 및 TE-완충제(10 mM 트리스-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5)와 혼합된 DNA를 2xHBS(50 mM HEPES, 280 mM NaCl, 1.5 mM NaH2PO4, pH 7.2)에 첨가하고 실온(22±2℃)에서 45분 동안 배양하였다. 혼합물 및 최종 농도 100 μM의 클로로퀸을 세포에 첨가하고 표준 세포 배양 조건(10% CO2) 하에 37℃에서 5시간 동안 방치하여 배양한 후에 배지를 신선한 유지 배지로 교체하였다.
3H-NKA 결합 분석은 방사성 표지된 (3H) NKA(추적자)와, 관심 수용체를 발현하는 살아있는 세포상의 합성된 펩티드 리간드 간의 경쟁적인 수용체 결합 원리에 의해 펩티드-수용체 결합을 측정한다.
분석 용액은 TKR 완충제(50 mM 트리스/HCl pH 7.5, 5 mM MnCl2, 및 150 mM NaCl), 세척 완충제(TKR 완충제 + 0.2% w/v OvAlb), 결합 완충제(세척 완충제 + 0.1 ㎎/㎖ 바시트라신), 및 추적자 용액(결합 완충제 + ~15000 cpm/웰 3H-추적자)을 사용하였다. 분석을 형질감염 다음 날에 얼음 상에서 수행하였다.
간략하게, 유지 배지를 흡출하고, 플레이트를 저온 세척 완충제로 1회 세척한 후 저온 결합 완충제 100 ㎕를 첨가하고, 4℃에 두어 플레이트가 냉각되게 하였다. 저온 플레이트에 표시된 펩티드(리간드)를 첨가한 바로 다음에 저온 추적자 용액(~15000 cpm/웰)을 첨가하였다. 플레이트를 즉시 4℃로 옮기고 4시간 동안 배양하였다. 배양 후, 저온 세척 완충제로 x2 세척하여 결합을 정지시킨 후에 225 ㎕의 Ultima Gold XR을 첨가하였다. 플레이트를 중간 속도로 대략 30분 동안 진탕시키고 실온에서 밤새 정치시킨 후에 플레이트를 MicroBeta 플레이트 카운터(Perkin Elmer)에서 카운팅하였다.
실시예 4: 환상 아데노신 모노포스페이트(cAMP) 측정에 의한 효능 및 효험의 측정
물질:
CaCl2, 트리스-HCl, EDTA, HEPES, NaCl, 클로로퀸, 3-이소부틸-1-메틸잔틴(IBMX), 및 오브알부민(계란의 알부민)(Sigma Aldrich). COS-7 원숭이 신장 세포주를 ATCC로부터 수득하였다. DMEM 1885, FBS, 페니실린/스트렙토마이신(P/S) 및 HBSS를 Thermo Scientific/Gibco로부터 수득하였다. 고형의 백색 96웰 플레이트를 Corning으로부터 수득하였다. 생물학을 위한 Hithunter cAMP 분석을 Discover X로부터 수득하였다. 인간 및 마우스 타키키닌 수용체 1, 2, 3 mRNA의 암호화 서열을 함유하는 pcDNA3.1(+)을 Genscript(맞춤 주문)로부터 수득하였다. 합성된 펩티드를 염수 + 0.2%(w/v) 오브알부민에 희석하였다.
인간 Tacr1: NM_001058.4
인간 Tacr2: NM_001057.3
인간 Tacr3: NM_001059.2
방법:
효능제-유도된 G-단백질 커플링된 수용체(GPCR) 활성화의 2차 척도로서 사이클린 아데노신 모노포스페이트(cAMP)를 DiscoverX로부터의 Hithunter cAMP-분석에 의해 측정하였다. 표시된 수용체 중 하나를 암호화하는 벡터 pcDNA3.1(+)(Genscript)로 인산칼슘 형질감염에 의해 일시적으로 형질감염된 COS-7 세포를 사용하여 분석을 수행하였다. 간략하게, CaCl2(2 M) 및 TE-완충제(10 mM 트리스-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5)와 혼합된 DNA를 2xHBS(50 mM HEPES, 280 mM NaCl, 1.5 mM NaH2PO4, pH 7.2)에 첨가하고 실온(22±2℃)에서 45분 동안 배양하였다. 혼합물 및 최종 농도 100 μM의 클로로퀸을 세포에 첨가하고 표준 세포 배양 조건(10% CO2) 하에 37℃에서 5시간 동안 방치하여 배양한 후에 배지를 신선한 유지 배지로 교체하였다.
cAMP-분석은 수용체 발현 세포에 효능제(리간드) 결합 시 cAMP 2차 메신저의 생성을 유도하는 타키키닌 수용체의 능력을 이용한다. cAMP의 생성은, Gq-단백질에 대한 커플링(IP3-생성)이 타키키닌 수용체에 의한 주요 신호전달 기전으로 간주되지만, Gs-단백질에 대한 수용체 결합으로부터 유래한다.
분석을 형질감염 다음 날에 수행하였다. 간략하게, 유지 배지를 흡출하고, 플레이트를 HBSS에서 1x 세척한 후 분석 완충제(HBSS + 1 mM IBMX)를 첨가하고, 30분 동안 37℃에서 예비-배양한 다음 37℃에서 효능제(리간드)와 함께 15분 배양하였다. 배양 후, 플레이트에 대해 제조사에 의해 기재된 바와 같이 세포 용해 및 항-cAMP-항체 배양을 수행하였다. Perkin Elmer의 EnVision 다중모드 플레이트 판독기로 발광을 측정하였다.
실시예 5: 펩티드의 합성 및 특성화
일반적인 방법
하기는 수지 결합된 펩티드를 합성하는 방법(아미노산의 탈보호 방법, 수지로부터 펩티드를 절단하고 정제하는 방법을 포함한, SPPS 방법)뿐만 아니라, 생성된 펩티드를 검출하고 특성화하는 방법(LCMS 및 UPLC 방법)에 관한 것이다.
SPPS 방법
사용된 Fmoc-보호된 아미노산 유도체는 권장된 표준이었다: Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(BOC)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Trp(BOC)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Val-OH 및 Fmoc-Lys(Mtt)-OH(예를 들어, Anaspec, Bachem, Iris Biotech, 또는 NovabioChem으로부터 공급된다).
N-말단 아미노산은 알파 아미노기에서 Boc 보호된다(예를 들어, N-말단에 Asp가 있는 펩티드의 경우 Boc-Asp(OtBu)-OH).
Mtt로 보호된 리신을 사용하여 리신의 입실론-질소에 치환기를 도입하였다(Fmoc-Lys(Mtt)-OH). Fmoc-8-아미노-3,6-디옥사옥탄산 및 Fmoc-Glu-OtBu와 같은 적합하게 보호된 구성 요소를 치환체의 도입에 사용하였다. 지방산 모이어티의 도입은 옥타데칸디오산 모노-3급-부틸-에스테르와 같은 구성 요소를 사용하여 달성되었다.
SPPS를 Protein Technologies(Tucson, AZ 85714 USA)의 SymphonyX 고상 펩티드 합성기에서 100-㎛ol, 150-㎛ol, 300 ㎛ol 또는 450-㎛ol 규모로, 수지 로딩에 비해 4, 6, 12 또는 18-배 과잉의 Fmoc-아미노산(300 mM Oxyma Pure®와 함께 DMF 중의 300 mM)을 사용하여 수행하였다. Fmoc-PAL AM 수지(Novabiochem, 로딩량, 예를 들어 0.61 nmol/g), Rink Amide AM 폴리스티렌 수지(Novabiochem, 로딩량, 예를 들어 0.64 mmol/g), 또는 2-클로로트리틸 클로라이드 수지(로딩량 1.42 mmol/g)를 고체 지지체로서 사용하였다. Fmoc-탈보호를 DMF 중의 20% 피페리딘을 사용하여 수행하였다. 커플링을 DMF 중의 1:1:1:1 아미노산/(Oxyma Pure®)/DIC/콜리딘을 사용하여 수행하였다. DCM(1x1.5 ㎖) 및 DMF 상부 세척(6x6 ㎖)을 탈보호 단계와 결합 단계 사이에서 수행하였다. 커플링 시간은 일반적으로 60분(60분 내지 8시간 범위)이었다. 비제한적으로 Fmoc-Arg(Pbf)-OH 및 Fmoc-Gly-OH를 포함한 일부 아미노산은 "이중 커플링"되었으며, 이는 첫 번째 커플링후(예를 들어, 60분), 수지가 배출되고 더 많은 시약이 첨가되며(아미노산, Oxyma Pure®, DIC 및 콜리딘), 혼합물이 다시 반응되었음(예를 들어, 60분)을 의미한다. 먼저 수지를 DCM(1 x 1분)으로 세척한 다음 상기 수지를 HFIP/DCM/TIS(75/23/2)(1 x 5분)에 현탁시킴으로써 Mtt 기를 제거하였다. 수지를 DCM으로 세척하고 HFIP/DCM/TIS(75/23/2)에 현탁시키고(사이에 DCM 세척 2 x 25분), 후속적으로 DMF(1x), DCM(4x), DMF(2x), 피페리딘/DMF(20:80), DMF(1x), DCM(1x), DMF(6x)로 차례로 세척하였다.
수지로부터 절단
합성 후에, 수지를 DCM으로 세척하고, 펩티드를 TFA/TIS/수(95/2.5/2.5)로 2-3시간 처리한 다음 디에틸에테르로 침전시켜 수지로부터 절단하였다. 침전물을 디에틸에테르로 세척하였다.
정제
조 펩티드를 적합한 용매 혼합물(예를 들어, 10/20/70 아세트산/MeCN/수)에 용해시키고 C18-실리카겔을 함유하는 컬럼 상에서 역상 예비 HPLC(Waters Prep)로 정제하였다. 증가하는 구배의 0.1 % TFA를 함유하는 수 중 MeCN, 또는 증가하는 구배의 포스페이트 완충제 중의 80:20 MeCN:MQ-수(20 mm Na2HPO4, 20 mm NaH2PO4, MQ 중 10% MeCN, pH 7.2)로 용출을 수행하였다. UPLC와 LCMS 방법을 조합하여 관련 분획을 분석하고 적절한 분획을 모아 동결 건조시켰다.
검출 및 특성화 방법
LCMS 방법
Waters Acquity UPLC 시스템 및 LCT Premier XE 질량 분석기(Micromass)로 이루어진 셋업에서 LCMS를 수행하였다. 실온에서 적절한 부피의 샘플(바람직하게는 2-10 ㎕)을 컬럼(Waters Acquity UPLC BEH, C-18, 1.7 ㎛, 2.1 ㎜ x 50 ㎜)에 주입하고 A, B(및 D)의 구배로 용출시킴으로써 분석을 수행하였다.
방법: LCMS34
용출제: A: MQ-수 중 0.1% 포름산. B: 아세토니트릴 중 0.1% 포름산. 구배: 0.4 ㎖/분에서 4.0분 동안 선형 5% - 95% 아세토니트릴. 검출: 214 ㎚(TUV(조정가능한 UV 검출기)로부터의 아날로그 출력) MS 이온화 모드: API-ES(양성 모드). 스캔: 100-2000 amu(대안적으로 500-2000 amu), 단계 0.1 amu.
방법: LCMS43
용출제: A: MQ-수. B: 아세토니트릴 D: 수:아세토니트릴 1:1 중 100 mm 트리에틸암모늄 아세테이트(Et3N + AcOH로 7.8로 pH 조절됨). 구배: 0.4 ㎖/분에서 4.0분 동안 선형 0% - 97.5% 아세토니트릴 + 등용매 2.5% D. 검출: 214 ㎚(TUV(조정가능한 UV 검출기)로부터의 아날로그 출력) MS 이온화 모드: API-ES(양성 모드). 스캔: 100-2000 amu(대안적으로 500-2000 amu), 단계 0.1 amu.
UPLC 방법
이중 밴드 검출기가 장착된 Waters UPLC 시스템을 사용하여 역상 분석을 수행하였다. ACQUITY UPLC BEH, C18, 1.7 um, 2.1 ㎜ x 150 ㎜ 컬럼을 사용하여 214 ㎚에서 UV 검출을 수집하였다. UPLC 시스템은 2개의 용출제 저장소 A와 B에 연결되었다.
방법: UPLC01:
컬럼 온도: 40℃. 용출제: A: 99.95% MQ-수, 0.05% TFA, B: 99.95% CH3CN, 0.05% TFA. 하기의 선형 구배를 사용하였다: 16분에 걸쳐 0.40 ㎖/분의 유량으로 95% A, 5% B에서 40% A, 60% B.
방법: UPLC02:
컬럼 온도: 40℃. 용출제: A: 99.95% MQ-수, 0.05% TFA, B: 99.95% CH3CN, 0.05% TFA. 하기의 선형 구배를 사용하였다: 16분에 걸쳐 0.40 ㎖/분의 유량으로 95% A, 5% B에서 5% A, 95% B.
방법: UPLC060:
컬럼 온도: 60℃. 용출제: A: 0.02 m Na2SO4, 0.002 m Na2HPO4, 0.002 m NaHPO4, B: MQ-수 중 70% CH3CN. 단계 구배: 3분에 걸쳐 10-20% B, 이어서 17분에 걸쳐 20-50% B, 이어서 1분에 걸쳐 50-80% B. 단계 구배 실행-시간: 0.40 ㎖/분의 유량으로 21분.
방법: UPLC061:
컬럼 온도: 60℃. 용출제: A: 0.02 m Na2SO4, 0.002 m Na2HPO4, 0.002 m NaHPO4, B: MQ-수 중 70% CH3CN. 단계 구배: 3분에 걸쳐 10-20% B, 이어서 17분에 걸쳐 20-80% B, 이어서 1분에 걸쳐 80-90% B. 단계 구배 실행-시간: 0.40 ㎖/분의 유량으로 21분.
실시예 6: 공액화 모이어티의 구조
Figure pct00018
세마글루티드 연장기: 2xOEG-감마Glu-C18 이산. 중성 링커는 "Conj-Neu-C18DA"라 지칭된다.
Figure pct00019
3x감마-Glu-C18 이산. 음성 하전된 링커는 "Conj-Neg"라 지칭된다.
Figure pct00020
Glu-C18 이산. 양성 하전된 링커는 "Conj-Pos1"이라 지칭된다.
Figure pct00021
Glu-C18 이산. 양성 하전된 링커는 "Conj-Pos2"라 지칭된다.
Figure pct00022
2xOEG-감마-Glu-C16 이산
Figure pct00023
2xOEG-감마-Glu-C14 이산
Figure pct00024
2xOEG-감마-Glu-C20 이산
Figure pct00025
2xOEG-감마-Glu-C18 일산
실시예 7: NK2R 활성화, 신호전달 및 선택성에 대한 NKA(4-10) 유사체상의 아미노산 치환 조사.
4번 위치(X 1 ) 돌연변이
선택성 및 활성화를 실시예 1에 기재된 바와 같이 인간 NK1-, NK2- 및 NK3R에 대한 IP3-분석에 의해 측정하였다. Gs-커플링을 실시예 4에 기재된 바와 같이 cAMP 축적에 의해 조사하였다. 결합을 실시예 3에 기재된 바와 같이 경쟁적 3H-NKA 결합에 의해 측정하였다.
결과:
Figure pct00026
[표 7]
화합물 304, 335, 305, 336, 306 및 337의 선택성 및 수용체 활성화의 비교. 아미노산 서열에서 연장기의 위치는 별표 "*"로 표시된다. 달리 명시되지 않는 한, "*"는 "Conj-Neu-C18DA"이며 그 구조는 실시예 6에 예시되어 있다. 데이터는 EC50 또는 Graphpad Prism 8에서 S자, 4PL, X is log(농도) 방정식을 사용하여 비선형 회귀에 의해 계산된 효능으로서 표시된다. ND: 결정되지 않음.
요약
·Asp4-to-Glu4 치환은 NKA(4-10) 유사체에서 hNK2R IP3 활성화를 변화시키지 않는다(화합물: 304-337).
·Asp4-to-Glu4 치환은 Tyr-유사체에 대한 hNK2R 선택성을 변화시키지 않지만 결합 친화도를 감소시킨다(화합물: 305 및 336).
·Glu4 Tyr-유사체는 Gs를 활성화하지 않는다(화합물 336).
5번 위치(X 2 ) 돌연변이
선택성 및 활성화를 실시예 1에 기재된 바와 같이 인간 NK1-, NK2- 및 NK3R에 대한 IP3-분석에 의해 측정하였다.
결과:
Figure pct00027
[표 8]
화합물 304 대 306(Lys5 -> Arg5), 337 대 335, 336 대 357을 조사하여 획득된 결과. 아미노산 서열에서 연장기의 위치는 별표 "*"로 표시된다. 달리 명시되지 않는 한, "*"는 "Conj-Neu-C18DA"이며 그 구조는 실시예 6에 예시되어 있다. 데이터는 EC50 또는 Graphpad Prism 8에서 S자, 4PL, X is log(농도) 방정식을 사용하여 비선형 회귀에 의해 계산된 효능으로서 표시된다. ND: 결정되지 않음.
요약
·5번 위치(X2)를 아르기닌 치환을 사용하여 시험하였다. 일반적으로, 아르기닌 치환은 NK2R 활성화, 선택성 또는 편향에 영향을 미치지 않았다(화합물:304-357).
·Glu4_Tyr6 유사체에서, Arg5 치환은 Gq 편향에 영향을 주지 않고 NK2- 및 NK1R 효능을 증가시킬 수 있었다(화합물: 336, 337 및 357).
·Arg5 치환은 NKA(4-10)Glu4 유사체에서 NK3R 효능을 증가시킨다(화합물: 335 및 337).
6번 위치(X 3 ) 돌연변이
선택성 및 활성화를 실시예 1에 기재된 바와 같이 인간 NK1-, NK2- 및 NK3R에 대한 IP3-분석에 의해 측정하였다. Gs-커플링을 실시예 4에 기재된 바와 같이 cAMP 축적에 의해 조사하였다. 결합을 실시예 3에 기재된 바와 같이 경쟁적 3H-NKA 결합에 의해 측정하였다.
결과:
Figure pct00028
[표 9]
화합물 304, 305, 361, 362, 363, 330 및 356의 선택성 및 수용체 활성화의 비교. NmLeu는 L-N-메틸류신이다. 아미노산 서열에서 연장기의 위치는 별표 "*"로 표시된다. 달리 명시되지 않는 한, "*"는 "Conj-Neu-C18DA"이며 그 구조는 실시예 6에 예시되어 있다. 데이터는 EC50 또는 Graphpad Prism 8에서 S자, 4PL, X is log(농도) 방정식을 사용하여 비선형 회귀에 의해 계산된 효능으로서 표시된다. ND: 결정되지 않음.
요약
·NKA(4-10) 유사체상의 Phe6에서 Tyr6 치환은 약간의 효능 상실과 함께 NK2R-선택성, 수용체 결합 및 Gs-커플링 효능을 촉진한다(화합물: 304 및 305).
·Phe6의 페닐에서 4번 위치에서 3번 위치로의, 티로신의 페닐기 상의 하이드록실기의 위치 변화는 NK2R 선택성을 감소시키고, NK1R 효능을 Phe-유사체 수준으로 회복시킨다(화합물: 304, 305 및 361).
·프롤린의 도입 또는 Ty6 및 Val7의 전환은 NK1-3R에 대한 수용체 활성화의 완전한 손실을 야기한다(화합물: 362 및 363).
·I-4-Phe 및 dPhe 치환은 NK2R 활성화를 완전히 파괴한다(화합물: 330 및 356).
7번 위치(X 4 ) 돌연변이
선택성 및 활성화를 실시예 1에 기재된 바와 같이 인간 NK1-, NK2- 및 NK3R에 대한 IP3-분석에 의해 측정하였다. Gs-커플링을 실시예 4에 기재된 바와 같이 cAMP 축적에 의해 조사하였다. 결합을 실시예 3에 기재된 바와 같이 경쟁적 3H-NKA 결합에 의해 측정하였다.
결과:
Figure pct00029
Figure pct00030
[표 10]
화합물 314, 315, 335, 305, 348, 351, 304, 387, 336, 397, 344, 366, 381, 382, 383, 384, 및 386의 선택성 및 수용체 활성화의 비교. 아미노산 서열에서 연장기의 위치는 별표 "*"로 표시된다. 달리 명시되지 않는 한, "*"는 "Conj-Neu-C18DA"이며 그 구조는 실시예 6에 예시되어 있다. 데이터는 EC50 또는 Graphpad Prism 8에서 S자, 4PL, X is log(농도) 방정식을 사용하여 비선형 회귀에 의해 계산된 효능으로서 표시된다. ND: 결정되지 않음.
요약
·7번 위치의 아르기닌 치환은 NKA(4-10) 유사체에 대한 수용체 활성화 특성의 손상을 야기한다(화합물: 314, 315, 335 및 336).
·7번 위치에서 이소류신(S-동형) 치환이 가능하며 Tyr6 NKA(4-10) 유사체의 효능, 효험 및 선택성을 변화시키지 않는다. 그러나 이소류신(R-동형)은 NK2R 효능을 감소시킨다. 두 이소류신 치환 모두 Gs 신호전달 및 수용체 결합 능력을 감소시킨다(화합물: 348 및 351).
·NKA(4-10) 유사체상의 쓰레오닌 치환은 NK2R 활성을 감소시키지만, Phe6-NKA(4-10) 유사체에서 선택성 드라이버로 작용할 수 있다. Thr7은 수용체 결합을 촉진하고 NKA와 유사한 Gs 활성화를 지속한다(화합물: 304, 387, 305, 397, 344, 366, 381, 382, 383, 384).
·7번 위치의 세린 치환은 선택성에 영향을 미치지 않으면서 NK2R 효능 및 효험을 감소시킨다(화합물: 305 및 386).
8번 위치(X 5 ) 돌연변이
선택성 및 활성화를 실시예 1에 기재된 바와 같이 인간 NK1-, NK2- 및 NK3R에 대한 IP3-분석에 의해 측정하였다. 결합을 실시예 3에 기재된 바와 같이 경쟁적 3H-NKA 결합에 의해 측정하였다.
Figure pct00031
[표 11]
화합물 310, 312, 322, 308, 389, 373, 402, 392, 385, 396, 및 393의 선택성 및 수용체 활성화의 비교. 아미노산 서열에서 연장기의 위치는 별표 "*"로 표시된다. 달리 명시되지 않는 한, "*"는 "Conj-Neu-C18DA"이며 그 구조는 실시예 6에 예시되어 있다. 데이터는 EC50 또는 Graphpad Prism 8에서 S자, 4PL, X is log(농도) 방정식을 사용하여 비선형 회귀에 의해 계산된 효능으로서 표시된다. ND: 결정되지 않음.
요약
·NKA(2-10) 상의 베타-알라닌 치환은 NK2- 및 NK3R 선택성을 촉진하지만 NK2R 효능 및 효험을 감소시킨다(화합물: 310, 312, 322 및 308).
·Aib8 치환은 Phe6-NKA(4-10) 유사체에서 선택성을 촉진한다(화합물: 389 및 373).
·8번 위치 d-Ser 치환은 Phe6- 및 Tyr6-NKA(4-10) 유사체뿐만 아니라 내인성 NKA(4-10) 주쇄를 갖는 NKA(4-10) 유사체에서 선택성을 촉진하지만 NK2R 친화도를 감소시킨다(화합물: 389, 402, 392, 385, 396, 393).
9번 위치(X 6 ) 돌연변이
선택성 및 활성화를 실시예 1에 기재된 바와 같이 인간 NK1-, NK2- 및 NK3R에 대한 IP3-분석에 의해 측정하였다.
Figure pct00032
[표 12]
화합물 304, 389, 305, 392, 344 및 393의 선택성 및 수용체 활성화의 비교. 아미노산 서열에서 연장기의 위치는 별표 "*"로 표시된다. 달리 명시되지 않는 한, "*"는 "Conj-Neu-C18DA"이며 그 구조는 실시예 6에 예시되어 있다. 데이터는 EC50 또는 Graphpad Prism 8에서 S자, 4PL, X is log(농도) 방정식을 사용하여 비선형 회귀에 의해 계산된 효능으로서 표시된다. ND: 결정되지 않음.
요약
·N-메틸-류신은 NKA(4-10) 유사체상의 hNK2R에 대한 적당한 효능 증가를 유도한다(화합물: 304-393).
·N-Me-Leu는 NKA(4-10) 유사체에서 NK2R 선택성을 유도한다(화합물: 304-393).
10번 위치(X 7 ) 돌연변이
선택성 및 활성화를 실시예 1에 기재된 바와 같이 인간 NK1-, NK2- 및 NK3R에 대한 IP3-분석에 의해 측정하였다. Gs-커플링을 실시예 4에 기재된 바와 같이 cAMP 축적에 의해 조사하였다. 결합을 실시예 3에 기재된 바와 같이 경쟁적 3H-NKA 결합에 의해 측정하였다.
Figure pct00033
[표 13]
화합물 316, 305, 344, 369, 353, 313, 370, 395, 및 394의 선택성 및 수용체 활성화의 비교. cHexAla는 L-사이클로헥실알라닌이다. 4-MeOPhe는 L-4-메톡시페닐알라닌이다. 아미노산 서열에서 연장기의 위치는 별표 "*"로 표시된다. 달리 명시되지 않는 한, "*"는 "Conj-Neu-C18DA"이며 그 구조는 실시예 6에 예시되어 있다. 데이터는 EC50 또는 Graphpad Prism 8에서 S자, 4PL, X is log(농도) 방정식을 사용하여 비선형 회귀에 의해 계산된 효능으로서 표시된다. ND: 결정되지 않음.
요약
·10번 위치의 메티오닌은 노르류신 및 메톡시닌에 비해 NK2R 활성화 및 결합을 개선시킨다. 그러나, 메톡시닌 및 노르류신은 메톡시닌-유사체와 양호한 선택성을 제공하며, 이는 노르류신-유사체와 비교하여 효능이 더 크다(화합물: 316, 305, 344, 394 및 395).
·선택성, 효능, 신호전달 및 결합을 유지하면서 4F-Phe에 의한 메티오닌 치환이 가능하다(화합물: 313, 353, 369 및 370).
실시예 8: 생체 내 연구를 위한 물질 및 방법
물질:
NaH2PO4·H2O, Na2HPO4·2H2O, 프로필렌 글리콜, 래트 및 마우스용 유지 식단(정규 사료, #1320, Altromin), C57BL/6NRj 마우스(Janvier Labs), 지방에서 60% 에너지를 사용하는 고지방식단(HFD)(# D12492, Research Diets Inc.), 펩티드 유사체(Novo Nordisk), d-글루코스(Sigma), 인슐린(Novo Nordisk), 멸균 염수 용액(Apoteket), Tween-80(Sigma), 로페라미드(Sigma), 글루코미터 및 글루코스 스트립(Bayer), 및 대사 및 행동 정보 평가를 위한 Promethion System(Sable Systems International).
비행시간형 액체 크로마토그래피 질량 분석법(TF-LC-MS): 에탄올, 메탄올, 아세토니트릴, 포름산, 밀리-q-수, TurboFlow Cyclone 컬럼 0.5x50 ㎜, Aeris Peptide XB-C18 2.1x50 ㎜(3.6 ㎛), Thermo TSQ Altis 삼중 사중극자 질량 분석기.
대사산물 식별 액체 크로마토그래피 질량 분석법(MetID-LC-MS): 메탄올, 아세토니트릴, 포름산, 밀리-q-수, Water Acquity UPLC 단백질 BEH C4 2.1x50 ㎜ 300 Å(1.7 ㎛), Bruker MaXis QTOF.
펩티드 유사체용 생체내 완충제: 8 mM 포스페이트 및 240 mM 프로필렌 글리콜, pH 8.2.
로페라미드용 생체내 완충제: 1%(v/v) Tween-80이 보충된 염수.
방법:
젖을 뗀 때부터 약 6-10주령까지 유지 식단을 제공하면서 동물을 수용하였다. 금식을 제외하고는 언제든지 마우스는 12시간의 명암 주기 및 섭씨 22-24도의 온도에서 먹이와 물에 자유롭게 접근할 수 있었다. 모든 동물 실험은 덴마크 동물 검사원 규정에 따라 수행되었다. 식단-유도된 비만 마우스를 사용한 연구의 경우, 실험 전 적어도 20주 동안 마우스에게 HFD를 공급하였다. 구체적으로, 글루코스 및 인슐린 내성 검사를 받고 있는 마우스의 경우, 45 g 이상의 마우스를 선택하였다.
간접 열량측정을 사용하여 용량-의존적으로 에너지 소비(EE)를 증가시키는 개별 펩티드 유사체의 능력을 평가하였으며, 우리는 대사 케이지 및 Promethion 시스템에 의해 측정된 간접 열량측정을 사용하였다. 이를 위해서, 산소 소비를 EE에 대한 대용 척도로서 사용하였다. 기질 선호도(지방 또는 탄수화물)를 호흡 교환 비(RER)를 사용하여 평가하였다. 동시에, 보행 거리와 같은 행동 정보, 및 물과 음식 섭취량을 기록하였다.
실험에 앞서, DIO 마우스를 적어도 10일(외부에서 5일, 및 안정한 시스템 기체 분석기 모듈에서 적어도 5일) 동안 습관화 케이지로 옮겨 적응시켰다. EE 평가를 위한 모든 생체 내 화합물 시험을 위해서, 마우스는 오후 2시에서 4시 사이에 피하 주사를 받았다.
약동학: 개별 펩티드 유사체의 생체내 반감기를 평가하기 위해서 우리는 펩티드 유사체를 1회 주사한 약 10주령의 마른 야생형 마우스를 사용하였다. 각 샘플 시점에 대해서 3-4 마리의 마우스를 사용하고 주사 후 표시된 시점에서 턱밑 정맥에서 혈액을 채취하였다. 주사 전에 마우스가 표준 사료 식단에 자유롭게 접근할 수 있게 하였다. 마우스에 0.5 ㎎/㎏ 펩티드 유사체를 2 ㎖/㎏ 부피로 피하 주사하였다.
혈액 샘플에 존재하는 펩티드 유사체 및 대사산물(들)의 양을 각각 TF-LC-MS 및 MetID-LC-MS에 의해 측정하였다.
TF-LC-MS:
샘플 제조: 1 부피의 혈장을 3 부피의 에탄올로 침전시킨다(내부 표준 포함). 혼합물을 13000 g에서 20분 동안 원심분리한다. 1 부피의 상등액을 2 부피의 Milli-Q 수(1% 포름산)로 희석한다.
보정 곡선: 펩티드 유사체를 블랭크 마우스 혈장에 주입하였다. 범위: 0.5 내지 2000 nM(선형 1/x2).
크로마토그래피, 이동상: 이동상 A: 5%(50/50 메탄올/아세토니트릴) + 95% Milli-Q + 1% 포름산. 이동상 B: 5% Milli-Q + 95%(50/50 메탄올/아세토니트릴) + 1% 포름산.
컬럼: TurboFlow Cyclone 0.5x50 ㎜ 및 Aeris Peptide XB-C18 2.1x50 ㎜(3.6 ㎛)
질량 분석법: Thermo TSQ Altis 삼중 사중극자, 양성 전기분무 이온화 모드, MRM-모드.
MetID-LC-MS:
샘플 제조: 1 부피의 혈장을 3부피의 메탄올로 침전시킨다. 혼합물을 13000 g에서 20분 동안 원심분리한다. 1 부피의 상등액을 2 부피의 Milli-Q 수(1% 포름산)로 희석한다.
보정 곡선: 펩티드 유사체를 블랭크 마우스 혈장에 주입하였다. 범위: 20, 200 및 2000 nM(선형 1/x2).
크로마토그래피: 이동상 A: Milli-Q 수 중 0.1% 포름산. 이동상 B: 아세토니트릴 중 0.1% 포름산.
컬럼: Water Acquity UPLC 단백질 BEH C4 2.1x50 ㎜ 300Å(1.7 ㎛)
질량 분석법: Bruker MaXis QTOF, 양성 전기분무 이온화 모드
전체 스캔(300에서 1800까지의 m/z) 및 MS/MS.
에너지 소비 스크리닝: 습관화 후, 마우스에 2 ㎖/㎏ 부피의 0.5 ㎎/㎏ 펩티드 유사체를 피하 주사하였다. 마우스에 q.a.d.(격일) 주사하고 총 2회의 주사를 제공하였다. EE를 평가하고 비히클에 대한 증가를, 주입 후 30시간 동안의 평균 산소 소모 퍼센트로서 계산하였다. 주사 전에 펩티드 유사체를 생체내 완충제에 0.25㎎/㎖로 용해시켰다.
에너지 소비 및 체중 감소 약력학: DIO 마우스에서 간접 열량측정에 의해 EE를 용량 의존적으로 증가시키는 개별 펩티드 유사체의 능력을 평가한다. 습관화 시작부터 실험이 끝날 때까지 체중을 모니터링하였다. 습관화 후, 마우스를 4개의 상이한 용량의 NKA(4-10) 유사체를 매일 주사하거나 또는 비히클을 9일 동안 매일 피하 주사하여 처리하였다.
EE, 체중, 음식 섭취량, 수분 섭취량, 및 보행 거리를 9일 내내 관찰하였다. 비히클에 대한 EE 증가는 주사 후 30시간 동안의 평균 산소 소모 퍼센트로서 계산하였다. 주사 전에 펩티드 유사체를 용해시키고 생체내 완충제에 희석시켰다. 시험된 화합물에 대한 상이한 반감기를 고려하기 위해, 주어진 화합물의 개별적인 pk-프로파일에 기초하여 각 화합물에 대한 용량을 계산하였다. 시험된 화합물의 동일한 AUC에 도달하기 위해서 하기에 나타내는 바와 같이 화합물 305에 대해 각각의 화합물에 대한 표적 AUC를 계산하였다.
305 pK 용량: 330 nmol/㎏
305 Cmax: 3453 nM
305 AUC: 28771
인슐린 내성 시험: DIO 마우스에서 NK2R-선택적 유사체를 단일 피하 주사한지 24시간 후에 복강내 인슐린 내성 시험(ipITT)을 사용하여 인슐린 내성에 대한 영향을 측정하였다. 실험 당일, 마우스를, 염수 용액 (0.2 ㎖/㎏)에 희석된 1.5 U/㎏ 인슐린을 복강내 주사하기 2시간 전에 금식시켰다. 글루코미터를 사용하여 글루코스의 변화를 모니터링하였다.
글루코스 내성 시험: DIO 마우스에서 NK2R-선택적 유사체를 단일 피하 주사한지 24시간 후에 복강내 글루코스 내성 시험(ipGTT)을 사용하여 내당능에 미치는 영향을 측정하였다. 실험 당일, 마우스를, 염수 용액(0.1 ㎖/㎏)에 희석된 1 g/㎏ 글루코스를 복강내 투여하기 4시간 전에 금식시켰다. 글루코미터를 사용하여 글루코스의 변화를 모니터링하였다.
기능장애성 배뇨 시험: 기능장애성 배뇨에 대한 영향을 조사하기 위해 로페라미드(5 ㎎/㎏)를 사용하여 마른 야생형 수컷 및 암컷 마우스에서 변비를 유도하였다. 위관 영양 30분 후, 마우스에게 비히클, 130, 260 및 수컷의 경우 또한 325 nmol/㎏의 EB344를 피하 투약하였다. 로페라미드 위관 영양 6시간 후, 마우스를 케이지에서 꺼내고 분변 펠릿의 수를 카운팅하였다.
실시예 9: NK2R 활성화, 신호전달 및 선택성에 대한 NKA 및 NKA(4-10) 유사체 상의 "공액화 모이어티"의 위치 및 조성 조사
내인성 NKA 및 NK2R-선택적 NKA(4-10) 유사체에 대해 "공액화 모이어티" 즉 "연장기"의 위치 및 조성을 조사하였다.
연장기 위치는 NKA(4-10) 유사체의 N 말단 영역에서 다루어졌다.
펩티드 주쇄와 지방산 사이의 링커 전하를 조사하였다.
지방산 종을 조사하였다.
선택성 및 활성화를 실시예 1에 기재된 바와 같이 인간 NK1-, NK2- 및 NK3R에 대한 IP3-분석으로 측정하였다. Gs-커플링을 실시예 4에 기재된 바와 같이 cAMP 축적에 의해 조사하였다. 결합을 실시예 3에 기재된 바와 같이 경쟁적 3H-NKA 결합에 의해 측정하였다. 알부민 결합을 실시예 2에 기재된 바와 같이 1% 인간 혈청 알부민의 존재 또는 부재 하에서 IP3 분석을 사용하여 수용체 활성화에 의해 측정하였다. 에너지 소비를 실시예 8에 기재된 바와 같이 대사 케이지에 수용된 식단-유도된 비만 마우스에서 측정하였다. 약동학 및 노출을 실시예 8에 기재된 바와 같이 화합물로 처리된 마른 마우스의 혈장에서 측정하였다.
Figure pct00034
Figure pct00035
[표 14]
NK2R-선택적 NKA(4-10) 유사체에 대한 수용체 활성 및 선택성에 대한 연장기 조성의 비교. 아미노산 서열에서 연장기의 위치는 별표 "*"로 표시되고, 연장기/공액화 모이어티의 구조는 실시예 6에서 찾을 수 있다. Conj: 공액; Neu: 중성 전하; Pos: 양전하; Neg: 음전하; MA: 일산; DA: 이산. Cxx는 지질 중의 탄소 원자 길이를 지칭한다, 즉 C18은 18개의 탄소 원자를 함유한다.
Figure pct00036
[표 15]
시험관내 알부민 결합에 대한 NK2R-선택적 NKA(4-10) 유사체에 대한 연장기 조성의 영향, 및 생체내 화합물 노출 및 약동학 대 생체내 에너지 소비의 비교. 아미노산 서열에서 연장기의 위치는 별표 "*"로 표시되고, 연장기/공액화 모이어티의 구조는 실시예 6에서 찾을 수 있다. BLLQ: 정량분석의 하한 미만. Conj: 공액; Neu: 중성 전하; Pos: 양전하; Neg: 음전하; MA: 일산; DA: 이산. Cxx는 지질 중의 탄소 원자 길이를 지칭한다, 즉 C18은 18개의 탄소 원자를 함유한다.
결과
연장기 위치
·NKA(4-10) 유사체, 화합물 301 및 307은, Lys5 연장된 유사체가 활성이지만 화합물 304로 예시된 N-말단 연장과 비교하여 NK2R 효능을 감소시킨다는 것을 보여준다.
·하나의 펩티드 주쇄 상에 N-말단 및 Lys5에 있는 2개의 연장기를 갖는 화합물 302는 NKA(4-10) 유사체를 불활성화한다(화합물 302).
링커 전하
·지방산 모이어티와 펩티드 주쇄 사이 연장기의 링커의 전하는 NKA(4-10) 유사체의 수용체 활성화에 중요하다.
·중성 하전된 링커는 NK2R 선택성, 효능 및 효험을 조절하지 않는다. (화합물: 304 및 305 vs 374 및 375).
·N-말단 연장기 또는 Lys5 상의 음성 하전된 링커는 NKA(4-10) 유사체의 NK2R 효능을 감소시킨다(화합물: 319 및 333).
·화합물 318 및 321에서와 같이, 양성 하전된 링커는 효능을 감소시키고 알부민 결합을 증가시켜, 화합물 305의 중성 하전된 링커에 비해 노출 수준을 낮추고 에너지 소비를 감소시킨다.
·연장기상의 이산 지방산 모이어티는 선택성과 반감기에 중요하다. 화합물 305 및 344에서와 같이 C18 이산으로부터, 화합물 390 및 391에서와 같이 C18 일산 지방산으로의 치환은 NK2R 선택성을 완전히 파괴하고 반감기를 감소시킨다.
·C18 이산 지방산 길이는 NK2R 효능 및 선택성에 최적이다. 화합물 344에서와 같이 연장기상의 C18 이산 지방산 길이를 C14 이산(화합물 368) 또는 C16 이산(화합물 367)으로 감소시키거나, 또는 C20 이산(화합물 380)으로 연장시키는 것은 모두 NK2R 선택성 및 효능을 감소시킨다. 각각 C16 및 C14 이산을 갖는 화합물 367 및 368도 또한 NK2R 효능을 상실시킨다.
요약
본 실시예에 기초하여, 화합물 304, 305 및 344에 의해 예시된 바와 같이 NKA(4-10) 유사체의 N-말단에 위치하는 2OEG-감마Glu-C18 이산을 구성하는 연장기는 NK2R 활성화, 선택성, 반감기 및 에너지 소비 유도에 최적이다.
실시예 10 식단-유도된 비만 마우스에서 체중 감소에 대한 NK2R-선택적 NKA(4-10) 유사체의 조사
식단-유발된 비만(DIO) 마우스에서 에너지 소비 및 체중 감소에 대한 연장된 NKA 유사체의 효과.
에너지 소비를 실시예 8에 기재된 바와 같이 대사 케이지에 수용된 식단-유도된 비만 마우스에서 측정하였다. 약동학 및 노출을 실시예 8에 기재된 바와 같이 화합물로 처리된 마른 마우스의 혈장에서 측정하였다.
Figure pct00037
[표 16]
NK2R-선택적 NKA(4-10) 유사체 304 및 고도의 NK2R-선택적 효능제, 화합물 305, 344 및 383의 반감기 대 생체내 효능 및 효험의 비교. 아미노산 서열상의 연장기의 위치를 별표 "*"로 표시하며, 연장기/공액화 모이어티의 구조를 실시예 6에서 찾을 수 있다.
결과
·모든 NK2R-선택적 NKA(4-10) 유사체(화합물 304, 305, 344 및 383)는 비히클과 비교하여 11-12%의 유사한 효능으로 에너지 소비를 증가시켰다.
·에너지 소비 효능이, 5번 위치에 Phe를 갖는 화합물(304 및 383)과 비교하여 Tyr5 돌연변이를 갖는 유사체(화합물 305 및 344)에서 개선되었다.
·선택적 NK2R 효능제의 체중 감소 효능을 반감기에 의해 측정한다. 따라서, 반감기가 5.5시간인 화합물 305는, 반감기가 모두 대략 10시간 이상인 화합물 304, 344 및 383과 비교하여 대략 50% 감소된 체중 감소 효능을 갖는다.
·고도의 NK2R-선택적 유사체, 예를 들어 305, 344 및 383은 화합물 304와 비교하여 약간 낮은 체중 감소 효능을 나타내었다. 이는 아마도 잔류 NK1R 활성화에 기인하는 듯 하다.
요약
본 실시예는 본 개시내용의 고도로 NK2R 선택적이고 수명이 긴 화합물, 예를 들어 344 및 383이 체중 감소 유도에 바람직함을 입증한다.
실시예 11: 식단-유도된 비만 마우스에서 글루코스 대사에 대한 NK2R-선택적 NKA(4-10) 유사체의 효과 조사
인슐린 저항성 및 전-당뇨 식단-유도된 비만(DIO) 마우스에서 글루코스 및 인슐린 내성에 대한 연장된 고도의 NK2R-선택적 NKA(4-10) 유사체의 효과.
글루코스 및 인슐린 내성 시험을 실시예 8에 기재된 바와 같이 식단-유도된 비만 마우스에서 수행하였다.
결과
결과를 도 6에 나타낸다. 고도의 NK2R-선택적 분자 344는 비만 마우스에서 글루코스와 인슐린 내성 모두를 개선시켰다. 인슐린 내성에 대한 효과는 공복 혈당 감소와 인슐린 민감성 증가 모두에 의해 주도되었다.
요약
약리학적 NK2R 활성화는 식단-유도된 비만 마우스에서 글루코스과 인슐린 내성을 개선시킨다. 따라서 본 개시내용의 화합물은 인슐린 저항성 및 당뇨병을 치료할 잠재력을 갖는다.
실시예 12: 야생형 마우스에서 기능장애성 배뇨에 대한 NK2R-선택적 NKA(4-10) 유사체의 효과 조사
마른 야생형 마우스에서 로페라미드-유도된 기능장애성 배뇨에 대한 연장된 고도의 NK2R-선택적 NKA(4-10) 유사체의 효과
로페라미드-유도된 변비를 실시예 8에 기재된 바와 같이, 기능장애성 배뇨의 모델로서 사용하였다.
결과
결과를 도 7에 나타낸다. 고도의 NK2R-선택적 분자 344는 용량-의존적 방식으로 로페라미드-유도된 기능장애성 배뇨를 개선시켰다.
요약
약리학적 NK2R 활성화는 마우스의 기능장애성 배뇨를 교정한다. 따라서 본 개시내용의 화합물은 기능장애성 배뇨를 치료할 잠재력을 갖는다.
실시예 13: 서열
Figure pct00038
Figure pct00039
Figure pct00040
Figure pct00041
달리 명시되지 않는 한, "*"는 "Conj-Neu-C18DA"이며, 그 구조는 실시예 6에 예시되어 있다. 달리 명시되지 않는 한, 공액화 모이어티는 N-말단 α-아미노기에 부착된다.
SEQUENCE LISTING <110> Embark Biotech ApS <120> Compounds and their use in treatment of tachykinin receptor mediated disorders <130> P5680EP00 <160> 57 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic compound <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Conj-Neu-C18 <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> N-methyl-Leucine <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> AMIDATION <400> 1 Asp Lys Phe Val Gly Leu Met 1 5 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic compound <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Conj-Neu-C18 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Conj-Neu-C18 <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> N-methyl-Leucine <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> AMIDATION <400> 2 Asp Lys Phe Val Gly Leu Met 1 5 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic compound <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Conj-Neu-C18 <220> <221> 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<223> AMIDATION <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Nle <400> 48 Asp Lys Phe Val Gly Leu Leu 1 5 <210> 49 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic compound <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Conj-Neu-C18 <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> N-methyl-Leucine <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> AMIDATION <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Nle <400> 49 Asp Lys Tyr Val Gly Leu Leu 1 5 <210> 50 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic compound <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Conj-Neu-C18 <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> N-methyl-Leucine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Metoxinine <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> AMIDATION <400> 50 Asp Lys Tyr Val Gly Leu Xaa 1 5 <210> 51 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic compound <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Conj-Neu-C18 <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> AMIDATION <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Nle <400> 51 Asp Lys Tyr Val Gly Leu Leu 1 5 <210> 52 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic compound <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Conj-Neu-C18 <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> AMIDATION <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Metoxinine <400> 52 Asp Lys Tyr Val Gly Leu Xaa 1 5 <210> 53 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic compound <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Conj-Neu-C18 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> 2-aminoisobutyric acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Metoxinine <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> AMIDATION <400> 53 Asp Lys Tyr Val Xaa Leu Xaa 1 5 <210> 54 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic compound <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Conj-Neu-C18 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> 2-aminoisobutyric acid <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> AMIDATION <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Nle <400> 54 Asp Lys Tyr Val Xaa Leu Leu 1 5 <210> 55 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic compound <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Conj-Neu-C18 <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> D-Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Metoxinine <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> AMIDATION <400> 55 Asp Lys Tyr Val Ser Leu Xaa 1 5 <210> 56 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic compound <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Conj-Neu-C18 <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> N-methyl-Leucine <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> AMIDATION <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Nle <400> 56 Glu Lys Phe Thr Gly Leu Leu 1 5 <210> 57 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic compound <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Conj-Neu-C18 <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> D-Ser <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> AMIDATION <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Nle <400> 57 Asp Lys Tyr Val Ser Leu Leu 1 5

Claims (36)

  1. 하기 화학식 I에 따른 뉴로키닌 수용체 2(NK2R) 효능제:
    화학식 I
    (A)-(B)
    여기서;
    (A)는 화학식 X1X2X3X4X5X6X7의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드이고, 여기서
    X1은 아스파트산(D) 및 글루탐산(E)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
    X2는 리신(K), 아르기닌(R) 및 히스티딘(H)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
    X3은 티로신(Y), 페닐알라닌(F), 메타-티로신(m-Y), 발린(V), 트립토판(W), 메티오닌(M), 류신(L), 이소류신(I) 및 알라닌(A)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
    X4는 발린(V), 쓰레오닌(T), 세린(S), 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 글리신(G) 및 알라닌(A)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
    X5는 글리신(G), 2-아미노이소부티르산(Aib), 세린(S), 알라닌(A), 발린(V), 류신(L), 베타-알라닌(bA) 및 이소류신(I)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
    X6은 류신(L), 이소류신(I) 알라닌(A) 및 N-메틸 류신(Me-Leu)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
    X7은 노르류신(Nle), 메톡시닌(Mox), 메티오닌(M), 4-플루오로페닐알라닌(4fF) 및 4-메톡시페닐알라닌(4MeOF)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
    (B)는 하기 일반식 II의 공액화 모이어티(conjugated moiety)이고:
    화학식 II
    Fa-Lg
    여기서;
    Fa는 하기 화학식 Fa-1의 것이고:
    Figure pct00042

    여기서 n은 14 내지 17이고, 바람직하게는 여기서 n은 15이고;
    여기서 X는 -OH, -OC1-6, -NH2, -NHC1-6 및 N(C1-6)2로 이루어진 그룹 중에서 선택되고,
    Lg는 하기 화학식 Lg-1의 연결 그룹(linking group)이다:
    Figure pct00043

    여기서 Z는 C, O 및 N으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 주쇄(backbone) 중에 18 내지 23개의 원자를 포함하는 쇄이고;
    여기서 R은 H 및 C1-6알킬로 이루어진 그룹 중에서 선택되고; Lg는 펩티드 (A)에 (B)를 공유 결합시키며,
    여기서 (B)는 말단 아미노산에 공유 결합된다.
  2. 제1항에 있어서,
    펩티드 (A)가 화학식 X1X2X3X4X5X6X7을 갖고, 여기서
    X1이 아스파트산(D) 및 글루탐산(E)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
    X2가 리신(K) 및 아르기닌(R)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
    X3이 티로신(Y) 및 페닐알라닌(F) 및 메타-티로신(m-Y)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
    X4가 발린(V) 및 쓰레오닌(T)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
    X5가 글리신(G), 2-아미노이소부티르산(Aib), 베타-알라닌(bA) 및 세린(S)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
    X6이 류신(L) 및 N-메틸 류신(Me-Leu)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
    X7이 노르류신(Nle), 메톡시닌(Mox), 메티오닌(M), 4-플루오로페닐알라닌(4fF) 및 4-메톡시페닐알라닌(4MeOF)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는
    NK2R 효능제.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    X2가 아르기닌(R)인, NK2R 효능제.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    X3이 티로신(Y)인, NK2R 효능제.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    X4가 쓰레오닌(T)인, NK2R 효능제.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    X5가 2-아미노이소부티르산(Aib) 및 세린(S)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, NK2R 효능제.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    X6이 N-메틸-류신(Me-Leu)인, NK2R 효능제.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    X7이 메톡시닌(Mox)인, NK2R 효능제.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    n이 15이고 X가 -OH인, NK2R 효능제.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    공액화 모이어티의 Lg가 pH = 7.4에서 양으로 하전(positively charging)되는 작용기를 포함하지 않는, NK2R 효능제.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    공액화 모이어티의 Lg가 pH = 7.4에서 순 중성 전하(net neutral charge) 또는 -1을 갖는, NK2R 효능제.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    공액화 모이어티가 하기 화학식 B1의 것인, NK2R 효능제:
    Figure pct00044
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    공액화 모이어티 (B)가, 임의로 아미드 결합을 통해, (A)의 N-말단에 공유 결합되는, NK2R 효능제.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    공액화 모이어티 (B)가 N-말단 α-NH2 기와의 아미드 결합을 통해 (A)의 N-말단에 공유 결합되는, NK2R 효능제.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    펩티드 (A)가 C-말단상에서 아미드화되는, NK2R 효능제.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    펩티드 (A)가 7 내지 15개의 아미노산, 예를 들어 7 내지 14개의 아미노산, 예를 들어 7 내지 13개의 아미노산, 예를 들어 7 내지 12개의 아미노산, 예를 들어 7 내지 11개의 아미노산, 예를 들어 7 내지 11개의 아미노산, 예를 들어 7 내지 10개의 아미노산, 예를 들어 7 내지 9개의 아미노산, 예를 들어 7 내지 8개의 아미노산을 포함하며, 바람직하게 상기 펩티드가 7개의 아미노산을 포함하는, NK2R 효능제.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    펩티드 (A)가 15개 이하의 아미노산, 예를 들어 14개 이하의 아미노산, 예를 들어 13개 이하의 아미노산, 예를 들어 12개 이하의 아미노산, 예를 들어 11개 이하의 아미노산, 예를 들어 10개 이하의 아미노산, 예를 들어 9개 이하의 아미노산, 예를 들어 8개 이하의 아미노산, 예를 들어 7개 이하의 아미노산을 포함하는, NK2R 효능제.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    펩티드 (A)가 화학식 X1X2X3X4X5X6X7의 7개 아미노산으로 이루어진, NK2R 효능제.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    (A)가 Asp;Lys;Phe;Val;Gly;NmLeu;Nle;NH2(화합물 305)이고,
    (B)가 (A)의 N-말단 아스파테이트에 공유 결합된 화학식 (B1)의 것인,
    NK2R 효능제.
  20. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    (A)가 Asp;Lys;Tyr;Val;Gly;NmLeu;Metox;NH2(화합물 344)이고,
    (B)가 (A)의 N-말단 아스파테이트에 공유 결합된 화학식 (B1)의 것인,
    NK2R 효능제.
  21. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    NK2R 효능제가 서열번호 1 내지 서열번호 57 중 어느 하나의 서열로 이루어진, NK2R 효능제.
  22. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    NK2R 효능제가:
    Figure pct00045

    Figure pct00046
    인, NK2R 효능제.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    NK2R 효능제가 선택적 뉴로키닌 수용체 2(NK2R) 효능제인, NK2R 효능제.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    NK2R 효능제가 300 nM 이하, 예를 들어 250 nm 이하, 예를 들어 200 nm 이하, 예를 들어 150 nM 이하, 예를 들어 100 nM 이하, 예를 들어 90 nM 이하, 예를 들어 80 nM 이하, 예를 들어 70 nM 이하, 예를 들어 60 nM 이하, 예를 들어 50 nM 이하의 인간 NK2R에 대한 EC50을 갖는, NK2R 효능제.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    NK2R 효능제가 50 nM 이하, 예를 들어 40 nm 이하, 예를 들어 30 nm 이하, 예를 들어 20 nM 이하, 예를 들어 15 nM 이하, 예를 들어 14 nM 이하, 예를 들어 13 nM 이하, 예를 들어 12 nM 이하, 예를 들어 11 nM 이하, 예를 들어 10 nM 이하의 인간 NK2R에 대한 EC50을 갖는, NK2R 효능제.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    NK2R 효능제가 적어도 100 nM, 예를 들어 적어도 200 nM, 예를 들어 적어도 300 nM, 예를 들어 적어도 400 nM, 예를 들어 적어도 500 nM의 인간 NK1R에 대한 EC50을 갖는, NK2R 효능제.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    NK2R 효능제가 적어도 100 nM, 예를 들어 적어도 200 nM, 예를 들어 적어도 300 nM, 예를 들어 적어도 400 nM, 예를 들어 적어도 500 nM의 인간 NK3R에 대한 EC50을 갖는, NK2R 효능제.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 뉴로키닌 수용체 2(NK2R) 효능제, 및 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 보조제(adjuvant), 부형제(excipient), 담체, 완충제 및/또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물.
  29. 약제(medicament)로서 사용하기 위한, 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 뉴로키닌 수용체 2(NK2R) 효능제.
  30. NK2R 매개 장애의 치료를 위한 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 뉴로키닌 수용체 2(NK2R) 효능제를 투여하는 단계를 포함하는, 대상체(subject)에서 질환을 치료하기 위한 방법.
  31. 제30항에 있어서,
    NK2R 매개 장애가 비만, 기능장애성 배뇨(dysfunctional voiding), II형 당뇨병과 같은 당뇨병, 및 당뇨병-관련된 장애로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 방법.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서,
    NK2R 매개 장애가 대사 장애인, 방법.
  33. 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
    대사 장애가 당뇨병-관련된 장애인, 방법.
  34. 제33항에 있어서,
    당뇨병-관련된 장애가 인슐린 내성 장애(impaired insulin tolerance) 및 내당능 장애(impaired glucose tolerance)로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 방법.
  35. NK2R을 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 뉴로키닌 수용체 2(NK2R) 효능제와 접촉시키는 단계를 포함하는, NK2R의 활성을 조절하기 위한 방법.
  36. 대사 장애의 치료를 위한 약제의 제조를 위한, 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 뉴로키닌 수용체 2(NK2R) 효능제의 용도.
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