CN113395994A - 用于预防和/或治疗缺血和治疗缺血/再灌注损伤的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及Apo J‑Glyc在预防缺血损伤中的用途，以及Apo J‑Glyc和非Glyc Apo J二者在治疗缺血损伤中和在治疗缺血再灌注损伤中的用途。

Description

用于预防和/或治疗缺血和治疗缺血/再灌注损伤的方法和组 合物

技术领域

本发明总体上涉及用于预防和/或治疗缺血损伤和治疗缺血/再灌注损伤的方法和组合物。

背景技术

在缺血期间，由于氧可用性降低，心脏能量代谢发生重要变化。缺血触发线粒体损伤、提高活性氧类(reactive oxidative species，ROS)生成和氧化性DNA损伤。快速再灌注是挽救缺血性心脏的最佳方式，然而，该过程与通过活化有害信号传导级联的细胞损伤有关，其可导致心肌细胞损伤，最终提高梗死面积。缺血和再灌注期间氧供应与消耗之间的不平衡通过基因和蛋白质表达以及多种蛋白质活性的协调变化诱导心肌细胞结构和功能上的改变。

线粒体是通过电子传递链进行氧化磷酸化的ATP的主要来源。由于心脏的能量需求，线粒体的作用至关重要，事实上它们代表其总质量的近三分之一。线粒体稳态的正确维持对细胞存活是必不可少的，因为线粒体是自由基和促凋亡因子的强效来源，但其也可降低过度氧化应激的有害作用。心肌缺血影响电子传递链，从而导致在再灌注期间心肌细胞死亡提高。实验方法已表明，缺血期间电子传递的化学阻断抑制线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)的打开，从而在再灌注期间降低心肌细胞损伤。缺血后适应(Ischemic post-conditioning，IPost-Co)(在长期缺血性损伤之后再灌注时应用的短暂发作的心肌缺血/再灌注)已显示活化固有促存活信号传导级联，从而限制再灌注损伤并降低梗死面积。有数项研究支持IPost-Co期间特定保护性通路的变化，例如再灌注损伤挽救激酶(Reperfusion Injury Salvage Kinases，RISK)的活化或促存活生存者活化因子增强(Survivor Activating Factor Enhancement，SAFE)。此外，已报道，芳香烃受体(aryl-hydrocarbon receptor，AhR)信号传导通路的下调似乎有助于由IPost-Co提供的心脏保护作用。在测试针对缺血和直接再灌注损伤(IdR)的心脏保护的临床试验中获得的有争议的结果(Cung TT，N.Engl.J.Med.2015；373：1021-31)强调需要进一步的研究以揭示未知的机制。

降低或预防缺血/再灌注损伤的有效治疗已被证明是难以捉摸的。尽管提高了对该过程的病理生理学的了解并且鼓励多种药剂的临床前试验，但大多数预防再灌注损伤的临床试验令人失望。因此，鉴于现有技术，仍然需要开发预防由缺血/再灌注导致之损害的策略。

发明概述

在第一方面中，本发明涉及用于预防缺血损伤的糖基化载脂蛋白J(ApoJ-Glyc)。

在第二方面中，本发明涉及用于治疗缺血损伤的糖基化载脂蛋白J(ApoJ-Glyc)或非糖基化载脂蛋白J(非Glyc ApoJ)。

在第三方面中，本发明涉及用于治疗缺血再灌注损伤的糖基化载脂蛋白J(ApoJ-Glyc)或非糖基化载脂蛋白J(非Glyc ApoJ)，其中ApoJ-Glyc或非Glyc ApoJ在缺血发作之后和再灌注之前施用。

附图简述

图1.用于初步研究、缺血模型和缺血再灌注模型的实验设计方案。该方案显示了心肌梗死(myocardial infarction，MI)动物模型中不同干预的时间线。AMI(acutemyocardial ischemia)：急性心肌缺血，i.p.(intraperitoneal)：腹膜内。

图2.在通过左前降支动脉结扎(left anterior descending artery ligation)的急性MI小鼠模型中，Apo J-Glyc和非Glyc Apo J对梗死面积的作用。在MI之前5分钟施用(载剂n＝3，Apo J-Glyc n＝8，非Glyc Apo J n＝8)。

图3.血清中的Apo J总水平(商业ELISA试剂盒)。在缺血诱导之前5分钟i.p.施用Apo J能够显著提高MI小鼠模型中的Apo J循环水平。

图4.在通过左前降支动脉结扎的心脏缺血45分钟的小鼠模型中，Apo J-Glyc和非Glyc Apo J施用对梗死面积的作用。在MI诱导之后10分钟施用(载剂，n＝12；Apo J-Glyc，n＝12；非Glyc Apo J，n＝11)。结果表示为平均值±SEM。

图5.在缺血/再灌注小鼠模型中，Apo J-Glyc和非Glyc Apo J施用对梗死面积的作用。在MI诱导之后10分钟施用(载剂，n＝12；Apo J-Glyc，n＝12；非Glyc Apo J，n＝12)。动物经受45分钟的缺血和2小时的再灌注。结果表示为平均值±SEM。

图6.用于缺血/再灌注大鼠模型的实验设计方案。该方案显示了在缺血诱导之后10分钟，在心肌梗死(MI)的大鼠模型中不同干预的时间线(缺血45分钟，随后再灌注24小时)。AMI：急性心肌缺血，i.v.(intravenous)：静脉内。

图7.在通过左前降支动脉结扎的急性MI大鼠模型中，Apo J-Glyc和非Glyc Apo J对梗死面积的作用。在MI大鼠模型中，在缺血诱导之后10分钟，i.v.施用Apo J-Glyc和非Glyc Apo J之后，梗死面积(梗死面积(infarct size，IS)与风险面积(area at risk，AAR)的比例)显著降低(缺血45分钟和再灌注24小时；载剂n＝13，Apo J-Glyc n＝11，非GlycApo J n＝11)。

图8.在通过左前降支动脉结扎的急性MI大鼠模型中，Apo J-Glyc和非Glyc Apo J对功能参数的作用。在MI大鼠模型中，在缺血诱导之后10分钟，i.v.施用Apo J-Glyc和非Glyc Apo J之后，左心室收缩末压(left ventricular end systolic pressure，LVESP)显著提高(缺血45分钟和再灌注24小时；载剂n＝13，Apo J-Glyc n＝11，非Glyc Apo J n＝11)。

图9.在通过左前降支动脉结扎的急性MI大鼠模型中，Apo J-Glyc和非Glyc Apo J对功能参数的作用。在MI大鼠模型中，在缺血诱导之后10分钟，i.v.施用Apo J-Glyc和非Glyc Apo J之后，左心室舒张显著提高(缺血45分钟和再灌注24小时；载剂n＝13，Apo J-Glyc n＝11，非Glyc Apo J n＝11)。

图10.在通过左前降支动脉结扎的急性MI大鼠模型中，Apo J-Glyc和非Glyc ApoJ对坏死生物标志物的作用。在MI大鼠模型中，在缺血诱导之后10分钟，在用Apo J-Glyc处理的大鼠中，心肌肌钙蛋白I血浆水平显著降低(缺血45分钟和再灌注24小时；载剂n＝13，Apo J-Glyc n＝11，非Glyc Apo J n＝11)。当施用非Glyc Apo J时未观察到该作用。

图11.用于缺血再灌注大鼠模型的实验设计方案。该方案显示了在心肌梗死大鼠模型中，在缺血诱导(MI)之前10分钟的不同干预的时间线(缺血45分钟，随后再灌注24小时)。

图12.在通过左前降支动脉结扎的急性MI大鼠模型中，Apo J-Glyc和非Glyc ApoJ对梗死面积的作用。在缺血45分钟和再灌注24小时之前10分钟，在MI大鼠模型中i.v.施用Apo J-Glyc和非Glyc Apo J之后，梗死面积(梗死面积(IS)与风险面积(AAR)的比例)显著降低(载剂n＝13，Apo J-Glyc n＝13，非Glyc Apo J n＝13)。

图13.在通过左前降支动脉结扎的急性MI大鼠模型中，Apo J-Glyc和非Glyc ApoJ对功能参数的作用。在缺血45分钟和再灌注24小时之前10分钟，在MI大鼠模型中i.v.施用Apo J-Glyc和非Glyc Apo J之后，左心室收缩末压(LVESP)显著提高(载剂n＝13，Apo J-Glyc n＝13，非Glyc Apo J n＝13)。

图14.在通过左前降支动脉结扎的急性MI大鼠模型中，Apo J-Glyc和非Glyc ApoJ对功能参数的作用。在缺血45分钟和再灌注24小时之前10分钟，在MI大鼠模型中i.v.施用Apo J-Glyc和非Glyc Apo J之后，左心室舒张显著提高(载剂n＝13，Apo J-Glyc n＝13，非Glyc Apo J n＝13)。

图15.在通过左前降支动脉结扎的急性MI大鼠模型中，Apo J-Glyc和非Glyc ApoJ对坏死生物标志物的作用。在缺血45分钟和再灌注24小时之前10分钟，在MI大鼠模型中，在用Apo J-Glyc和非Glyc Apo J处理的大鼠中，未观察到心肌肌钙蛋白I血浆水平的显著变化(载剂n＝13，Apo J-Glyc n＝13，非Glyc Apo J n＝13)。

发明详述

本发明的作者已观察到，当在缺血发作之前施用时，糖基化载脂蛋白J能够在小鼠中预防缺血损伤(图2)；当在小鼠缺血损伤之后施用时，糖基化Apo J和非糖基化Apo J二者能够降低梗死面积(图4)；并且当恰好在小鼠缺血损伤之后和再灌注之前施用时，糖基化Apo J和非糖基化Apo J二者能够降低梗死面积(图5)。

缺血损伤的预防

在第一方面中，本发明涉及用于预防缺血损伤的糖基化载脂蛋白J(ApoJ-Glyc)。

本文中使用的术语“载脂蛋白J”或“ApoJ”是指也称为以下的多肽：“簇集蛋白(clusterin)”、“睾酮抑制性前列腺信使(testosterone-Repressed Prostate Message)”、“补体相关蛋白SP-40，40”、“补体细胞裂解抑制剂”、“补体裂解抑制剂”、“硫酸化糖蛋白”、“Ku70结合蛋白”、“NA1/NA2”、“TRPM-2”、“KUB1”、“CLI”。人Apo J是UniProtKB/Swiss-Prot数据库中以登录号P10909提供的多肽(2018年9月12日的条目版本212)。

术语“糖基化的”通常是指具有共价连接的寡糖链的任何蛋白质。

本文中使用的术语“糖基化ApoJ”或“包含GlcNAc残基的Apo J”是指在至少一个聚糖链中包含至少一个N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)重复的任何Apo J分子，但是通常来说，Apo J在每个聚糖链中将包含至少一个N-乙酰葡糖胺。在一个实施方案中，糖基化ApoJ在单个Asn残基处包含N-聚糖，所述Asn残基选自相对于NCBI数据库条目中定义的登录号为NP_001822.3(2018年9月23日发布)的ApoJ前原蛋白序列的第86、103、145、291、317、354或374位处的Asn残基。在另一个实施方案中，糖基化ApoJ在ApoJ内的每个N-糖基化位点处，即在相对于NCBI数据库条目中定义的登录号为NP_001822.3(2018年9月23日发布)的ApoJ前原蛋白序列的第86、103、145、291、317、354和374位处的每个Asn处均包含N-聚糖。在另一个实施方案中，糖基化ApoJ在至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6或至少7个Asn残基处包含N-聚糖，所述Asn残基选自相对于NCBI数据库条目中定义的登录号为NP_001822.3(2018年9月23日发布)的ApoJ前原蛋白序列的第86、103、145、291、317、354或374位处的Asn残基。

“包含GlcNAc残基的Apo J”包括在高甘露糖N-聚糖、复合型N-聚糖或杂合寡糖N-聚糖中包含至少一个GlcNAc残基的Apo J分子。取决于N-聚糖的类型，可发现GlcNAc与多肽链直接连接或位于N-聚糖中的远端位置。

术语“GlcNAc”或“N-乙酰葡糖胺”是指由葡糖胺被乙酸酰胺化而得到并具有以下一般结构的葡萄糖衍生物：

在一个实施方案中，包含GlcNAc残基的Apo J包含两个GlcNAc残基并且在本文中称为(GlcNAc)₂。包含(GlcNAc)₂残基的Apo J分子包括其中(GlcNAc)₂存在于高甘露糖N-聚糖、复合型N-聚糖、杂合寡糖N-聚糖或O-聚糖中的分子。取决于N-聚糖的类型，可发现(GlcNAc)₂与多肽链直接连接或位于N-聚糖中的远端位置。

在一个优选实施方案中，“包含GlcNAc残基的Apo J”基本上不含其他类型的N-连接或O-连接的碳水化合物。在一个实施方案中，“包含GlcNAc残基的Apo J”不包含N-连接或O-连接的α-甘露糖残基。在另一个实施方案中，“包含GlcNAc残基的Apo J”不包含N-连接或O-连接的α-葡萄糖残基。在另一个实施方案中，“包含GlcNAc残基的Apo J”不包含N-连接或O-连接的α-甘露糖残基或者N-连接或O-连接的α-葡萄糖残基。

在一个优选实施方案中，ApoJ-Glyc通过在单个Asn残基处被糖基化的单一类型的糖基化Apo J分子进行，所述Asn残基选自相对于NCBI数据库条目中定义的登录号为NP_001822.3(2018年9月23日发布)的ApoJ前原蛋白序列的第86、103、145、291、317、354或374位处的Asn残基。在另一个优选实施方案中，ApoJ-Glyc作为糖基化Apo J分子的组合提供，其中每个分子可在相对于NCBI数据库条目中定义的登录号为NP_001822.3(2018年9月23日发布)的ApoJ前原蛋白序列的第86、103、145、291、317、354或374位处的Asn N-糖基化位点中的不同位点处被糖基化。在另一个优选实施方案中，ApoJ-Glyc是在ApoJ内的每个N-糖基化位点处，即在相对于NCBI数据库条目中定义的登录号为NP_001822.3(2018年9月23日发布)的ApoJ前原蛋白序列的第86、103、145、291、317、354和374位处的每个Asn处被糖基化的单一类型的糖基化ApoJ。

在一个优选实施方案中，ApoJ-Glyc包含GlcNAc残基。在另一个优选实施方案中，ApoJ-Glyc包含GlcNAc残基和唾液酸残基。

本文中使用的术语“包含GlcNAc和唾液酸残基的Apo J”是指包含在其聚糖链中的至少一个N-乙酰葡糖胺重复以及至少一个唾液酸残基重复的任何Apo J分子。

本文中使用的术语“唾液酸”是指被称为N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)并具有以下一般结构的单糖：

在一个实施方案中，Apo J包含两个GlcNAc残基和一个唾液酸残基(下文称为(GlcNAc)₂-Neu5Ac)。在另一个实施方案中，GlcNAc和唾液酸残基通过一个或更多个单糖连接。

在一个优选实施方案中，“包含GlcNAc残基和唾液酸残基的Apo J”基本上不含其他类型的N-连接或O-连接的碳水化合物。在一个实施方案中，“包含GlcNAc和唾液酸残基的Apo J”不包含N-连接或O-连接的α-甘露糖残基。在另一个实施方案中，“包含GlcNAc和唾液酸残基的Apo J”不包含N-连接或O-连接的α-葡萄糖残基。在另一个实施方案中，“包含GlcNAc残基和唾液酸残基的Apo J”不包含N-连接或O-连接的α-甘露糖残基或者N-连接或O-连接的α-葡萄糖残基。

在一个优选实施方案中，根据本发明应用的ApoJ-Glyc是从人血浆中纯化的。

从人血浆中纯化ApoJ-Glyc可使用本领域已知的常规方法，例如由de Silva etal.(J.Biol.Chem.，1990，265：24：14292-14297)、Kelso et al.(Biochemistry，1994，33：832-839)或Calero et al.，(Biochem.J.，1999，344：375-383)描述的那些进行。在一个实施方案中，ApoJ-Glyc可使用抗ApoJ特异性抗体通过免疫亲和色谱从人血浆中纯化。在一个更优选的实施方案中，ApoJ-Glyc可通过HPLC，优选反相HPLC进一步纯化。

本文中使用的术语“预防”是指在疾病或病症发作之前防止其发作或发生、使其发作或发生最小化或者阻碍其发作或发生的能力。

本文中使用的“缺血”涉及组织或器官的血液供应受限，导致细胞代谢所需的氧和葡萄糖短缺。缺血可以是短暂的或永久的。

本文中使用的术语“缺血损伤”涉及由细胞代谢所需的氧和葡萄糖的短缺而引起的损伤。

在一个优选实施方案中，缺血损伤是由选自以下的病症引起的：梗死、动脉粥样硬化、血栓形成、血栓栓塞、脂质栓塞、出血、支架、手术、血管成形术、手术期间旁路结束(endof bypass during surgery)、器官移植、完全缺血(total ischemia)，及其组合。

“梗死”涉及由组织或器官的动脉供应或静脉引流阻塞之后缺氧产生的局部缺血性坏死区域。更特别地，通常称为心脏病发作的心肌梗死(MI)与血液停止正确流向心脏部分并且心肌由于没有接受足够的氧而受损的事件有关。通常，梗死是由于白细胞、胆固醇和脂肪的不稳定积聚导致冠状动脉之一阻塞的结果。重要的风险因素是既往心血管疾病、老年期、吸烟、高的血液LDL胆固醇和甘油三酯水平、低的HDL胆固醇水平、糖尿病、高血压、缺乏体力活动、肥胖、慢性肾病、过度饮酒以及使用可卡因和安非他明。确定对象是否患有梗死的方法是本领域已知的，并且包括但不限于通过心电图(electrocardiogram，ECG)追踪心脏中的电信号，以及测试血液样品的与心肌损伤相关的物质包括肌酸激酶(creatinekinase，CK-MB)和肌钙蛋白。ECG测试用于基于追踪的形状来在两种类型的心肌梗死之间进行区分。高于基线的追踪的ST段被称为ST抬高MI(ST elevation MI，STEMI)，其通常需要更积极的治疗。确定梗死面积的方法是技术人员已知的并且包括测量血清样品中的血清标志物包括肌酸激酶(CK)-MB水平(Grande P et al.1982 Circulation 65：756-764)、用三苯基四唑氯化物进行组织染色(Fishbein MC et al.1981Am Heart J 101(5)：593-600)、锝(Tc)-99m甲氧基异丁基异腈(sestamibi)单光子发射计算机断层扫描(single-photonemission computed tomography，SPECT)心肌灌注成像、以及磁共振。

“动脉粥样硬化”涉及继发于由炎性细胞(主要是巨噬细胞)和包含脂质的细胞碎片构成的动脉壁中的积聚或粥样斑(atheroma)的任何动脉硬化。由于钙和脂肪物质例如胆固醇和甘油三酯的积聚，动脉壁增厚。动脉壁的弹性降低，损害血液流动。

“血栓形成”涉及血管内血凝块或血栓的形成，阻碍了血液流过循环系统。

“血栓栓塞”涉及血管中凝块(血栓)的形成，所述凝块(血栓)挣脱并被血流携带以堵塞另一条血管。凝块可堵塞肺(肺栓塞)、脑(卒中)、胃肠道、肾或腿中的血管。

“脂质栓塞”或“脂肪栓塞”是指在长骨或其他重大创伤之后，在肺实质和外周循环中通常无症状的脂肪球存在。

“出血”涉及失血或具有血液流动的过程，尤其是手术性的。特别地，当动脉或静脉受损使得血液逸出循环系统并在体内聚集时发生内出血。内出血可在组织、器官或体腔内发生。

“支架”涉及插入到体内天然通道/导管中以预防或抵消疾病诱发的局部流动收缩的设置(dispositive)，例如管。

“手术”或“手术治疗”意指涉及手或手与仪器对人或其他哺乳动物身体的有条不紊动作以产生治愈或补救的任何治疗性过程。

“血管成形术”涉及机械地使窄或阻塞的动脉变宽的技术，后者通常是动脉粥样硬化的结果。导丝上的空且塌陷的气囊(称为气囊导管)被传递到窄的位置中并随后使用约75至500倍正常血压(6至20个大气压)的水压使其膨胀至固定尺寸。气囊迫使内部白细胞/凝块斑块沉积物和周围肌肉壁扩张，打开血管以用于改善流动，并且随后将气囊缩小并撤回。在鼓胀时可插入或可不插入支架以确保血管保持开放。

“旁路手术”涉及包括改变管状身体部位的一类手术，并且包括心肺转流术(cardiopulmonary bypass)、部分回肠旁路手术、回肠空肠旁路术、胃旁路术(gastricbypass)和血管旁路术(vascular bypass)(例如冠状动脉旁路手术)。心肺转流术(CBP)在手术期间暂时接管心脏和肺的功能，维持血液循环和身体的氧含量。部分回肠旁路手术是涉及缩短回肠以缩短总小肠长度的手术过程。回肠空肠旁路术是设计为补救病态肥胖的手术。血管旁路术是针对流向身体区域的血液不足或损失而进行的手术过程。特别是，冠状动脉旁路手术，也称为冠状动脉旁路搭桥(coronary artery bypass graft，CABG)手术，是为了缓解心绞痛和降低由冠状动脉疾病引起的死亡风险而进行的手术过程。

“移植”意指通过其将细胞、组织或器官从供体对象转移至接受者对象或者从身体的一部分转移至同一对象的另一部分的手术过程。“供体对象”是通过输血或器官移植为另一对象提供血液、细胞、组织或器官的对象。供体对象是人或另外的哺乳动物。“接受者对象”是通过输血或器官移植接受来自另一对象的血液、细胞、组织或器官的对象。接受者对象是人或另外的哺乳动物。移植的组织包括但不限于骨组织、肌腱、角膜组织、心脏瓣膜、静脉和骨髓。移植的器官包括但不限于心脏、肺、肝、肾、胰和肠。其中供体对象和接受者对象是同一种属的遗传上不相同成员的移植的特定手术过程被称为同种异体移植。因此，术语同种异体移植(allotransplant)(也称为同种异体移植(allograft)、同种异体移植(allogeneic transplant)或同种移植(homograft))涉及来源于与接受者同一种属的遗传上不相同成员的细胞、组织或器官的移植。术语“可同种异体移植的”是指相对经常或常规移植的器官或组织。可同种异体移植的器官的一些实例包括心脏、肺、肝、胰、肾和肠。其中供体对象和接受者对象是不同种属的成员的移植的特定手术过程被称为异种移植。因此，术语异种移植(也称为异种移植(xenograft)、异种异体移植(xenogeneic transplant)或异种移植(heterograft))涉及将来源于供体的细胞、组织或器官移植至接受者，其中供体和接受者是不同种属的成员。

“完全缺血”涉及其中动脉和/或静脉血液供应被阻塞的缺血。

根据本发明待预防的缺血损伤可在来自对象的任何器官或组织中发生。器官包括但不限于脑、心脏、肾、肝、大肠、肺、胰、小肠、胃、肌、膀胱、脾、卵巢和睾丸。在一个优选实施方案中，器官选自心脏、肝、肾、脑、肠、胰、肺、骨骼肌，及其组合。在一个更优选的实施方案中，器官是心脏。组织包括但不限于神经组织、肌组织、皮肤组织和骨组织。

在一个优选实施方案中，缺血损伤选自包含以下的组：器官功能障碍(在缺血性器官或在任何其他器官中)、梗死、炎症(在受损器官或组织中)、氧化损伤、线粒体膜电位损伤、凋亡、再灌注相关心律失常、心脏顿抑(cardiac stunning)、心脏脂毒性、缺血来源的瘢痕形成，及其组合。

本文中使用的“器官功能障碍”涉及其中特定器官不执行其预期功能的病症。如果在没有外部临床干预的情况下不能维持正常的稳态，则器官功能障碍发展为器官衰竭。确定器官功能障碍的方法是技术人员已知的，其包括但不限于监测和评分，包括序贯器官衰竭评估(sequential organ failure assessment，SOFA)评分、多器官功能障碍(multipleorgan dysfunction，MOD)评分和器官功能障碍逻辑性(logistic organ dysfunction，LOD)评分。

“梗死”已在先前进行了定义。

“炎症”或“炎性应答”涉及经历炎症的组织中发生的一系列变化。特别地，炎症涉及对有害刺激，包括病原体、受损细胞或刺激物的生物响应。确定炎症的方法是本领域已知的并且包括但不限于：红细胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate，ESR)的测量，其中较高的ESR指示炎症；C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)的测量，其中较高的CRP水平指示炎症；以及白细胞计数(在炎症中提高)。

“氧化损伤”涉及在氧恢复期间可由活性物质的直接攻击引起的生物分子损伤。氧化损伤可涉及脂质过氧化、氧化DNA损伤和对蛋白质的氧化损伤。确定脂质过氧化的方法包括但不限于通过HPLC测定MDA(malondialdehyde，丙二醛)-TBA(thiobarbituric acid，硫代巴比妥酸)以及通过质谱对异前列腺素(其是多不饱和脂肪酸过氧化的特定终产物)进行量化。确定DNA氧化损伤的方法包括但不限于测量8-羟基-2’-脱氧鸟苷(8-hydroxy-2’-deoxyguanosine，8OHdG)。确定对蛋白质的氧化损伤的方法包括但不限于对包括以下的单个氨基酸氧化产物进行量化：犬尿氨酸(来自色氨酸)、二酪氨酸(其显示是代谢稳定的并且可在尿中检测到)、缬氨酸和亮氨酸氢氧化物、L-二羟基苯丙氨酸(L-dihydroxyphenylalanine，L-DOPA)、邻-酪氨酸、2-氧代-组氨酸、谷氨酸半醛和己二酸半醛，以及羰基测定(涉及蛋白质羰基的测量)。

“线粒体膜电位(Δψm)损伤”涉及跨过线粒体内膜为质子梯度形式的膜电位变化。用于评价线粒体膜电位损伤的方法是技术人员已知的，并且包括使用用于监测膜电位的荧光探针包括JC1染料(Cell Technology)以及测量激发和发射波长下整体荧光，从而允许对绿色(485nm和535nm)和红色荧光(550nm和600nm)进行量化。已知任何组织或器官的长期缺血会诱发线粒体膜电位损伤。

“凋亡”涉及导致选择性的细胞自杀形式的生物化学事件的调节网络，并且其特征在于可易于观察的形态和生物化学现象，例如脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)的片段化、染色质的凝缩，这可与核酸内切酶活性、染色体迁移、细胞核边缘化、凋亡小体的形成、线粒体肿胀、线粒体嵴的变宽、线粒体通透性转换孔的打开和/或线粒体质子梯度的消散相关或不相关。确定细胞凋亡的方法是技术人员已知的，并且包括但不限于测量DNA片段化的测定(包括在细胞透化之后对染色体DNA进行染色)、测量胱天蛋白酶例如胱天蛋白酶3的活化的测定(包括蛋白酶活性测定)、测量胱天蛋白酶切割产物的测定(包括检测PARP和细胞角蛋白18降解)、检查染色质色谱的测定(包括染色体DNA染色)、测量DNA链断裂(缺口)和DNA片段化(交错的DNA末端)的测定(包括对细胞缺口平移或ISNT进行主动标记和通过末端标记或TUNEL对细胞进行主动标记)、检测凋亡细胞表面上的磷脂酰丝氨酸的测定(包括检测易位膜组分)、测量质膜损伤/渗漏的测定(包括台盼蓝排除测定和碘化丙啶排除测定)。一些示例性测定包括通过流式细胞术分析凋亡细胞的散射参数、通过流式细胞术分析DNA含量(包括在荧光染料溶液例如碘化丙啶中的DNA染色)、通过末端脱氧核苷酸转移酶或TdT-测定对DNA链断裂进行荧光染料标记、通过流式细胞术和TUNEL测定分析膜联蛋白-V结合。

缺血损伤还可涉及再灌注相关心律失常。“心律失常”，也称为心脏节律障碍或不规律心跳，涉及其中心脏的电活动与正常相比不规律、更快或更慢的病症组。心跳可以是太快(心动过速，每分钟超过100次心跳)或太慢(心动过缓，每分钟小于60次心跳)，并且可以是规律的或不规律的。在一些情况下，心律失常可导致心脏骤停。心律失常可发生在心脏的上腔室(心房)或心脏的下腔室(心室)。心律失常的确定由本领域技术人员通过心电图(ECG)进行。

“心脏顿抑”涉及急性缺血发作之后发生的不同功能障碍水平，尽管血流接近正常或者是正常的。在短暂的缺血和再灌注发作之后，尽管不存在心肌细胞不可逆转损伤的组织学迹象，但仍然存在长期的机械功能障碍，这种现象称为心肌顿抑。顿抑涉及不同方面：除缺血后心室功能障碍心肌(心肌顿抑)之外，还证明有血管/微血管/内皮损伤(血管顿抑)、缺血后代谢功能障碍(代谢顿抑)、神经传递的长期受损(神经/神经元顿抑)和电生理改变(电顿抑)。

“心脏脂毒性”涉及一系列脂肪酸代谢改变、心肌内脂质过载和收缩功能障碍。虽然尚不清楚脂质如何诱导心脏功能障碍，但心肌内甘油三酯的积聚与基因表达改变有关。特别地，过氧化物酶体增殖物活化受体α(peroxisome proliferator-activated receptorα，PPARα)调节的基因的表达提高。PPARα是核受体，当其被长链脂肪酸活化时诱导提高脂肪酸的摄取和氧化的蛋白质的表达。PPARα的心脏特异性过表达在暴露于高循环脂肪酸水平的小鼠中诱导心脏功能障碍。压力过载的大鼠心脏中PPARα的药理学活化导致收缩功能障碍。在患有糖尿病和肥胖的患者中，炎性细胞因子肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα，TNF-α)在脂质过载组织中的表达提高，并且与胰岛素抗性呈正相关。TNF-α可直接导致心脏收缩功能障碍，并与心力衰竭的病理重塑有关。心肌细胞内过多脂质的积聚可导致可诱导细胞死亡的有毒脂质中间体的产生。

“瘢痕”涉及在伤口或损伤愈合之后留在组织上的任何痕迹。特别地，该术语涉及留在缺血组织上的痕迹。在本发明的上下文中，瘢痕形成来源于缺血。

缺血损伤可由例如以下的多种原因引起：自然事件(例如，心肌梗死之后血流的恢复)、创伤或恢复血液流动至已经受血液供应减少的组织或器官的一种或更多种手术过程或其他治疗性干预。这样的手术过程包括，例如冠状动脉旁路、移植手术、冠状血管成形术、器官移植手术等(例如，心肺转流术)。

应理解，缺血损伤的预防可通过在缺血发作之前施用Apo J-Glyc以及通过在缺血发作之后但在由缺血引起的损伤出现之前施用Apo J-Glyc来实现。在一个优选实施方案中，Apo J在缺血诱导开始之前施用。在一个更优选的实施方案中，Apo J在缺血发作之前至少10分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、1天、2天、3天、4天、5天或更长时间施用。

在一个实施方案中，由缺血损伤引起的损害是由脑缺血引起的。在另一个实施方案中，对脑组织的损伤是由缺血性卒中引起的。术语“缺血性卒中”是指由脑血管阻塞(导致脑缺氧)引起的脑功能突然丧失，其特征在于肌控制丧失、感觉或意识减弱或丧失、头晕、言语不清或随脑损伤的程度和严重性而变化的其他症状，也称为脑意外或脑血管意外。术语“脑缺血”(或“卒中”)也指脑供血不足，通常导致脑缺氧。

在一个实施方案中，由缺血引起的损伤是由心脏缺血引起的。在又一个更优选的实施方案中，心脏缺血是由心肌缺血引起的。

术语“心肌缺血”是指由冠状动脉粥样硬化和/或向心肌供氧不足引起的循环障碍。例如，急性心肌梗死表示对心肌组织的不可逆缺血性损伤。该损伤导致冠状循环中的阻塞性(例如，血栓形成或栓塞)事件并且产生其中心肌代谢需求超过向心肌组织之氧供应的环境。

在一个具体实施方案中，损伤是由微血管性心绞痛引起的。本文中使用的术语“微血管性心绞痛”是指由流过小心脏血管的血流不足引起的病症。

在一个优选实施方案中，心脏缺血是由急性心肌梗死引起的。

本文中使用的“心肌梗死”(MI)或“急性心肌梗死”是由一个或数个冠状动脉或其分支的阻塞而引起的部分心肌的缺血性坏死。心肌梗死的特征在于功能性心肌细胞丧失，心肌组织被不可逆地损伤。当存在晚期冠状动脉疾病时，心肌或心脏肌遭受梗死。在特定情况下，这在当位于冠状动脉内的动脉粥样硬化斑块形成溃疡或破裂，导致该血管急性阻塞时发生。

在一个具体实施方案中，缺血损伤是由冠状动脉阻塞(心肌梗死)和另外的血管重建和血液回流引起的。

在一个优选实施方案中，用于预防缺血损伤的Apo J-Glyc在缺血之前施用。在缺血发作之前的施用时间也没有特别限制。在一个优选实施方案中，Apo J-Glyc在缺血之前至少1秒、至少5秒、至少10秒、至少15秒、至少30秒或至少45秒，优选地在缺血之前至少1分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、45分钟，或者甚至在缺血之前至少1小时、2小时或3小时，或者甚至更靠前施用。

在一个优选实施方案中，用于预防缺血损伤的Apo J-Glyc以治疗有效量施用。

本文中使用的与Apo J-Glyc在预防缺血损伤中的用途相关的术语“治疗有效量”涉及实现对来源于疾病的一种或更多种症状的可感知的预防、治愈、延迟、严重程度的降低或者改善的Apo J-Glyc的足够量，并且通常尤其是由药剂本身的特征和待实现的治疗性作用决定。这也将取决于待治疗的对象、所述对象所患疾病的严重程度、选择的剂型等。由于该原因，本发明中提及的剂量必须仅被视为是对本领域技术人员的指导，技术人员必须根据上述变量调整剂量。在一个实施方案中，有效量产生了对所治疗疾病的一种或更多种症状的改善。

即使个体需要不同，但是根据本发明应用的化合物的治疗有效量的最佳范围的确定属于本领域那些专家的共同经验。一般而言，提供有效治疗所需的剂量(可由本领域的一位专家进行调整)将根据以下而变化：年龄；健康状况；适合度；性别；饮食；体重；受体的改变程度；治疗频率；损伤的性质和状况；损害或疾病的性质和程度；对象的医学状况；施用途径；药理学考虑因素例如所使用特定化合物的活性、效力、药动学和毒理学特性；是否使用系统药物递送；以及该化合物是否作为药物组合的一部分进行施用。在对象中在预防缺血损伤方面治疗有效的根据本发明应用的化合物的量可通过常规临床技术(参见，例如，ThePhysician′s Desk Reference，Medical Economics Company，Inc.，Oradell，NJ，1995和Drug Facts and Comparisons，Inc.，St.Louis，MO，1993)来确定。

在一个优选实施方案中，用于预防缺血损伤的Apo J-Glyc以0.1mg/kg至1mg/kg的剂量范围施用。在一个更优选的实施方案中，Apo J-Glyc以0.1至0.2mg/kg、0.2至0.3mg/kg、0.3至0.4mg/kg、0.4至0.5mg/kg、0.5至0.6mg/kg、0.6至0.7mg/kg、0.7至0.8mg/kg、0.8至0.9mg/kg、0.9至1mg/kg的剂量范围施用。在又一个更优选的实施方案中，Apo J-Glyc以0.5mg/kg的剂量施用。

以非限制性方式，Apo J-Glyc的施用途径尤其包括：非侵入性药理学施用途径，例如经口、经胃肠、经鼻或舌下途径；和侵入性施用途径，例如肠胃外途径。在一个具体实施方案中，Apo J-Glyc通过肠胃外途径(例如，皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鞘内等)以治疗有效量施用。“通过肠胃外途径施用”被理解为由通过注射来施用目的化合物组成的施用途径，因此需要使用注射器和针。根据针到达的组织，有不同类型的肠胃外穿刺：肌内(将化合物注射到肌组织中)、静脉内(将化合物注射到静脉中)、皮下(在皮肤下注射)和皮内(在皮肤层之间注射)。鞘内途径用于将不能良好穿透血脑屏障的药物施用到中枢神经系统中，使得将该药物施用至脊髓周围的空间(鞘内空间)。在一个优选实施方案中，施用是皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下或鞘内施用。在一个优选实施方案中，施用途径是静脉内。

在一个优选实施方案中，Apo J-Glyc以单剂量施用。本文中使用的“单剂量”是指以一剂/以一次/单途径/单接触点施用的物理上离散的单位Apo J-Glyc剂量。单剂量可每天施用一次或更多次。在一个具体实施方案中，单剂量每天施用一次。在另一个实施方案中，单剂量每天施用两次。例如，单剂量可被分成两个剂量并且每一半分剂量在一天中的不同时间施用于对象。

在一个优选实施方案中，Apo J-Glyc在缺血之前至少1秒，通常在缺血之前至少15秒、30秒或45秒，优选在缺血之前至少1分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、45分钟，或者甚至在缺血之前至少1小时、2小时或3小时，或者甚至更早施用。

缺血损伤的治疗

在第二方面中，本发明涉及用于治疗缺血损伤的糖基化载脂蛋白J(Apo J-Glyc)或非糖基化载脂蛋白J(非Glyc Apo J)。

术语“糖基化Apo J”已关于本发明的第一方面进行了定义并且在本文中同等地使用。

本文中使用的术语“非糖基化Apo J”是指其中没有一个N-糖基化位点(相对于NCBI数据库条目中定义的登录号为NP_001822的Apo J前原蛋白序列的第86、103、145、291、317、354和374位处的氨基酸)被糖基化的Apo J。

本文中使用的术语“治疗”是指治疗性措施和预防性或预防措施二者，其中目的是预防或减缓(减轻)不期望的生理变化或病症，例如缺血/再灌注损伤。有益的或期望的临床结果包括但不限于：症状的减轻、疾病程度的减弱、疾病状态稳定(即，不恶化)、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的改善或缓和，以及缓解(无论是部分还是全部)，无论是可检测出还是不可检测出的。“治疗”也可意指与未接受治疗时的预期存活相比延长存活。需要治疗的那些包括已患有病症或障碍的那些以及易于患有病症或障碍的那些或者其中病症或障碍待被预防的那些。

在一个优选实施方案中，Apo J-Glyc是包含N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)残基的糖基化Apo J。在另一个优选实施方案中，Apo J-Glyc是包含N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)残基和唾液酸残基的糖基化Apo J。

在一个优选实施方案中，Apo J-Glyc在单个Asn残基处包含N-聚糖，所述Asn残基选自相对于NCBI数据库条目中定义的登录号为NP_001822.3(2018年9月23日发布)的Apo J前原蛋白序列的第86、103、145、291、317、354或374位处的Asn残基。在另一个优选实施方案中，糖基化Apo J在Apo J内的每个N-糖基化位点处，即在相对于NCBI数据库条目中定义的登录号为NP_001822.3(2018年9月23日发布)的Apo J前原蛋白序列的第86、103、145、291、317、354和374位处的每个Asn处均包含N-聚糖。在另一个实施方案中，糖基化ApoJ在至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个或至少7个Asn残基处包含N-聚糖，所述Asn残基选自相对于NCBI数据库条目中定义的登录号为NP_001822.3(2018年9月23日发布)的Apo J前原蛋白序列的第86、103、145、291、317、354或374位处的Asn残基。

在一个优选实施方案中，Apo J-Glyc是在单个Asn残基处被糖基化的单一类型的糖基化Apo J分子，所述Asn残基选自相对于NCBI数据库条目中定义的登录号为NP_001822.3(2018年9月23日发布)的Apo J前原蛋白序列的第86、103、145、291、317、354或374位处的Asn残基。在另一个优选实施方案中，Apo J-Glyc是糖基化Apo J分子的组合，其中每个分子可在选自相对于NCBI数据库条目中定义的登录号为NP_001822.3(2018年9月23日发布)的Apo J前原蛋白序列的第86、103、145、291、317、354或374位处的Asn残基的不同位点处被糖基化。在另一个优选实施方案中，Apo J-Glyc是在Apo J内的每个N-糖基化位点处，即在相对于NCBI数据库条目中定义的登录号为NP_001822.3(2018年9月23日发布)的Apo J前原蛋白序列的第86、103、145、291、317、354和374位处的每个Asn处被糖基化的单一类型的Apo J-Glyc。

在一个优选实施方案中，根据本发明的本方面应用的ApoJ-Glyc是从如上所述的人血浆中纯化的。在另一个优选实施方案中，根据本发明应用的ApoJ-non Glyc是已在缺乏N型糖基化所需机制的生物体中重组产生的重组ApoJ。在一个优选实施方案中，ApoJ-非Glyc是重组来源的，其通过使用以下在大肠杆菌(E.coli)中表达获得：本领域公知的操作例如在Dabbs and Wilson(Plos One，9(1)：e86989.doi：10.1371/joumal.pone.0086989)中描述的那些，或者适合用于在大肠杆菌中表达重组蛋白的任何其他方法，如在Rosanoand Ceccarelli(Frontiers in Microbiology，2014，doi：10.3389/fmicb.2014.00172)中所述的。在一个实施方案中，ApoJ-非Glyc在使得分子在包涵体中表达的条件下在大肠杆菌中表达，在存在离液剂例如尿素和/或含二硫基团的试剂(例如DTT)的情况下将包涵体纯化并使蛋白质溶解。

在一个优选实施方案中，缺血损伤是由选自以下的病症引起的：梗死、动脉粥样硬化、血栓形成、血栓栓塞、脂质栓塞、出血、支架、手术、血管成形术、手术期间旁路结束、器官移植、完全缺血，及其组合。

在另一个优选实施方案中，缺血损伤是在选自以下的器官或组织中产生的：心脏、肝、肾、脑、肠、胰、肺、骨骼肌，及其组合。

在另一个优选实施方案中，缺血损伤选自包含以下的组：器官功能障碍(在缺血性器官或在任何其他器官中)、梗死、炎症(在受损器官或组织中)、氧化损伤、线粒体膜电位损伤、凋亡、再灌注相关心律失常、心脏顿抑、心脏脂毒性、缺血来源的瘢痕形成，及其组合。

在一个优选实施方案中，由缺血损伤引起的损伤是由脑缺血引起的。

在另一个优选实施方案中，由缺血引起的损伤是由心脏缺血引起的。在又一个更优选的实施方案中，心脏缺血是由心肌缺血或急性心肌缺血引起的。

在一个优选实施方案中，用于治疗缺血损伤的Apo J-Glyc在缺血期间施用。在另一个实施方案中，根据本发明应用的ApoJ-Glyc在缺血发作之后施用。

更优选地，根据本发明应用的Apo J-Glyc在可广泛变化的时间段内施用。在一个优选实施方案中，Apo J-Glyc在缺血发作之后至少1秒、至少5秒、至少10秒、至少15秒、至少30秒或至少45秒，优选在缺血发作之后至少1分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、45分钟，或者甚至在缺血发作之后至少1小时、2小时或3小时，或者甚至更靠后施用。

在一个优选实施方案中，用于治疗缺血损伤的Apo J-Glyc以治疗有效量施用。

在一个实施方案中，用于治疗缺血损伤的Apo J-Glyc和/或非Glyc-Apo J在缺血期间施用。在一个优选实施方案中，根据本发明应用的Apo J-Glyc和/或非Glyc-Apo J在缺血发作之后施用。

更优选地，根据本发明应用的Apo J-Glyc和/或非Glyc-Apo J在可广泛变化的时间段内施用。在一个优选实施方案中，其在缺血之后至少1秒、至少5秒、至少10秒、至少15秒、至少30秒或至少45秒时施用。在另一个优选实施方案中，在缺血之后至少1分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、45分钟时，或者甚至在缺血之后至少1小时、2小时或3小时，或者甚至更晚施用。

在一个优选实施方案中，根据本发明应用的Apo J-Glyc是从人血浆中纯化的。在另一个优选实施方案中，根据本发明应用的非Glyc-Apo J是人重组体。在另一个优选实施方案中，根据本发明应用的Apo J-Glyc是从人血浆中纯化的，并且非Glyc-Apo J是人重组体。

在一个优选实施方案中，用于治疗缺血损伤的Apo J-Glyc和/或非Glyc-Apo J以0.1mg/kg至2mg/kg的剂量范围施用。在一个更优选的实施方案中，Apo J-Glyc以0.1至0.2mg/kg、0.2至0.3mg/kg、0.3至0.4mg/kg、0.4至0.5mg/kg、0.5至0.6mg/kg、0.6至0.7mg/kg、0.7至0.8mg/kg、0.8至0.9mg/kg、0.9至1mg/kg、1至1.1mg/kg、1.1至1.2mg/kg、1.2至1.3mg/kg、1.3至1.4mg/kg、1.4至1.5mg/kg的剂量范围施用。在一些另外优选的实施方案中，Apo J-Glyc以0.1至1.4mg/kg、0.2至1.3mg/kg、0.3至1.2mg/kg、0.4至1.1mg/kg、0.5至1mg/kg、0.6至0.9mg/kg、0.7至0.8mg/kg的剂量范围施用。在又一个更优选的实施方案中，ApoJ-Glyc以0.5mg/kg的剂量施用。

在一个优选实施方案中，施用途径是静脉内。

在一个优选实施方案中，Apo J-Glyc或非Glyc-ApoJ以单剂量施用。本文中使用的“单剂量”是指以一剂/以一次/单途径/单接触点施用的物理上离散的单位Apo J-Glyc或非Glyc-ApoJ剂量。单剂量可每天施用一次或更多次。在一个具体实施方案中，单剂量每天施用一次。在另一个实施方案中，单剂量每天施用两次。例如，单剂量可被分成两个剂量并且每一半分剂量在一天中的不同时间施用于对象。

在一个优选实施方案中，Apo J-Glyc在缺血之后至少1秒，通常在缺血之后至少15秒、30秒或45秒，优选在缺血之后至少1分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、45分钟，或者甚至在缺血之后至少1小时、2小时或3小时，或者甚至更晚施用。

先前关于缺血损伤的预防所描述的所有术语和实施方案同样适用于本发明的该方面。

缺血再灌注损伤的治疗

本发明的作者还观察到，在缺血/再灌注的鼠模型中，相对安慰剂组而言，在缺血之后的早期阶段施用糖基化载脂蛋白J(Apo J-Glyc)或非糖基化载脂蛋白J(非Glyc-ApoJ)显著降低了梗死面积。因此，在另一方面中，本发明涉及用于治疗缺血再灌注损伤的糖基化载脂蛋白J(Apo J-Glyc)或非糖基化载脂蛋白J(非Glyc-Apo J)，其中Apo J-Glyc或非Glyc-Apo J在缺血发作之后和再灌注之前施用。

应理解，通过降低由缺血引起的损伤，根据本方面的糖基化载脂蛋白J(Apo J-Glyc)或非糖基化载脂蛋白J(非Glyc-Apo J)的施用的另外的优点在于其还导致由随后的再灌注引起的损伤降低。从而预防与再灌注相关的损伤。因此，在另一方面中，本发明涉及用于预防缺血再灌注损伤的糖基化载脂蛋白J(Apo J-Glyc)或非糖基化载脂蛋白J(非Glyc-Apo J)，其中Apo J-Glyc或非Glyc-ApoJ在缺血发作之后和再灌注之前施用。

本文中使用的术语“再灌注”涉及恢复缺血组织的血流。尽管血液再灌注对缺血组织具有明确益处，但已知再灌注本身会引发一连串的不良反应，反而损伤组织。

本文中使用的术语“缺血/再灌注损伤”，也称为“缺血/再灌注损伤(ischemia/reperfusion damage)”，涉及在缺血一段时间之后，当血液供应返回到器官或组织时引起的器官或组织损伤。缺血期间血液的氧和营养物的缺乏产生一种状况，其中循环的恢复通过诱导氧化应激导致炎症和氧化损伤，而不是恢复正常功能。与再灌注相关的氧化应激可对受影响的组织或器官造成损伤。缺血/再灌注损伤的生物化学特征在于：在缺血事件期间氧耗竭，随后复氧和在再灌注期间伴随产生活性氧类。

随缺血/再灌注发生的损伤是缺血期间积聚的物质与再灌注时递送的物质之间相互作用的结果。这些事件的基石是氧化应激，其定义为氧自由基与内源性清除系统之间的不平衡。结果是细胞损伤和死亡，其最初是局部的，但是如果炎症反应不受约束，则最终变成系统性的。

在一个实施方案中，糖基化载脂蛋白J(Apo J-Glyc)和/或非糖基化载脂蛋白J(非Glyc-Apo J)在缺血发作之后和再灌注之前施用。

在一个优选实施方案中，Apo J-Glyc是包含N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)残基的糖基化Apo J。在另一个优选实施方案中，Apo J-Glyc是包含N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)残基和唾液酸残基的糖基化Apo J。

在一个优选实施方案中，Apo J-Glyc在单个Asn残基处包含N-聚糖，所述Asn残基选自相对于NCBI数据库条目中定义的登录号为NP_001822.3(2018年9月23日发布)的Apo J前原蛋白序列的第86、103、145、291、317、354或374位处的Asn残基。在另一个优选实施方案中，糖基化Apo J在Apo J内的每个N-糖基化位点处，即在相对于NCBI数据库条目中定义的登录号为NP_001822.3(2018年9月23日发布)的Apo J前原蛋白序列的第86、103、145、291、317、354和374位处的每个Asn处均包含N-聚糖。在另一个实施方案中，糖基化Apo J在至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个或至少7个Asn残基处包含N-聚糖，所述Asn残基选自相对于NCBI数据库条目中定义的登录号为NP_001822.3(2018年9月23日发布)的ApoJ前原蛋白序列的第86、103、145、291、317、354或374位处的Asn残基。

在一个优选实施方案中，Apo J-Glyc是在单个Asn残基处被糖基化的单一类型的糖基化Apo J分子，所述Asn残基选自相对于NCBI数据库条目中定义的登录号为NP_001822.3(2018年9月23日发布)的Apo J前原蛋白序列的第86、103、145、291、317、354或374位处的Asn残基。在另一个优选实施方案中，Apo J-Glyc是糖基化Apo J分子的组合，其中每个分子可在选自相对于NCBI数据库条目中定义的登录号为NP_001822.3(2018年9月23日发布)的Apo J前原蛋白序列的第86、103、145、291、317、354或374位处的Asn残基的任何可能的位点处被糖基化。在另一个优选实施方案中，Apo J-Glyc是在Apo J内的每个N-糖基化位点处，即在相对于NCBI数据库条目中定义的登录号为NP_001822.3(2018年9月23日发布)的Apo J前原蛋白序列的第86、103、145、291、317、354和374位处的每个Asn处被糖基化的单一类型的糖基化Apo J。

非糖基化Apo J在相对于NCBI数据库条目中定义的登录号为NP_001822.3(2018年9月23日发布)的Apo J前原蛋白序列的第86、103、145、291、317、354和374位处的任何Asn残基处均不包含N-聚糖。

在一个优选实施方案中，根据本发明的本方面应用的Apo J-Glyc是从人血浆中纯化的。根据本发明的本方面应用的另一优选的非糖基化Apo J是人重组体。

在一个优选实施方案中，缺血/再灌注损伤是由选自以下的病症引起的：梗死、动脉粥样硬化、血栓形成、血栓栓塞、脂质栓塞、出血、支架、手术、血管成形术、手术期间旁路结束、器官移植、完全缺血，及其组合。

在另一个优选实施方案中，缺血/再灌注损伤是在选自以下的器官或组织中产生的：心脏、肝、肾、脑、肠、胰、肺、骨骼肌，及其组合。

在另一个优选实施方案中，缺血/再灌注损伤选自包含以下的组：器官功能障碍、梗死、炎症、氧化损伤、线粒体膜电位损伤、凋亡、再灌注相关心律失常、心脏顿抑、心脏脂毒性、缺血来源的瘢痕形成，及其组合。

在一个实施方案中，由缺血/再灌注损伤引起的损伤是由脑缺血引起的。

在一个实施方案中，由缺血/再灌注引起的损伤是由心脏缺血引起的。在又一个更优选的实施方案中，心脏缺血是由心肌缺血引起的。

在一个优选实施方案中，心脏缺血是由急性心肌梗死引起的。

在一个优选实施方案中，用于预防缺血/再灌注损伤的Apo J-Glyc或非Glyc-ApoJ在缺血发作之后和再灌注之前施用。

用于预防缺血/再灌注损伤的Apo J-Glyc或非Glyc-Apo J的施用时刻没有特别限制，前提是其在再灌注开始之前施用。在一些优选实施方案中，Apo J-Glyc或非Glyc-Apo J在缺血之后至少1秒、至少5秒、至少10秒、至少15秒、至少30秒或至少45秒施用。在另一个优选实施方案中，在缺血之后至少1分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、45分钟，或者甚至在缺血之后至少1小时、2小时或3小时，或者甚至更晚施用。

在一个优选实施方案中，糖基化载脂蛋白J(Apo J-Glyc)和/或非糖基化载脂蛋白J(非Glyc-Apo J)以治疗有效量施用。

在一个优选实施方案中，用于预防缺血损伤的Apo J-Glyc以0.1mg/kg至1mg/kg的剂量范围施用。在一个更优选的实施方案中，Apo J-Glyc以0.1至0.2mg/kg、0.2至0.3mg/kg、0.3至0.4mg/kg、0.4至0.5mg/kg、0.5至0.6mg/kg、0.6至0.7mg/kg、0.7至0.8mg/kg、0.8至0.9mg/kg、0.9至1mg/kg的剂量范围施用。在又一个更优选的实施方案中，ApoJ-Glyc以0.5mg/kg的剂量施用。

合适的施用途径是已关于本发明的第一和第二方面如上限定的那些。

在一个优选实施方案中，施用途径是静脉内。

在一个优选实施方案中，根据本发明应用的Apo J-Glyc是从人血浆中纯化的。在另一个优选实施方案中，根据本发明应用的非Glyc-Apo J是人重组体。在另一个优选实施方案中，根据本发明应用的Apo J-Glyc是从人血浆中纯化的并且非Glyc-Apo J是人重组体。

在一个优选实施方案中，Apo J-Glyc或非Glyc-Apo J以单剂量施用。本文中使用的“单剂量”是指以一剂/以一次/单途径/单接触点施用的物理上离散的单位Apo J-Glyc或非Glyc-Apo J剂量。单剂量可每天施用一次或更多次。在一个具体实施方案中，单剂量每天施用一次。在另一个实施方案中，单剂量每天施用两次。例如，单剂量可被分成两个剂量并且每一半分剂量在一天中的不同时间施用于对象。

在一个优选实施方案中，Apo J-Glyc或非Glyc-Apo J在再灌注之前至少1秒，通常在再灌注之前至少15秒、30秒或45秒，优选在再灌注之前至少1分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、45分钟，或者甚至在再灌注之前至少1小时、2小时或3小时，或者甚至更早施用。

先前关于缺血损伤的预防所描述的所有术语和实施方案同样适用于本发明的该方面。

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下面通过以下实施例对本发明进行详细说明，这些实施例仅是举例说明性的并且决不限制本发明的范围。

材料和方法

啮齿动物福利

小鼠模型：11周龄的C3H雄性小鼠是从Janvier实验室(France)获得的。使动物适应一周并以不限量饮食喂养。遵循适当的动物护理规则和程序(Generalitat deCatalunya DOGC 2073，1995)并经动物测试伦理委员会批准。

大鼠模型：将成年Sprague Dawley大鼠用于静脉内施用蛋白质(约250mg重量)。根据标准程序使动物适应5天并以不限量饮食喂养。在动物测试伦理委员会批准之后，遵循适当的动物护理规则和程序。

啮齿动物麻醉

用氯胺酮-赛拉嗪(ketamine-xylazine)(100mg/kg和10mg/kg；I.P.)对动物进行深度麻醉并将丁丙诺啡作为镇痛药(0.075mg/kg)施用。之后，给动物插管并连接至具有20G套管的小鼠机械呼吸机(Inspira asv，Harvard Apparatus)。另外，在开胸(thoraxopening)之后在温度控制手术平台上获取每只动物的心电图(ECG，啮齿动物手术监视器，Indus Instruments)。

通过结扎左前降支冠状动脉的心肌缺血手术

在第四肋间间隙进行左开胸术，将肋骨用牵开器分离，用于显微手术。打开心包，确定左前降支动脉(LAD)并用7-0丝线结扎。

缺血小鼠模型

对小鼠进行45分钟的阻塞。为了避免脱水，用动物的皮肤和小夹具暂时闭合胸部。缺血45分钟之后，使用EDTA作为抗凝剂进行血液提取。最终，处死动物，取出心脏并浸入PBS中持续数分钟，并且将肝在-80℃下冷冻。

缺血/再灌注的小鼠模型

在缺血/再灌注模型中，在缺血之后45分钟逆转LAD并且恢复血流。两小时之后，再次结扎LAD，并用EDTA作为抗凝剂提取血液。随后，静脉内施用在0.9％NaCl中的1％伊文思蓝(Sigma-Aldrich，United States)以划定风险面积(area-at-risk，AAR)。如前所述，处死动物，取出心脏并浸入PBS中持续数分钟，并将肝在-80℃下冷冻。

缺血/再灌注的大鼠模型

在缺血/再灌注模型中，在缺血之后45分钟逆转LAD并且恢复血流。24小时之后，再次结扎LAD，并且用EDTA作为抗凝剂提取血液。随后，静脉内施用在0.9％NaCl中的1％伊文思蓝(Sigma-Aldrich，United States)以划定风险面积(AAR)。如前所述，处死动物，取出心脏并浸入PBS中持续数分钟，并且将肝在-80℃下冷冻。

产物施用

在初步小鼠研究中，在MI诱导之前5分钟施用Apo J-Glyc或非Glyc Apo J(3mg/kg，i.p.)。在临床前小鼠研究中，在缺血和缺血/再灌注模型二者中，在MI诱导之后10分钟，i.p.注射6mg/kg的每种处理。在大鼠研究中，静脉内施用(i.v.)0.75mg/kg。安慰剂组用相同体积的载剂(PBS)进行施用(在小鼠中i.p.并且在大鼠中i.v.)。

梗死面移测量

在初步小鼠研究中，通过免疫组织化学分析对梗死面积进行形态测定评估。在该过程之后，将小鼠心脏浸入固定液(4％多聚甲醛)中，嵌入OCT化合物中，并从尖(apex)至基底进行横切(10μm厚切片，相距200μm)。将切片用苏木精和伊红染色，并且由不知情且有经验的操作者使用图像分析软件(ImageJ，NIH)确定形态确定梗死面积分析。梗死面积通过切片之间心肌梗死面积的总和来计算，并表示为总LV壁表面的百分比。确定了每个切片的三个测量值。

在临床前小鼠研究和大鼠研究中，在该过程之后，将心脏在-80℃下冷冻五分钟，并用刀片获得1mm厚的切片。将样品与PBS中的1％TTC(四唑氯化物，Sigma-Aldrich，UnitedStates)在37℃下一起孵育15分钟。一旦染色，对样品的两侧进行拍照，并由不知情且有经验的操作者用ImageJ(NIH，Bethesda，MD，United States)对梗死面积进行量化。结果表示为梗死面积与左心室总面积的百分比。

风险面积(AAR)确定

在临床前小鼠研究和大鼠研究中，一旦染色，对样品的两侧进行拍照，并由不知情且有经验的操作者用ImageJ(NIH，Bethesda，MD，United States)对梗死面积(IS)进行量化。结果表示为涉及左心室的风险面积(AAR)百分比、梗死面积(IS)百分比和梗死面积/风险面积(IS/AAR)。

统计分析

通过夏皮罗-威尔克检验(Shapiro Wilk Test)测试数据正态性。在此之后，还进行了ANOVA事后比较分析(ANOVA；StatView，SAS Institute)。

实施例

实施例1.在缺血小鼠模型中，在心肌梗死之前用Apo J-Glyc处理降低了

心肌损伤：针对缺血性损伤的潜在预防作用。

在初步研究中，在MI诱导之前5分钟施用Apo J-Glyc或非Glyc Apo J(3mg/kg，i.p.)(图1，上图)。在缺血小鼠模型中，与经安慰剂处理的动物相比，Apo J-Glyc的施用能够预防心脏缺血性损伤，导致梗死面积平均降低17％(通过免疫组织化学分析评估的左心室百分比)。在施用非Glyc Apo J的情况下未观察到该作用(图2)。

另外，用商业ELISA试剂盒对总Apo J血清水平进行分析，显示Apo J循环水平显著提高(图3)。

实施例2.在缺血小鼠模型中，在缺血诱导之后用Apo J-Glyc和非Glyc Apo J处理降低了缺血性心脏损伤：针对缺血性损伤的潜在治疗性作用。

在缺血模型(图1，中图)中，在缺血诱导之后10分钟施用Apo J-Glyc或非Glyc ApoJ。缺血45分钟之后，进行血液提取，处死动物，取出心脏并在-80℃下冷冻。

在通过左前降支动脉结扎的急性心肌梗死鼠模型中，当在缺血之后早期施用时，用Apo J-Glyc或非Glyc Apo J(6mg/kg，i.p.)处理显著降低了梗死面积(相对于安慰剂组分别为15％和12％)(表1和图4)。

表1.-缺血发作之后10分钟i.p.施用6mg/kg的Apo J-Glyc/非Glyc Apo J之后缺血小鼠模型中的梗死面积。

实施例3.在缺血再灌注小鼠模型中，在缺血诱导之后用Apo J-Glyc和非Glyc ApoJ处理降低了缺血性心脏损伤：针对缺血再灌注损伤的潜在治疗性作用。

在缺血/再灌注模型(图1，下图)中，在缺血之后45分钟逆转LAD并且通过2小时再灌注恢复血流。在通过左前降支动脉结扎缺血45分钟和2小时再灌注的小鼠模型中，相对安慰剂组而言，在缺血之后的早期(缺血诱导之后10分钟)施用Apo J-Glyc或非Glyc Apo J显著降低了梗死面积，使得有效治疗缺血性心脏损伤并预防由再灌注诱导的进一步损伤。

表2.-在缺血发作之后10分钟i.p.施用6mg/kg的Apo J-Glyc/非Glyc ApoJ之后缺血/再灌注小鼠模型中的风险面积(AAR)、梗死面积(IS)和IS/AAR比例。

实施例4.在缺血再灌注大鼠模型中，在缺血诱导之后用Apo J-Glyc和非Glyc ApoJ处理降低了缺血性心脏损伤：针对缺血再灌注损伤的潜在治疗性作用。

在缺血/再灌注模型(图6)中，在缺血之后45分钟逆转LAD并且通过24小时再灌注恢复血流。当在缺血45分钟之后和再灌注24小时之前施用时，Apo J-Glyc或非Glyc Apo J的施用导致心脏缺血性损伤显著降低。该作用通过梗死面积(梗死面积(IS)与风险面积(AAR)的比例)的降低(图7)和左心室收缩末压(LVESP)的改善(图8)以及左心室舒张的改善(图9)得到证实。血浆心肌肌钙蛋白I水平在用Apo J-Glyc处理的大鼠中显著降低，但在接受非Glyc Apo J的大鼠中则没有(图10)。

实施例5.在缺血再灌注大鼠模型中，在心肌梗死之前用Apo J-Glyc和非Glyc ApoJ处理降低了心肌损伤：针对缺血再灌注损伤的潜在预防作用。

在缺血/再灌注模型(图11)中，在缺血之后45分钟逆转LAD并且通过24小时再灌注恢复血流。当在缺血45分钟之后和再灌注24小时之前施用时，Apo J-Glyc或非Glyc Apo J的施用导致心脏缺血性损伤的显著预防。该作用通过梗死面积(梗死面积(IS)与风险面积(AAR)的比例)的降低(图12)和左心室收缩末压(LVESP)的改善(图13)以及左心室舒张的改善(图14)得到证实。血浆心肌肌钙蛋白I水平在施用Apo J-Glyc和非Glyc Apo J之后均没有显著变化(图15)。

Claims (12)

1.糖基化载脂蛋白J(Apo J-Glyc)，其用于预防缺血损伤。

2.糖基化载脂蛋白J(Apo J-Glyc)或非糖基化载脂蛋白J(非Glyc Apo J)，其用于治疗缺血损伤。

3.糖基化载脂蛋白J(Apo J-Glyc)或非糖基化载脂蛋白J(非Glyc Apo J)，其用于治疗缺血再灌注损伤，其中所述Apo J-Glyc或所述非Glyc Apo J在缺血发作之后和再灌注之前施用。

4.根据权利要求1、2或3所述应用的糖基化Apo J，其中所述糖基化Apo J是包含N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)残基的糖基化Apo J或包含N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和唾液酸残基的糖基化Apo J。

5.根据权利要求1至4中任一项所述应用的糖基化Apo J，其中所述糖基化Apo J是通过从人血浆中纯化获得的。

6.根据权利要求1至4中任一项所述应用的糖基化载脂蛋白J(Apo J-Glyc)或非糖基化载脂蛋白J(非Glyc Apo J)，其中所述缺血损伤或缺血/再灌注损伤是由选自以下的病症引起的：梗死、动脉粥样硬化、血栓形成、血栓栓塞、脂质栓塞、出血、支架、手术、血管成形术、手术期间旁路结束、器官移植、完全缺血，及其组合。

7.根据权利要求1至6中任一项所述应用的糖基化载脂蛋白J(Apo J-Glyc)或非糖基化载脂蛋白J(非Glyc Apo J)，其中所述缺血损伤或缺血/再灌注损伤是在选自以下的器官或组织中产生的：心脏、肝、肾、脑、肠、胰、肺、骨骼肌，及其组合。

8.根据权利要求1至7中任一项所述应用的糖基化载脂蛋白J(Apo J-Glyc)或非糖基化载脂蛋白J(非Glyc Apo J)，其中所述缺血损伤或缺血/再灌注损伤选自包含以下的组：器官功能障碍、梗死、炎症、氧化损伤、线粒体膜电位损伤、凋亡、再灌注相关心律失常、心脏顿抑、心脏脂毒性、缺血来源的瘢痕形成，及其组合。

9.根据权利要求1至8中任一项所述应用的糖基化或非糖基化Apo J，其中所述缺血损伤或所述缺血/再灌注损伤是由脑缺血或心脏缺血引起的。

10.根据权利要求9所述应用的糖基化或非糖基化Apo J，其中所述心脏缺血是由急性心肌梗死(AMI)引起的。

11.根据权利要求1至10中任一项所述应用的糖基化或非糖基化Apo J，其中所述糖基化或非糖基化Apo J静脉内施用。

12.根据权利要求1至11中任一项所述应用的糖基化或非糖基化Apo J，其中所述糖基化或非糖基化Apo J以单剂量施用。

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