CN109154620A - 用于缺血患者的诊断和风险分层的方法和试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基于糖基化Apo J水平检测的用于诊断缺血或缺血性组织损伤的方法，用于在已患有缺血事件的患者中预测缺血的进展、用于确定已患有缺血事件的患者的预后以及用于确定患有稳定型冠脉疾病的患者患复发性缺血事件之风险的方法。本发明还涉及用于测定样品中糖基化Apo J的方法。

Description

用于缺血患者的诊断和风险分层的方法和试剂盒
技术领域
本发明涉及用于患有心肌缺血或脑缺血或与其相关的组织缺血性损伤的个体的预后、诊断和危险分层以及用于呈现患有稳定型冠状动脉疾病(coronary arterydisease，CAD)的个体中的复发性缺血事件的生物标志物。
背景技术
急性冠脉综合征(Acute coronary syndrome，ACS)和脑血管事件是动脉粥样硬化血栓形成最常见的临床表现，并且代表全世界死亡和残疾的主要原因。由于早期血运重建(revascularization)的重要性以及死亡的高风险和/或生活质量的下降，早期诊断至关重要。在这种背景下，生物标志物作为重要工具出现以补充用于患有疑似ACS之患者的诊断、检别分类(triage)、风险分层和管理的临床评估，以及区分缺血性卒中与出血性卒中。这些生物标志物应提供病理过程信息并代表更复杂和昂贵的诊断技术(如磁共振等)的替代选择。
事实上，由于非心脏问题与心脏缺血事件具有相似的症状(由于呼吸或肌肉病例状况引起的疼痛)，急诊室的入院百分率很高。在脑血管疾病的情况下，迫切需要具有出血性卒中与缺血性卒中的辨别物，从而可相应地且迅速地启动患者管理。
因此，对于用于缺血的早期、特异性和灵敏性检测的新生物标志物的鉴定存在未满足的需求。到目前为止，已经研究了炎症、心脏功能和坏死的标志物。然而，尚不清楚它们的测量是否可用于缺血综合征的诊断和预后。缺血性器官损伤通常先于组织坏死，并且如果及时检测到，则可逆转。用于准确且早期检测缺血的现有标志物的这种缺乏导致世界范围内提高的不必要的经济成本。
如今，急性冠脉综合征(ACS)的诊断和管理是基于临床评估、心电图检查结果和肌钙蛋白水平(唯一一组公认的生物标志物)。该方案的应用带来一些限制，这些限制使得寻找用于管理心肌缺血患者的新生物标志物是必不可少的。第一个缺点是心脏肌钙蛋白(cardiac troponin，cTn)是不可逆坏死(细胞死亡)(心肌损伤的晚期阶段)的标志物。此外，高灵敏度cTn测定(hs-cTn)已显示出一定的非特异性。另外，目前的指南强调需要进行连续hs-cTn测量以对急性胸痛患者进行适当的检别分类。
基于载脂蛋白J(apolipoprotien，Apo J)的同种型分布谱变化的用于检测缺血性组织损伤的方法已在出版物WO2011098645以及在Cubedo，J.，等(J.Proteome Res.，2011，10：211-220)中描述。在那些研究中，通过双向电泳随后通过质谱法鉴定两组不同的Apo J同种型Apo J-15和Apo J-29。这些Apo J形式与组织损伤有关，并且特别是与由AMI引起的心脏损伤有关。在缺血性损伤中，及时并准确地检测缺血事件是至关重要的，以防止其可导致不可逆的组织损伤的进展。在这种情况下，基于双向电泳和随后的质谱法用于确定Apo J分布谱变化的方法不能用于临床实践，因为它们太复杂、冗长且昂贵而无法用于缺血的诊断。
因此，本领域中需要用于检测血管损伤和特别是AMI的改进方法。
发明概述
在第一方面，本发明涉及用于在对象中诊断缺血或缺血性组织损伤的方法，其包括在所述对象的样品中确定含有N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)残基的糖基化Apo J的水平或含有N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和唾液酸残基的Apo J糖基化的水平，或用于在对象中诊断缺血或缺血性组织损伤的方法，其包括在所述对象的样品中确定能够与曼陀罗(Daturastramonium)凝集素特异性结合的糖基化Apo J的水平或能够与栽培小麦(Triticumvulgaris)凝集素特异性结合的糖基化Apo J的水平。
在第二方面，本发明涉及用于在已患有缺血事件的患者中预测缺血的进展或用于确定已患有缺血事件的患者的预后的方法，其包括在所述患者的样品中确定糖基化Apo J的水平，其中糖基化Apo J相对于参考值的降低水平指示缺血正在进展或患者的不良预后。
在另一方面，本发明涉及用于确定患有稳定型冠脉疾病的患者患复发性缺血事件的风险的方法，其包括在所述患者的样品中确定糖基化Apo J的水平，其中糖基化Apo J相对于参考值的降低水平指示患者表现出患复发性缺血事件的风险提高。
在另一方面，本发明涉及试剂盒，其包含
a.第一试剂，其为与选自N-乙酰葡糖胺和唾液酸的聚糖残基特异性结合的凝集素，以及
b.第二试剂，其能够与Apo J多肽特异性结合。
在另一方面，本发明涉及根据本发明的试剂盒，其用于在患者中诊断缺血或缺血性组织损伤、用于在已患有缺血事件的患者中确定缺血的进展、用于对已患有缺血事件的患者进行预后或用于确定患有稳定型冠脉疾病的患者患复发性缺血事件的风险。
在另一方面，本发明涉及用于测定样品中糖基化Apo J的方法，其包括以下步骤：
(i)在足以使样品中的糖基化Apo J与凝集素之间形成复合物的条件下，使所述样品与特异性结合糖基化Apo J中存在的聚糖残基的凝集素接触，以及
(ii)检测含有凝集素和糖基化Apo的复合物的量。
附图简述
图1.Apo J 2-DE谱。来自对照和AMI前(pre-AMI)缺血血清样品的2-DE凝胶中ApoJ簇的代表性图样。血清中的Apo J检测为13个斑点的簇，pI范围为4.5至5.0，且分子量为37.1至47.3kDa。鉴定为Apo J的斑点从酸性pH至碱性pH进行编号。斑点2仅在AMI前缺血患者中明显。注意，标记为1、3、7、8、10、11和13的斑点描绘了AMI前缺血中的增强的检测水平，而斑点6和9描绘了与对照组相比AMI前缺血凝胶中降低的强度。斑点3、7、8和11是Apo J-29，且斑点6和9是Apo J-15。
图2.糖基化Apo J形式。来自(A)健康供体和(B)AMI前缺血患者的糖基化血清级分(通过其与伴刀豆凝集素A(Concavalin A)和栽培小麦凝集素的混合物结合而分离)中的Apo J簇的代表性2-DE图像。检测到pI和MW与总血清的那些对应的六个斑点(1、2、4、5、8和11)。对于图1，斑点从酸性pH至碱性pH进行编号。AMI前缺血患者的Apo J斑点的强度低于对照。在斑点4和8中，降低更明显。
图3.O-糖基化Apo J形式。O-糖基化血清级分中的Apo J簇的代表性2-DE图像(通过其与木菠萝(Artocarpus integrifolia)凝集素结合而分离)。检测到pI和MW与总血清的那些对应的9个斑点(1、3、4、6、7、8、9、11和12)。对于图1和2，斑点从酸性pH至碱性pH进行编号。
图4.Apo J糖基化形式的丰度。示出了通过用新的和原始的免疫亲和酶促糖基化测定法或EGA的特异性测量之人血浆样品中不同Apo J糖基化形式的丰度的条形图。
图5.诊断值。(A)示出了缺血早期(N＝38)和健康对象(N＝144)中Apo J-GlcNAc+Neu5Ac+Apo J-GlcNAc水平的箱形图(box-plot)。(B)示出了存在心肌缺血的Apo J-GlcNAc+Neu5Ac+ApoJ-GlcNAc水平之诊断值的接受者操作曲线(Receiver operating curve，ROC)，曲线下面积(AUC)为0.934(P＜0.0001)且截止值为332μg/mL，灵敏度为97％，且特异性为71％。
图6.STEMI患者中的诊断值。(A)示出了入院时STEMI患者(N＝212)和健康对象(N＝144)中Apo J-GlcNAc+Neu5Ac+Apo J-GlcNAc水平的箱形图。(B)示出了存在缺血的ApoJ-GlcNAc+Neu5Ac+Apo J-GlcNAc水平之辨别值的接受者操作曲线(ROC)，曲线下面积(AUC)为0.713(P＜0.0001)且截止值为409μg/mL，灵敏度为80％，且特异性为53％。(C)示出入院时STEMI患者(N＝340)和健康对象(N＝139)中Apo J-GlcNAc水平的箱形图。(B)示出了存在缺血的Apo J-GlcNAc水平之辨别值的接受者操作曲线(ROC)，曲线下面积(AUC)为0.830(P＜0.0001)且截止值为393μg/mL，灵敏度为81％，且特异性为72％。
图7.缺血进展。(A)示出了入院时和缺血时Apo J-GlcNAc+Neu5Ac+A po J-GlcNAc水平之间的反向且显著相关性的回归图。(B)示出了入院之后3天(t＝72h)的82名STEMI患者中Apo J-GlcNAc+Neu5Ac+Apo J-GlcNAc水平进行性降低的箱形图。(C)示出了入院时和缺血时Apo J-GlcNAc水平之间的反向且显著相关性的回归图。
图8.预后值。示出了入院时Apo J-GlcNAc+Neu5Ac+Apo J-GlcNAc水平的显著性差异与(A)已知与院内死亡和6个月死亡直接相关的最终TIMI血流分级(TIMI flow grade)；(B)与在患有STEMI之后较差的预后有关的心源性休克的存在(65位心源性休克患者和147位无心源性休克)相关的箱形图。
图9.风险分层。(A)示出了入院时Apo J-GlcNAc+Neu5Ac+Apo J-GlcNAc水平与GRACE风险评分之间的反向且显著相关性的回归图。(B)示出了STEMI患者入院之后3天最高GRACE风险评分值与Apo J-GlcNAc+Neu5Ac+Apo J-GlcNAc水平降低之间关联的箱形图。(C)示出了入院时Apo J-GlcNAc水平与GRACE风险评分之间的反向且显著相关性的回归图。
图10.STEMI患者中6个月随访时的复发事件和死亡。Kaplan-Meier曲线示出了以下的影响：在入院时Apo J-GlcNAc+Neu5Ac+Apo J-GlcNAc(A)和T肌钙蛋白(B)水平，6个月随访之后存在复发性缺血事件或死亡；以及入院时的Apo J-GlcNAc水平和死亡(C)或6个月随访之后复发性缺血事件与死亡的组合(D)。
图11.Apo J-GlcNAc+Neu5Ac+Apo J-GlcNAc血浆水平的预测值。(A)示出了稳定型CAD患者的样品采集和随访的时机的方案：患者在样品采集前患有急性冠脉综合征(ACS)平均0.6±0.04年并随后随访2.3±0.3年。(B)示出了在随访时患有缺血性复发事件的慢性CAD患者(N＝16)与未患有复发性事件的患者(N＝18)相比Apo J-GlcNAc+Neu5Ac+Apo J-GlcNAc水平的箱形图。(C)示出了在稳定型CAD患者中呈现复发性缺血事件的Apo J-GlcNAc+Neu5Ac+Apo J-GlcNAc水平之预测值的接受者操作曲线(ROC)。
图12.脑缺血中Apo J-GlcNAc+Neu5Ac+Apo J-GlcNAc的诊断值。示出卒中患者(N＝174)和健康对象(N＝164)中的Apo J-GlcNAc+Neu5Ac+Apo J-GlcNAc血浆水平的箱形图。
发明详述
用于缺血组织损伤的诊断方法
本发明的作者已经观察到，在缺血的早期阶段，含有GlcNAc残基的Apo J的水平或含有GlcNAc和唾液酸(Neu5Ac)的Apo J的水平相对于对照对象中观察到的水平降低。虽然已经描述了糖基化Apo J的水平和心脏缺血患者之间的相关性，但是该研究是通过使用能够与含有α-甘露糖、α-葡萄糖、(GlcNAc)2和Neu5Ac残基的聚糖结合的凝集素的混合物确定糖基化Apo J的水平来进行的。该方法不允许鉴定优先有助于辨别患者与对照对象的那些糖基化Apo J形式。本发明的作者已经能够鉴定优先有助于辨别来自患有缺血的患者的样品与对照样品的那些糖基化ApoJ形式。事实上，在先前的研究中，作者报道了Apo J-29在AMI前缺血中升高，与含有GlcNAc残基的Apo J或含有GlcNAc和唾液酸(Neu5Ac)的Apo J的情况相反。此外，AMI前缺血患者在检测的具有α-甘露糖、α-葡萄糖、(GlcNAc)2和Neu5Ac残基的Apo J中显示25％的降低，而含有GlcNAc残基的Apo J或含有GlcNAc和唾液酸(Neu5Ac)的Apo J的特异性检测导致AMI前缺血患者中45％至50％的降低。因此，相对于使用现有技术中描述的方法使用测定的糖基化Apo J形式进行的诊断，这些糖基化Apo J形式的确定允许以提高的灵敏度和特异性进行缺血的诊断。
因此，在第一方面，本发明涉及用于在对象中诊断缺血或缺血性组织损伤的方法(下文中称为本发明的诊断方法)，其包括在所述对象的样品中确定含有N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)残基的糖基化Apo J的水平或含有N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和唾液酸残基的糖基化Apo J的水平，其中含有N-乙酰葡糖胺残基的Apo J相对于参考值的降低水平或含有N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和唾液酸残基的Apo J相对于参考值的降低水平指示患者患有缺血或缺血性组织损伤。本发明还涉及用于在对象中诊断缺血或缺血性组织损伤的第二方法，其包括在所述对象的样品中确定能够与曼陀罗凝集素特异性结合的糖基化Apo J的水平或能够与栽培小麦凝集素特异性结合的Apo J糖基化的水平，其中相对于参考值，能够与曼陀罗凝集素特异性结合的Apo J的降低水平或能够与栽培小麦凝集素特异性结合的Apo J的降低水平指示患者患有缺血或缺血性组织损伤。
本发明的诊断方法是特别有利的，因为它允许在相关器官或组织的不可逆坏死损伤之前检测急性缺血事件(不依赖于ACS的情况下的肌钙蛋白水平)。即使在事件发生之后的前六个小时内，这也为缺血的存在提供诊断值。
在本发明的上下文中，术语“诊断”涉及当应用如本文中所公开的方法时，辨别来自患有心肌缺血或脑缺血或与其相关的缺血性组织损伤的患者的样品与来自未患有该损害和/或损伤的个体的样品的能力。如本领域技术人员所理解的，这种检测并非意在对所有样品100％正确。然而，它要求对所分析样品的统计学上显著数量进行正确分类。统计上显著的量可由本领域中的专家通过使用不同的统计学工具来设置，例如但不限于置信区间的确定、p值确定、t检验(Student’s t test)和费希尔判别函数(discriminating functionFisher)。优选地，置信区间为至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或小于99％。优选地，p值小于0.05、0.01、0.005或0.0001。优选地，本发明可在至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的所测试的特定组或群体的对象中正确地检测缺血或缺血性损伤。
术语“缺血”在本文中与“缺血事件”可互换使用并且是指由于向组织的器官的血流降低或中断而导致的任何情况。缺血可能是短暂的或永久的。
表述“缺血性组织损伤”、“缺血性组织损害”、“缺血引起的组织损伤”、“与缺血相关的组织损伤”、“由于缺血导致的组织损伤”、“由缺血引起的组织损伤”和“缺血性损伤的组织”是指由于一段时间缺血而对器官或组织或细胞的形态学、生理学和/或分子损伤。
在一个实施方案中，由缺血引起的损伤是心脏组织的损伤。在一个更优选的实施方案中，心肌组织的损伤由心肌缺血引起。
术语“心肌缺血”是指由冠状动脉粥样硬化和/或向心肌供氧不足引起的循环障碍(circulatory disturbance)。例如，急性心肌梗死表示对心肌组织的不可逆缺血性损害。这种损害导致冠状动脉循环中的闭塞性(例如，血栓形成或栓塞)事件并且产生其中心肌代谢需求超过向心肌组织之氧供应的环境。
在另一个实施方案中，损伤由微血管性心绞痛引起。本文中使用的术语“微血管性心绞痛”是指由通过小的心脏血管的血流不足引起的病症。
在一个实施方案中，由缺血引起的损伤是脑组织的损伤。在另一个实施方案中，对脑组织的损伤是由缺血性卒中引起的。术语“缺血性卒中”是指由脑血管阻塞(导致脑缺氧)引起的脑功能的突然丧失，其特征在于肌肉控制丧失、感觉或意识减弱或丧失、头晕、言语不清或随着脑损伤的程度和严重性而改变的其他症状，也称为脑事故或脑血管事故。术语“脑缺血”(或“卒中”)也指脑供血不足，通常导致脑缺氧。
术语“对象”或“个体”或“动物”或“患者”包括期望治疗的任何对象，特别是哺乳动物对象。哺乳动物对象包括人、家畜、农场动物和动物园动物或宠物动物，例如狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛、奶牛等。在本发明的一个优选实施方案中，对象是哺乳动物。在本发明的一个更优选的实施方案中，对象是人。
本文中使用的术语“样品”或“生物样品”是指从对象分离的生物材料。生物样品含有适用于检测给定蛋白质(例如，Apo J)的糖基化形式之水平的任何生物材料。样品可从任何合适的组织或生物流体中分离，例如血液、唾液、血浆、血清、尿、脑脊液(cerebrospinalliquid，CSF)或粪便。在本发明的一个特别实施方案中，样品是组织样品或生物流体。在本发明的一个更特别的实施方案中，生物流体选自血液、血清或血浆。
优选地，在以相关术语进行确定的情况下，用于确定Apo J的不同糖基化形式之水平的样品是用于确定参考值的相同类型的样品。例如，如果含有GlcNAc残基的Apo J或含有GlcNAc和唾液酸残基的Apo J的测定在血浆样品中进行，则血浆样品也将用于确定参考值。如果样品是生物流体，则参考样品也将在相同类型的生物流体中测定，例如，血液、血清、血浆、脑脊液。
本文中使用的术语“Apo J”是指多肽，也称为“簇集素(clusterin)”、“睾酮抑制性前列腺信使(testosterone-Repressed Prostate Message)”、“载脂蛋白J”、“补体相关蛋白SP-40，40”、“补体细胞裂解抑制剂、“补体裂解抑制剂”、“硫酸化糖蛋白”、“Ku70-结合蛋白”、“NA1/NA2”、“TRPM-2”、“KUB1”、“CLI”。人Apo J是在UniProtKB/Swiss-Prot数据库(2016年3月16日的条目版本187)中以登录号P10909提供的多肽。
本文中使用的术语“含有GlcNAc残基的Apo J”是指在至少一个聚糖链中含有至少一个GlcNAc重复的任何Apo J分子，尽管通常Apo J将在每个聚糖链中含有至少一个N-乙酰基葡糖胺。“含有GlcNAc残基的Apo J”包括在高甘露糖N-聚糖、复合型N-聚糖、杂合寡糖N-聚糖或O-聚糖中含有至少一个GlcNAc残基的Apo J分子。取决于N-聚糖的类型，可发现GlcNAc直接连接至多肽链或在N-聚糖的远端位置。
术语“GlcNAc”或“N-乙酰基葡糖胺”是指葡萄糖胺通过乙酸酰胺化产生的并具有以下一般结构的葡萄糖衍生物：
在一个实施方案中，含有GlcNAc残基的Apo J含有两个GlcNAc残基，并且在本文中称为(GlcNAc)2。含有(GlcNAc)2残基的Apo J分子包括其中(GlcNAc)2存在于高甘露糖N-聚糖、复合型N-聚糖、杂合寡糖N-聚糖或O-聚糖中的分子。取决于N-聚糖的类型，可发现(GlcNAc)2直接连接至多肽链或在N-聚糖的远端位置。
在一个优选的实施方案中，含有GlcNAc或(GlcNAc)2残基的糖基化Apo J的水平被定义为能够曼陀罗凝集素与特异性结合的Apo J水平。
当在本发明中用于指凝集素与糖基化形式的Apo J结合时，术语“特异性结合”被理解为通过对非特异性结合具有显著更高亲和力的两个分子的三维结构之间的互补性的存在，凝集素与糖基化形式的Apo J特异性结合以使得所述凝集素与糖基化形式的Apo J之间的结合相对于反应混合物中存在的其他分子优选在任意所述分子的结合之前发生的能力。这导致凝集素不与Apo J分子中可能存在或可能不存在的其他聚糖交叉反应。例如，可通过评估所述凝集素在常规条件下与目的聚糖以及与一定数量的或多或少(结构上和/或功能上)密切相关的聚糖的结合来测试所研究凝集素的交叉反应性。只有当凝集素与目的聚糖结合但不与或基本上不与任何其他聚糖结合时，才认为对目的聚糖具有特异性。例如，如果凝集素与糖基化Apo J之间的结合亲和力的解离常数(Kd)小于10-6M、小于10-7M、小于10-8M、小于10-9M、小于10-10M、小于10-11M、小于10-12M、小于10-13M，小于10-14M或小于10-15M时，则认为结合是特异性的。
在一个优选的实施方案中，“含有GlcNAc残基的Apo J”基本上不含其他类型的N-连接或O-连接的糖类。在一个实施方案中，“含有GlcNAc残基的Apo J”不含有N-连接或O-连接的α-甘露糖残基。在另一个实施方案中，“含有GlcNAc残基的Apo J”不含有N-连接或O-连接的α-葡萄糖残基。在另一个实施方案中，“含有GlcNAc残基的Apo J”不含有N-连接或O-连接的α-甘露糖残基或N-连接或O-连接的α-葡萄糖残基。
本文中使用的术语“含有GlcNAc和唾液酸残基的Apo J”是指在其聚糖链中含有至少一个N-乙酰基-葡萄糖重复和至少一个唾液酸残基重复的任何Apo J分子。
本文中使用的术语“唾液酸”是指称为N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)并具有以下一般结构的单糖：
在一个实施方案中，Apo J含有两个GlcNAc残基和一个唾液酸残基(下文中称为(GlcNAc)2-Neu5Ac)。在另一个实施方案中，GlcNAc和唾液酸残基通过一个或更多个单糖连接。
在一个实施方案中，含有N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和唾液酸残基的糖基化Apo J的水平对应于能够与栽培小麦凝集素特异性结合的Apo J的水平。
在一个优选的实施方案中，“含有GlcNAc残基和唾液酸残基的Apo J”基本上不含其他类型的N-连接或O-连接的糖类。在一个实施方案中，“含有GlcNAc和唾液酸残基的ApoJ”不含有N-连接或O-连接的α-甘露糖残基。在另一个实施方案中，“含有GlcNAc和唾液酸残基的Apo J”不含有N-连接或O-连接的α-葡萄糖残基。在另一个实施方案中，“含有GlcNAc残基和唾液酸残基的Apo J”不含有N-连接或O-连接的α-甘露糖残基或N-连接或O-连接的α-葡萄糖残基。
在一个优选的实施方案中，“能够与栽培小麦凝集素特异性结合的糖基化Apo J”对应于含有至少一个唾液酸残基或至少一个GlcNAc残基的任何糖基化形式的Apo J，包括含有N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)残基但不含唾液酸残基的Apo J、含有(GlcNAc)2残基但不含唾液酸残基的Apo J、含有N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)残基和唾液酸残基的Apo J、含有(GlcNAc)2残基和唾液酸的Apo J以及含有唾液酸但不含GlcNAc或(GlcNAc)2残基的Apo J。应理解，(GlcNAc)残基和(GlcNAc)2残基可存在于与唾液酸残基相同的聚糖链中。或者，唾液酸残基可存在于不含(GlcNAc)残基或(GlcNAc)2残基的聚糖链中。
在一个优选的实施方案中，“能够与曼陀罗凝集素特异性结合的糖基化Apo J”对应于含有至少一个GlcNAc残基的任何糖基化形式的Apo J，包括含有N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)残基的Apo J和含有(GlcNAc)2残基的Apo J。
关于含有N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)残基的糖基化Apo J水平，术语“降低水平”或“低水平”涉及样品中含有N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)残基的Apo J的任何表达水平低于参考值。因此，当含有N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)残基的Apo J表达水平比其参考值低至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％、至少110％、至少120％、至少130％、至少140％、至少150％或更多时，认为含有N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)残基的Apo J表达水平降低或低于其参考值。
关于含有N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和唾液酸残基的糖基化Apo J的水平相关，术语“降低水平”或“低水平”涉及样品中含有N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和唾液酸残基的Apo J的任何表达水平低于参考值。因此，当含有N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和唾液酸残基的Apo J表达水平比其参考值低至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％、至少110％、至少120％、至少130％、至少140％、至少150％或更多时，认为含有N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和唾液酸残基的Apo J表达水平降低或低于其参考值。
关于能够与栽培小麦凝集素特异性结合的糖基化Apo J水平，术语“降低水平”或“低水平”涉及在样品中能够与栽培小麦凝集素特异性结合的Apo J的任何表达水平低于参考值。因此，当能够与栽培小麦凝集素特异性结合的Apo J的表达水平比其参考值低至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％、至少110％、至少120％、至少130％、至少140％、至少150％或更多时，认为能够与栽培小麦凝集素特异性结合的Apo J的表达水平降低或低于其参考值。
关于能够与曼陀罗凝集素特异性结合的糖基化Apo J水平，术语“降低水平”或“低水平”涉及在样品中能够与曼陀罗凝集素特异性结合的ApoJ的任何表达水平低于参考值。因此，当能够与曼陀罗凝集素特异性结合的Apo J的表达水平比其参考值低至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％、至少110％、至少120％、至少130％、至少140％、至少150％或更多时，认为能够与曼陀罗凝集素特异性结合的Apo J的表达水平降低或低于其参考值。
本发明的诊断方法包括将在研究对象中获得的水平与参考值进行比较，其中相对于参考值含有N-乙酰葡糖胺残基的Apo J的降低水平或相对于参考值含有N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和唾液酸残基的Apo J的降低水平指示患者患有缺血或缺血性组织损伤。本发明的诊断方法作为替代地包括将在研究对象中获得的水平与参考值进行比较，其中相对于参考值能够与曼陀罗凝集素结合的Apo J的降低水平或相对于参考值能够与栽培小麦凝集素结合的Apo J的降低水平指示患者患有缺血或缺血性组织损伤。
本文中使用的术语“参考值”涉及用作用于评价由从对象收集的样品获得的值或数据的参考的预定标准。参考值或参考水平可以是绝对值；相对值；具有上限或下限的值；一系列的值；平均值；中值；平均值；或与特定对照或基线值相比的值。参考值可基于单个样品值，例如，从来自被测试对象的样品获得的但在较早的时间点的值。参考值可基于大量的样品，例如来自实际年龄匹配组的对象群体，或基于包括或不包括待测试样品的样品池。在一个实施方案中，参考值对应于在健康对象中确定的含有GlcNAc残基的Apo J的水平、含有GlcNAc和唾液酸(Neu5Ac)的Apo J的水平、能够与栽培小麦凝集素特异性结合的Apo J的水平或者能够与曼陀罗凝集素特异性结合的Apo J水平，其中健康对象被理解为在含有GlcNAc残基的Apo J的水平、含有GlcNAc和唾液酸(Neu5Ac)的Apo J的水平、能够与栽培小麦凝集素特异性结合的Apo J水平或能够与曼陀罗凝集素特异性结合的Apo J水平时不显示缺血性组织损伤，并且优选地不显示缺血性损伤的病史的对象。
在另一个实施方案中，参考值对应于相应生物标志物的平均值或平均水平，所述生物标志物是从在临床观点上看良好记录的且没有疾病(特别是未患有缺血性组织损伤，特别是未患有缺血性心肌损伤或缺血性脑损伤)的患者组获得的样品池确定的。在所述样品中，例如可通过确定参考群体中的平均表达水平来确定表达水平。在确定参考值时，有必要考虑样品类型的一些特征，例如年龄、性别、身体状态或患者的其他特征。例如，参照样品可从相同量的至少2个、至少10个、至少100个至超过1000个个体的组中获得，使得群体在统计学上是显著的。
应理解，根据本发明的诊断方法用于诊断患者的参考值是从相同类型的样品以及与诊断中考虑的标志物相同的生物标志物获得的值。因此，如果通过确定含有GlcNAc或(GlcNAc)2的糖基化Apo J的水平来实施诊断方法，则诊断中使用的参考值也是从如上定义的健康对象或样品池中获得含有GlcNAc残基或(GlcNAc)2(视情况而定)的糖基化Apo J的表达水平。在另一个实施方案中，如果通过确定含有GlcNAc和唾液酸残基的糖基化Apo J的水平来实施诊断方法，则诊断中使用的参考值也是如上所述获得的含有N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和唾液酸残基的糖基化Apo J的表达水平。在另一个实施方案中，如果通过确定能够与曼陀罗凝集素特异性结合的糖基化Apo J的水平来实施诊断方法，则诊断中使用的参考值也是如上所述获得的能够与曼陀罗凝集素特异性结合的糖基化Apo J的表达水平。在另一个实施方案中，如果通过确定能够与栽培小麦凝集素特异性结合的糖基化Apo J的水平来实施诊断方法，则诊断中使用的参考值也是如上所述获得的能够与栽培小麦特异性结合的糖基化的Apo J的表达水平。
在另一个实施方案中，如果测定生物标志物以诊断心肌组织损伤，则参考值将是来自不显示心肌组织损伤且优选地没有患心肌组织损伤之记录的健康对象的相同生物标志物的水平。如果参考值是从来自对象的样品池获得的相同生物标志物的平均水平，则制备样品池的对象是不显示心肌组织损伤且优选没有患心肌组织损伤之记录的对象。
在另一个实施方案中，如果测定生物标志物以诊断脑组织损伤，则参考值将是来自不显示脑组织损伤且优选没有患脑组织损伤之记录的健康对象的相同生物标志物的水平。如果参考值是从来自对象的样品池中获得的相同生物标志物的平均水平，则获得样品池的对象是不显示脑组织损伤且优选没有患脑组织损伤之记录的对象。
可优化本发明的诊断方法中使用的参考值以获得期望的特异性和灵敏度。
在一个实施方案中，当期望97％的灵敏度和71％的特异性时，在心肌缺血的诊断中使用的参考值是332μg/mL的Apo J-GlcNAc+Neu5Ac+Apo J-GlcNAc或393μg/mL的Apo J-GlcNAc，或者当期望81％的灵敏度和72％的特异性时，参考值是393μg/mL的Apo J-GlcNAc(即，当患者显示低于332μg/mL的Apo J-GlcNAc+Neu5Ac+Apo J-GlcNAc时，根据本发明的诊断方法允许心肌缺血的诊断具有97％的灵敏度和71％的特异性，或者当患者显示低于393μg/mL的Apo J-GlcNAc时，具有81％的灵敏度和72％的特异性)。
在另一个实施方案中，当期望66％的灵敏度和51％的特异性时，在脑缺血的诊断中使用的参考值是424μg/mL的Apo J-GlcNAc+Neu5Ac+Apo J-GlcNAc(即，当患者显示小于424μg/mL Apo J-GlcNAc+Neu5Ac+Apo J-GlcNAc时，根据本发明的诊断方法允许脑缺血的诊断具有66％的灵敏度和51％的特异性)。
在一个实施方案中，当期望97％的灵敏度和71％的特异性时，在心肌缺血的诊断中使用的参考值是332μg/mL的能够与栽培小麦凝集素结合的Apo J，或当期望81％的灵敏度和72％的特异性时，参考值是393μg/mL的能够与曼陀罗凝集素结合的Apo J(即，当患者显示低于332μg/mL的能够与栽培小麦凝集素结合的Apo J时，根据本发明的诊断方法允许心肌缺血的诊断具有97％的灵敏度和71％的特异性，当患者显示低于393μg/mL的能够与曼陀罗凝集素结合的Apo J时，具有81％的灵敏度和72％的特异性)。
在另一个实施方案中，当期望66％的灵敏度和51％的特异性时，在脑缺血的诊断中使用的参考值是424μg/mL的能够与栽培小麦凝集素结合的Apo J(即，当患者显示低于424μg/mL的能够与栽培小麦凝集素结合的Apo J时，根据本发明的诊断方法允许脑缺血的诊断具有66％的灵敏度和51％的特异性)。
在一个优选的实施方案中，在样品中可检测到坏死标志物的可检出的升高之前进行含有N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)的糖基化Apo J的水平、含有N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和唾液酸残基的糖基化Apo J的水平、能够与曼陀罗凝集素特异性结合的Apo J的水平或能够与栽培小麦凝集素特异性结合的糖基化Apo J的水平的确定。在一个优选的实施方案中，坏死标志物是T-肌钙蛋白或CK。在另一个实施方案中，缺血损伤的症状开始的1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、30小时、40小时、50小时内在获得的样品中进行含有N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)的糖基化Apo J的水平、含有N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和唾液酸残基的糖基化Apo J的水平、能够与曼陀罗凝集素特异性结合的Apo J的水平或能够与栽培小麦凝集素特异性结合的糖基化ApoJ的水平的确定。在一个优选的实施方案中，在心肌缺血性损伤的情况下，症状通常是胸痛、呼吸短促、发汗、虚弱、头晕目眩(light-headedness)、恶心、呕吐和心悸。在一个实施方案中，患者是AMI前患者。
在另一个优选的实施方案中，在脑缺血性损伤的情况下，缺血损伤的症状是但不限于：改变的嗅觉、味觉、听觉或视觉，上睑下垂或眼肌的无力，反射降低：咽(gag)、吞咽、瞳孔对光反应性，面部感觉减弱和肌肉无力，平衡问题和眼球震颤，失语症，失用症(改变的自主运动)，视野缺陷，构音障碍，记忆力缺陷，半边忽略(hemineglect)，思维紊乱，意识错乱，性欲亢进姿势(hypersexual gesture)(涉及额叶)，缺乏对他或她的洞察力，通常与卒中相关，残疾，行走步态改变，运动协调改变，眩晕或不平衡。
在另一个实施方案中，在来自患者的样品中进行根据本发明的诊断方法的糖基化形式的Apo J的水平的确定，所述样品在患者施用旨在降低缺血或降低缺血性组织损伤的任何药物之前获得。在一个实施方案中，在心肌组织损伤的情况下，在来自患者的样品中进行糖基化形式的Apo J的水平的确定，所述样品在患者用他汀类、抗血小板剂和/或抗凝血剂治疗之前获得。
在一个实施方案中，在脑组织损伤的情况下，在来自患者的样品中进行糖基化形式的Apo J的水平的测定，所述样品在患者用组织纤溶酶原激活剂、抗血小板剂和/或抗凝血剂治疗之前获得。
用于对患有缺血性损伤的患者进行预后的方法
出乎意料地，本发明的作者还发现糖基化Apo J的水平不仅可用于检测正进行的缺血事件，而且可用于已患有缺血事件的患者的预后。
因此，在另一方面，本发明涉及用于在患有缺血事件的患者中预测缺血的进展(下文中称为本发明的预后方法)或用于在患有缺血事件的患者中确定预后的方法，其包括在所述患者的样品中确定糖基化Apo J的水平，其中糖基化Apo J相对于参考值的降低水平指示缺血正在进展或患者的不良预后。
在本发明的上下文中，术语“预测进展”涉及当应用本文中公开的方法时在患有缺血或与其相关的缺血性组织损伤之后预测疾病进程的能力。如本领域技术人员所理解的，该检测不意在对所有样品100％正确。然而，它要求所分析样品的统计上显著数量必须被正确分类。统计上显著的量可由本领域的专家通过使用不同的统计学工具来设置，例如但不限于置信区间的确定、p值确定、t检验和费希尔判别函数。优选地，置信区间为至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或小于99％。优选地，p值小于0.05、0.01、0.005或0.0001。优选地，本发明可在至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的所测试的特定组或群体的对象中正确地检测缺血或缺血性损伤。
在本发明的上下文中，术语“确定预后”与“预后”可互换使用，涉及当应用本文中所公开的方法时预测患有心肌缺血或脑缺血或与其相关的缺血性组织损伤后患者的结局的能力。如本领域技术人员所理解的，该检测并非意在对所有样品100％正确。然而，它要求所分析的样品的统计上显著数量被正确分类。统计上显著的量可由本领域的专家通过使用不同的统计学工具来设置，例如但不限于置信区间的确定、p值确定、t检验和费希尔判别函数。优选地，置信区间为至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或小于99％。优选地，p值小于0.05、0.01、0.005或0.0001。优选地，本发明可在至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的所测试的特定组或群体的对象中正确地检测缺血或缺血性损伤。
在一个优选的实施方案中，患者的预后作为6个月复发的风险来确定。在确定6个月复发风险的情况下，应理解复发是指在第一次缺血事件之后的前6个月内发生第二次缺血事件。在一个实施方案中，第二次缺血事件是与第一次缺血事件相同的类型，即第一次缺血事件是心肌缺血，并且预后作为患者患第二次心肌缺血事件的风险来确定。在另一个实施方案中，第二次缺血事件是与第一次缺血事件不同的类型，即如果第一次缺血事件是心肌缺血，则预后作为患者患脑缺血事件的风险来确定，或者反之亦然，如果第一次缺血事件是脑缺血事件，则预后作为患者患心肌缺血事件的风险来确定。
在另一个实施方案中，患者的预后作为院内死亡的风险来确定。
在一个优选的实施方案中，患者的预后作为6个月死亡的风险来确定。
术语“Apo J”、“患者”、“缺血事件”和“样品”已在本发明的诊断方法的上下文中详细描述，并且同样适用于本方法。
在一个实施方案中，样品是生物流体。在另一个实施方案中，生物流体是血浆或血清。
在一个实施方案中，缺血事件是心肌缺血事件。在另一个实施方案中，心肌缺血事件是ST段抬高型心肌梗死(ST-elevation myocardial infarction，STEMI)。在另一个实施方案中，缺血事件是脑缺血事件。
本文中使用的术语“糖基化Apo J”是指含有与多肽链连接的至少一个N-连接或O-连接的寡糖链的任何形式的Apo J。术语“糖基化Apo J”包括含有N-连接和O-连接的寡糖的这两种变体。该术语还包括含有N-连接的复合型寡糖、高甘露糖寡糖或杂合型寡糖的ApoJ。
在一个实施方案中，在本发明的预后方法中测定的糖基化Apo J是含有N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)残基的糖基化Apo J。在一个更优选的实施方案中，含有N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)残基的糖基化Apo J的水平对应于能够与曼陀罗凝集素特异性结合的Apo J的水平。在一个实施方案中，在本发明的预后方法中测定的糖基化Apo J是能够与曼陀罗凝集素特异性结合的糖基化的Apo J。
在另一个实施方案中，在本发明的预后方法中测定的糖基化Apo J是含有N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和唾液酸残基的糖基化Apo J。在一个更优选的实施方案中，含有N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和唾液酸残基的糖基化Apo J的水平对应于能够与栽培小麦凝集素特异性结合的Apo J的水平。在一个实施方案中，在本发明的预后方法中测定的糖基化Apo J是能够与栽培小麦凝集素特异性结合的糖基化的Apo J。
关于糖基化Apo J的水平，术语“降低水平”或“低水平”涉及样品中糖基化Apo J的任何表达水平低于参考值。因此，当糖基化Apo J的水平低于其参考值至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％、至少110％、至少120％、至少130％、至少140％、至少150％或更多时，认为糖基化Apo J的水平降低或低于其参考值。在一个优选的实施方案中，含有N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)残基的糖基化Apo J的水平低于参考样品中存在的水平。在另一个实施方案中，含有N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)2残基的糖基化Apo J的水平低于参考样品中存在的水平。在另一个实施方案中，能够与栽培小麦凝集素特异性结合的糖基化Apo J的水平低于参考样品中的水平。在另一个实施方案中，能够与曼陀罗凝集素特异性结合的糖基化Apo J的水平低于参考样品中的水平。
当涉及本发明的预后方法时，术语“参考值”涉及用作用于评价从对象收集的样品获得的值或数据的参考的预定标准。参考值或参考水平可以是绝对值；相对值；具有上限或下限的值；一系列的值；平均值；中值；平均值；或与特定对照或基线值相比的值。参考值可基于单个样品值，例如，从来自被测试对象的样品获得的但在较早的时间点的值。参考值可基于大量样品，例如来自按实际年龄匹配组的对象群体，或基于包括或不包括待测试样品的样品池。在一个实施方案中，参考值对应于在患有缺血事件且其中缺血未进展或者具有良好进展的对象中确定的糖基化Apo J的水平。在进展确定为6个月复发风险的情况下，参考值可被视为在缺血事件时刻取得的来自患者的样品中的糖基化Apo J水平，但其中患者在首次缺血事件发生之后至少6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、18个月、24个月、36个月、48个月或更长时间内未患有任何另外的缺血事件。在另一个实施方案中，当进展作为住院死亡的风险来确定时，参考值可被视为在缺血事件发生时患者中糖基化Apo J的水平，但其中患者已经从医院出院。在进展确定为6个月死亡风险的情况下，参考值可被视为在缺血事件时取得的来自患者样品中糖基化Apo J的水平，但其中患者在缺血事件之后仍然存活至少6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、18个月、24个月、36个月、48个月或更长时间。
在另一个实施方案中，参考值对应于从以下患者组获得的样品池确定的相应生物标志物的平均值或平均水平，所述患者从临床观点上看良好记录的并且其在患有缺血时间之后显示出如上文段落中限定的良好预后。在所述样品中，可例如通过确定参考群体中的平均表达水平来确定表达水平。在确定参考值时，有必要考虑样本类型的一些特征，例如患者的年龄、性别、身体状态以及其他特征。例如，参考样品可从相同量的至少2个、至少10个、至少100个至超过1000个个体的组中获得，使得群体在统计学上是显著的。
应理解，根据本发明的预后方法用于患者的预后的参考值是从相同类型的样品和与诊断中考虑的标志物相同的生物标志物获得的值。因此，如果通过确定含有GlcNAc或(GlcNAc)2的糖基化Apo J的水平来进行预后方法，则预后中使用的参考值也是可从如上文限定的健康对象或样品池获得的含有GlcNAc残基或(GlcNAc)2(视情况而定)的糖基化ApoJ的表达水平。在另一个实施方案中，如果通过确定含有GlcNAc和唾液酸残基的糖基化ApoJ的水平来实施预后方法，则预后中使用的参考值也是如上所述得到的含有N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和唾液酸残基的糖基化Apo J的表达水平。
如果通过测定能够与曼陀罗凝集素结合的糖基化Apo J的水平来实施预后方法，则预后中使用的参考值也是从如上文限定的健康对象或样品池获得的能够与曼陀罗凝集素结合的糖基化Apo J的表达水平。在另一个实施方案中，如果通过确定能够与栽培小麦凝集素结合的糖基化Apo J的水平来实施预后方法，则预后中使用的参考值也是能够与如上所述获得的载培小麦凝集素结合的糖基化Apo J的表达水平。
在另一个实施方案中，如果测定生物标志物以确定患有心肌组织损伤的患者的预后，则参考值将是来自对象的相同生物标志物的水平，所述对象在患有心肌缺血事件之后显示符合上文限定的任何标准(6个月之后没有缺血事件的复发、6个月之后没有院内死亡或死亡)的良好预后。如果参考值是从来自对象的样品池获得的相同生物标志物的平均水平，则制备样品池的对象是在患有心肌缺血事件之后已经显示出符合上述限定的任何标准(6个月之后没有缺血事件的复发、6个月之后没有院内死亡或死亡)的良好预后的对象。
在另一个实施方案中，如果测定生物标志物以确定脑组织损伤的预后，则参考值将是来自对象的相同生物标志物的水平，所述对象在患有脑缺血事件之后已经显示出符合上述限定的任何标准(6个月之后没有缺血事件的复发、6个月之后没有院内死亡或死亡)的良好预后。如果参考值是从来自对象的样品池获得的相同生物标志物的平均水平，则制备样品池的对象是在患有脑缺血事件之后已经显示出符合上述限定的任何标准(6个月之后没有缺血事件的复发、6个月之后没有院内死亡或死亡)的良好预后的对象。
可优化本发明的预后方法中使用的参考值以获得期望的特异性和灵敏度。
在一个具体实施方案中，当期望58％的灵敏度和51％的特异性时，在死亡和复发事件的预后中使用的参考值是287μg/mL的Apo J-GlcNAc(即当患者显示低于287μg/mL的Apo J-GlcNAc时，根据本发明的预后方法允许死亡或复发事件的预后具有58％的灵敏度和61％的特异性)。
在一个具体实施方案中，当期望55％的灵敏度和65％的特异性时，死亡和复发事件的预后中使用的参考值是398μg/mL的Apo J-GlcNAc+Neu5Ac+Apo J-GlcNAc(即，当患者显示低于398μg/mL的Apo J-GlcNAc+Neu5Ac+Apo J-GlcNAc时，根据本发明的预后方法允许死亡或复发事件的预后具有55％的灵敏度和65％的特异性)。
在一个具体实施方案中，当期望55％的灵敏度和65％的特异性时，死亡和复发事件的预后中使用的参考值是398μg/mL的能够与栽培小麦凝集素特异性结合的Apo J(即，当患者显示出低于398μg/mL的能够与栽培小麦凝集素特异性结合的Apo J时，根据本发明的预后方法允许死亡或复发事件的预后具有55％的灵敏度和65％的特异性)。
在一个具体实施方案中，当对死亡和复发事件的预后期望58％的灵敏度和51％的特异性时，死亡和复发事件的预后中使用的参考值是287μg/mL的能够与曼陀罗凝集素特异性结合的Apo J并且当对死亡的预后期望64％的灵敏度和50％的特异性时，参考值是273μg/mL的能够与曼陀罗凝集素特异性结合的Apo J(即，当患者显示低于287μg/mL的能够与曼陀罗凝集素特异性结合的Apo J时，根据本发明的预后方法允许死亡或复发事件的预后具有58％的灵敏度和51％的特异性，或当患者显示低于273μg/mL的能够与曼陀罗凝集素特异性结合的Apo J时，死亡的预后具有64％的灵敏度和50％的特异性)。
本发明的风险分层方法
本发明的作者还已示出糖基化Apo J的水平，且特别是含有GlcNAc和Neu5Ac的糖基化Apo J的水平还是用于确定患有稳定型冠状动脉疾病(CAD)的患者患复发性缺血事件之风险的可用生物标志物。该方法允许根据患者患有缺血事件的风险对患者进行分层，因此可用于根据风险为患者指定特定的预防性治疗。
因此，在另一方面，本发明涉及用于确定患有稳定型冠状动脉疾病的患者患复发性缺血事件的风险的方法(下文中，本发明的风险分层方法)，所述方法包括在所述患者的样品中确定糖基化Apo J的水平，其中糖基化Apo J相对于参考值的降低水平指示患者显示患复发性缺血事件的风险提高。
在本发明的上下文中，术语“确定风险”或“风险分层”涉及当应用本文中公开的方法时确定以下风险或概率的能力：a)患者在患有心肌缺血或脑缺血或与其相关的缺血性组织损伤之后患额外的临床并发症，和/或b)受益于心肌缺血或脑缺血或与其相关的缺血性组织损伤的特定治疗。如本领域技术人员所理解的，该检测并非意在对所有样品100％正确。然而，它要求对所分析的样品的统计学上显著数量进行正确分类。统计上显著的量可由本领域的专家通过使用不同的统计学工具来设置，例如但不限于置信区间的确定、p值确定、t检验和费希尔判别函数。优选地，置信区间为至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或小于99％。优选地，p值小于0.1、0.05、0.01、0.005或0.0001。优选地，本发明可在至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的所测试的特定组或群体的对象中正确地检测缺血或缺血性损伤。
术语患者、缺血事件、样品、Apo J和糖基化Apo J已经在本发明的诊断和预后方法的上下文中详细描述，并且同样适用于本发明的风险分层方法。
在一个实施方案中，复发性缺血事件是急性冠脉综合征、卒中或短暂性缺血事件。
在一个实施方案中，样品是生物流体。在另一个实施方案中，生物流体是血浆或血清。
在一个实施方案中，缺血事件是心肌缺血事件。在另一个实施方案中，心肌缺血事件是ST段抬高型心肌梗死(STEMI)。在另一个实施方案中，缺血事件是脑缺血事件。
在一个实施方案中，在本发明的预后方法中测定的糖基化Apo J是含有N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)残基的糖基化Apo J。在另一个实施方案中，含有N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)残基的糖基化Apo J的水平对应于能够与曼陀罗凝集素特异性结合的Apo J的水平。
在另一个实施方案中，在本发明的预后方法中测定的糖基化Apo J是含有N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和唾液酸残基的糖基化Apo J。在另一个实施方案中，含有N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和唾液酸残基的糖基化Apo J的水平对应于能够与栽培小麦凝集素特异性结合的Apo J的水平。
术语“稳定型冠脉疾病(stable coronary disease)”和“稳定型冠心病(stablecoronary heart disease)”具有相同的含义并且可互换使用。这两个术语都包括医学病症稳定型冠状动脉疾病(stable coronary artery disease，SCAD)。在术语“稳定型心血管疾病”、“稳定型冠脉疾病”或“稳定型冠心病”的上下文中，“稳定型”被定义为在没有急性心血管事件的情况下诊断的心血管疾病的任何病症。因此，例如，稳定型冠脉疾病限定了冠脉疾病的不同演变阶段，不包括冠状动脉血栓形成在临床表现中占主导地位(急性冠脉综合征)的情况。患有SCAD的患者由以下一种或更多种病症限定：阳性EGG应激测试或阳性心肌闪烁显像(myocardial scintigraphy)或冠状动脉狭窄＞50％的稳定型心绞痛、急性冠脉综合征病史、冠状动脉血运重建史、以稳定剂量通过抗血小板剂、抗凝血剂和/或他汀类治疗至少3个月。
在一个优选的实施方案中，患有稳定型冠脉疾病的患者在稳定型冠脉疾病之前患有急性冠脉综合征。在一些优选的实施方案中，患有稳定型冠脉疾病的患者在稳定型冠脉疾病之前至少1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、18个月、24个月、36个月、48个月、60个月或更长时间已患有急性冠脉综合征。
关于本发明的预后方法中的糖基化Apo J的水平，术语“降低水平”或“低水平”涉及样品中糖基化Apo J的低于参考值的任何表达水平。因此，当糖基化Apo J的水平低于其参考值至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％、至少110％、至少120％、至少130％、至少140％、至少150％或更多时，认为糖基化Apo J水平降低或低于其参考值。在一个优选的实施方案中，含有N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)残基的糖基化Apo J的水平低于参考样品中存在的水平。在另一个实施方案中，含有N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)2残基的糖基化Apo J的水平低于参考样品中存在的水平。在另一个实施方案中，含有N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和唾液酸残基的糖基化Apo J的水平低于参考样品中的水平。在另一个实施方案中，能够与栽培小麦凝集素结合的糖基化Apo J的水平低于参考样品中存在的水平。在另一个实施方案中，能够与曼陀罗凝集素结合的糖基化Apo J的水平低于参考样品中的水平。
当涉及本发明的风险分层方法时，术语“参考值”涉及用作用于评价由从对象收集的样品获得的值或数据的参考的预定标准。参考值或参考水平可以是绝对值；相对值；具有上限或下限的值；一系列的值；平均值；中值；平均值；或与特定对照或基线值相比的值。参考值可基于单个样品值，例如，从来自被测试对象的样品获得的但在较早时间点的值。参考值可基于大量样品，例如来自实际年龄匹配组的对象群体，或基于包括或不包括待测试样品的样品池。在一个实施方案中，参考值对应于在患有稳定型冠脉疾病但未患有任何复发性缺血事件的对象中确定的糖基化Apo J的水平。在这种情况下，可从中确定参考值的合适患者是患有稳定型冠脉疾病且在稳定型冠脉疾病发作之后至少6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、18个月、24个月、36个月、48个月或更长时间未患缺血性复发事件的患者。
在另一个实施方案中，参考值对应于由从以下患者组获得的样品池确定的相应生物标志物的平均值或平均水平，所述患者从临床观点上看良好记录且患有稳定型冠脉疾病，但在稳定型冠脉疾病发作之后至少6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、18个月、24个月、36个月、48个月或更长时间内未患复发性缺血事件。在所述样品中，可例如通过确定参考群体中的平均表达水平来确定表达水平。在确定参考值时，有必要考虑样本类型的一些特征，例如患者的年龄、性别、身体状况等。例如，参考样品可从相同量的至少2个、至少10个、至少100个至超过1000个个体的组中获得，使得群体在统计学上是显著的。
应理解，根据本发明的风险分层方法用于患者的风险分层的参考值是从相同类型的样品和与诊断中考虑的标志物相同的生物标志物获得的值。因此，如果通过确定含有GlcNAc或(GlcNAc)2的糖基化Apo J的水平来实施风险分层方法，则风险分层中使用的参考值也是从如上定义的对象或样品池中获得的含有GlcNAc残基或(GlcNAc)2(视情况而定)的糖基化Apo J的表达水平。在另一个实施方案中，如果通过确定含有GlcNAc和唾液酸残基的糖基化Apo J的水平来实施风险分层方法，则风险分层中使用的参考值也是含如上所述获得的含有N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和唾液酸残基的糖基化Apo J的表达水平。
在另一个实施方案中，如果通过测定能够与栽培小麦凝集素特异性结合的糖基化Apo J的水平来实施风险分层方法，则风险分层中使用的参考值也是如上所述获得的能够与栽培小麦凝集素特异性结合的糖基化Apo J的表达水平。在另一个实施方案中，如果通过确定能够与曼陀罗凝集素特异性结合的糖基化Apo J的水平来实施风险分层方法，则风险分层中使用的参考值也是如上所述获得的能够与曼陀罗凝集素特异性结合的糖基化Apo J的表达水平。
可优化在本发明的风险分层方法中使用的参考值，以便获得期望的特异性和灵敏度。在一个具体实施方案中，当期望94％的灵敏度和64％的特异性时，风险分层方法中使用的参考值是485μg/mL的Apo J-GlcNAc+Neu5Ac+Apo J-GlcNAc(即，当患者显示低于485μg/mL的Apo J-GlcNAc+Neu5Ac+Apo J-GlcNAc时，根据本发明的风险分层方法允许患有CAD的患者的复发事件的预测具有94％的灵敏度和64％的特异性)。
在另一个实施方案中，当期望94％的灵敏度和64％的特异性时，风险分层方法中使用的参考值是485μg/mL的能够与栽培小麦凝集素特异性结合的Apo J(即，当患者显示小于485μg/mL的能够与栽培小麦凝集素特异性结合的Apo J时，根据本发明的风险分层方法允许患有CAD的患者的复发事件的预测具有94％的灵敏度和64％的特异性)。
用于测定根据本发明的生物标志物的试剂盒
本发明的作者还获得了允许检测糖基化Apo J的试剂盒，其适用于诊断本文中提及的疾病以及其中涉及糖基化Apo J的其他疾病。
因此，在另一方面，本发明涉及包含以下的试剂盒：
a.第一试剂，其为与选自N-乙酰葡糖胺和唾液酸的聚糖残基特异性结合的凝集素，以及
b.第二试剂，其能够与Apo J多肽特异性结合。
本发明中使用的术语“与选自N-乙酰葡糖胺和唾液酸的聚糖残基特异性结合的凝集素”是指与具有与来自任何生物体的糖结合之能力的抗体以及其以重组方式获得的变体不同的并且保持与糖蛋白中糖残基结合之能力的任何蛋白质。适用于本发明的凝集素的实例包括但不限于从以下分离的凝集素：直生刀豆(Conavalia ensiformis)、欧洲鳗鲡(Anguilla anguilla)、栽培小麦(Tritium vulgaris)、曼陀罗(Datura stramonium)、雪钟花(Galanthus nivalis)、朝鲜槐(Maackia amurensis)、落花生(Arachis hypogaea)、西洋接骨木(Sambucus nigra)、鸡冠刺桐(西ythtina cristagalli)、小扁豆(Lensculinaris)、大豆(Glycine max)、菜豆(Phaseolus vulgaris)、独角仙(Allomyrinadichotoma)、双花扁豆(Dolichos biflorus)、翅荚百脉根(Lotus tetragonolobus)、荆豆(Ulex europaeus)和蓖麻(Ricinus communis)。
适用于本发明的凝集素的实例包括但不限于表1中所示的凝集素，该表1显示了凝集素的常用名称、其来源生物和与所述凝集素特异性结合的糖。
在一个优选的实施方案中，凝集素是来自栽培小麦的凝集素、来自曼陀罗的凝集素或其组合。
在一个优选的实施方案中，第二试剂是抗Apo J抗体或其含有其抗原结合区的片段。
在本发明的上下文中，术语“Apo J抗体”是指免疫球蛋白分子及其免疫活性部分，即含有特异性结合如本文中所定义的糖基化Apo J的抗原结合位点的分子。适合用于根据本发明的抗体包括识别位于糖基化Apo J的多肽部分中的一个或更多个表位的抗体，前提是该结合不受N-连接或O-连接的糖类之存在的影响。这些抗体能够结合Apo J的糖基化形式及其非糖基化形式二者。
免疫活性免疫球蛋白分子的部分的实例包括可通过用酶(例如胃蛋白酶)处理抗体而产生的F(ab)和F(ab′)2。抗体可以是多克隆的(通常包括针对不同决定簇或表位的不同抗体)或单克隆抗体(针对抗原上的单一决定簇)。抗体也可以是重组的、嵌合的、人源化的、合成的或任何上述的组合。
在一个实施方案中，凝集素是固定化的。固定化通常通过连接至支持物来实现。本发明中使用的术语“支持物”是指与本发明的组分物理结合的任何固体材料，因此是固定化的。适合用于本发明的固体支持物包括但不限于硅酮、玻璃、石英、聚酰亚胺、丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯、陶瓷、硝酸纤维素、金属、无定形碳化硅、聚苯乙烯以及适用于微制造或微刻(microlithography)的任何其他材料。
凝集素可通过共价键或通过非共价键(例如氢桥、疏水相互作用或离子键)固定至支持物。Shalon等(Genome Research 6：639-645(1996))，LeGendre(BioTechniques 9：788-805(1990))、US6197599和US6140045中已经描述了合适的微阵列和支持物的一般性综述。或者，可使用通过环氧基团、乙烯基磺酸基团、活性酯基团、醛基团、羧基基团、氨基基团、硫醇基团、异硫氰酸酯基团等活化的支持物。在通过环氧基团活化支持物的情况下，这些基团包括3-环氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷(3-glycidoxypropyltrimethoxysilane，GTMS)、2-(3，4-环氧环己基)乙基三甲氧基硅烷、3-环氧丙氧基丙基甲基二乙氧基硅烷、3-环氧丙氧基丙基三乙氧基硅烷等。
在一个实施方案中，根据本发明的试剂盒的组分含有标记物(label)。原则上，本发明考虑使用任何标记物，前提是可与试剂盒的组分b共价缀合并且其允许随后检测所述组分。在一个优选的实施方案中，可通过改变其化学特性、电特性或磁特性中的至少一种来检测标记物。
因此，本发明考虑用3H、11C、14C、18F、32P、35S、64Cu、68Ga、86y、99Tc、111In、123I、124I、125I、131I、133Xe、177Lu、211At或213B类型的放射性同位素修饰蛋白质的可能性。用放射性同位素进行标记通常通过使用能够络合金属离子的螯合配体进行，例如DOTA、DOTP、DOTMA、DTPA和TETA(Macrocyclics，Dallas，Tex.)。
然而，在一个优选的实施方案中，用荧光基团标记组分a。用于本发明的合适的荧光化合物包括但不限于溴化乙锭、SYBR Green、异硫氰酸荧光素(FITC)、四甲基罗丹明异硫醇(TRIT)、5-羧基荧光素、6-羧基荧光素、荧光素、HEX(6-羧基-2’，4，4’，5’，7，7’-六氯荧光素)、Oregon Green 488、Oregon Green 500、Oregon Green 514、Joe(6-羧基-4’，5’-二氯-2’，7’-二甲氧基荧光素)、5-羧基-2’，4’，5’，7’-四氯荧光素、5-羧基罗丹明、罗丹明、四甲基罗丹明(Tamra)、Rox(羧基-X-罗丹明)、R6G(罗丹明6G)、酞菁、偶氮甲碱类(azomethines)、花青类(cyanines)(Cy2、Cy3和Cy5)、Texas Red、Princeston Red、BODIPYFL-Br2、BODIPY 530/550、BODIPY TMR、BODIPY 558/568、BODIPY 564/570、BODIPY 576/589、BODIPY 581/591、BODIPY TR、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、DABCYL、曙红(Eosin)、赤藓红(Erythrosine)、溴化乙锭、绿色荧光蛋白(GFP)及其类似物、基于半导体纳米晶体的无机荧光标记(量子点)、基于镧系元素(例如Eu3+和Sm3+)的荧光标记物等。
在另一个实施方案中，试剂盒含有能够与组分b特异性结合的第三组分(组分c)。在这种情况下，一旦其与组分a结合，不是通过直接检测组分b而是通过检测组分c来检测在支持物中由凝集素捕获的Apo J。
任何分子都可用作试剂盒的第三组分，前提是它能够与组分b特异性结合。在一个实施方案中，用结合对(binding pair)的第一成员修饰组分b，且用结合对的第二成员修饰组分c。
术语“结合对”是指具有通过任何类型的分子间相互作用(包括但不限于生物化学、生理学和/或化学相互作用)具有特异性结合之能力的一对分子(称为结合对的第一和第二成员)。结合对包括免疫类型(例如抗原/抗体、抗原/抗体片段、半抗原/抗半抗原)的任何类型的相互作用以及非免疫类型(例如亲和素/生物素、亲和素/生物素化分子、叶酸/叶酸结合蛋白、激素/激素受体、凝集素/糖类、凝集素/用糖类修饰的分子、酶/酶底物、酶/酶抑制剂、蛋白A/抗体、蛋白G/抗体、互补核酸(包括DNA、RNA和肽核酸(PNA)的序列，多核苷酸/多核苷酸结合蛋白等)的相互作用。
应理解，术语结合对的“第一”和“第二”成员是相对的，并且每个上述成员可被视为结合对的第一或第二成员。
在一个甚至更优选的实施方案中，其中根据本发明的试剂盒的组分b是抗体，在这种情况下，第三组分是能够与所述组分b特异性结合的抗体。在这种情况下，第二抗体含有标记物。试剂盒的第三组分的合适标记物与上述试剂盒的组分b的标记物相同。试剂盒的第三组分的标记物可以是荧光基团、发光基团或酶。如果可检测的化合物是酶，则该酶必须例如在添加活化剂、底物、扩增剂等之后能够产生可检测的信号。适合作为本发明可检测标签的酶和相应的底物包括：
·碱性磷酸酶：
○显色底物：基于磷酸对硝基苯酯(p-NPP)、5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯/氮蓝四唑(BCIP/NBT)、Fast-Red/萘酚磷酸酯-AS-TS的底物
○荧光底物：磷酸4-甲基伞形酯(4-MUP)、2-(5’-氯-2’-磷酰氧基苯基)-6-氯-4-(3H)-喹唑啉酮(CPPCQ)、3，6-荧光素二磷酸酯(3，6-FDP)、Fast Blue BB、Fast Red TR或Fast Red Violet LB的重氮盐。
·过氧化物酶：
○基于以下的显色底物：2，2-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺)酸(ABTS)、邻苯二胺(OPT)、3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)、邻联茴香胺、5-氨基水杨酸、3-二甲基氨基苯甲酸(DMAB)和3-甲基-2-苯并噻唑啉腙(MBTH)、3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)和3，3’-二氨基联苯胺(DAB)四盐酸盐。
○荧光底物：4-羟基-3-甲氧基苯乙酸、还原的吩嗪、还原的苯并噻嗪，包括Red试剂、Amplex UltraRed试剂和还原的二羟基蒽。
·糖苷酶：
○显色底物：邻硝基苯-β-D-半乳糖苷(O-NPG)、对硝基苯-β-D-半乳糖苷和用于β-D-半乳糖苷酶的4-甲基伞形基苯基-β-D-半乳糖苷(MUG)。
○荧光底物：试卤灵β-D-吡喃半乳糖苷、荧光素二半乳糖苷(FDG)、荧光素二葡糖醛酸、4-甲基伞形基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷、羧基伞形基-β-D-吡喃半乳糖苷和氟化香豆素β-D-吡喃半乳糖苷。
·氧化还原酶(萤光素酶)：
○发光底物：萤光素。
在酶标记物的情况下，试剂盒可含有一种或更多种酶底物作为另外的组分。
在一个甚至更优选的实施方案中，与结合对的第二成员结合的可检测化合物是荧光化合物。本发明中使用的术语“荧光化合物”是指所有那些吸收确定波长或波长范围的光并发射不同波长或波长范围的光的化合物。适用于本发明的荧光化合物包括但不限于溴化乙锭、SYBR Green、异硫氰酸荧光素(FITC)、四甲基罗丹明异硫醇(TRIT)、5-羧基荧光素、6-羧基荧光素、荧光素、HEX(6-羧基-2’，4，4’，5’，7，7’-六氯荧光素)、Oregon Green 488、Oregon Green 500、Oregon Green 514、Joe(6-羧基-4’，5’-二氯-2’，7’-二甲氧基荧光素)、5-羧基-2’，4’，5’，7’-四氯荧光素、5-羧基罗丹明、罗丹明、四甲基罗丹明(Tamra)、Rox(羧基-X-罗丹明)、R6G(罗丹明6G)、酞菁、偶氮甲碱、花青类(Cy2、Cy3和Cy5)、Texas Red、Princeston Red、BODIPY FL-Br2、BODIPY 530/550、BODIPY TMR、BODIPY 558/568、BODIPY564/570、BODIPY 576/589、BODIPY 581/591、BODIPY TR、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、DABCYL、曙红、赤藓红、溴化乙锭、绿色荧光蛋白(GFP)及其类似物，基于半导体纳米晶体的无机荧光标记物(量子点)。基于镧系元素(例如Eu3+和Sm3+)的荧光标记物等。
任选地，在另一个实施方案中，试剂盒还包含作为背景对照的空白和/或含有不同浓度的糖基化Apo J的标准曲线。
在另外的方面，本发明涉及根据本发明和如上定义的试剂盒在用于以下方法中的用途：用于在对象中诊断缺血或缺血性组织损伤、用于在患有缺血事件的患者中预测缺血的进展、用于对患有缺血事件的患者进行预后或用于确定患有稳定型冠脉疾病的患者患复发性缺血事件的风险。
用于测定样品中糖基化Apo j的方法
在另一方面，本发明涉及用于测定样品中糖基化Apo J的方法，其包括以下步骤：
(i)在足以使样品中的糖基化Apo J与凝集素之间形成复合物的条件下，使样品与特异性结合糖基化Apo J中存在的聚糖残基的凝集素接触，以及
(ii)检测含有凝集素和N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)的糖基化Apo J的复合物的量。
术语“糖基化Apo J”、“样品”和“特异性结合糖基化Apo J中存在的聚糖残基的凝集素”已在本发明的诊断和预后方法的上下文中以及在根据本发明的试剂盒上下文中详细描述，并且同样可适用于根据本发明的测定糖基化Apo J的方法。
在步骤(i)中，用于测定糖基化Apo J的方法包括在足以使样品中的糖基化Apo J与凝集素之间形成复合物的条件下，使样品与特异性结合糖基化Apo J中存在的聚糖残基的凝集素接触。
用于形成所述复合物的合适条件可由技术人员确定，并包括适当的温度、孵育时间和pH。在一个特定的实施方案中，温度为4至40℃，特别是10至35℃，更特别是15至30℃，优选20至25℃(室温)。在一个特定的实施方案中，pH为pH 2至pH 10，优选pH 4至pH 10。在一个特定的实施方案中，使步骤(i)进行至少1分钟，优选至少5分钟，更多优选至少30分钟，甚至更优选至少60分钟。
在一些实施方案中，在与凝集素接触之前稀释样品。样品的合适稀释度为1∶10至1∶100000，优选1∶100至1∶1000，更优选血浆样品的稀释度为1∶200或1∶1500。
在一个实施方案中，步骤(i)中使用的凝集素是与N-乙酰葡糖胺特异性结合的凝集素或与N-乙酰葡糖胺和唾液酸特异性结合的凝集素。在一个更优选的实施方案中，与N-乙酰葡糖胺特异性结合的凝集素是来自曼陀罗的凝集素，或其中与N-乙酰葡糖胺和唾液酸或与唾液酸特异性结合的凝集素是来自栽培小麦的凝集素。
在另一个实施方案中，与聚糖残基特异性结合的凝集素是固定化的。合适的支持物与本发明的试剂盒中描述的支持物相同。
一旦步骤(i)已进行足够时间以允许在凝集素与样品中存在的糖基化Apo J之间形成复合物，则进行步骤(ii)。在步骤(ii)中，用于测定糖基化Apo J的方法包括检测含有凝集素和糖基化Apo J的复合物的量。
在一个实施方案中，在开始步骤(ii)之前洗涤步骤(i)中获得的复合物以除去可能通过非特异性结合连接至支持物的任何Apo J。使用洗涤溶液进行步骤(i)之后的洗涤。在一个特定的实施方案中，洗涤溶液含有一种或更多种盐。优选地，洗涤溶液含有的盐是NaCl，由Tris缓冲液(TBS)或由磷酸盐缓冲液(PBS)构成。作为替代或补充，洗涤溶液含有至少一种洗涤剂。优选地，洗涤剂选自聚山梨酯20(Tween 20)和Triton X-100。
通常使用与Apo J多肽特异性结合的试剂进行含有凝集素和糖基化Apo J的复合物的量的检测。在一个优选的实施方案中，与Apo J多肽特异性结合的试剂是抗体或其含有其抗原结合区的片段。
用于检测糖基化Apo J的方法的步骤(ii)中使用的合适抗体已在根据本发明的试剂盒的上下文中限定，并且在本文中同样适用。在一个实施方案中，抗体与可检测标记物偶联。用于抗Apo J抗体的合适标记物在上文中根据本发明的试剂盒的上下文中限定。在一个优选的实施方案中，可通过改变其化学特性、电特性或磁特性中至少一种来检测标记物。
在另一个实施方案中，使用能够与特异性结合Apo J多肽之试剂特异性结合的试剂进行含有凝集素和糖基化ApoJ的复合物的量的检测。在另一个实施方案中，能够与特异性结合Apo J多肽之试剂特异性结合的第三试剂是抗体或其含有其抗原结合区的片段，在这种情况下，通过检测已与特异性结合Apo J之试剂结合的抗体来检测复合物。这通过使用含有可检测标记物的抗体来完成。用于在抗体中使用的合适标记物在上文根据本发明的试剂盒的上下文中限定。标记物可以是荧光标记物或酶标记物。
***
通过以下实施例举例说明本发明，所述实施例不意在限制本发明的范围。
实施例
实施例1
心肌缺血中Apo J-GlcNAc+Neu5Ac+Apo J-GlcNAc和Apo J-GlcNAc的诊断值
先前已经使用双向电泳(2-DE)、随后通过质谱法鉴定表征了心脏缺血患者中的Apo J蛋白质组谱(Cubedo，J.，等，2011，Journal of proteomeresearch 10：211-220)。在该研究中，显示特定的Apo J形式在事件发生之后的前六个小时内升高(Apo J-29)或降低(Apo J-15)(图1)。通过应用这些标准，提出特定的Apo J形式(Apo J-15和Apo J-29)是由急性心肌梗死(AMI)诱导的组织损伤的标志物。在同一研究中，还分析了Apo J-15和Apo J-29中检测到的变化是否可能是由于Apo J的糖基化谱的变化。具体而言，用伴刀豆凝集素A和栽培小麦凝集素(其结合具有α-甘露糖、α-葡萄糖、(GlcNAc)2和Neu5Ac残基的蛋白质)的混合物分离了血清糖蛋白。通过2-DE分析、随后通过质谱鉴定来分析分离的蛋白质。在该分析中(图2)，发现只有斑点1、2、4、5、8和11含有α-甘露糖、α-葡萄糖、(GlcNAc)2和Neu5Ac残基，而斑点3、6、7、9、10、12和13不含有那些残基。在AMI前缺血患者中，α-甘露糖、α-葡萄糖、(GlcNAc)2和Neu5Ac残基的糖基化Apo J斑点的强度低于对照组。这种降低在形式4和8中更明显。在缺血早期阶段，总α-甘露糖、α-葡萄糖、(GlcNAc)2和Neu5Ac糖基化的Apo J强度降低了25％。相反，在缺血的早期阶段，不具有那些残基的Apo J形式(3、6、7、10、12和13)升高。
然而，由于上述测定中使用的凝集素的多重特异性，这些测定不能辨别Apo J的不同糖基化形式(含有α-甘露糖的形式、含有α-葡萄糖的形式、含有(GlcNAc)2的形式和/或含有Neu5Ac残基的形式)中的哪一种实际上是与缺血性损伤相关的生物标志物。此外，通过使用木菠萝凝集素，其结合具有α-半乳糖和GalNAc残基(仅见于O-聚糖中)的蛋白质，发现(图3)只有斑点1、3、4、6、7、8、9、11和12含有α-半乳糖和GalNAc残基，而斑点2、5、10和13不含有那些残基。因此，先前报道的斑点1、2、4、5、8和11的降低不仅指示含有α-甘露糖、α-葡萄糖、(GlcNAc)2和Neu5Ac残基的形式降低，因为这些斑点中的一些还含有O-糖基化残基，且更具体地说是α-半乳糖和GalNAc残基。
为了辨别Apo J中不同类型残基的存在，已使用了不同的方法。该方法(下文中称为免疫亲和酶促糖基化测定或EGA)允许特异性检测和定量不同的糖基化Apo J形式。该EGA是基于：1)第一步，其中蛋白质通过其与特定糖基化残基的结合而被固定化(表1)；2)第二步，其中用针对Apo J蛋白质序列的单克隆或多克隆抗体检测Apo J；3)最后一步，其中通过报道系统或分子进一步检测和定量特定固定化糖基化Apo J形式的量。该报道系统可包括：a)比色系统(例如二抗)以及报道系统(例如生物素-链霉亲和素-HRP)；或b)系统中的物理化学变化(即化学变化、电变化或磁变化)。
表1.Apo J中存在的聚糖和糖类结构和用于其检测的基于特定凝集素的方法学方法。
将该方法用于不同的凝集素，已发现糖基化Apo J可具有以下聚糖残基：a)(GlcNAc)2+Neu5Ac；b)αNeu5Ac(2→6)gal+GalNAc；c)α-L-岩藻糖；d)单独的GalNAc；以及e)单独的(GlcNAc)2(图4)。
然后应用EGA以在38位AMI前缺血患者和144位健康对照的血浆样品中特异性测量具有(GlcNAc)2+Neu5Ac残基(Apo J-GlcNAc+Neu5Ac+Apo J-GlcNAc)的Apo J。结果发现，当与对照组相比，AMI前缺血患者在缺血早期显示Apo J-GlcNAc+Neu5Ac+Apo J-GlcNAc水平降低45％(AMI前缺血：264±18vs.C：473±6μg/mL；P＜0.0001；图5A)。在胸痛发作之后的前6小时内和在坏死标志物(T-肌钙蛋白和CK)升高之前，在入院时(t＝0)采集AMI前缺血患者的样品。此时，由于事件开始，患者未接受任何治疗。C-统计学分析显示Apo J-GlcNAc+Neu5Ac+Apo J-GlcNAc水平与EGA的测量显示存在心肌缺血的高辨别值，曲线下面积(AUC)为0.934(P＜0.0001)且截止值为332μg/mL，灵敏度为97％且特异性为71％(图5B和表2)。因此，Apo J-GlcNAc+Neu5Ac+Apo J-GlcNAc水平的测量可用作缺血诊断的生物标志物。
我们用EGA方法进一步分析了212位STEMI患者的Apo J-GlcNAc+Neu5Ac+Apo J-GlcNAc水平。在入院时在具有不同的缺血性疼痛进展时间(1h至60h)的STEMI患者(包括从头开始事件和继发事件)中采集样品，所述患者包括入院时具有阳性T-肌钙蛋白检测的患者(具有坏死的患者组)。当与对照组相比，STEMI患者在入院时Apo J-GlcNAc+Neu5Ac+ApoJ-GlcNAc血浆水平降低15％(STEMI：402±8vs C：473±6μg/mL；P＜0.0001；图6A)。C-统计学分析显示用EGA进行Apo J-GlcNAc+Neu5Ac+Apo J-GlcNAc水平的测量显示出对存在心肌缺血的辨别能力，曲线下面积(AUC)为0.713(P＜0.0001)且截止值为409μg/mL，灵敏度为80％且特异性为53％(图6B)。
当随后应用EGA在340位STEMI患者和139位健康对照中来特异性测量具有(GlcNAc)2残基的Apo J(Apo J-GlcNAc)与曼陀罗凝集素时，发现在入院时在STEMI患者中Apo J-GlcNAc血浆水平降低35％(STEMI：328±7vs C：506±12μg/mL；P＜0.0001；图6C)。C-统计学分析显示，Apo J-GlcNAc水平的测量显示出对存在心肌缺血的更高辨别能力，曲线下面积(AUC)为0.830(P＜0.0001)且截止值为393μg/mL，灵敏度为81％且特异性为72％(图6D)。
表2.适合于用于诊断心肌损伤的方法、用于诊断脑缺血的方法、用于对死亡和复发事件进行预后的方法的截止值及相关灵敏度和特异性，以及对于用于在患有稳定型CAD的患者中进行风险分层的方法及相应的灵敏度和特异性值。
实施例2
Apo J-GlcNAc+Neu5Ac+Apo J-GlcNAc和Apo J-GlcNAc的预后值
在第二阶段，我们评估了特异性量化糖基化Apo J形式是否具有预后值。Apo J-GlcNAc+Neu5Ac+Apo J-GlcNAc水平与缺血时间呈显著且反向相关(缺血时间定义为症状发作与入院之间的经过时间；R＝-0.259 P＝0.0003；图7A)。此外，入院之后3天，82位STEMI患者中Apo J-GlcNAc+Neu5Ac+Apo J-GlcNAc水平的测量显示当与入院时相比逐渐降低(t＝72h：331±10vs.t＝0：402±8μg/mL；P＜0.0001；图7B)。当仅分析Apo J-GlcNAc水平时，还存在与缺血时间的显著且反向的相关(R＝-0.113 P＝0.048；图7C)。这些结果突出了ApoJ-GlcNAc+Neu5Ac+Apo J-GlcNAc和Apo J-GlcNAc是缺血进展的新生物标志物。
此外，最终TIMI血流分级为0或1(其与由于住院和6个月死亡风险提高导致的更坏预后相关)的STEMI患者当与最终TIMI血流≥2的STEMI患者相比时显示出显著降低的ApoJ-GlcNAc+Neu5Ac+ApoJ-GlcNAc血浆水平(图8A)。此外，那些患有心源性休克(其与患STEMI之后的更差预后相关)的患者当与未患有心源性休克的患者相比时显示出入院时Apo J-GlcNAc+Neu5Ac+Apo J-GlcNAc血浆水平降低12％(图8B)。
此外，Apo J-GlcNAc+Neu5Ac+Apo J-GlcNAc水平与GRACE风险评分(其与死亡相关)之间存在反向且显著的相关(R＝-0.257P＝0.0002；图9A)。此外，参看那些82位STEMI患者的随访中Apo J-GlcNAc+Neu5Ac水平的变化，我们观察到在事件之后3天Apo J-GlcNAc+Neu5Ac+Apo J-GlcNAc水平比入院时甚至更低的那些患者显示更高的GRACE风险评分值(P＝0.002；图9B)。类似地，Apo J-GlcNAc水平也与GRACE风险评分反向且显著相关(R＝-0.184P＝0.0006；图9C)。所有这些结果都表明Apo J-GlcNAc+Neu5Ac+Apo J-GlcNAc和ApoJ-GlcNAc在缺血事件的情况下作为风险分层标志物的意外作用。
此外，Kaplan-Meier存活分析显示，入院时的Apo J-GlcNAc+Neu5Ac+Apo J-GlcNAc水平低于STEMI组的中位值的那些患者在6个月随访之后在复发性缺血事件的出现和死亡率中存在显著性差异(P＝0.008；图10A)。当用T-肌钙蛋白进行相同分析时未观察到这种作用(P＝0.363；图10B)。Apo J-GlcNAc水平也具有预后价值，因为Kaplan-Meier存活分析显示入院时的Apo J-GlcNAc水平在最低四分位数内(＜236.8μg/mL)的那些STEMI患者显示6个月随访的存活率显著降低(P＝0.015；图10C)。当6个月随访之后复发性缺血事件的出现和死亡二者被视为Kaplan-Meier分析中的终点时，入院时Apo J-GlcNAc水平在最低四分位数内(＜236.8μg/mL)的STEMI患者与入院时显示更高Apo J-GlcNAc值的那些患者二者之间也观察到显著性差异(P＝0.031；图10D)。因此，我们的结果指出Apo J-GlcNAc+Neu5Ac+Apo J-GlcNAc和Apo J-GlcNAc血浆水平作为缺血呈现之后的预后标志物的作用。
实施例3
用于在稳定型冠状动脉疾病(CAD)的情况下呈现复发性缺血事件(心脏或脑)的预 测值Apo J-GlcNAc+Neu5Ac±Apo J-GlcNAc。
本研究已显示了Apo J-GlcNAc+Neu5Ac+Apo J-GlcNAc测量的另一个意外性质，其是在稳定型冠状动脉疾病(CAD)的情况下用于呈现复发性缺血事件(心脏或大脑)的预测值。我们已经分析了一组在采集样品之前已患有急性冠脉综合征(ACS)平均0.6±0.04年并在随后随访2.3±0.3年的慢性CAD患者(N＝34)的Apo J-GlcNAc+Neu5Ac+Apo J-GlcNAc水平(图11A)。血浆样品获自两组患者：随访时患有急性缺血事件(任何急性冠脉综合征(ACS)、卒中或短暂性脑缺血事件(TIA))的那些患者(N＝16)和在随访期期间未患急性缺血事件的那些患者(N＝18)。这两组之间在年龄、糖尿病和高血压的发病率以及胆固醇参数方面没有显著性差异。所包括的患者均不是吸烟者，并且在样品采集时所有患者均进行抗血小板治疗。患有复发事件的患者在患有该事件之前与在随访时未患有任何事件的患者相比显示出Apo J-GlcNAc+Neu5Ac+Apo J-GlcNAc水平低28％(图11B)。实际上，接受者操作曲线(ROC)显示用于在稳定型CAD患者中呈现复发性缺血事件的Apo J-GlcNAc+Neu5Ac+Apo J-GlcNAc水平的预测值(图11C)。具体而言，在本研究中，低于485μg/mL的Apo J-GlcNAc+Neu5Ac+Apo J-GlcNAc水平在稳定型CAD患者中能够以94％的灵敏度和64％的特异性预测复发性缺血事件的呈现(表2)。因此，Apo J-GlcNAc+Neu5Ac+Apo J-GlcNAc显示作为在患有稳定型CAD的患者中呈现复发性急性缺血事件之前的“沉默”缺血过程之标志物的另外的价值。
实施例4
Apo J-GlcNAc+Neu5Ac+Apo J-GlcNAc作为脑缺血中生物标志物的作用
此外，当与164位健康对照相比，在174位卒中患者中Apo J-GlcNAc+Neu5Ac+ApoJ-GlcNAc水平的测量显示降低8％(卒中：418±7vs.C：453±7μg/mL；P＝0.0008；图12)，突出了Apo J-GlcNAc+Neu5Ac+Apo J-GlcNAc也是脑缺血的生物标志物。

Claims (38)

1.用于在对象中诊断缺血或缺血性组织损伤的方法，其包括在所述对象的样品中确定含有N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)残基的糖基化Apo J的水平或含有N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和唾液酸残基的糖基化Apo J的水平，其中含有N-乙酰葡糖胺残基的Apo J相对于参考值的降低水平或含有N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和唾液酸残基的Apo J相对于参考值的降低水平指示所述患者患有缺血或缺血性组织损伤。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述缺血是心肌缺血或脑缺血。
3.权利要求2所述的方法，其中所述心肌缺血是急性心肌缺血或微血管性心绞痛。
4.权利要求2所述的方法，其中所述脑缺血是卒中。
5.权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述患者被怀疑已患有缺血事件。
6.权利要求5所述的方法，其中所述确定在所怀疑的缺血事件发生之后的前6小时内、在至少一种坏死标志物的水平升高之前或在患者已接受针对所怀疑的缺血事件的任何治疗之前进行。
7.用于在已患有缺血事件的患者中预测缺血的进展或用于确定已患有缺血事件的患者的预后的方法，其包括在所述患者的样品中确定糖基化Apo J的水平，其中糖基化Apo J相对于参考值的降低水平指示缺血正在进展或所述患者的不良预后。
8.权利要求7所述的方法，其中所述糖基化Apo J是含有N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)残基的糖基化Apo J或含有N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和唾液酸残基的糖基化Apo J。
9.根据权利要求7或8中任一项所述的方法，其中所述缺血事件是心肌缺血事件。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述心肌缺血事件是ST段抬高型心肌梗死。
11.根据权利要求7至10中任一项所述的方法，其中所述患者的预后作为6个月复发的风险、住院死亡的风险或6个月死亡的风险来确定。
12.用于确定患有稳定型冠脉疾病的患者患复发性缺血事件的风险的方法，其包括在所述患者的样品中确定糖基化Apo J的水平，其中糖基化Apo J相对于参考值的降低水平指示患者表现出患复发性缺血事件的风险提高。
13.权利要求12所述的方法，其中所述糖基化Apo J是含有N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)残基的糖基化Apo J或含有N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和唾液酸残基的糖基化Apo J。
14.权利要求12至13中任一项所述的方法，其中所述患有稳定型冠脉疾病的患者在所述稳定型冠脉疾病之前已患有急性冠脉综合征。
15.权利要求12至14中任一项所述的方法，其中所述复发性缺血事件是急性冠脉综合征、卒中或短暂性缺血事件。
16.权利要求1至15中任一项所述的方法，其中含有N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)残基的糖基化Apo J的水平对应于能够与曼陀罗(Datura stramonium)凝集素特异性结合的Apo J的水平，或其中含有N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和唾液酸残基的糖基化Apo J的水平对应于能够与栽培小麦(Triticum vulgaris)凝集素特异性结合的Apo J的水平。
17.权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述样品是生物流体。
18.权利要求17所述的方法，其中所述生物流体是血浆或血清。
19.试剂盒，其包含
a.第一试剂，其为与选自N-乙酰葡糖胺和唾液酸的聚糖残基特异性结合的凝集素，以及
b.第二试剂，其能够与Apo J多肽特异性结合。
20.权利要求19所述的试剂盒，其中所述凝集素是来自栽培小麦的凝集素或来自曼陀罗的凝集素或其组合。
21.权利要求19或20所述的试剂盒，其中所述第二试剂是抗体或其含有其抗原结合区的片段。
22.权利要求19至21中任一项所述的试剂盒，其中所述第一试剂是固定化的。
23.权利要求19至22中任一项所述的试剂盒，其中所述第二试剂含有标记物。
24.权利要求23所述的试剂盒，其中所述标记物可通过其化学特性、电特性或磁特性中至少一种的变化来检测。
25.权利要求19至22中任一项所述的试剂盒，其还包含能够与所述第二试剂特异性结合的第三试剂。
26.权利要求25所述的试剂盒，其中所述第三试剂是抗体或其含有其抗原结合区的片段。
27.根据权利要求19至26中任一项所述的试剂盒用于以下的用途：用于在患者中诊断缺血或缺血性组织损伤、用于在已患有缺血事件的患者中确定缺血的进展、用于对已患有缺血事件的患者进行预后或用于确定患有稳定型冠脉疾病的患者患复发性缺血事件的风险。
28.用于测定样品中糖基化Apo J的方法，其包括以下步骤：
(i)在足以使所述样品中糖基化Apo J与凝集素之间形成复合物的条件下，使所述样品与特异性结合糖基化Apo J中存在的聚糖残基的凝集素接触，以及
(ii)检测含有所述凝集素和所述糖基化Apo J的复合物的量。
29.根据权利要求28所述的方法，其中步骤(i)中使用的凝集素是与N-乙酰葡糖胺特异性结合的凝集素或与N-乙酰葡糖胺和唾液酸特异性结合的凝集素。
30.根据权利要求28或29所述的方法，其中所述与N-乙酰葡糖胺特异性结合的凝集素是来自曼陀罗的凝集素，或其中所述与N-乙酰葡糖胺和唾液酸特异性结合的凝集素是来自栽培小麦的凝集素。
31.根据权利要求28至30中任一项所述的方法，其中所述与聚糖残基特异性结合的凝集素是固定化的。
32.根据权利要求28至31中任一项所述的方法，其中使用与Apo J多肽特异性结合的试剂检测步骤(ii)中的复合物。
33.权利要求32所述的方法，其中与所述Apo J多肽特异性结合的试剂是抗体或其含有其抗原结合区的片段。
34.权利要求33所述的方法，其中所述抗体与可检测标记物偶联。
35.权利要求34所述的方法，其中所述标记物可通过其化学特性、电特性或磁特性中至少一种的变化来检测。
36.权利要求28至33中任一项所述的方法，其中所述检测使用能够与特异性结合所述Apo J多肽之试剂特异性结合的试剂进行。
37.权利要求36所述的方法，其中能够与特异性结合所述Apo J多肽之试剂特异性结合的第三试剂是抗体或其含有其抗原结合区的片段。
38.权利要求1至18中任一项所述的方法，其中含有N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)残基的糖基化Apo J的水平或含有N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和唾液酸残基的糖基化Apo J的水平的确定使用如权利要求19至26中任一项所限定的试剂盒或如权利要求28至37中任一项所限定的方法确定。
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