CN116745310A - 化合物及其在治疗速激肽受体介导的病症中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及化合物及其在治疗由速激肽受体例如速激肽受体2介导的病症中的用途。

Description

化合物及其在治疗速激肽受体介导的病症中的用途
技术领域
本发明涉及化合物及其在治疗由速激肽受体(例如速激肽受体2)介导的病症中的用途。
背景技术
速激肽神经肽受体家族由三种G蛋白偶联受体(GPCR)组成：速激肽受体(Tachykinin receptor,Tacr)1、Tacr2和Tacr3，也称为神经激肽受体1-3(NK1-3R)。速激肽受体的内源性配体是作为NK1R的优选配体的神经肽物质P(SP)、作为NK2R的优选配体的神经激肽A(NKA)和作为NK3R的优选配体的神经激肽B。所述内源性配体对其受体都不是特异性的。因此，每个肽配体可以交叉激活速激肽受体家族的所有成员，效力接近于其优选受体的效力。激活后，速激肽受体优先与Gq偶联，产生细胞内三磷酸肌醇(IP3)信号传导反应。此外，所有受体也可以与Gs偶联并诱导cAMP积累，尽管其效力低于Gq激活。
肥胖、胰岛素抵抗和2型糖尿病是多因素疾病。这些疾病都是相互关联的，确切的病理机制尚不清楚。
人们普遍认为肥胖是由能量摄入和能量消耗(EE)之间的失衡引起的。因此，增加高热量摄入并伴有不活动被认为是肥胖的主要驱动因素。除了能量失衡外，高循环胰岛素水平，如胰岛素抵抗所见，被认为会由于胰岛素介导的营养储存增加而增强体重增加。
胰岛素抵抗是身体细胞不正确响应内分泌激素胰岛素的一种病况。胰岛素的作用是让身体细胞吸收葡萄糖，葡萄糖将被用作能量燃料或作为脂肪储存。这意味着，当面临胰岛素抵抗时，身体更有可能在血液中积累葡萄糖，从而导致血糖升高(高血糖症)。因此，为了试图应对高血糖症，身体会产生更多的胰岛素，因此与健康个体相比，胰岛素抵抗的个体通常会产生更多胰岛素。
糖尿病是一种身体产生胰岛素的细胞无法满足胰岛素调节血糖的需求的疾病。一般来说，糖尿病可以分为三种不同类型：妊娠期糖尿病，即妊娠期发生的糖尿病；1型糖尿病，这是一种自身免疫性病症，其中β细胞被破坏，个体无法产生胰岛素；2型糖尿病，最常见的糖尿病形式，是由进行性β细胞损失和胰岛素抵抗引起。2型糖尿病的β细胞损失被认为是由胰岛素需求增加引起的β细胞衰竭，以及血糖和循环脂肪酸升高引起的细胞损伤共同引起的。
由于肥胖、胰岛素抵抗和糖尿病的相互联系，以能量消耗为目标的治疗，即通过激活B/BAT，将有可能治疗这三种病症。因此，增加的能量消耗有可能通过减少能量储存来治疗肥胖，通过降低空腹血糖来治疗胰岛素抵抗，和通过降低空腹血糖本身来治疗糖尿病，并通过减少胰岛素需求来保护β细胞免受衰竭。
棕色和米色脂肪组织(B/BAT)可以通过冷暴露而受到生理刺激，从而显著消耗血液中的葡萄糖和甘油三酯衍生的脂肪酸，并增加能量消耗。典型地，棕色和米色脂肪组织在Gs偶联的β-肾上腺素能GPCR的刺激下被激活，以引发细胞内cAMP反应，该反应激活脂解、从外周摄取葡萄糖和脂质，并通过激活解偶联蛋白1来解偶联线粒体中的电子传递链。激活的棕色和米色脂肪组织对脂质和葡萄糖的摄取优于任何其他组织，因此这些组织的激活对于开发肥胖、胰岛素抵抗和糖尿病的疗法具有吸引力。
目前在人类中激活B/BAT的尝试集中在β-肾上腺素能/cAMP通路上。事实证明，这种通路能够诱导大量的EE，但同时会增加不期望的副作用，如心率、血压和血糖(高血糖症)。
除了B/BAT激活外，NK2R和配体NKA还能够激活内脏平滑肌上的NK2R，并刺激结肠和膀胱的收缩。NK2R激活的收缩活性在包括大鼠、狗、猪和人类在内的物种中是保守的。
对小鼠、大鼠、狗和猕猴的几项研究表明，NK2R激动剂是胃肠道和膀胱促动力剂，通过激活位于平滑肌细胞上的NK2R引起剂量依赖性平滑肌收缩。呕吐和低血压是由NK1R交叉激活引起的常见副作用，因此，需要开发NK2R特异性激动剂来减少这些疗法的副作用。
发明内容
本发明人已经开发了一系列靶向速激肽/神经激肽受体2(NK2R)的化合物。NK2R是速激肽G蛋白偶联受体(GPCR)家族的成员，该家族还包含速激肽/神经激肽受体1和3(NK1R和NK3R)。NK2R的内源性配体是神经激肽A(NKA)，而物质P和神经激肽B分别是NK1R和NK3R的内源性配体。NKA是一种10个氨基酸的局部作用神经肽，主要在肠嗜铬细胞中产生，已知可激活平滑肌收缩。NK2R优先与Gq蛋白偶联，但也可以募集Gs和Gβ-γ和β-抑制蛋白(arrestin)。Tacr2 mRNA表达的主要器官是肾上腺(小鼠)和胃肠道(人类和小鼠)。
本发明人提供了NK2R的化学稳定激动剂的合成，作为能量消耗的激活剂，用于治疗NK2R介导的病症，例如选自肥胖、功能性排尿障碍、糖尿病(例如II型糖尿病)和糖尿病相关病症的NK2R介导的病症。
在第一方面，提供了式(I)的化合物：
(A)-(B)(I)，
其中
(A)是包含通式X1X2X3X4X5X6X7的氨基酸序列的肽，其中
X1选自天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)；
X2选自赖氨酸(K)、精氨酸(R)和组氨酸(H)；
X3选自酪氨酸(Y)、苯丙氨酸(F)、间-酪氨酸(m-Y)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)、蛋氨酸(M)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)和丙氨酸(A)；
X4选自缬氨酸(V)、苏氨酸(T)、丝氨酸(S)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、甘氨酸(G)和丙氨酸(A)；
X5选自甘氨酸(G)、2-氨基异丁酸(Aib)、丝氨酸(S)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、β-丙氨酸(bA)和异亮氨酸(I)；
X6选自亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、丙氨酸(A)和N-甲基亮氨酸(Me-Leu)；并且
X7选自正亮氨酸(Nle)、methoxinine(Mox)、蛋氨酸(M)、4-氟苯丙氨酸(4fF)和4-甲氧基苯丙氨酸(4MeOF)；
(B)是通式(II)的缀合部分
Fa-Lg(II)，
其中
Fa是C10-C20脂肪酸，任选地被一个或多个羧酸基团取代，
Lg是将(B)共价连接到肽(A)的连接基团，
并且其中(B)与末端氨基酸或与非末端氨基酸共价连接。
在第二方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含本文定义的化合物和一种或多种药学上可接受的佐剂、赋形剂、载体、缓冲剂和/或稀释剂。
在第三方面，提供了如本文定义的化合物用作药物。
在第四方面，提供了一种用于治疗受试者的疾病的方法，所述方法包括施用本文所述的化合物，用于治疗NK2R介导的病症。
在第五方面，提供了一种调节NK2R活性的方法，所述方法包括使NK2R与本文定义的化合物接触。
在第六方面，提供了本文定义的化合物在制备用于治疗代谢病症的药物中的用途。
附图说明
图1：位置6(X3)：Phe-Tyr突变。NKA(4-10)类似物中置换为酪氨酸促进了hNK2R的选择性。来自位置6(X3)突变的数据。受体激活通过化合物304和305对人(h)NK1R(图1A)、hNK2R(图1B)或hNK3R(图1C)的IP3测定来测量，使用所指示的肽化合物作为激动剂(配体)进行IP3测定。神经激肽A(NKA)与所有受体一起使用作为比较，而物质P(SP)和神经激肽B(NKB)分别仅与hNK1R和hNK3R一起使用。图表显示了作为化合物浓度(log[配体])的函数，肽化合物孵育后所示受体的受体激活(3H-肌醇信号)。数据以平均3H肌醇信号+/-SD表示。使用Graphpad Prism 8中的S形4PL进行非线性回归，X是log(浓度)方程。
图2：位置7(X4)Val-Thr突变。在NKA(4-10)类似物中，位置7上的苏氨酸置换充当独立于Tyr6的选择性驱动因素。来自位置7(X4)突变的数据。受体激活通过化合物344、366、381、382、383和384对人(h)NK1R(图2A)、hNK2R(图2B)或hNK3R(图2C)的IP3测定来测量，使用所示的肽化合物作为激动剂(配体)进行IP3测定。神经激肽A(NKA)与所有受体一起使用作为比较，而物质P(SP)和神经激肽B(NKB)分别仅与hNK1R和hNK3R一起使用。作为化合物浓度(log[配体])的函数，显示肽化合物孵育后所示受体的受体激活(10-6M NKA百分比形式的3H-肌醇信号)。数据以平均受体激活(％)+/-SD表示。使用Graphpad Prism 8中的S形4PL进行非线性回归，X是log(浓度)方程。
图3：位置10(X7)突变：Met置换。用正亮氨酸或metoxinine置换蛋氨酸提高了hNK2R的选择性，这不依赖于选择性驱动因素，但略微降低了hNK2R功效。来自位置10(X7)突变的数据。受体激活通过化合物395、316、305、344和394对人(h)NK1R(图3A)、hNK2R(图3B)或hNK3R(图3C)的IP3测定来测量，使用所示的肽化合物作为激动剂(配体)进行IP3测定。神经激肽A(NKA)与所有受体一起使用作为比较，而物质P(SP)和神经激肽B(NKB)分别仅与hNK1R和hNK3R一起使用。作为化合物浓度(log[配体])的函数，显示肽化合物孵育后所示受体的受体激活(10-6M NKA百分比形式的3H-肌醇信号)。数据以平均受体激活(％)+/-SD表示。使用Graphpad Prism 8中的S形4PL进行非线性回归，X是log(浓度)方程。
图4：具有中性连接基和带正电连接基的肽类似物是优选的。来自延长物连接基电荷分析的数据。受体激活通过化合物305、318、319和321对人(h)NK1R(图4A)、hNK2R(图4B)或hNK3R(图4C)的IP3测定来测量，使用所示的肽化合物作为激动剂(配体)进行IP3测定。神经激肽A(NKA)与所有受体一起使用作为比较，而物质P(SP)和神经激肽B(NKB)分别仅与hNK1R和hNK3R一起使用。作为化合物浓度(log[配体])的函数，显示肽化合物孵育后所示受体的受体激活(10-6M NKA百分比形式的3H-肌醇信号)。数据以平均受体激活(％)+/-SD表示。使用Graphpad Prism 8中的S形4PL进行非线性回归，X是log(浓度)方程。
图5：延长物(protractor)的组成对N-末端延长的NKA(4-10)类似物的受体选择性和体内半衰期很重要。单脂肪酸或二脂肪酸分析数据。受体激活通过化合物305、344、390和391对人(h)NK1R(图5A)、hNK2R(图5B)或hNK3R(图5，C)的IP3测定来测量，使用所示的肽化合物作为激动剂(配体)进行IP3测定。神经激肽A(NKA)与所有受体一起使用作为比较，而物质P(SP)和神经激肽B(NKB)分别仅与hNK1R和hNK3R一起使用。作为化合物浓度(log[配体])的函数，显示肽化合物孵育后所示受体的受体激活(10-6M NKA百分比形式的3H-肌醇信号)。数据以平均受体激活(％)+/-SD表示。使用Graphpad Prism 8中的S形4PL进行非线性回归，X是log(浓度)方程。
图6：NK2R激动改善了饮食诱导的肥胖小鼠的空腹血糖以及葡萄糖和胰岛素耐受性。野生型饮食诱导的肥胖C57BL/6NRj小鼠通过皮下注射344(325nmol/kg)治疗一次，并在治疗后24小时进行腹膜内葡萄糖耐量试验(ipGTT；图6A.)或腹膜内胰岛素耐量试验(ipITT；图6B.)。数据以平均值+/-SEM表示，n＝5-7，通过双因素方差分析和Bonferroni事后检验进行分析，*p<0.05，**p<0.01，****p<0.0001。
图7：NK2R纠正小鼠功能性排尿障碍。在皮下施用不同剂量的选择性NK2R激动剂(化合物344)之前30分钟，通过经口管饲洛哌丁胺(LP；5mg/kg)诱导功能性排尿障碍。使用溶媒(Veh)处理的小鼠作为正常排尿的对照。通过在六小时期间产生的粪便颗粒数量来评估排尿。数据以平均值+/-SEM表示，n＝5-7，通过单因素方差分析和化合物344处理小鼠与LP相比的多重比较检验进行分析，**p<0.01。
具体实施方案
术语和定义
为了便于理解以下描述，在以下段落中给出了一些定义。
术语“烷基”，无论是单独使用还是作为取代基的一部分使用，都是指具有1-8个碳原子，例如1-6个碳原子的直链和支链碳链。因此，指定数的碳原子(例如，C1-8)独立地是指烷基部分中的碳原子数或是指较大的含烷基取代基的烷基部分。
在具有多个烷基的取代基中，例如(C1-6烷基)2氨基-，二烷基氨基的C1-6烷基可以相同或不同。本文定义的烷基可以被一个或多个取代基(如卤素或一个或多个卤素)取代。在一个实施方案中，烷基被1、2或3个氟原子取代。在一个实施方案中，烷基被羧基(CO2)取代，例如羧基甲基(CO2Me)。
应当理解，本领域普通技术人员可以选择本发明化合物上的取代基和取代模式以提供化学稳定的化合物，并且该化学稳定的化合物可以通过本领域已知的技术以及本文所述的那些方法容易地合成。
术语“受试者”是指动物，优选是哺乳动物，且最优选是人。
根据IUPAC的建议，本文使用其1个字母或3个字母代码来命名蛋白原性“氨基酸”(AA)，参见例如http://www.chem.qmul.ac.uk/iupac/AminoAcid/。大写字母缩写表示L-氨基酸，而小写字母缩写表示D-氨基酸。
本文中提到了一系列非蛋白原性氨基酸。所使用的名称应清晰，且技术人员可以理解。间-酪氨酸(m-Y)是3-羟基苯丙氨酸。Methoxinine(Mox)的结构如下所示：
如本文使用的，氨基酸β-丙氨酸(bA)也称为3-氨基丙酸。氨基酸N-甲基-亮氨酸在本文中被称为(NmLeu)。
“末端脂肪酸”是一种脂肪酸，其中羧酸基团位于脂肪链的末端碳原子上。因此，“末端C16-C20脂肪酸”是由16至20个碳原子组成的脂肪酸链，其中酸基团位于末端，并且羧酸基团的碳原子是末端链碳。
速激肽受体活性
激动剂诱导的G蛋白偶联受体(GPCR)激活可通过实施例1中所述的肌醇-1,4,5-三磷酸[3H]放射性受体测定(IP3测定)来测量。IP3测定利用在初始3H-肌醇标记期后在激动剂(配体)在受体表达细胞上结合时，速激肽受体诱导产生肌醇三磷酸(IP3)第二信使的能力。实际上，这意味着可以通过计数3H活性来评估作为受体活性的量度的第二信使IP3的产生。
“NK2R激动剂”可以相对于在生物测定(例如本文所述的IP3测定)中测量的NK1受体和/或NK3受体的活性而具有不同程度的选择性。“选择性NK2R激动剂”在本文中被定义为其结合或激活NK2受体的效力比结合或激活NK1和/或NK3受体时高至少约10倍或更多的配体。在结合和功能(激活)测定中被认为有选择性的分子不一定是选择性NK2R激动剂。结合效力通常被报告为EC50，EC50值越低，等同于效力越大。因此，选择性NK2R激动剂具有的NK2R结合EC50比其NK1和/或NK3结合EC50低至少约10倍或更多。激活受体的效力通常也被报告为Ki，Ki值越低，等同于效力越大。
在优选的实施方案中，本文提供的化合物是神经激肽受体2(NK2R)激动剂。在一个实施方案中，该化合物是选择性神经激肽受体2(NK2R)激动剂。
在一个实施方案中，所述化合物对人NK2R的EC50为300nM或更小，例如250nm或更小，例如200nm或更小、例如150nM或更小、例如100nM或更小、例如90nM或更小、例如80nM或更小、例如70nM或更小、例如60nM或更小、例如50nM或更小。
在一个实施方案中，所述化合物对人NK2R的EC50为50nM或更小，例如40nm或更小，例如30nm或更小、例如20nM或更小、例如15nM或更小、例如14nM或更小、例如13nM或更小、例如12nM或更小、例如11nM或更小、例如10nM或更小。
在一个实施方案中，该化合物对人NK1R的EC50为至少100nM，例如至少200nM，例如至少300nM，例如至少400nM，例如至少500nM。
在一个实施方案中，所述化合物对人NK3R的EC50为至少100nM，例如至少200nM，例如至少300nM，例如至少400nM，例如至少500nM。
速激肽受体介导的病症
在一个实施方案中，提供了如本文定义的化合物用作药物。本发明人提供了作为能量消耗激活剂的NK2R的化学稳定激动剂的合成，用于治疗代谢病症(例如肥胖)以及用于治疗功能性排尿障碍。
在一个实施方案中，提供了一种用于治疗受试者的疾病的方法，所述方法包括施用本文所述的化合物用于治疗NK2R介导的病症。
在一个实施方案中，NK2R介导的病症选自：肥胖、功能性排尿障碍、糖尿病(如II型糖尿病)和糖尿病相关病症。
在一个实施方案中，NK2R介导的病症是代谢病症。在一个实施方案中，代谢病症是糖尿病相关病症。特别地，糖尿病相关病症选自胰岛素耐受性受损和葡萄糖耐受性受损。
此外，在一个实施方案中，提供了一种调节NK2R活性的方法，所述方法包括使NK2R与本文定义的化合物接触。
在一个实施方案中，提供了本文定义的化合物在制备用于治疗代谢病症的药物中的用途。
肽-(A)
在第一个实施方案中，提供了式(I)的化合物：
(A)-(B) (I)，
其中：
(A)是包含通式X1X2X3X4X5X6X7的氨基酸序列的肽，其中
X1选自天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)；
X2选自赖氨酸(K)、精氨酸(R)和组氨酸(H)；
X3选自酪氨酸(Y)、苯丙氨酸(F)、间-酪氨酸(m-Y)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)、蛋氨酸(M)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)和丙氨酸(A)；
X4选自缬氨酸(V)、苏氨酸(T)、丝氨酸(S)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、甘氨酸(G)和丙氨酸(A)；
X5选自甘氨酸(G)、2-氨基异丁酸(Aib)、丝氨酸(S)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、β-丙氨酸(bA)和异亮氨酸(I)；
X6选自亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、丙氨酸(A)和N-甲基亮氨酸(Me-Leu)；并且
X7选自正亮氨酸(Nle)、methoxinine(Mox)、蛋氨酸(M)、4-氟苯丙氨酸(4fF)和4-甲氧基苯丙氨酸(4MeOF)；
(B)是通式(II)的缀合部分
Fa-Lg (II)，
其中：
Fa是C10-C20脂肪酸，任选被一个或多个羧酸基团取代，
Lg是将(B)共价连接到肽(A)的连接基团，
并且其中(B)与末端氨基酸或与非末端氨基酸共价连接。
在第二个实施方案中，提供了其中肽(A)为通式X1X2X3X4X5X6X7的化合物，其中
X1选自天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)；
X2选自赖氨酸(K)和精氨酸(R)；
X3选自酪氨酸(Y)和间-酪氨酸(m-Y)，
X4选自缬氨酸(V)和苏氨酸(T)；
X5选自甘氨酸(G)、2-氨基异丁酸(Aib)、β-丙氨酸(bA)和丝氨酸(S)；
X6选自亮氨酸(L)和N-甲基亮氨酸(Me-Leu)；并且
X7选自正亮氨酸(Nle)、methoxinine(Mox)、蛋氨酸(M)、4-氟苯丙氨酸(4fF)和4-甲氧基苯丙氨酸(4MeOF)。
在第三个实施方案中，提供了其中肽(A)为通式X1X2X3X4X5X6X7的化合物，其中
X1选自天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)；
X2选自赖氨酸(K)和精氨酸(R)；
X3选自酪氨酸(Y)和苯丙氨酸(F)和间-酪氨酸(m-Y)，
X4选自缬氨酸(V)和苏氨酸(T)；
X5选自甘氨酸(G)、2-氨基异丁酸(Aib)、β-丙氨酸(bA)和丝氨酸(S)；
X6选自亮氨酸(L)和N-甲基亮氨酸(Me-Leu)；并且
X7选自正亮氨酸(Nle)、methoxinine(Mox)、蛋氨酸(M)、4-氟苯丙氨酸(4fF)和4-甲氧基苯丙氨酸(4MeOF)。
在一个实施方案中，提供了其中X2是精氨酸(R)的化合物。
在一个实施方案中，提供了其中X3是酪氨酸(Y)的化合物。在一个实施方案中，提供了其中X3是酪氨酸(Y)并且其中X2是精氨酸(R)的化合物。在一个实施方案中，X3是酪氨酸(Y)，X2是精氨酸(R)，且X5是2-氨基异丁酸(Aib)。
在一个实施方案中，提供了其中X4是苏氨酸(T)的化合物。
在一个实施方案中，提供了其中X5选自2-氨基异丁酸(Aib)和丝氨酸(S)的化合物。
在一个实施方案中，提供了其中X6是N-甲基亮氨酸(Me-Leu)的化合物。
在一个实施方案中，提供了其中X7是methoxinine(Mox)的化合物。在一个实施方案中，提供了其中X7是methoxinine(Mox)并且其中X2是精氨酸(R)的化合物。在一个实施方案中，X7是methoxinine(Mox)，X2是精氨酸(R)，且X3是酪氨酸(Y)。
优选地，肽(A)在C末端被酰胺化。
在一个实施方案中，肽(A)包含7至15个氨基酸，例如7至14个氨基酸，例如7至13个氨基酸，例如7至12个氨基酸，例如7至11个氨基酸，例如7至11个氨基酸，例如7至10个氨基酸，例如7至9个氨基酸，例如7至8个氨基酸，优选地，其中所述肽包含7个氨基酸。
在一个实施方案中，肽(A)包含不多于15个氨基酸，例如不多于14个氨基酸，例如不多于13个氨基酸，例如不多于12个氨基酸，例如不多于11个氨基酸，例如不多于10个氨基酸，例如不多于9个氨基酸，例如不多于8个氨基酸，例如不多于7个氨基酸。
在一个实施方案中，肽(A)由通式X1X2X3X4X5X6X7的7个氨基酸组成。优选地，所述肽在C末端被酰胺化。
在一个特定的实施方案中，提供化合物，其中
(A)是Asp；Lys；Phe；Val；Gly；NmLeu；Nle；NH2(化合物305)，并且
(B)具有共价连接到(A)的N-末端天冬酰胺的式(B1)。
在一个特定的实施方案中，提供化合物，其中
(A)是Asp；Lys；Tyr；Val；Gly；NmLeu；Metox；NH2(化合物344)，并且
(B)具有共价连接到(A)的N-末端天冬氨酸的式(B1)。
在一个实施方案中，所述化合物由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:57中任一个的序列组成。
在一个特定的实施方案中，所述化合物是：
在本公开的上下文中，除非另有说明，当键从一个原子引出到由其一个或三个字母代码缩写的氨基酸时，该键连接到氨基酸主链的α-氨基或羰基碳。例如，在ID 398的化合物的情况下，“Lys”通过其α-氨基与其相邻的羰基连接，并且“Thr”通过其主链羰基碳与“NH”连接。
缀合部分–(B)
缀合部分在本文中也被称为延长物。在一个实施方案中，提供了如本文定义的化合物，其中Lg具有式(Lg-1)，
其中Z是在主链中包含18-23个原子的链，所述原子选自C、O和N；
并且其中R选自H和C1-6烷基。本领域技术人员知道，根据特定原子的化合价，C、O和N可以被氢取代。主链可以包含一个或多个羰基，例如1、2、3或4个羰基。主链还可以包含一个或多个羧酸基团，例如1或2个。在一些实施方案中，Z包括被一个或多个酰胺官能团中断的乙二醇片段。一个实例在式(B1)中示出，其中脂肪酸Fa具有式(Fa-1)，Lg-1的R为H，且Z的主链包含21个选自C、O和N的原子。
在一个实施方案中，提供了化合物，其中Fa是末端C16-C20脂肪酸。
在一个实施方案中，提供了化合物，其中Fa具有式(Fa-1)
其中n为11至20，例如12至19，例如13至18，例如14至17，优选其中n为15；
并且其中X选自-OH、-OC1-6、-NH2、-NHC1-6和N(C1-6)2。在一个特定的实施方案中，n为15，且X为-OH。
在一个实施方案中，提供了化合物，其中所述缀合部分的Lg不包含在pH＝7.4时带正电的官能团。在一个实施方案中，缀合部分的Lg不包含多于1个在pH＝7.4时带负电的官能团。在一个实施方案中，缀合部分的Lg在pH＝7.4时具有净中性电荷或-1。
在一个优选的实施方案中，提供了如本文定义的化合物，其中缀合部分具有式(B1)
在一个特别优选的实施方案中，提供了如本文定义的化合物，其中缀合部分具有下式；
在一个实施方案中，缀合部分(B)共价连接到(A)的N-末端，任选地通过酰胺键。
在一个实施方案中，缀合部分(B)通过与N-末端α-NH2基团的酰胺键共价连接到(A)的N-末端。
药物组合物
在一个实施方案中，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含如本文定义的化合物和一种或多种药学上可接受的佐剂、赋形剂、载体、缓冲剂和/或稀释剂。
项
1.一种根据式(I)的化合物：
(A)-(B) (I)，
其中
(A)是包含通式X1X2X3X4X5X6X7的氨基酸序列的肽，其中
X1选自天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)；
X2选自赖氨酸(K)、精氨酸(R)和组氨酸(H)；
X3选自酪氨酸(Y)、苯丙氨酸(F)、间-酪氨酸(m-Y)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)、蛋氨酸(M)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)和丙氨酸(A)；
X4选自缬氨酸(V)、苏氨酸(T)、丝氨酸(S)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、甘氨酸(G)和丙氨酸(A)；
X5选自甘氨酸(G)、2-氨基异丁酸(Aib)、丝氨酸(S)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、β-丙氨酸(bA)和异亮氨酸(I)；
X6选自亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、丙氨酸(A)和N-甲基亮氨酸(Me-Leu)；并且
X7选自正亮氨酸(Nle)、methoxinine(Mox)、蛋氨酸(M)、4-氟苯丙氨酸(4fF)和4-甲氧基苯丙氨酸(4MeOF)；
(B)是通式(II)的缀合部分
Fa-Lg (II)，
其中
Fa是C10-C20脂肪酸，任选被一个或多个羧酸基团取代，
Lg是将(B)共价连接到肽(A)的连接基团，
并且其中(B)与末端氨基酸或与非末端氨基酸共价连接。
2.根据前述项中任一项所述的化合物，其中肽(A)具有通式X1X2X3X4X5X6X7，其中
X1选自天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)；
X2选自赖氨酸(K)和精氨酸(R)；
X3选自酪氨酸(Y)和苯丙氨酸(F)和间-酪氨酸(m-Y)，
X4选自缬氨酸(V)和苏氨酸(T)；
X5选自甘氨酸(G)、2-氨基异丁酸(Aib)、β-丙氨酸(bA)和丝氨酸(S)；
X6选自亮氨酸(L)和N-甲基亮氨酸(Me-Leu)；并且
X7选自正亮氨酸(Nle)、methoxinine(Mox)、蛋氨酸(M)、4-氟苯丙氨酸(4fF)和4-甲氧基苯丙氨酸(4MeOF)。
3.根据前述项中任一项所述的化合物，其中X2为精氨酸(R)。
4.根据前述项中任一项所述的化合物，其中X3为酪氨酸(Y)。
5.根据前述项中任一项所述的化合物，其中X4为苏氨酸(T)。
6.根据前述项中任一项所述的化合物，其中X5选自2-氨基异丁酸(Aib)和丝氨酸(S)。
7.根据前述项中任一项所述的化合物，其中X6为N-甲基亮氨酸(Me-Leu)。
8.根据前述项中任一项所述的化合物，其中X7为methoxinine(Mox)。
9.根据前述项中任一项所述的化合物，其中Lg具有式(Lg-1)，
其中Z是在主链中包含18-23个原子的链，所述原子选自C、O和N；
并且其中R选自H和C1-6烷基。
10.根据前述项中任一项所述的化合物，其中Fa是末端C16-C20脂肪酸。
11.根据前述项中任一项所述的化合物，其中Fa具有式(Fa-1)，
其中n为11至20，例如12至19，例如13至18，例如14至17，优选其中n为15；
并且其中X选自-OH、-OC1-6、-NH2、-NHC1-6和N(C1-6)2。
12.根据项11所述的化合物，其中n为15，并且其中X为-OH。
13.根据前述项中任一项所述的化合物，其中所述缀合部分的Lg不包含在pH＝7.4时带正电的官能团。
14.根据前述项中任一项所述的化合物，其中所述缀合部分的Lg在pH＝7.4时具有净中性电荷或-1。
15.根据前述项中任一项所述的化合物，其中所述缀合部分具有式(B1)；
16.根据前述项中任一项所述的化合物，其中所述缀合部分(B)共价连接到(A)的N-末端，任选地通过酰胺键。
17.根据前述项中任一项所述的化合物，其中所述缀合部分(B)通过与N-末端α-NH2基团的酰胺键共价连接到(A)的N-末端。
18.根据前述项中任一项所述的化合物，其中所述肽(A)在C末端被酰胺化。
19.根据前述项中任一项所述的化合物，其中所述肽(A)包含7至15个氨基酸，例如7至14个氨基酸，例如7至13个氨基酸，例如7至12个氨基酸，例如7至11个氨基酸，例如7至11个氨基酸，例如7至10个氨基酸，例如7至9个氨基酸，例如7至8个氨基酸，优选地，其中所述肽包含7个氨基酸。
20.根据前述项中任一项所述的化合物，其中所述肽(A)包含不多于15个氨基酸，例如不多于14个氨基酸，例如不多于13个氨基酸，例如不多于12个氨基酸，例如不多于11个氨基酸，例如不多于10个氨基酸，例如不多于9个氨基酸，例如不多于8个氨基酸，例如不多于7个氨基酸。
21.根据前述项中任一项所述的化合物，其中所述肽(A)由通式X1X2X3X4X5X6X7的7个氨基酸组成。
22.根据前述项中任一项所述的化合物，其中
(A)是Asp；Lys；Phe；Val；Gly；NmLeu；Nle；NH2(化合物305),并且
(B)是共价连接到(A)的N-末端天冬氨酸的式(B1)。
23.根据前述项中任一项所述的化合物，其中
(A)是Asp；Lys；Tyr；Val；Gly；NmLeu；Metox；NH2(化合物344)，并且
(B)是共价连接到(A)的N-末端天冬氨酸的式(B1)。
24.根据前述项中任一项所述的化合物，其中所述化合物由SEQ ID NO:1至SEQ IDNO:57中任一个的序列组成。
25.根据前述项中任一项所述的化合物，其中所述化合物是：
26.根据前述项中任一项所述的化合物，其中所述化合物是神经激肽受体2(NK2R)激动剂。
27.根据前述项中任一项所述的化合物，其中所述化合物是选择性神经激肽受体2(NK2R)激动剂。
28.根据前述项中任一项所述的化合物，其中所述化合物对人NK2R的EC50为300nM或更小，例如250nm或更小，例如200nm或更小、例如150nM或更小、例如100nM或更小、例如90nM或更小、例如80nM或更小、例如70nM或更小、例如60nM或更小、例如50nM或更小。
29.根据前述项中任一项所述的化合物，其中所述化合物对人NK2R的EC50为50nM或更小，例如40nm或更小，例如30nm或更小、例如20nM或更小、例如15nM或更小、例如14nM或更小、例如13nM或更小、例如12nM或更小、例如11nM或更小、例如10nM或更小。
30.根据前述项中任一项所述的化合物，其中所述化合物对人NK1R的EC50为至少100nM，例如至少200nM，例如至少300nM，例如至少400nM，例如至少500nM。
31.根据前述项中任一项所述的化合物，其中所述化合物对人NK3R的EC50为至少100nM，例如至少200nM，例如至少300nM，例如至少400nM，例如至少500nM。
32.一种药物组合物，其包含前述项中任一项所定义的化合物和一种或多种药学上可接受的佐剂、赋形剂、载体、缓冲剂和/或稀释剂。
33.根据项1至31中任一项所定义的化合物，其用作药物。
34.一种治疗受试者的疾病的方法，包括施用项1至31中任一项所定义的化合物用于治疗NK2R介导的病症。
35.根据前述项中任一项所述的方法，其中所述NK2R介导的病症选自肥胖、功能性排尿障碍、糖尿病(如II型糖尿病)和糖尿病相关病症。
36.根据前述项中任一项所述的方法，其中所述NK2R介导的病症是代谢病症。
37.根据前述项中任一项所述的方法，其中所述代谢病症是糖尿病相关病症。
38.根据项35所述的方法，其中所述糖尿病相关病症选自胰岛素耐受性受损和葡萄糖耐受性受损。
39.一种调节NK2R活性的方法，包括使NK2R与项1至31中任一项所定义的化合物接触。
40.根据项1至31中任一项所定义的化合物在制备用于治疗代谢病症的药物中的用途。
项II
1.一种式(I)的化合物：
(A)-(B) (I)，
其中
(A)是包含通式X1X2X3X4X5X6X7的氨基酸序列的肽，其中
X1选自天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)；
X2选自赖氨酸(K)、精氨酸(R)和组氨酸(H)；
X3选自酪氨酸(Y)、苯丙氨酸(F)、间-酪氨酸(m-Y)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)、蛋氨酸(M)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)和丙氨酸(A)；
X4选自缬氨酸(V)、苏氨酸(T)、丝氨酸(S)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、甘氨酸(G)和丙氨酸(A)；
X5选自甘氨酸(G)、2-氨基异丁酸(Aib)、丝氨酸(S)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、β-丙氨酸(bA)和异亮氨酸(I)；
X6选自亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、丙氨酸(A)和N-甲基亮氨酸(Me-Leu)；并且
X7选自正亮氨酸(Nle)、methoxinine(Mox)、蛋氨酸(M)、4-氟苯丙氨酸(4fF)和4-甲氧基苯丙氨酸(4MeOF)；
(B)是通式(II)的缀合部分
Fa-Lg(II)，
其中
Fa是C10-C20脂肪酸，任选被一个或多个羧酸基团取代，
Lg是将(B)共价连接到肽(A)的连接基团，
并且其中(B)与末端氨基酸或与非末端氨基酸共价连接。
2.根据前述项中任一项所述的化合物，其中肽(A)具有通式X1X2X3X4X5X6X7，其中
X1选自天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)；
X2选自赖氨酸(K)和精氨酸(R)；
X3选自酪氨酸(Y)和苯丙氨酸(F)和间-酪氨酸(m-Y)，
X4选自缬氨酸(V)和苏氨酸(T)；
X5选自甘氨酸(G)、2-氨基异丁酸(Aib)、β-丙氨酸(bA)和丝氨酸(S)；
X6选自亮氨酸(L)和N-甲基亮氨酸(Me-Leu)；并且
X7选自正亮氨酸(Nle)、methoxinine(Mox)、蛋氨酸(M)、4-氟苯丙氨酸(4fF)和4-甲氧基苯丙氨酸(4MeOF)。
3.根据前述项中任一项所述的化合物，其中
X2为精氨酸(R)；
X3是酪氨酸(Y)；
X4是苏氨酸(T)；
X5选自2-氨基异丁酸(Aib)和丝氨酸(S)；
X6是N-甲基-亮氨酸(Me-Leu)；和/或
X7是methoxinine(Mox)。
4.根据前述项中任一项所述的化合物，其中Lg具有式(Lg-1)，
其中Z是在主链中包含18-23个原子的链，所述原子选自C、O和N；
并且其中R选自H和C1-6烷基。
5.根据前述项中任一项所述的化合物，其中Fa是末端C16-C20脂肪酸。
6.根据前述项中任一项所述的化合物，其中Fa具有式(Fa-1)，
其中n为11至20，例如12至19，例如13至18，例如14至17，优选其中n为15；
并且其中X选自-OH、-OC1-6、-NH2、-NHC1-6和N(C1-6)2。
7.根据前述项中任一项所述的化合物，其中所述缀合部分具有式(B1)；
8.根据前述项中任一项所述的化合物，其中所述缀合部分(B)通过与N-末端α-NH2基团的酰胺键共价连接到(A)的N-末端。
9.根据前述项中任一项所述的化合物，其中所述肽(A)在C末端被酰胺化。
10.根据前述项中任一项所述的化合物，其中所述肽(A)包含7至15个氨基酸，例如7至14个氨基酸，例如7至13个氨基酸，例如7至12个氨基酸，例如7至11个氨基酸，例如7至11个氨基酸，例如7至10个氨基酸，例如7至9个氨基酸，例如7至8个氨基酸，优选地，其中所述肽包含7个氨基酸。
11.根据前述项中任一项所述的化合物，其中所述肽(A)由通式X1X2X3X4X5X6X7的7个氨基酸组成。
12.根据前述项中任一项所述的化合物，其中所述化合物由SEQ ID NO:1至SEQ IDNO:57中任一个的序列组成。
13.根据前述项中任一项所述的化合物，其中
(A)是Asp；Lys；Tyr；Val；Gly；NmLeu；Metox；NH2(化合物344)，并且
(B)具有共价连接到(A)的N-末端天冬氨酸的式(B1)。
14.根据前述项中任一项所述的化合物，其中所述化合物是：
15.根据前述项中任一项所述的化合物，其中所述化合物是神经激肽受体2(NK2R)激动剂，例如选择性神经激肽受体2(NK2R)激动剂。
实施例
实施例1：通过测量肌醇三磷酸(IP3)测量效力和功效来测定化合物的选择性
材料：
甲酸、LiCl、CaCl2、Tris-HCl、EDTA、HEPES、NaCl、氯喹和卵白蛋白(来自鸡蛋的白蛋白)(Sigma Aldrich)。COS-7猴肾细胞系从ATCC获得。DMEM 1885、FBS、青霉素/链霉素(P/S)和HBSS来自Thermo Scientific/Gibco。透明Costar 96孔组织培养物处理板和固体白色96孔板来自Corning。来自Perkin Elmer的聚赖氨酸包被的硅酸钇SPA珠(#RPNQ0010)和Myo-[2-3H(N)]-肌醇-(#NET114A[005MC)。来自Perkin Elmer的肌醇-1,4,5-三磷酸[3H]放射性受体测定(IP3测定)。从Genscript获得含有人和小鼠速激肽受体1、2、3mRNA编码序列的pcDNA3.1(+)(定制订单)。在盐水+0.2％(w/v)卵白蛋白中稀释的合成肽。
mRNA IDs
人Tacr1：NM_001058.4
人Tacr2：NM_001057.3
人Tacr3：NM_001059.2
方法：
激动剂诱导的G蛋白偶联受体(GPCR)激活通过肌醇-1,4,5-三磷酸[3H]放射性受体测定(IP3测定)来测量。使用通过磷酸钙转染法瞬时转染编码所述受体之一的载体pcDNA3.1(+)(Genscript)的COS-7细胞，进行测定。简言之，将与CaCl2(2M)和TE缓冲液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 7.5)混合的DNA滴加到2xHBS(50mM HEPES，280mM NaCl，1.5mM NaH2PO4，pH 7.2)中，并在室温(22±2℃)下孵育45分钟。将混合物和最终浓度为100μM的氯喹添加到细胞中，并在标准细胞培养条件下(10％CO2)下在37℃下孵育5小时，然后将培养基更换为含有5μl/mL的Myo-[2-3H(N)]-肌醇的新鲜培养基(标记培养基)。
IP3测定利用了在初始3H-肌醇标记期后，在激动剂(配体)在受体表达细胞上结合时，速激肽受体诱导产生肌醇三磷酸(IP3)第二信使的能力。实际上，这意味着可以通过计数3H活性来评估作为受体活性的量度的第二信使IP3的产生。
使用的测定溶液：洗涤缓冲液(HBSS)、测定缓冲液(HBSS+10mM LiCl和0,2％w/v卵白蛋白)、裂解缓冲液(10mM甲酸)和SPA YSI珠粒(12.5mg/ml，在H2O中的溶液)。在转染后第二天进行测定。简言之，抽吸标记培养基，平板在洗涤缓冲液中洗涤1次，然后加入100μl测定缓冲液，在37℃下预孵育30分钟后与激动剂一起孵育120分钟。孵育后，立即将平板置于冰上，抽吸孵育培养基，并且每孔加入40μl的10mM甲酸。将平板在冰上孵育至少30分钟。将60μl(1mg/孔)的SPA YSI珠粒/孔移液到固体白色96孔平板中，并将35μl裂解溶液转移到平板上，然后用密封盖覆盖平板并振荡10分钟(最大速度)。将平板离心并在室温下放置8小时，然后在MicroBeta平板计数器(Perkin Elmer)中对平板进行计数。
实施例2：通过使用肌醇三磷酸(IP3)定量测量受体活性来测定人血清白蛋白 (HSA)结合
材料：
甲酸、LiCl、CaCl2、Tris-HCl、EDTA、HEPES、NaCl、NaH2PO4、氯喹、卵白蛋白(来自鸡蛋的白蛋白)和人血清白蛋白(HSA)(Sigma Aldrich)。COS-7猴肾细胞系从ATCC获得。DMEM1885、FBS、青霉素/链霉素(P/S)和HBSS来自Thermo Scientific/Gibco。透明Costar 96孔组织培养物处理板和固体白色96孔板来自Corning。来自Perkin Elmer的聚赖氨酸包被的硅酸钇SPA珠(#RPNQ0010)和Myo-[2-3H(N)]-肌醇-(#NET114A[005MC)。来自Perkin Elmer的肌醇-1,4,5-三磷酸[3H]放射性受体测定(IP3测定)。从Genscript获得含有人速激肽受体1、2、3mRNA编码序列的pcDNA3.1(+)(定制订单)。在盐水+0.2％(w/v)卵白蛋白或盐水+1％(w/v)HSA中稀释合成肽。
人Tacr1：NM_001058.4
人Tacr2：NM_001057.3
人Tacr3：NM_001059.2
方法：
激动剂诱导的G蛋白偶联受体(GPCR)激活通过肌醇-1,4,5-三磷酸[3H]放射性受体测定(IP3测定)来测量。使用通过磷酸钙转染法瞬时转染编码所示受体之一的载体pcDNA3.1(+)(Genscript)的COS-7细胞，进行测定。简言之，将与CaCl2(2M)和TE缓冲液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 7.5)混合的DNA滴加到2xHBS(50mM HEPES，280mM NaCl，1.5mM NaH2PO4，pH 7.2)中，并在室温(22±2℃)下孵育45分钟。将混合物和最终浓度为100μM的氯喹添加到细胞中，并在标准细胞培养条件下(10％CO2)下在37℃下孵育5小时，然后将培养基更换为含有5μl/mL的Myo-[2-3H(N)]-肌醇的新鲜培养基(标记培养基)。
间接HSA结合IP3测定利用在初始3H-肌醇标记期后在激动剂(配体)在受体表达细胞上结合时，速激肽受体诱导产生肌醇三磷酸(IP3)第二信使的能力。该测定依赖于这样的假设，即高的肽HSA结合将导致低的受体介导的第二信使IP3的产生。因此，该测定是对HSA结合的间接评估。
使用的测定溶液：洗涤缓冲液(HBSS)、测定缓冲液0.2％OvAlb(HBSS+10mM LiCl和0,2％w/v卵白蛋白)或测定缓冲液1％HSA(HBSS+10mM LiCl和1％w/v HSA)、赖氨酸缓冲液(10mM甲酸)和SPA YSI珠粒(12.5mg/ml在H2O中的溶液)。在转染后第二天进行测定。简言之，抽吸标记培养基，在洗涤缓冲液中洗涤平板1次，然后在加入100μl测定缓冲液0.2％OvAlb或测定缓冲液1％HAS，在37℃下预孵育30分钟后与激动剂一起孵育120分钟。孵育后，立即将平板置于冰上，抽吸孵育培养基，并且每孔加入40μl的10mM甲酸。将平板在冰上孵育至少30分钟。将60μl(1mg/孔)的SPA YSI珠粒/孔移液到固体白色96孔平板中，并将35μl裂解溶液转移到平板上，然后用密封盖覆盖平板并振荡10分钟(最大速度)。将平板离心并在室温下放置8小时，然后在MicroBeta板计数器(Perkin Elmer)中对平板进行计数。
实施例3：通过测量3H-NKA竞争性结合来测定肽-NK2R的结合
材料：
CaCl2、Tris-HCl、EDTA、HEPES、NaCl、NaH2PO4、氯喹、卵白蛋白(来自鸡蛋的白蛋白)、MnCl2·4H2O和来自Sigma Aldrich.的杆菌肽。COS-7猴肾细胞系从ATCC获得。DMEM1885、FBS、青霉素/链霉素(P/S)、HBSS和1M Tris/HCl来自Thermo Scientific/Gibco。白色/透明底部96孔板来自Costar。3H-NKA(Novo Nordisk#NNC0392-0000-0497)。来自PerkinElmer的Ultima Gold XR。
从Genscript(定制订单)获得含有人和小鼠速激肽受体1、2、3mRNA编码序列的pcDNA3.1(+)。在盐水+0.2％(w/v)卵白蛋白(OvAlb)中稀释合成肽。
人Tacr1：NM_001058.4
人Tacr2：NM_001057.3
人Tacr3：NM_001059.2
方法：
使用通过磷酸钙转染法瞬时转染编码所示受体之一的载体pcDNA3.1(+)(Genscript)的COS-7细胞，进行测定。简言之，将与CaCl2(2M)和TE缓冲液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 7.5)混合的DNA滴加到2xHBS(50mM HEPES，280mM NaCl，1.5mM NaH2PO4，pH7.2)中，并在室温(22±2℃)下孵育45分钟。将混合物和最终浓度为100μM的氯喹添加到细胞中，并在标准细胞培养条件下(10％CO2)下在37℃下孵育5小时，然后将培养基更换为新鲜维持培养基。
3H-NKA结合测定通过放射性标记的(3H)NKA(示踪剂)和表达感兴趣受体的活细胞上合成的肽配体之间的受体结合竞争原理来测量肽-受体结合。
使用的测定溶液：TKR缓冲液(50mM Tris/HCl pH 7.5，5mM MnCl2，和150mMNaCl)、洗涤缓冲液(TKR缓冲液+0.2％w/v OvAlb)、结合缓冲液(洗涤缓冲液+0.1mg/ml杆菌肽)和示踪剂溶液(结合缓冲液+～15000cpm/孔3H-示踪剂)。
在转染后第二天在冰上进行测定。简言之，抽吸维持培养基，将平板在冷洗涤缓冲液中洗涤1次，加入100μl的冷的结合缓冲液并置于4℃下使平板冷却。在冷板中加入所示肽(配体)，然后立即加入冷示踪剂溶液(～15000cpm/孔)。立即将培养板移至4℃并孵育4小时。在孵育后，通过用冷洗涤缓冲液洗涤2次然后加入225μl的Ultima Gold XR，来停止结合。将平板以中速振荡约30分钟并在室温下放置过夜，然后在MicroBeta板计数器(PerkinElmer)中对平板进行计数。
实施例4：通过测量环状单磷酸腺苷(cAMP)来测定效力和功效
材料：
CaCl2、Tris-HCl、EDTA、HEPES、NaCl、氯喹、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)和卵白蛋白(来自鸡蛋的白蛋白)(Sigma Aldrich)。COS-7猴肾细胞系从ATCC获得。DMEM 1885、FBS、青霉素/链霉素(P/S)和HBSS来自Thermo Scientific/Gibco。来自Corning的固体白色96孔板。来自Discover X生物制品的Hithunter cAMP测定。从Genscript(定制订单)获得含有人和小鼠速激肽受体1、2、3mRNA编码序列的pcDNA3.1(+)。在盐水+0.2％(w/v)卵白蛋白中稀释合成肽。
人Tacr1：NM_001058.4
人Tacr2：NM_001057.3
人Tacr3：NM_001059.2
方法：
作为激动剂诱导的G蛋白偶联受体(GPCR)激活的二级测量，通过DiscoverX的Hithhunter cAMP测定法测量细胞周期蛋白腺苷一磷酸(cAMP)。使用通过磷酸钙转染法瞬时转染编码所示受体之一的载体pcDNA3.1(+)(Genscript)的COS-7细胞，进行测定。简言之，将与CaCl2(2M)和TE缓冲液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 7.5)混合的DNA滴加到2xHBS(50mM HEPES，280mM NaCl，1.5mM NaH2PO4，pH 7.2)中，并在室温(22±2℃)下孵育45分钟。将混合物和最终浓度为100μM的氯喹添加到细胞中，并在标准细胞培养条件下(10％CO2)下在37℃下孵育5小时，然后将培养基更换为新鲜维持培养基。
cAMP测定利用在激动剂(配体)在受体表达细胞上结合时速激肽受体诱导产生cAMP第二信使的能力。cAMP的产生源于受体与Gs蛋白的偶联，尽管与Gq蛋白的偶联(IP3-产生)被认为是速激肽受体的主要信号传导机制。
在转染后第二天进行测定。简言之，抽吸维持培养基，在HBSS中洗涤平板1次，然后加入100μl测定缓冲液(HBSS+1mM IBMX)，在37℃下预孵育30分钟，然后在37℃下与激动剂(配体)一起孵育15分钟。孵育后，如制造商所述，对平板进行细胞裂解和抗cAMP抗体孵育。使用来自Perkin Elmer的EnVision多模态酶标仪测量发光。
实施例5：肽的合成和表征
一般方法
以下涉及用于合成树脂结合肽的方法(SPPS方法，包括氨基酸脱保护的方法、从树脂切割肽的方法以及其纯化的方法)，以及检测和表征所得肽的方法(LCMS和UPLC方法)。
SPPS方法
使用的Fmoc保护的氨基酸衍生物是推荐的标准：由例如Anaspec、Bachem、IrisBiotech或NovabioChem供应的Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(BOC)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Trp(BOC)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH和Fmoc-Lys(Mtt)-OH。
N-末端氨基酸在α-氨基处受到Boc保护(例如，对于N-末端有Asp的肽，Boc-Asp(OtBu)-OH)。
在赖氨酸的ε-氮上引入取代基是使用用Mtt保护的赖氨酸(Fmoc-Lys(Mtt)-OH)实现的。使用适当保护的结构单元如Fmoc-8-氨基-3,6-二氧杂辛酸和Fmoc-Glu-OtBu，用于引入取代基。脂肪酸部分的引入是使用构建模块如十八碳烯二酸单叔丁基酯来实现的。
SPPS是在100-μmol、150-μmol、300μmol或450-μmol规模下，使用相对于树脂负载量为4、6、12或18倍过量的Fmoc-氨基酸(DMF中300mM，含300mM的Oxyma)，在ProteinTechnologies(Tucson,AZ 85714U.S.A.)的SymphonyX固相肽合成器上进行的。使用Fmoc-PAL AM树脂(Novabichem，负载量例如0.61nmol/g)、Rink酰胺AM聚苯乙烯树脂(Novabiochem，负载量例如0.64mmol/g)或2-氯三苯甲基氯化物树脂(负载量1.42mmol/g)作为固体载体。使用20％哌啶在DMF中进行Fmoc脱保护。在DMF中使用1:1:1:1的氨基酸/(Oxyma/>)/DIC/三甲基吡啶进行偶联。在脱保护和偶联步骤之间进行DCM(1x1.5 ml)和DMF顶洗涤(6x6 ml)。偶联时间通常为60分钟(范围从60分钟到8小时)。一些氨基酸包括但不限于Fmoc-Arg(Pbf)-OH和Fmoc-Gly-OH是“双偶联”的，这意味着在第一次偶联(例如60分钟)后，树脂被排出并加入更多的试剂(氨基酸、Oxyma/>DIC和三甲基吡啶)，混合物允许再次反应(例如60分钟)。通过首先用DCM洗涤树脂(1x 1分钟)，然后将树脂悬浮在HFIP/DCM/TIS(75/23/2)中(1x 5分钟)，来去除Mtt基团。将树脂用DCM洗涤并悬浮在HFIP/DCM/TIS(75/23/2)中(2x 25分钟，其间用DCM洗涤)，随后依次用DMF(1x)、DCM(4x)、DMF(2x)、哌啶/DMF(20:80)、DMF(1x)、DCM(1x)、DMF(6x)洗涤。
从树脂切割
在合成后，用DCM洗涤树脂，并通过用TFA/TIS/水(95/2.5/2.5)处理2-3小时，然后用二乙醚沉淀，将肽从树脂上切割。沉淀用二乙醚洗涤。
纯化
将粗肽溶解在合适的溶剂混合物(诸如例如10/20/70乙酸/MeCN/水)中，并在含有C18硅胶的柱上通过反相制备HPLC(Waters Prep)纯化。在含有0.1％TFA的水中以增加的MeCN梯度进行洗脱，或在磷酸盐缓冲液中以增加的80:20MeCN:MQ-水梯度进行洗脱(含20mmNa2HPO4、20mm NaH2PO4、10％MeCN的MQ，pH 7.2)。通过UPLC和LCMS方法的组合分析相关馏分，并将适当的馏分合并和冷冻干燥。
检测和表征方法
LCMS方法
LCMS在由Micromass的Waters Acquity UPLC系统和LCT Premier XE质谱仪组成的装置上进行。在室温下通过将适当体积的样品(优选2-10μl)注射到柱(Waters AcquityUPLC BEH,C-18,1.7μm,2.1mm x 50mm)上进行分析，该柱以A、B(和D)的梯度洗脱。
方法：LCMS34
洗脱液：A：含0.1％甲酸的MQ-水溶液。B：含0.1％甲酸的乙腈溶液。梯度：线性5％-95％乙腈，在4.0分钟内，0.4ml/min。检测：214nm(TUV(可调谐UV检测器)的模拟输出)。MS电离模式：API-ES(正模式)。扫描：100-2000amu(或者500-2000amu)，步长0.1amu.
方法：LCMS43
洗脱液：A：超纯水。B：乙腈。D：100mm三乙基乙酸铵的水溶液：乙腈1:1(用Et3N+AcOH将pH调节至7.8)。梯度：线性0％-97.5％乙腈+等梯度2.5％D，在4.0分钟内，0.4ml/min。检测：214nm(TUV(可调谐UV检测器)的模拟输出)。MS电离模式：API-ES(负模式)。扫描：100-2000amu(或者500-2000amu)，步长0.1amu.
UPLC方法
使用装有双波段检测器的Waters UPLC系统进行反相分析。使用ACQUITY UPLCBEH,C18,1.7um,2.1mm x 150mm柱，收集214nm下的UV检测。UPLC系统连接到两个洗脱液储器A和B。
方法：UPLC01：
柱温：40℃。洗脱液：A：99.95％MQ-水，0.05％TFA。B：99.95％的CH3CN、0.05％的TFA。使用以下线性梯度：95％的A、5％的B至40％的A、60％的B，在16分钟内，流速为0.40ml/min。
方法：UPLC02：
柱温：40℃。洗脱液：A：99.95％MQ-水，0.05％TFA。B：99.95％的CH3CN、0.05％的TFA。使用以下线性梯度：95％的A、5％的B至5％的A、95％的B，在16分钟内，流速为0.40ml/min。
方法：UPLC60：
柱温：60℃。洗脱液：A：0.02m Na2SO4，0.002m Na2HPO4，0.002mNaHPO4。B：70％的CH3CN在MQ-水中的溶液。阶梯梯度：10-20％的B在3分钟内，然后20-50％的B在17分钟内，然后50-80％的B在1分钟内。阶梯梯度运行时间：21分钟，流速为0.40ml/min。
方法：UPLC61：
柱温：60℃。洗脱液：A：0.02m Na2SO4，0.002m Na2HPO4，0.002mNaHPO4。B：70％的CH3CN在MQ-水中的溶液。阶梯梯度：10-20％的B在3分钟内，然后20-80％的B在17分钟内，然后80-90％的B在1分钟内。阶梯梯度运行时间：21分钟，流速为0.40ml/min。
实施例6：缀合部分的结构
Semaguide延长物：2xOEG-γGlu-C18二酸。中性连接基称为“Conj-Neu-C18DA”。
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3xγ-Glu-C18二酸。带负电的连接基称为“Conj-Neg”。
Glu-C18二酸。带正电的连接基称为“Conj-Pos1”。
Glu-C18二酸。带正电的连接基称为“Conj-Pos2”。
2xOEG-γ-Glu-C16二酸
2xOEG-γ-Glu-C14二酸
2xOEG-γ-Glu-C20二酸
2xOEG-γ-Glu-C18二酸
实施例7：NKA(4-10)类似物上的氨基酸置换对NK2R激活、信号传导和选择性的研 究。
位置4(X1)突变
如实施例1中所述，通过对人NK1-、NK2-和NK3R的IP3测定来测量选择性和激活。如实施例4中所述，通过cAMP积累来研究Gs-偶联。如实施例3中所述，通过竞争性3H-NKA结合来测量结合。
结果：
表7.化合物304、335、305、336、306和337的选择性和受体激活的比较。
延长物在氨基酸序列上的位置用星号“*”标记。除非另有说明，否则“*”是“Conj-Neu-C18DA”，其结构如实施例6所示。数据表示为通过使用Graphpad Prism 8的S形4PL的非线性回归计算的EC50或功效，X为log(浓度)方程。ND：未测定的。
概述
·Asp4置换为Glu4不改变hNK2R IP3在NKA(4-10)类似物上的激活(化合物：304-337)。
·Asp4置换为Glu4不改变hNK2R对Tyr类似物的选择性，但降低结合亲和力(化合物：305和336)。
·Glu4 Tyr-类似物不激活Gs(化合物336)。
位置5(X2)突变
如实施例1中所述，通过对人NK1-、NK2-和NK3R的IP3测定来测量选择性和激活。
结果：
表8.通过研究化合物304与306(Lys5->Arg5)、337与335、336与357获得的结果。
延长物在氨基酸序列上的位置用星号“*”标记。除非另有说明，否则“*”是“Conj-Neu-C18DA”，其结构如实施例6所示。数据表示为通过使用Graphpad Prism 8的S形4PL的非线性回归计算的EC50或功效，X为log(浓度)方程。ND：未测定的。
概述
·位置5(X2)使用精氨酸置换进行测试。一般来说，精氨酸置换不影响NK2R激活、选择性或偏好(化合物：304-357)。
·对于Glu4_Tyr6类似物，Arg5置换可以增加NK2-和NK1R的功效，而不影响Gq偏好(化合物：336、337和357)。
·Arg5置换增加NK3R对NKA(4-10)Glu4类似物的效力(化合物：335和337)。
位置6(X3)突变
如实施例1中所述，通过对人NK1-、NK2-和NK3R的IP3测定来测量选择性和激活。如实施例4中所述，通过cAMP积累来研究Gs-偶联。如实施例3中所述，通过竞争性3H-NKA结合来测量结合。
结果
表9.化合物304、305、361、362、363、330和356的选择性和受体激活的比较。
NmLeu是L-N-甲基亮氨酸。延长物在氨基酸序列上的位置用星号“*”标记。除非另有说明，否则“*”是“Conj-Neu-C18DA”，其结构如实施例6所示。数据表示为通过使用Graphpad Prism 8中的S形4PL的非线性回归计算的EC50或功效，X为log(浓度)方程。ND：未测定的。
概述
·NKA(4-10)类似物上的Phe6置换为Tyr6促进了NK2R选择性，但功效、受体结合和Gs-偶联功效略有损失(化合物：304和305)。
·从Phe6苯基上的位置4到位置3改变酪氨酸苯基上的羟基位置，导致NK2R选择性降低，并将NK1R功效恢复到Phe类似物水平(化合物：304、305和361)。
·脯氨酸的引入或Ty6和Val7的转换导致NK1-3Rs受体激活的完全丧失(化合物：362和363)。
·I-4-Phe和dPhe置换完全破坏NK2R激活(化合物：330和356)。
位置7(X4)突变
如实施例1中所述，通过对人NK1-、NK2-和NK3R的IP3测定来测量选择性和激活。如实施例4中所述，通过cAMP积累来研究Gs-偶联。如实施例3中所述，通过竞争性3H-NKA结合来测量结合。
结果
表10.化合物314、315、335、305、348、351、304、387、336、397、344、366、381、382、383、384和386的选择性和受体激活的比较。
延长物在氨基酸序列上的位置用星号“*”标记。除非另有说明，否则“*”是“Conj-Neu-C18DA”，其结构如实施例6所示。数据表示为通过使用Graphpad Prism 8中的S形4PL的非线性回归计算的EC50或功效，X为log(浓度)方程。ND：未测定的。
概述
·位置7上的精氨酸置换导致NKA(4-10)类似物的受体激活特性丧失(化合物：314、315、335和336)。
·位置7上的异亮氨酸(S-同工型)置换是可能的，并且不改变Tyr6NKA(4-10)类似物的效力(potency)、功效(efficacy)和选择性(selectivity)。然而，异亮氨酸(R-同工型)降低NK2R效力。两种异亮氨酸置换都降低了Gs信号传导和受体结合能力(化合物：348和351)。
·NKA(4-10)类似物上的苏氨酸置换降低了NK2R活性，但可以作为Phe6-NKA(4-10)类似物中的选择性驱动因素而工作。类似于NKA，Thr7促进受体结合并维持Gs激活(化合物：304、387、305、397、344、366、381、382、383、384)。
·位置7上的丝氨酸置换降低了NK2R的效力和功效，而不影响选择性(化合物：305和386)。
位置8(X5)突变
如实施例1中所述，通过对人NK1-、NK2-和NK3R的IP3测定来测量选择性和激活。如实施例3中所述，通过竞争性3H-NKA结合来测量结合。
表11.化合物310、312、322、308、389、373、402、392、385、396、和393的选择性和受体激活的比较。
延长物在氨基酸序列上的位置用星号“*”标记。除非另有说明，否则“*”是“Conj-Neu-C18DA”，其结构如实施例6所示。数据表示为通过使用Graphpad Prism 8中的S形4PL的非线性回归计算的EC50或功效，X为log(浓度)方程。ND：未测定的。
概述
·NKA(2-10)上的β-丙氨酸置换促进了NK2-和NK3R选择性，但降低NK2R的效力和功效(化合物：310、312、322和308)。
·Aib8置换促进了Phe6-NKA(4-10)类似物中的选择性(化合物：389和373)。
·位置8d-Ser置换促进了具有内源性NKA(4-10)主链的NKA(4-10)类似物以及Phe6-和Tyr6-NKA(4-10)类似物的选择性，但降低了NK2R亲和力(化合物：389、402、392、385、396、393)。
位置9(X6)突变
如实施例1中所述，通过对人NK1-、NK2-和NK3R的IP3测定来测量选择性和激活。
表12.化合物304、389、305、392、344和393的选择性和受体激活的比较。
延长物在氨基酸序列上的位置用星号“*”标记。除非另有说明，否则“*”是“Conj-Neu-C18DA”，其结构如实施例6所示。数据表示为通过使用Graphpad Prism 8中的S形4PL的非线性回归计算的EC50或功效，X为log(浓度)方程。ND：未测定的。
概述
·N-甲基亮氨酸诱导了NKA(4-10)类似物对hNK2R的适度效力增加(化合物：304-393)。
·N-Me-Leu诱导了NKA(4-10)类似物中的NK2R选择性(化合物：304-393)。
位置10(X7)突变
如实施例1中所述，通过对人NK1-、NK2-和NK3R的IP3测定来测量选择性和激活。如实施例4中所述，通过cAMP积累来研究Gs偶联。如实施例3中所述，通过竞争性3H-NKA结合来测量结合。
表13.化合物316、305、344、369、353、313、370、395和394的选择性和受体激活的比较。
cHexAla是L-环己基丙氨酸。4-MeOPhe是L-4-甲氧基苯丙氨酸。延长物在氨基酸序列上的位置用星号“*”标记。除非另有说明，否则“*”是“Conj-Neu-C18DA”，其结构如实施例6所示。数据表示为通过使用Graphpad Prism 8中的S形4PL的非线性回归计算的EC50或功效，X为log(浓度)方程。ND：未测定的。
概述
·与正亮氨酸和methoxinine相比，位置10的蛋氨酸改善了NK2R的激活和结合。然而，与正亮氨酸类似物相比，methoxinine和正亮氨酸提供了更好的选择性，其中methoxinine类似物更有效(化合物：316、305、344、394和395)。
·用4F-Phe置换蛋氨酸是可能的，同时保持选择性、效力、信号传导和结合(化合物：313、353、369和370)。
实施例8：用于体内研究的材料和方法
材料：
NaH2PO4·H2O、Na2HPO4·2H2O、丙二醇、大鼠和小鼠的维持饮食(普通饲料，#1320，Altromin)、C57BL/6NRj小鼠(Janvier实验室)、60％脂肪能量的高脂肪饮食(HFD)(#D12492,Research Diets Inc.)、肽类似物(Novo Nordisk)、d-葡萄糖(Sigma)、胰岛素(Novo Nordisk)、无菌盐水溶液(Apoteket)、吐温-80(Sigma)、洛哌丁胺(Sigma)、血糖仪和葡萄糖条(Bayer)以及用于评估代谢和行为信息的Promethion系统(Sable SystemsInternational)。
飞行时间液相色谱质谱法(TF-LC-MS)：乙醇、甲醇、乙腈、甲酸、超纯水、TurboFlow旋流器柱0.5x50 mm、Aeris肽XB-C18 2.1x50 mm(3.6μm)、Thermo TSQ Altis三重四极杆质谱仪。
代谢物鉴定液相色谱质谱法(MetID-LC-MS)：甲醇、乙腈、甲酸、超纯水、WaterAcquity UPLC蛋白质BEH C4 2.1x50 mm (1.7m)、Bruker MaXis QTOF。
肽类似物的体内缓冲液：8mM磷酸盐和240mM丙二醇，pH 8.2。
洛哌丁胺体内缓冲液：补充有1％(v/v)吐温-80的盐水。
方法：
从断奶到6-10周龄左右，动物被安置在有维持饮食的地方。在任何时候，除了禁食之外，小鼠都可以在12小时的光暗循环和22-24℃的温度下随意获得食物和水。所有动物实验均按照丹麦动物检查条例进行。
对于使用饮食诱导的肥胖小鼠的研究，在实验前给小鼠喂食HFD至少20周。具体地，对于进行葡萄糖和胰岛素耐受测试的小鼠，选择高于45g的小鼠。
间接量热法用于评估单个肽类似物剂量依赖性增加能量消耗(EE)的能力。我们使用代谢笼和Promethion系统测量的间接量热法。为此，氧气消耗被用作EE的替代测量。使用呼吸交换率(RER)评估物质偏好(脂肪或碳水化合物)。平行地，记录诸如步行距离、水和食物摄入的行为信息。
在实验之前，将DIO小鼠转移到适应笼中至少10天(在室外5天，在Sable Systems气体分析仪模块中至少5天)以使其适应新环境。对于用于EE评估的所有体内化合物测试，小鼠在下午2点至4点之间接受皮下注射。
药代动力学：为了评估单个肽类似物的体内半衰期，我们使用注射一次肽类似物的10周龄左右的野生型瘦小鼠。对于每个样本时间点，使用3-4只小鼠，并在注射后的所示时间点从下颌下静脉抽血。在注射之前，小鼠可以随意获得标准饮食。将0.5mg/kg的肽类似物以2ml/kg的体积皮下注射给小鼠。
分别通过TF-LC-MS和MetID-LC-MS测量血液样品中存在的肽类似物和代谢物的量。
TF-LC-MS：
样品制备：一个体积的血浆用三个体积的乙醇沉淀(带有内标)。将混合物以13000g离心20分钟。用两体积的超纯水(1％甲酸)稀释一体积的上清液。
校正曲线：将肽类似物加入到空白小鼠血浆中。范围：0.5至2000nM(线性1/x2)。
色谱法，流动相：流动相A：5％(50/50甲醇/乙腈)+95％Milli-Q+1％甲酸。流动相B：5％Milli-Q+95％(50/50甲醇/乙腈)+1％甲酸。
柱：TurboFlow旋流器0.5x50 mm和Aeris Peptide XB-C18 2.1x50 mm(3.6μm)
质谱法：Thermo TSQ Altis三重四极杆，正电喷雾电离模式，MRM-模式。
MetID-LC-MS：
样品制备：一个体积的血浆用三个体积的甲醇沉淀。将混合物以13000g离心20分钟。用两体积的超纯水(1％甲酸)稀释一体积的上清液
校正曲线：将肽类似物加入到空白小鼠血浆中。范围：20nM、200nM和2000nM(线性1/x2)。
色谱法：流动相A：0.1％甲酸在超纯水中的溶液。流动相B：0.1％甲酸在乙腈中的溶液
柱：Water Acquity UPLC Protein BEH C4 2.1x50 mm (1.7μm)
质谱法：Bruker MaXis QTOF，正电喷雾电离模式
全扫描(m/z从300到1800)和MS/MS。
能量消耗筛选：适应后，将0.5mg/kg的肽类似物以2ml/kg的体积皮下注射给小鼠。小鼠每隔一天(q.a.d.，quaque altera die)注射一次，总共接受两次注射。对EE进行评估，并将随溶媒的增加量计算为注射后30小时时间内平均耗氧量的百分比。注射前，将肽类似物在体内缓冲液中溶解至0.25mg/ml。
能量消耗和体重减轻药效学：通过间接量热法评估单独肽类似物在DIO小鼠中剂量依赖性增加EE的能力。从适应开始到实验结束，对体重进行监测。适应后，小鼠通过每天注射四种不同剂量的NKA(4-10)类似物或通过每天皮下注射溶媒持续治疗九天。
在所有9天内观察EE、体重、食物摄取、水分摄取和步行距离。对EE随溶媒的增加量计算为注射后30小时时间内平均耗氧量的百分比。注射前，将肽类似物在体内缓冲液中溶解并稀释。为了考虑所测试化合物的不同半衰期，每种化合物的剂量都是根据给定化合物的个体pk-曲线计算的。如下所示，计算每种化合物相对于化合物305的目标AUC，以达到测试化合物的相同AUC。
305pK剂量：330nmol/kg
305Cmax：3453nM
305AUC：28771
胰岛素耐受性测试：在DIO小鼠中单次皮下注射NK2R选择性类似物后24小时，使用腹膜内胰岛素耐受性测试(ipITT)测定对胰岛素耐受性的影响。在实验当天，小鼠禁食两小时，然后通过腹膜内注射接受在盐水溶液(0.2mL/kg)中稀释的1.5U/kg胰岛素。使用血糖仪监测葡萄糖的变化。
葡萄糖耐受性测试：在DIO小鼠中单次皮下注射NK2R选择性类似物后24小时，使用腹膜内葡萄糖耐受性测试(ipGTT)测定对葡萄糖耐受性的影响。在实验当天，小鼠禁食四小时，然后通过腹膜内注射接受在盐水溶液(0.1mL/kg)中稀释的1g/kg葡萄糖。使用血糖仪监测葡萄糖的变化。
功能性排尿障碍测试：为了研究对功能性排尿障碍的影响，使用洛哌丁胺(5mg/kg)在瘦野生型雄性和雌性小鼠中诱导便秘。管饲后30分钟，给小鼠皮下给药任一溶媒、130、260，雄性还给药325nmol/kg的EB344。在洛哌丁胺管饲后6小时，将小鼠从笼子中取出，并计数粪便颗粒的数量。
实施例9：用于NK2R激活、信号传导和选择性的NKA和NKA(4-10)类似物上“缀合部 分”的定位和组成的研究
在内源性NKA和NK2R-选择性NKA(4-10)类似物上研究了“缀合部分”即“延长物”的位置和组成。
延长物位置定位在NKA(4-10)类似物的N-末端区域中。
研究了肽主链和脂肪酸之间连接基的电荷。
对脂肪酸进行了研究。
如实施例1中所述，通过对人NK1-、NK2-和NK3R的IP3测定来测量选择性和激活。如实施例4中所述，通过cAMP积累来研究Gs-偶联。如实施例3中所述，通过竞争性3H-NKA结合来测量结合。如实施例2中所述，在存在或不存在1％人血清白蛋白的情况下，使用IP3测定法通过受体激活来测定白蛋白结合。如实施例8中所述，在饲养在代谢笼中的饮食诱导的肥胖小鼠中测量能量消耗。如实施例8中所述，在化合物处理的瘦小鼠的血浆中测量药代动力学和暴露。
表14：延长物组合物对NK2R选择性NKA(4-10)类似物的受体活性和选择性的比较。
延长物在氨基酸序列上的位置用星号“*”标记，延长物/缀合部分的结构可以在实施例6中找到。Conj：缀合；Neu：中性电荷；Pos：正电荷；Neg：负电荷；MA：单酸；DA：二酸。Cxx是指脂质中碳原子的长度，即C18含有十八个碳原子。
表15.NK2R选择性NKA(4-10)类似物上延长物组合物对体外白蛋白结合，以及化合物暴露和体内药代动力学对体内能量消耗的影响的比较。
延长物在氨基酸序列上的位置用星号“*”标记，延长物/缀合部分的结构可以在实施例6中找到。BLLQ：低于定量下限。Conj：缀合；Neu：中性电荷；Pos：正电荷；Neg：负电荷；MA：单酸；DA：二酸。Cxx是指脂质中碳原子的长度，即C18含有十八个碳原子。
结果
延长物位置
·NKA(4-10)类似物，化合物301和307，表明Lys5延长的类似物是活性的，但与化合物304举例说明的N-末端延长相比，降低了NK2R的效力。
·具有两个延长物的化合物302，在N-末端的一个肽主链上和在Lys5处，使NKA(4-10)类似物失活(化合物302)。
连接基电荷
·延长物中脂肪酸部分和肽主链之间的连接基的电荷对于NKA(4-10)类似物的受体激活是重要的。
·带中性电荷的连接基不调节NK2R的选择性、效力和功效。(化合物：304和305相比374和375)。
·N-末端延长物或Lys5上的带负电荷的连接基降低NKA(4-10)类似物的NK2R效力(化合物：319和333)。
·与化合物305的带中性电荷的连接基相比，如化合物318和321中的带正电荷的连接基降低效力并增加白蛋白结合，导致更低的暴露水平和降低的能量消耗。
·延长物上的二酸脂肪酸部分对选择性和半衰期很重要。从C18二酸(如化合物305和344中)置换为C18单酸脂肪酸(如化合物390和391中)完全破坏了NK2R的选择性并缩短半衰期。
·C18二酸脂肪酸长度对于NK2R的效力和选择性是最佳的。将延长物上的C18二酸脂肪酸长度(如化合物344中)减少到C14二酸(化合物368)或C16二酸(化合物367)，或延长到C20二酸(化合物380)，都会导致NK2R选择性和功效的降低。分别具有C16和C14二酸的化合物367和368也失去NK2R效力。
概述
基于本实施例，得出的结论是，构成位于NKA(4-10)类似物N-末端上的2OEG-γGlu-C18二酸的延长物，如化合物304、305和344所示，对于NK2R的激活、选择性、半衰期和能量消耗诱导是最佳的。
实施例10 NK2R选择性NKA(4-10)类似物对饮食诱导的肥胖小鼠体重减轻的研究
延长的NKA类似物对饮食诱导肥胖(DIO)小鼠能量消耗和体重减轻的影响。
如实施例8中所述，在饲养在代谢笼中的饮食诱导的肥胖小鼠中测量能量消耗。如实施例8中所述，在化合物处理的瘦小鼠的血浆中测量药代动力学和暴露。
表16.NK2R选择性NKA(4-10)类似物304和高度NK2R选择性激动剂化合物305、344和383的半衰期与体内效力和功效的比较。
延长物在氨基酸序列上的位置用星号“*”标记，延长物/缀合部分的结构可以在实施例6中找到。
结果
·与溶媒相比，所有NK2R选择性NKA(4-10)类似物(化合物304、305、344和383)增加了能量消耗，具有11-12％的相似功效。
·与在位置5具有Phe的化合物(304和383)相比，具有Tyr5突变的类似物(化合物305和344)的能量消耗效力得到改善。
·选择性NK2R激动剂的体重减轻功效由半衰期决定。因此，与半衰期均为约10小时或更长的化合物304、344和383相比，半衰期为5.5小时的化合物305的体重减轻功效降低了约50％。
·与化合物304相比，高度NK2R选择性类似物，如305、344和383，表现出略低的体重减轻功效。这可能是由于残留的NK1R激活。
概述
本实施例证明，本公开的高度NK2R选择性和经久耐用的化合物，例如344和383，对于体重减轻诱导是优选的。
实施例11：NK2R选择性NKA(4-10)类似物对饮食诱导肥胖小鼠葡萄糖代谢影响的 研究
延长的高度NK2R选择性NKA(4-10)类似物对胰岛素抵抗和糖尿病前期饮食诱导肥胖(DIO)小鼠葡萄糖和胰岛素耐受性的影响。
如实施例8所述，对饮食诱导的肥胖小鼠进行葡萄糖和胰岛素耐受性测试。
结果
结果如图6所示。高度NK2R选择性分子344改善了肥胖小鼠的葡萄糖和胰岛素耐受性。对胰岛素耐受性的影响是由空腹血糖下降和胰岛素敏感性增加共同驱动的。
概述
药理学NK2R激活改善了饮食诱导的肥胖小鼠的葡萄糖和胰岛素耐受性。因此，本公开的化合物具有治疗胰岛素抵抗和糖尿病的潜力。
实施例12：NK2R选择性NKA(4-10)类似物对野生型小鼠功能性排尿障碍影响的研 究
延长的高度NK2R选择性NKA(4-10)类似物对洛哌丁胺诱导的瘦野生型小鼠功能性排尿障碍的影响。
如实施例8所述，洛哌丁胺诱导的便秘被用作功能性排尿障碍的模型。
结果
结果如图7所示。高度NK2R选择性分子344以剂量依赖性方式改善了洛哌丁胺诱导的功能性排尿障碍。
概述
药理学NK2R激活纠正了小鼠功能性排尿障碍。因此，本公开的化合物具有治疗功能性排尿障碍的潜力。
实施例13：序列
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/>
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除非另有说明，否则“*”是“Conj-Neu-C18DA”，其结构如实施例6所示。除非另有说明，否则缀合部分连接到N-末端的α-氨基上。
序列表
<110> 艾巴克生物科技有限公司（Embark Biotech ApS）
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<223> 酰胺化
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(6)
<223> Metoxinine
<400> 23
Asp Lys Tyr Val Gly Leu Xaa
1 5
<210> 24
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成的化合物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Conj-Neu-C18
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> Ile S同工型
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> N-甲基-亮氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> 酰胺化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> Nle
<400> 24
Asp Lys Tyr Ile Gly Leu Leu
1 5
<210> 25
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成的化合物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Conj-Neu-C18
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> Ile R同工型
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> N-甲基-亮氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> 酰胺化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> Nle
<400> 25
Asp Lys Tyr Ile Gly Leu Leu
1 5
<210> 26
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成的化合物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Conj-Neu-C18
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> N-甲基-亮氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> 酰胺化
<400> 26
Asp Lys Tyr Val Gly Leu Phe
1 5
<210> 27
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成的化合物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Conj-Neu-C18
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> D-Phe
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> N-甲基-亮氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> 酰胺化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> Nle
<400> 27
Asp Lys Phe Val Gly Leu Leu
1 5
<210> 28
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成的化合物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Conj-Neu-C18
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> N-甲基-亮氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> 酰胺化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> Nle
<400> 28
Glu Arg Tyr Val Gly Leu Leu
1 5
<210> 29
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成的化合物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Conj-Neu-C18
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> 3-OH-Phe
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> N-甲基-亮氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> 酰胺化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> Nle
<400> 29
Asp Lys Phe Val Gly Leu Leu
1 5
<210> 30
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成的化合物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Conj-Neu-C18
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> N-甲基-亮氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> 酰胺化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> Nle
<400> 30
Asp Lys Pro Val Gly Leu Leu
1 5
<210> 31
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成的化合物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Conj-Neu-C18
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> N-甲基-亮氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> 酰胺化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> Nle
<400> 31
Asp Lys Val Tyr Gly Leu Leu
1 5
<210> 32
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成的化合物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Conj-Neu-C18
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> N-甲基-亮氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> 酰胺化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> Metoxinine
<400> 32
Asp Lys Tyr Thr Gly Leu Xaa
1 5
<210> 33
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成的化合物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Conj-Neu-C16
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> N-甲基-亮氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> 酰胺化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> Nle
<400> 33
Asp Lys Tyr Val Gly Leu Leu
1 5
<210> 34
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成的化合物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Conj-Neu-C14
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> N-甲基-亮氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> 酰胺化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> Nle
<400> 34
Asp Lys Tyr Val Gly Leu Leu
1 5
<210> 35
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成的化合物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Conj-Neu-C18
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> N-甲基-亮氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> 酰胺化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> 4-F-Phe
<400> 35
Asp Lys Tyr Val Gly Leu Phe
1 5
<210> 36
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成的化合物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Conj-Neu-C18
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> N-甲基-亮氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> 酰胺化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> L-4-甲氧基苯丙氨酸
<400> 36
Asp Lys Phe Val Gly Leu Phe
1 5
<210> 37
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成的化合物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Conj-Neu-C18
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> 2-氨基异丁酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> 酰胺化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> Nle
<400> 37
Asp Lys Phe Val Xaa Leu Leu
1 5
<210> 38
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成的化合物
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> N-甲基-亮氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> 酰胺化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> Nle
<400> 38
Asp Lys Tyr Val Gly Leu Leu
1 5
<210> 39
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成的化合物
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> N-甲基-亮氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> 酰胺化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> Nle
<400> 39
Asp Lys Phe Val Gly Leu Leu
1 5
<210> 40
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成的化合物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Conj-Neu-C20
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> N-甲基-亮氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> 酰胺化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> Nle
<400> 40
Asp Lys Tyr Val Gly Leu Leu
1 5
<210> 41
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成的化合物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Conj-Neu-C18
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> N-甲基-亮氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Metoxinine
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> 酰胺化
<400> 41
Glu Lys Tyr Thr Gly Leu Xaa
1 5
<210> 42
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成的化合物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Conj-Neu-C18
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> N-甲基-亮氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Metoxinine
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> 酰胺化
<400> 42
Glu Lys Tyr Val Gly Leu Xaa
1 5
<210> 43
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成的化合物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Conj-Neu-C18
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> N-甲基-亮氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Metoxinine
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> 酰胺化
<400> 43
Asp Lys Phe Thr Gly Leu Xaa
1 5
<210> 44
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成的化合物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Conj-Neu-C18
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> N-甲基-亮氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Metoxinine
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> 酰胺化
<400> 44
Asp Lys Phe Val Gly Leu Xaa
1 5
<210> 45
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成的化合物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Conj-Neu-C18
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> D-Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> 酰胺化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> Nle
<400> 45
Asp Lys Phe Val Ser Leu Leu
1 5
<210> 46
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成的化合物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Conj-Neu-C18
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> N-甲基-亮氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> 酰胺化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> Nle
<400> 46
Asp Lys Tyr Ser Gly Leu Leu
1 5
<210> 47
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成的化合物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Conj-Neu-C18
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> N-甲基-亮氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> 酰胺化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> Nle
<400> 47
Asp Lys Phe Thr Gly Leu Leu
1 5
<210> 48
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成的化合物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Conj-Neu-C18
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> 酰胺化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> Nle
<400> 48
Asp Lys Phe Val Gly Leu Leu
1 5
<210> 49
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成的化合物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Conj-Neu-C18
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> N-甲基-亮氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> 酰胺化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> Nle
<400> 49
Asp Lys Tyr Val Gly Leu Leu
1 5
<210> 50
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成的化合物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Conj-Neu-C18
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> N-甲基-亮氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Metoxinine
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> 酰胺化
<400> 50
Asp Lys Tyr Val Gly Leu Xaa
1 5
<210> 51
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成的化合物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Conj-Neu-C18
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> 酰胺化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> Nle
<400> 51
Asp Lys Tyr Val Gly Leu Leu
1 5
<210> 52
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成的化合物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Conj-Neu-C18
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> 酰胺化
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Metoxinine
<400> 52
Asp Lys Tyr Val Gly Leu Xaa
1 5
<210> 53
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成的化合物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Conj-Neu-C18
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> 2-氨基异丁酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Metoxinine
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> 酰胺化
<400> 53
Asp Lys Tyr Val Xaa Leu Xaa
1 5
<210> 54
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成的化合物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Conj-Neu-C18
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> 2-氨基异丁酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> 酰胺化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> Nle
<400> 54
Asp Lys Tyr Val Xaa Leu Leu
1 5
<210> 55
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成的化合物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Conj-Neu-C18
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> D-Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Metoxinine
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> 酰胺化
<400> 55
Asp Lys Tyr Val Ser Leu Xaa
1 5
<210> 56
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成的化合物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Conj-Neu-C18
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> N-甲基-亮氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> 酰胺化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> Nle
<400> 56
Glu Lys Phe Thr Gly Leu Leu
1 5
<210> 57
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成的化合物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Conj-Neu-C18
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> D-Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> 酰胺化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> Nle
<400> 57
Asp Lys Tyr Val Ser Leu Leu
1 5

Claims (36)

1.根据式(I)的神经激肽受体2(NK2R)激动剂：
(A)-(B)(I)，
其中
(A)是包含通式X1X2X3X4X5X6X7的氨基酸序列的肽，其中
X1选自天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)；
X2选自赖氨酸(K)、精氨酸(R)和组氨酸(H)；
X3选自酪氨酸(Y)、苯丙氨酸(F)、间-酪氨酸(m-Y)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)、蛋氨酸(M)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)和丙氨酸(A)；
X4选自缬氨酸(V)、苏氨酸(T)、丝氨酸(S)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、甘氨酸(G)和丙氨酸(A)；
X5选自甘氨酸(G)、2-氨基异丁酸(Aib)、丝氨酸(S)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、β-丙氨酸(bA)和异亮氨酸(I)；
X6选自亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、丙氨酸(A)和N-甲基亮氨酸(Me-Leu)；并且
X7选自：正亮氨酸(Nle)、methoxinine(Mox)、蛋氨酸(M)、4-氟苯丙氨酸(4fF)和4-甲氧基苯丙氨酸(4MeOF)；
(B)是通式(II)的缀合部分
Fa-Lg(II)，
其中
Fa具有式(Fa-1)，
其中n为14至17，优选其中n为15；
并且其中X选自-OH、-OC1-6、-NH2、-NHC1-6和N(C1-6)2，
Lg是式(Lg-1)的连接基团，
其中Z是在主链中包含18-23个选自C、O和N的原子的链；
并且其中R选自H和C1-6烷基；并且Lg将(B)共价连接到肽(A)，
并且其中(B)与末端氨基酸共价连接。
2.根据前述权利要求中任一项所述的NK2R激动剂，其中所述肽(A)具有通式X1X2X3X4X5X6X7，其中
X1选自天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)；
X2选自赖氨酸(K)和精氨酸(R)；
X3选自酪氨酸(Y)和苯丙氨酸(F)和间-酪氨酸(m-Y)，
X4选自缬氨酸(V)和苏氨酸(T)；
X5选自甘氨酸(G)、2-氨基异丁酸(Aib)、β-丙氨酸(bA)和丝氨酸(S)；
X6选自亮氨酸(L)和N-甲基亮氨酸(Me-Leu)；并且
X7选自正亮氨酸(Nle)、methoxinine(Mox)、蛋氨酸(M)、4-氟苯丙氨酸(4fF)和4-甲氧基苯丙氨酸(4MeOF)。
3.根据前述权利要求中任一项所述的NK2R激动剂，其中X2为精氨酸(R)。
4.根据前述权利要求中任一项所述的NK2R激动剂，其中X3为酪氨酸(Y)。
5.根据前述权利要求中任一项所述的NK2R激动剂，其中X4为苏氨酸(T)。
6.根据前述权利要求中任一项所述的NK2R激动剂，其中X5选自2-氨基异丁酸(Aib)和丝氨酸(S)。
7.根据前述权利要求中任一项所述的NK2R激动剂，其中X6为N-甲基-亮氨酸(Me-Leu)。
8.根据前述权利要求中任一项所述的NK2R激动剂，其中X7为methoxinine(Mox)。
9.根据前述权利要求中任一项所述的NK2R激动剂，其中n为15并且其中X为-OH。
10.根据前述权利要求中任一项所述的NK2R激动剂，其中所述缀合部分的Lg不包含在pH＝7.4时带正电的官能团。
11.根据前述权利要求中任一项所述的NK2R激动剂，其中所述缀合部分的Lg在pH＝7.4时具有净中性电荷或-1。
12.根据前述权利要求中任一项所述的NK2R激动剂，其中所述缀合部分具有式(B1)；
13.根据前述权利要求中任一项所述的NK2R激动剂，其中所述缀合部分(B)共价连接到(A)的N-末端，任选地通过酰胺键。
14.根据前述权利要求中任一项所述的NK2R激动剂，其中通过与N-末端α-NH2基团的酰胺键，所述缀合部分(B)共价连接到(A)的N-末端。
15.根据前述权利要求中任一项所述的NK2R激动剂，其中所述肽(A)在C末端被酰胺化。
16.根据前述权利要求中任一项所述的NK2R激动剂，其中所述肽(A)包含7至15个氨基酸，例如7至14个氨基酸，例如7至13个氨基酸，例如7至12个氨基酸，例如7至11个氨基酸，例如7至11个氨基酸，例如7至10个氨基酸，例如7至9个氨基酸，例如7至8个氨基酸，优选地，其中所述肽包含7个氨基酸。
17.根据前述权利要求中任一项所述的NK2R激动剂，其中所述肽(A)包含不多于15个氨基酸，例如不多于14个氨基酸，例如不多于13个氨基酸，例如不多于12个氨基酸，例如不多于11个氨基酸，例如不多于10个氨基酸，例如不多于9个氨基酸，例如不多于8个氨基酸，例如不多于7个氨基酸。
18.根据前述权利要求中任一项所述的NK2R激动剂，其中所述肽(A)由通式X1X2X3X4X5X6X7的7个氨基酸组成。
19.根据前述权利要求中任一项所述的NK2R激动剂，其中
(A)是Asp；Lys；Phe；Val；Gly；NmLeu；Nle；NH2(化合物305)，并且
(B)具有共价连接到(A)的N-末端天冬氨酸的式(B1)。
20.根据权利要求1-18中任一项所述的NK2R激动剂，其中
(A)是Asp；Lys；Tyr；Val；Gly；NmLeu；Metox；NH2(化合物344)，并且
(B)具有共价连接到(A)的N-末端天冬氨酸的式(B1)。
21.根据权利要求1-18中任一项所述的NK2R激动剂，其中所述NK2R激动剂由SEQ IDNO:1至SEQ ID NO:57中任一个的序列组成。
22.根据权利要求1-18中任一项所述的NK2R激动剂，其中所述NK2R激动剂是：
23.根据前述权利要求中任一项所述的NK2R激动剂，其中所述NK2R激动剂是选择性神经激肽受体2(NK2R)激动剂。
24.根据前述权利要求中任一项所述的NK2R激动剂，其中所述NK2R激动剂对人NK2R的EC50为300nM或更小，例如250nm或更小，例如200nm或更小、例如150nM或更小、例如100nM或更小、例如90nM或更小、例如80nM或更小、例如70nM或更小、例如60nM或更小、例如50nM或更小。
25.根据前述权利要求中任一项所述的NK2R激动剂，其中所述NK2R激动剂对人NK2R的EC50为50nM或更小，例如40nm或更小，例如30nm或更小、例如20nM或更小、例如15nM或更小、例如14nM或更小、例如13nM或更小、例如12nM或更小、例如11nM或更小、例如10nM或更小。
26.根据前述权利要求中任一项所述的NK2R激动剂，其中所述NK2R激动剂对人NK1R的EC50为至少100nM，例如至少200nM，例如至少300nM，例如至少400nM，例如至少500nM。
27.根据前述权利要求中任一项所述的NK2R激动剂，其中所述NK2R激动剂对人NK3R的EC50为至少100nM，例如至少200nM，例如至少300nM，例如至少400nM，例如至少500nM。
28.一种药物组合物，其包含根据前述权利要求中任一项所定义的神经激肽受体2(NK2R)激动剂，以及一种或多种药学上可接受的佐剂、赋形剂、载体、缓冲剂和/或稀释剂。
29.根据权利要求1至27中任一项所定义的神经激肽受体2(NK2R)激动剂，其用作药物。
30.一种治疗受试者疾病的方法，包括施用根据权利要求1至29中任一项所定义的神经激肽受体2(NK2R)激动剂用于治疗NK2R介导的病症。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述NK2R介导的病症选自肥胖、功能性排尿障碍、糖尿病(如II型糖尿病)和糖尿病相关病症。
32.根据权利要求30-31中任一项所述的方法，其中所述NK2R介导的病症是代谢病症。
33.根据权利要求30-32中任一项所述的方法，其中所述代谢病症是糖尿病相关病症。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述糖尿病相关病症选自胰岛素耐受性受损和葡萄糖耐受性受损。
35.一种调节NK2R活性的方法，包括使NK2R与根据权利要求1至27中任一项所定义的神经激肽受体2(NK2R)激动剂接触。
36.根据权利要求1至27中任一项所定义的神经激肽受体2(NK2R)激动剂在制备用于治疗代谢病症的药物中的用途。
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