CN108676074A - 一种促肝细胞生长的活性多肽 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种促肝细胞生长的活性多肽,其中活性多肽的氨基酸序列为AAQKPDILTTGSGNPIG。本发明公开的活性多肽,可以靶向肝脏器官,明显刺激新生肝细胞的DNA合成,促进肝细胞生长,加速肝脏组织的修复,恢复肝功能,在开发预防或治疗肝炎、肝硬化和肝纤维化药物中应用。
Description
技术领域
本发明涉及多肽合成技术领域,特别是涉及一种促肝细胞生长的活性多肽。
背景技术
近年来,肝炎一直是全球性重要公共卫生问题之一,世卫组织最新数据显示,全球共有20亿人感染肝炎病毒,其中约有5亿人感染了慢性肝炎,每年约有100万人因此而死亡。肝脏相关的疾病,包括各种肝炎以及肝硬化、肝纤维化,是困扰人类健康的重大疾病,肝炎、肝硬化及肝纤维化均会有大量的肝细胞坏死,致肝衰竭甚至危及生命。
目前,抗生素作为一种对肝炎病毒疗效显著的药物在临床上广泛应用,但随着抗生素的长期使用,大量耐药性菌株不断产生而导致抗生素疗效下降、剂量提高;同时抗生素的滥用情况不断加剧等问题也引起了人们的重视。鉴于新药开发的速度较慢,因此活性多肽作为一种新型的抗生素替代物引发了学者的强烈兴趣。活性多肽其独特的氨基酸组成及结构中的两亲性,使多肽可以和细胞核内大分子如核酸、蛋白质等,以及病毒或细菌表面带负电荷的成分相结合,进而破坏细胞膜结构或胞内大分子而扰乱细胞的正常功能并导致细胞死亡。近年来,多肽类药物治疗肝脏疾病已经取得了不少进步,但是,到目前为止,治疗肝脏疾病仍旧缺乏有效的治疗策略和有效药物。
因此,提供一种活性多肽,从而能明显刺激新生肝细胞的DNA合成,促进肝细胞再生,加速肝脏组织的修复,恢复肝功能是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此,本发明提供了一种活性多肽,可以靶向肝脏器官,明显刺激新生肝细胞的DNA合成,促进肝细胞生长,加速肝脏组织的修复,恢复肝功能。
为了实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
一种促肝细胞生长的活性多肽,其特征在于,所述活性多肽的氨基酸序列为AAQKPDILTTGSGNPIG;SEQ ID NO:1。
其中,本发明中活性多肽的合成方法为化学合成,主要步骤为:
(1)以氯三苯甲基氯树脂为起始原料,以由9-芴甲氧羰基保护的氨基酸为单体,合成反应从C端向N端按照所述氨基酸序列依次缩合,接上氨基酸以合成多肽;
(2)合成完毕后加入裂解试剂,从而将所述多肽从树脂上裂解下来;
(3)使用乙醚沉淀所述多肽或者氮气吹干所述多肽,采用制备型HPLC进行纯化。
进一步地,所述活性多肽在开发预防或治疗肝炎、肝硬化和肝纤维化药物中的应用。
经由上述的技术方案可知,与现有技术相比,本发明提供了一种促肝细胞生长的活性多肽,具有如下技术优点:本发明中的活性多肽可以靶向肝脏器官,明显刺激新生肝细胞的DNA合成,促进肝细胞生长,加速肝脏组织的修复,恢复肝功能。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明提供的活性多肽的高效液相色谱图。
图2附图为本发明提供的活性多肽的质谱图。
图3附图为本发明提供的活性多肽对SMMC-7721细胞生长的促进作用图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1
活性多肽的化学合成方法
其中,DCM为二氯甲烷;HBTU为苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐;DIEA为N,N-二异丙基乙胺;DMF为N,N-二甲基甲酰胺;TFA为三氟乙酸;EDT为1,2-乙二硫醇;Fmoc为9-芴甲氧羰基;TIS为三异丙基硅烷;
步骤:
1)将3g氯三苯甲基氯树脂(取代度为1.03mmol/g)放入反应管中,加入45mL DCM,震荡30min;
2)接第一个氨基酸
通过砂芯抽滤掉溶剂,加入10mmol的Fmoc-Gly氨基酸,加入DMF溶解,再加入30mmol的DIEA,震荡60min;
3)脱保护
去掉DMF,加20%哌啶DMF溶液45mL,反应5min;去掉再加20%哌啶DMF溶液45mL,15min;
4)洗
加入30mL的DMF清洗两次,再加入30mL的DCM清洗两次,最后加入30mL的DMF清洗两次;
5)缩合
保护氨基酸12mmol,HBTU 13mmol,均使用15mL的DMF进行溶解,加入反应管,并立刻加入DIEA 13mmol,反应30min;
6)洗
加入30mL的DMF清洗一次,再加入30mL的DCM清洗两次,最后加入30mL的DMF清洗两次;
7)重复3-6步骤,从右到左依次接入序列中的氨基酸直至结束
8)抽干,按照下列步骤洗涤树脂
加入30mL的DMF清洗两次,加入30mL的甲醇清洗两次,加入30mL的DMF清洗两次;加入30mL的DCM清洗两次,抽干10min;
9)从树脂上切割多肽
配制切割液:TFA 95%,水1%,EDT 2%,TIS 2%;
用量:30mL;切割时间:120min;
10)纯化
将切割后的裂解液用氮气吹干,用乙醚洗涤6次,常温挥干,用制备型HPLC色谱将粗品提纯。
实施例2
其中,将实施例1得到的活性多肽进行液相色谱分析,其条件为:
流动相A:0.1%的TFA水溶液;流动相B:0.1%的TFA乙腈溶液;
梯度:20%-35%流动相B,10min;
色谱柱:Kromasil 100-5C184.6×300mm(5um);
波长:220nm;
流速:1.0mL/min。
其高效液相色谱图如图1所示;测得样品纯度为98.7%。
质谱(ESI):质谱图如图2所示;活性多肽的分子离子峰为1640.6。
实施例3
活性多肽对SMMC-7721细胞增长的刺激作用
取实施例1制备的活性多肽,用RPMI-1640培养液制成每1mL中含活性多肽100μg的溶液。用10%的小牛血清培养液培养SMMC-7721细胞至对数增长期,其中SMMC-7721细胞为商品化购买的细胞;用0.25%胰蛋白酶-乙二胺四醋酸二钠消化液,消化对数增长期的SMMC-7721细胞,加10%小牛血清培养液,稀释至每1mL中含2.5×104~5×104个细胞,将上述细胞悬液在96孔细胞板上铺板,每孔100μL,其中3孔加10%小牛血清培养液100μL作为空白对照,置于37℃,含5%二氧化碳饱和水汽的培养箱中,培养3~4小时使其贴壁。
供试品组,每孔加供试品溶液100μL,每批供试品均做3个孔,细胞对照组每孔分别加RPMI-1640培养液100μL,置于37℃,含5%二氧化碳饱和水汽的培养箱中培养48小时,结束培养前4小时取出培养板,吸去培养液,每孔加入0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.3)洗一次,然后在每孔中加入上述磷酸盐缓冲液(pH7.3)100μL和MTT溶液20μL,继续培养。
培养结束后,吸出培养液,每孔加入100μL二甲基亚砜,摇匀,在酶标仪上以550nm的波长处分别测定其吸收度。
结果:细胞对照组为0.0217±0.0009,供试品组为0.0661±0.0003值,供试品组和细胞对照组之间有显著性差异,p≤0.01。
结论:本发明的活性多肽对SMMC-7721肝细胞的生长具有明显的促进作用。
实施例4
根据实施例2中的方法,以LO-2,Chang liver,HepG-2和Huh-7细胞替代SMMC-7721细胞,并测定其吸收度;其中LO-2,Chang liver,HepG-2和Huh-7均为商品化购买的细胞。
结果:如图3所示,供试品组和细胞对照组之间有显著性差异,p≤0.01。
结论:本发明的活性多肽对LO-2,Chang liver,HepG-2和Huh-7肝细胞的生长具有明显的促进作用。
实施例5
活性多肽对肝损伤大鼠的活性
将雄性SD大鼠(220±10g)腹腔注射D-氨基半乳糖(500mg/kg体重),5小时后饲以颗粒饲料、5%葡萄糖水,分笼饲养48小时后将存活的SD大鼠50只分成2组,治疗组腹腔一次性注射活性多肽(500μg/kg体重),对照组注入同量注射用生理盐水。结果,25天后治疗组存活率为68%,而对照组为24%。
结论:本发明的活性多肽具有治疗D-氨基半乳糖所致大鼠肝衰竭的效果。
本发明中的活性多肽,可以靶向肝脏器官,明显刺激新生肝细胞的DNA合成,促进肝细胞生长,加速肝脏组织的修复,恢复肝功能;此外,活性多肽在开发预防或治疗肝炎、肝硬化和肝纤维化的药物中应用。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述,每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处,各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言,由于其与实施例公开的方法相对应,所以描述的比较简单,相关之处参见方法部分说明即可。
对所公开的实施例的上述说明,使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的,本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下,在其它实施例中实现。因此,本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例,而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 广州博瑞佳生物科技有限公司
<120> 一种促肝细胞生长的活性多肽
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ala Ala Gln Lys Pro Asp Ile Leu Thr Thr Gly Ser Gly Asn Pro Ile
1 5 10 15
Gly
Claims (2)
1.一种促肝细胞生长的活性多肽,其特征在于,所述活性多肽的氨基酸序列为AAQKPDILTTGSGNPIG;SEQ ID NO:1。
2.根据权利要求1所述的一种促肝细胞生长的活性多肽,其特征在于,所述活性多肽在开发预防或治疗肝炎、肝硬化和肝纤维化药物中的应用。
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