CN114514021A - 用于治疗非酒精性脂肪性肝病、免疫缺陷、男性不育症和血管疾病的swell1调节剂 - Google Patents

用于治疗非酒精性脂肪性肝病、免疫缺陷、男性不育症和血管疾病的swell1调节剂 Download PDF

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Abstract

本发明提供了使用SWELL1‑LRRC8调节剂和/或结合分子用于治疗用途，例如用于治疗非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、免疫缺陷和/或男性不育症和用于调控血管紧张度、全身动脉和/或肺动脉血压和/或血流量。

Description

用于治疗非酒精性脂肪性肝病、免疫缺陷、男性不育症和血管 疾病的SWELL1调节剂
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年6月10日提交的美国临时申请号62/859,606的优先权。以上引用的本申请的全部内容特此以引用的方式并入。
背景技术
非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是脂肪堆积在肝脏中的疾患。非酒精性脂肪性肝炎(NASH)是NAFLD的一种类型。患有NASH的患者具有炎症和肝细胞损伤，以及肝脏中的脂肪。
通常，非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)很少或没有引起症状。医生使用您的病史、体检和测试来诊断非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。测试可包括血液测试、成像测试，并且有时还包括肝活检。
医生可建议减肥来治疗非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。减肥可减少肝脏中的脂肪、炎症和纤维化。然而，尚没有药物被批准用于治疗NAFLD和NASH。因此，需要用于NAFLD和NASH的治疗。
正常人免疫系统发育需要正常的SWELL1功能。在一个实例中，由SWELL1的一个等位基因中的易位引起的截短的SWELL1蛋白的表达抑制正常B细胞发育，从而导致无丙种球蛋白血症5(AGM5)。(Sawada等人,J Clin Invest.2003年12月；112(11):1707-13)因为不同类型的免疫系统细胞(例如B淋巴细胞和T淋巴细胞)使用相似的细胞内信号传导途径，因此可能其他免疫系统细胞(例如T淋巴细胞、巨噬细胞和/或NK细胞)的发育和/或功能也将受到SWELL1表达或功能不足的影响。目前，尚没有药物被批准用于治疗丙种球蛋白血症5和许多其他免疫系统细胞功能缺陷。
目前，男性不育的分子原因仅被部分了解。在缺乏SWELL1的小鼠中，晚期精细胞在发育成精子期间未能减少其细胞质，并且具有紊乱线粒体鞘与成角鞭毛，从而导致精子活力降低。这表明SWELL1也是正常精细胞发育和男性生育能力所需的。(Lück等人,J BiolChem.2018年7月27日；293(30):11796-11808)
发明内容
因此，某些实施方案提供用于预防和/或治疗需要这种疗法的患者的非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的SWELL1调节剂。
某些实施方案提供了SWELL1调节剂用于预防和/或治疗非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的用途。
某些实施方案提供了一种用于调节需要这种治疗的患者中的血管紧张度、全身动脉和/或肺动脉血压和/或血流量的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的SWELL1调节剂。
某些实施方案提供了SWELL1调节剂用于调控血管紧张度、全身动脉和/或肺动脉血压和/或血流量的用途。
某些实施方案提供了一种用于预防和/或治疗需要这种疗法的患者的丙种球蛋白血症或其他免疫缺陷的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的SWELL1调节剂。
某些实施方案提供了SWELL1调节剂用于预防和/或治疗丙种球蛋白血症或其他免疫缺陷的用途。
某些实施方案提供了一种用于预防和/或治疗需要这种疗法的患者的男性不育症的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的SWELL1调节剂。
某些实施方案提供了SWELL1调节剂用于预防和/或治疗男性不育症的用途。
附图说明
图1a-1g.ICl,SWELL和SWELL1蛋白在T2Dβ细胞和脂肪细胞中减少。a-b.在基线(iso，黑色迹线)和；低渗刺激(hypo，红色迹线)情况下在非T2D和T2D小鼠(a)和人(b)β细胞中测量的ICl,SWELL的电流-电压图。c-d.来自非T2D(n＝3个细胞)和T2D(n＝6个细胞)小鼠(c)以及非T2D(n＝6个细胞)和T2D(n＝22个细胞)人(d)β细胞的在+100和-100mV下的平均内向和外向ICl,SWELL电流密度。e.从瘦#(n＝7个细胞)、肥胖非T2D#(n＝13个细胞)和T2D患者(n＝5个细胞)的内脏脂肪分离的脂肪细胞的在+100和-100mV下的平均内向和外向ICl,SWELL电流密度。f.检测从多基因T2D KKAy小鼠(12月龄)分离的腹股沟脂肪组织中的SWELL1蛋白表达的蛋白质印迹，分别与其对照品系KKAa(12月龄)和野生型C57BL/6小鼠(14月龄)进行比较。g.比较分别从瘦、肥胖非T2D和肥胖T2D患者分离的内脏脂肪组织中的SWELL1蛋白表达的蛋白质印迹。#来自瘦和肥胖非T2D脂肪细胞的数据从Zhang,Y等人(2017)中的之前报告数据重新绘制以进行比较。数据呈现为平均值±SEM。在c和d中使用双尾未配对t检验。在e中使用双尾排列t检验组比较。*和**分别表示p<0.05和p<0.01。
图2a-2k.SWELL1蛋白表达调控胰岛素刺激的PI3K-AKT2-AS160信号传导。a.检测野生型(WT，黑色)、SWELL1敲除(KO，红色)以及KO(KO+SWELL1 O/E，蓝色)3T3-F442A脂肪细胞(左)中SWELL1的腺病毒过表达中用0和10nM胰岛素刺激15分钟情况下SWELL1、pAKT2、AKT2和β-肌动蛋白的水平的蛋白质印迹。pAKT2/β-肌动蛋白的相应密度计量比显示在右侧(对于每种条件，n＝3个独立实验)。b.来自WT(黑色，n＝5个细胞)、KO(红色，n＝4个细胞)和KO+SWELL1 O/E(蓝色，n＝4个细胞)3T3-F442A前脂肪细胞的在+100和-100mV下的平均内向和外向电流密度。c-d.比较野生型(WT，黑色)和WT(WT+SWELL1 O/E，蓝色)3T3-F442A脂肪细胞中SWELL1过表达中用0和10nM胰岛素刺激情况下SWELL1、pAKT2、AKT2和β-肌动蛋白(c)以及pAS160、AS160和β-肌动蛋白(d)的水平的蛋白质印迹(对于每种条件，n＝6个独立实验)。pAKT2/β-肌动蛋白和总AKT2的相应密度计量比显示在(c)中右侧，并且pAS160/β-肌动蛋白(右上)和总AS160(右下)显示在(d)中。e)源自冷冻电子显微镜(EM)和X射线晶体学结构(PDB ID:6G90#)的同质型小鼠LRRC8a/SWELL1的卡通模型以及显示源自DCPIB结合的SWELL1冷冻-EM结构(PDB ID:6NZW$)(底部)和Smod1/DCPIB的化学结构(顶部)的孔区域中结合的Smod1/DCPIB的插图(出于描述目的显示为二聚体)。f)在HEK细胞中在低渗刺激和随后的10μM Smod1抑制后，随时间推移的ICl,SWELL内向和外向电流。g)检测WT 3T3-F442A前脂肪细胞中用0、3和10nM胰岛素刺激情况下SWELL1、pAKT2和β-肌动蛋白的水平的蛋白质印迹(对于每种条件n＝2个独立实验，顶部)以及SWELL1/β-肌动蛋白和pAKT2/β-肌动蛋白的相应密度计量比(底部)；h)在WT和KO 3T3-F442A脂肪细胞中在0和10nM胰岛素情况下SWELL1、pAKT2、AKT2和β-肌动蛋白(对于每种条件，n＝6个独立实验)以及SWELL1/β-肌动蛋白(i)和分别pAKT2/β-肌动蛋白(顶部)和pAKT2/AKT2(底部)(j)生物相应密度计量比；k)WT 3T3-F442A脂肪细胞中在0和10nM胰岛素情况下的pAS160、AS160和β-肌动蛋白(对于每种条件，n＝3个独立实验，左)以及在媒介物或Smod1中孵育96小时的pAS160/AS160(右)的相应密度计量比。所有密度计量都针对WT 3T3-F442A前脂肪细胞/脂肪细胞的0nM胰岛素的值归一化，除了底图j)，其中pAKT2/AKT2归一化分别针对WT的0nM胰岛素和KO的0nM胰岛素进行，这是由于WT和KO中总AKT2的差异表达。#Deneka等人(2018)和$Kern等人(2019)。数据呈现为平均值±SEM。双尾未配对t检验用于a-d、g和i-k中，其中*、**和***分别表示p<0.05、p<0.01和p<0.001。
图3a-3m.Smod1通过增强胰岛素敏感性和分泌来诱导SWELL1并改善鼠T2D模型中的全身葡萄糖内稳态。a.检测用媒介物或Smod1(5mg/kg i.p.x 3-6天，如图4e中所述)治疗的高脂肪饮食(HFD)持续21周的C57BL/6小鼠内脏脂肪中的SWELL1蛋白表达的蛋白质印迹，以及SWELL1/β-肌动蛋白的相应密度计量比(右)(每组中n＝6只小鼠)。b.与未治疗的对照KKAa和野生型C57/B6小鼠相比，比较用Smod1(5mg/kg i.p每天x 14天)治疗的多基因T2DKKAy小鼠的腹股沟脂肪组织中的SWELL1蛋白表达的蛋白质印迹。c.用媒介物或Smod1(5mg/kg i.p)治疗10天(在每组中n＝7只小鼠)的HFD持续8周的C57BL/6小鼠的葡萄糖耐受性测试(GTT)和胰岛素耐受性测试(ITT)。d-f.在Smod1(5mg/kg ip)治疗4天之前和之后多基因T2D KKAy小鼠(n＝6)的空腹血糖水平(d)、GTT(e)和ITT(f)，与其对照品系KKAa(n＝3)进行比较。g-h.用媒介物或Smod1(5mg/kg i.p)治疗6天的常规饲料喂养的瘦小鼠的空腹血糖水平(g)和相应的GTT(h)(在每组中n＝6)。i-j.用媒介物或Smod1(5mg/kg i.p)治疗的HFD-T2D小鼠的空腹血糖水平(i)以及GTT(16周HFD，4天治疗)和ITT(18周HFD，4天治疗)(j)。k.腹膜内注射葡萄糖(0.75g/kg BW)后，用媒介物(n＝3)或Smod1(n＝4，5mg/kg i.p)治疗的HFD-T2D小鼠(HFD 18周，治疗4天)血浆中的相对胰岛素分泌。l-m.来自从用媒介物(n＝3只小鼠，和3个实验重复)或Smod1(n＝3只小鼠，和2个实验重复，5mg/kg ip)治疗的HFD-T2D小鼠(21周时间点)(l)和从用媒介物或Smod1治疗的多基因T2D KKAy小鼠(5mg/kg i.p持续6天，每组中n＝3只小鼠，3个实验重复)(m)分离的胰岛的葡萄糖刺激胰岛素分泌(GSIS)灌注测定；以及分别在右侧上的它们的相应曲线下面积(AUC)比较。数据呈现为平均值±SEM。在a、g、i、l和m中使用双尾未配对t检验。在d中使用配对t检验。在k中进行配对(组内)和未配对(组间)t检验。双因素ANOVA用于c、e、f、h和j。统计显著性由*、**和***表示，分别表示p<0.05、p<0.01和p<0.001。
图4a-4i.Smod1改善鼠T2D模型中的全身胰岛素敏感性、组织葡萄糖摄取和非酒精性脂肪性肝病。a.用媒介物(n＝7)或Smod1(n＝8)治疗4天的KKAy小鼠的血糖正常性高胰岛素血症性钳夹期间的平均葡萄糖输注塑料。b.用媒介物或Smod1治疗的KKAy小鼠的基线和血糖正常性高胰岛素血症性钳夹期间的肝葡萄糖产生(每组中n＝9)。c.用媒介物或Smod1治疗的KKAy小鼠(每组中n＝9)的追踪钳夹期间，从脂肪(iWAT、gWAT)和心脏中的2-DG摄取确定的葡萄糖摄取。d.在KKAy小鼠钳夹期间从肝脏(对于媒介物n＝9，并且对于Smod1 n＝8)、脂肪(iWAT，n＝7媒介物和n＝6Smod1)和腓肠肌(n＝7媒介物和n＝6Smod1)中的2-DG摄取确定的葡萄糖摄取为糖原。e.在HFD喂养期间注射了媒介物或Smod1(每组中n＝6)的C57BL/6小鼠的治疗方案的示意性图示。f.在媒介物或Smod1(5mg/kg i.p.)的慢性间歇性治疗后HFD-T2D小鼠的肝脏质量(左)和归一化的与体重的比率(右)。g-i.相应的苏木精-伊红染色的肝脏切片(g)、肝脏甘油三酯(每组中6只小鼠)(h)，以及基于肝细胞脂肪变性、炎症和气球样变的相应NAFLD活性得分(NAS)(i)。数据呈现为平均值±SEM。双尾未配对t检验用于a-d、f、h和i中。统计显著性由*、**和***表示，分别表示p<0.05、p<0.01和p<0.001。比例尺-100μm。
图5A-5C.脂肪细胞SWELL1缺失(Adipo KO)限制高脂肪高蔗糖饮食(58％kcal脂肪，18％蔗糖，27周)下肥胖症背景下的脂肪过多，并且加剧非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)。a)附睾(eWAT)和腹股沟(iWAT)脂肪垫的代表性图像(左)。用高脂肪/高蔗糖(HFHS)饮食喂养27周的WT(n＝10)和Adipo KO(n＝8)小鼠的总脂肪垫重量和脂肪垫相对于体重的比率(右)。b)从WT(顶部)和Adipo KO(底部)解剖的肝脏组织的代表性图像。相应的总肝脏质量和肝脏质量相对于体重的比率。c)WT和Adipo KO小鼠的苏木精和伊红(H&E)染色的肝脏切片的代表性图像以及从H和E切片估计的肝脏脂肪变性。比例尺：100μm。
图6A-6C.脂肪细胞SWELL1缺失(Adipo KO)限制短期高脂肪饮食(60％kcal脂肪，8周)中的脂肪过多，并且易患非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)。a)用高脂肪饮食喂养8周的WT和Adipo KO(n＝7每组)小鼠的总体重。b)解剖的附睾(eWAT)和腹股沟(iWAT)脂肪垫的总质量及其相应的总脂肪垫重量和脂肪垫相对于体重的比率。c)分别从WT和Adipo KO小鼠解剖的总肝脏质量和肝脏质量相对于体重的比率。
图7A-7C.脂肪细胞SWELL1缺失(Adipo KO)限制长期高脂肪饮食(60％kcal脂肪，19周)中的脂肪过多，并且易患非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)。a)用高脂肪饮食喂养19周的WT(n＝7)和Adipo KO(n＝6)小鼠的总体重。b)解剖的附睾(eWAT)和腹股沟(iWAT)脂肪垫的总质量及其相应的总脂肪垫重量和脂肪垫相对于体重的比率。c)分别从WT和Adipo KO小鼠解剖的总肝脏质量和肝脏质量相对于体重的比率。
图8.SWELL1蛋白随着年龄增长而减少。比较分别从用常规饲料喂养的年幼(2月龄，雌性)和年老(18月龄，雌性)C57BL/6小鼠分离的附睾脂肪组织中的SWELL1蛋白表达的蛋白质印迹的代表性图像。
图9a-9d.脂肪细胞SWELL1缺失(Adipo KO)限制随着年龄增长(常规饲料，18月龄)的脂肪过多，并且易患非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)。a)用常规饲料喂养18个月的WT(n＝15)和Adipo KO(n＝11)小鼠的总体重。b)解剖的附睾(eWAT)和腹股沟(iWAT)脂肪垫的总质量及其相应的总脂肪垫重量和脂肪垫相对于体重的比率。c)分别从WT和Adipo KO小鼠解剖的总肝脏质量和肝脏质量相对于体重的比率。d)WT和Adipo KO小鼠的苏木精和伊红(H&E)染色的肝脏切片的代表性图像以及从H和E切片估计的它们的相应肝脏脂肪变性。比例尺：100μm。
图10A-10E.图10描绘的结果证明SWELL1是人脐静脉内皮细胞中的显著VRAC电流所必需。图10A，Ad-shSCR和Ad-shSWELL1转导的HUVEC中内源性SWELL1的蛋白质印迹。图10B，SWELL1免疫荧光染色。图10C，响应于从-100至+100mV的电压阶跃，SWELL1介导VRAC。图10D，shSCR和shSWELL1转导的HUVEC中的电流-电压关系。图10E，-100mV和+100mV下的平均电流密度。
图11A-11B.图11描绘的结果证明SWELL1是内皮中胰岛素-PI3K、ERK信号传导所必需的。
图12A-12K.图12描绘6小时胰岛素刺激内的时程实验结果。
图13A-13K.图13描绘的结果证明，超过内源性SWELL1蛋白水平的过表达SWELL1足以增加HUVEC中胰岛素刺激的pAKT、eNOS、p-eNOS和pERK(MAP激酶信号传导)，同时减少p-p70、pS6核糖体蛋白(mTOR信号传导)。
图14A-14B.图14描绘的结果证明SWELL1存在于包含GRB2、Cav1和eNOS的信号传导复合物中。
图15A-15B.图15描绘的结果证明SWELL1调控HUVEC中的拉伸依赖性AKT和ERK1/2信号传导。
图16A-16C.图16描绘的结果是，与对照相比，SWELL1 KD HUVEC显著大4倍(图7A)并且在划痕测定中迁移快>5倍(图7B)。相反，SWELL1过表达使迁移速率显著减慢至对照水平(图7C)。
图17A-17B.图17描绘的结果表明SWELL1可通过mTOR信号传导调控血管生成。
图18.图18描绘的结果是，与对照相比，SWELL1 KD HUVEC的全基因组转录组分析(RNA测序)揭示调控血管生成、迁移和肿瘤发生的多种途径，包括GADD45、IL-8、p70S6K、TREM1、血管生成素和HGF信号传导。
图19.图19描绘与eSWELL1 KO小鼠中的内皮功能障碍和血管松弛受损、从而导致收缩期高血压的倾向一致的结果。
图20.图20描绘的结果是，在以HFHS饮食饲养的小鼠中，与WT小鼠相比，eSWELL1KO小鼠的视网膜血流量受损更严重，具有显著局灶性和弥漫性视网膜血管变窄，并且与雄性小鼠相比，雌性小鼠的情况明显更糟。还证明SWELL1对内皮中的胰岛素AKT、eNOS、ERK和mTOR信号传导是必要且足够的，并且这种信号传导与SWELL1介导的质膜VRAC活性无关。
图21a-21e.具有C末端3XFlagtag的全长SWELL1的瞬时表达挽救ICl,SWELL且运输至质膜。
a-c.分别在基线(iso，黑色迹线)和低渗(hypo，红色迹线)刺激在3T3-F442A前脂肪细胞WT(a)、KO(b)和KO(KO+SWELL1 O/E)中SWELL1的腺病毒过表达(c)中测量的ICl,SWELL的电流-电压图。d.展示用抗Flag或抗SWELL1抗体定位内源性SWELL1或过表达的SWELL1的免疫染色图像(比例尺–20μm)。e.与SWELL1 KO前脂肪细胞相比，WT 3T3-F442A中SWELL1抗体的验证(比例尺–20μm)，从而揭示内源性SWELL1定位的点状模式(插图)。
图22a-22d.Smod1不会在瘦非T2D小鼠中引起低血糖症，并且在长期治疗的鼠T2D中维持血糖正常，而没有明显的毒性迹象。用媒介物或Smod1(5mg/kg ip)治疗10天的常规饲料的C57BL/6瘦小鼠的空腹血糖水平(a)、GTT(b)和ITT(c)(每组中n＝7只雄性)。d.用媒介物(n＝5只雄性)或Smod1(5mg/kg i.p，n＝4只雄性)治疗8周的HFD-T2D小鼠(8周HFD)的GTT。数据呈现为平均值±SEM。在a中使用双尾未配对t检验。双因素ANOVA用于b-d。统计显著性由*、**和***表示，分别表示p<0.05、p<0.01和p<0.001，并且‘ns’表示差异不显著。
图23.Smod1在急性治疗时不会诱发高血糖症。注射媒介物或Smod1(5mg/kg i.p)后禁食6小时(0分钟)和30分钟后，1个月HFD喂养的C57BL/6小鼠的空腹血糖水平(每组中n＝8只雄性)。数据呈现为平均值±SEM。双尾未配对t检验用于测量。统计显著性由*、**和***表示，分别表示p<0.05、p<0.01和p<0.001，并且‘ns’表示差异不显著。
图24.Smod1不影响棕色脂肪和骨骼肌中的葡萄糖摄取。葡萄糖摄取由用媒介物或Smod1(每组中n＝9，5mg/kg i.p)治疗4天的KKAy小鼠的钳夹下收获的棕色脂肪、趾长伸肌(EDL)、比目鱼肌和腓肠肌中的2-DG摄取确定。数据呈现为平均值±SEM。双尾未配对t检验用于分析。并且‘ns’表示差异不显著。
图25.Smod1改善鼠T2D模型中的非酒精性脂肪性肝病。如图图4e所示，用媒介物或Smod1(5mg/kg i.p)治疗的HFD-T2D小鼠的苏木精和伊红染色的肝脏组织学切片的图像。比例-(10X:100μm和20X:50μm)。
具体实施方式
因此，某些实施方案提供用于预防和/或治疗需要这种疗法的患者的非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的SWELL1调节剂。
某些实施方案提供了SWELL1调节剂用于预防和/或治疗非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的用途。
某些实施方案提供了一种用于调节需要这种治疗的患者中的血管紧张度、全身动脉和/或肺动脉血压和/或血流量的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的SWELL1调节剂。
在某些实施方案中，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的SWELL1调节剂以调控血管紧张度。
在某些实施方案中，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的SWELL1调节剂以调控全身动脉和/或肺动脉血压。
在某些实施方案中，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的SWELL1调节剂以调控血流量。
某些实施方案提供了SWELL1调节剂用于调控血管紧张度、全身动脉和/或肺动脉血压和/或血流量的用途。
某些实施方案提供了一种用于预防和/或治疗需要这种疗法的患者的丙种球蛋白血症或其他免疫缺陷的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的SWELL1调节剂。
某些实施方案提供了SWELL1调节剂用于预防和/或治疗丙种球蛋白血症或其他免疫缺陷的用途。
某些实施方案提供了一种用于预防和/或治疗需要这种疗法的患者的男性不育症的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的SWELL1调节剂。
某些实施方案提供了SWELL1调节剂用于预防和/或治疗男性不育症的用途。
在某些实施方案中，SWELL1调节剂是DCPIB、克罗米芬、萘福昔定或他莫昔芬。
在某些实施方案中，SWELL1调节剂是DCPIB。
在某些实施方案中，SWELL1调节剂是式I化合物或其盐
Figure BDA0003498502270000111
Figure BDA0003498502270000121
其中：
X1a和X2a独立地是卤基；
R1a是C1-6烷基、3-6元环烷基或苯基，其中所述C1-6烷基任选地被3-6元环烷基取代；
R2a是氢或C1-6烷基，其中C1-6烷基任选地被羧基取代；并且
R3a是C1-6烷基。
在某些实施方案中，SWELL1调节剂是式II化合物或其盐
Figure BDA0003498502270000122
其中：
R1b是氢、卤基或甲氧基；
R2b中仅一个是–O(CH2)n-NR3bR4b；
另一个R2b是氢、卤基或甲氧基；
R3b和R4b中的每一个独立地是H或C1-6烷基，或者R3b和R4b与它们所连接的氮一起形成氮杂环丙烷子基、氮杂环丁烷子基、吗啉代、哌嗪子基、吡咯烷子基或哌啶子基；
n是2至4的整数；并且
X是卤基。
在某些实施方案中，SWELL1调节剂是式III化合物或其盐
Figure BDA0003498502270000131
其中：
R1c和R2c中的每一个独立地是H或C1-8烷基，或者R1c和R2c与它们所连接的氮一起形成氮杂环丙烷子基、氮杂环丁烷子基、吗啉代、哌嗪子基、吡咯烷子基或哌啶子基；其中所述氮杂环丙烷子基、氮杂环丁烷子基、吗啉代、哌嗪子基、吡咯烷子基或哌啶子基任选地被一个或多个C1-6烷基取代；
m是2至6的整数，
R3c是C1-C8烷氧基；并且
p是1至4的整数。
在某些实施方案中，SWELL1调节剂是式IV化合物或其盐
Figure BDA0003498502270000132
其中：
R1d和R2d中的每一个独立地是H或C1-6烷基，或者R1d和R2d与它们所连接的氮一起形成氮杂环丙烷子基、氮杂环丁烷子基、吗啉代、哌嗪子基、吡咯烷子基或哌啶子基；
R3d和R4d中的每一个独立地是芳基，所述芳基任选地被一个或多个选自C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6二烷基氨基或卤基的基团取代；
R5d是C1-6烷基或C1-6烯基，其中所述C1-6烷基任选地被芳基取代；并且
q是2至6的整数。
在某些实施方案中，SWELL1调节剂和/或SWELL1-LRRC8结合分子的施用或使用足以上调SWELL1的表达和/或SWELL1-LRRC8复合物的稳定性和/或组装和/或膜转运和/或SWELL1-LRRC8信号传导，或者改变SWELL1相关蛋白(例如，LRRC8b、c、d、e、GRB2、Cav1、IRS1或IRS2)的表达和/或相关。
在某些实施方案中，SWELL1调节剂的施用或使用足以上调SWELL1的表达。
在某些实施方案中，SWELL1-LRRC8调节剂是DCPIB、克罗米芬、萘福昔定或他莫昔芬。
在某些实施方案中，SWELL1-LRRC8调节剂是SWELL1抑制剂。
在某些实施方案中，SWELL1-LRRC8调节剂是SWELL1活化剂。
在某些实施方案中，SWELL1-LRRC8调节剂是SWELL1结合分子或蛋白质。
在某些实施方案中，SWELL1-LRRC8调节剂使SWELL1-LRRC8组装和转运至质膜稳定。
在某些实施方案中，SWELL1-LRRC8调节剂增加SWELL1-LRRC8信号传导。
在某些实施方案中，SWELL1-LRRC8调节剂是DCPIB。
在某些实施方案中，SWELL1调节剂的施用或使用足以上调SWELL1蛋白的表达。
在某些实施方案中，SWELL1-LRRC8调节剂或调节剂是DCPIB、克罗米芬、萘福昔定或他莫昔芬或调节SWELL1-LRRC8活性或表达水平的化合物。在某些实施方案中，所述化合物是式I、II、III或IV的化合物或其盐。
在某些实施方案中，SWELL1调节剂的施用或使用足以上调SWELL1和/或辅助蛋白(包括但不限于LRRC8b、LRRC8c、LRRC8d、LRRC8e、GRB2、Cav1、IRS1、IRS2)的表达、和/或组装和/或转运。
在某些实施方案中，SWELL1-LRRC8调节剂是式I、II、III或IV的化合物或其盐。
在某些实施方案中，调节剂改变泛连接蛋白通道活性、表达或功能，因为泛连接蛋白蛋白质与SWELL1/LRRC8蛋白同源。
脂肪组织的健康扩增对于维持代谢健康至关重要，以富含甘油三酯的脂蛋白的形式为能量储存提供优化的储库。事实上，不能有效储存脂质的功能失调的脂肪细胞可导致脂肪代谢障碍并导致非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)和代谢综合征。SWELL1(LRRC8a)是体积敏感性膜蛋白复合物的组分，其在脂肪细胞中高度表达，在肥胖情况下被诱导，并且在高脂肪喂养期间是正常脂肪细胞扩增所必需的。在此，表明脂肪细胞SWELL1是伴随高脂肪、高蔗糖饮食(HFHS，西方饮食)和衰老发生的脂肪细胞扩增所必需的。靶向脂肪的SWELL1 KO小鼠(Adipo KO)在高脂肪/高蔗糖饮食喂养时体重随时间推移轻微降低，并且年老小鼠的体重没有显著差异。类似地，通过NMR评估的总脂肪质量和脂肪百分比在肥胖小鼠中也略有减少，但在年老小鼠中则没有。然而，与HFHS喂养和年老小鼠的WT相比，Adipo KO小鼠的iWAT和eWAT贮库重量显著较低。年老和HFHS喂养的Adipo KO小鼠的肝脏质量显著增加，并且这与显著肝脂肪变性和NAFLD相关。这些数据强调脂肪细胞SWELL1对健康脂肪细胞扩增以防止在过度营养和衰老的情况下发生NAFLD的重要性。
脂肪组织的维持是能量内稳态的基本过程，并且尤其是在健康和患病状态环境中能量需求不断变化的环境中至关重要。在之前的工作中，发现了名为SWELL1(也称为LRRC8A)的新型跨膜蛋白，它是脂肪细胞中体积调控阴离子电流(VRAC)活动所必需的，充当脂肪细胞大小的传感器，并且是胰岛素敏感性所必需的。脂肪特异性SWELL1敲除(SWELL1KO)小鼠对胰岛素不敏感，并且与野生型(WT)对应物相比，在高脂肪饮食喂养的肥胖条件下，脂肪过多减少，从而表明SWELL1是脂肪扩增所必需的。然后，通过使WT和SWELL1 KO小鼠经受高脂肪/高蔗糖饮食持续27周来质疑在没有SWELL1的情况下过量脂肪是如何分布的。然后分离了组织，并且发现KO小鼠具有显著降低的脂肪含量(在eWAT和iWAT中分别降低41％和9％)，从而证实了之前的报告。令人感兴趣地，发现与WT相比，SWELL1 KO小鼠的肝脏质量增加32％，并且通过苏木精和伊红染色的组织学检查，与WT相比，SWELL1 KO肝脏表明更多的脂肪变性。这些数据表明，在肥胖条件下脂肪维持和扩增需要脂肪SWELL1，否则脂肪沉积机制失调并发展为非酒精性脂肪性肝病。
肥胖主要是由组成脂肪细胞的大量体积膨胀引起的。正是这种脂肪细胞大小的增加与代谢疾病密切相关，暗示了脂肪细胞中未被发现的体积感测信号传导分子的作用。将脂肪细胞膜片钳与shRNA和CRISPR/cas9介导的基因沉默相结合，表明SWELL1(LRRC8a)(含富含亮氨酸的重复序列的蛋白质家族的成员)在脂肪细胞中编码体积敏感性电流。SWELL1在肥胖情况下的肥大脂肪细胞中诱导和激活，并且是脂肪细胞肥大和葡萄糖摄取所必需的。此外，SWELL1通过C末端富含亮氨酸的重复结构域与GRB2/Cav1和PI3K-AKT途径路的相互作用调节脂肪细胞胰岛素信号传导。在体内，SWELL1敲低降低肥胖小鼠的脂肪细胞大小、脂肪质量并加剧葡萄糖耐受不良。这些研究将SWELL1鉴定为脂肪细胞大小的细胞自主传感器，其在肥胖情况下调控脂肪细胞生长、胰岛素敏感性和葡萄糖耐受性。
此外，来自胰腺β细胞的胰岛素分泌由通过电压门控Ca2+通道(VGCC)的钙流入起始以触发胰岛素囊泡与β细胞质膜融合。VGCC的发射取决于β细胞膜电位，而后者进而由去极化(兴奋性)和超极化(抑制性)离子电流的平衡介导。虽然很多注意力都集中在抑制性超极化钾电流上，但对使β细胞去极化所需的必要兴奋性电流知之甚少，包括这些兴奋性电流的分子特性。用于使电流去极化的一种候选物是被称为体积调控性阴离子电流(VRAC)或ICl,SWELL的氯离子电导。此处显示，使用shRNA和CRISPR/cas9基因沉默结合β细胞膜片钳，SWELL1(LRRC8a)介导β细胞中的ICl,SWELL。SWELL1介导的ICl,SWELL响应于低渗和葡萄糖刺激的β细胞肿胀而激活。SWELL1耗减完全破坏葡萄糖刺激和低渗肿胀介导的β细胞中VGCC依赖性细胞内钙信号传导的激活。最后，靶向SWELL1 KO MIN6细胞和β细胞的SWELL1 KO鼠胰岛表现出显著受损的葡萄糖刺激的胰岛素分泌，保留了胰岛素含量。这些结果揭示SWELL1作为葡萄糖传感器的生理作用——将葡萄糖介导的β细胞肿胀与VGCC触发的钙信号传导和胰岛素分泌的SWELL1依赖性激活相联系。这些发现强调SWELL1在肿胀介导的β细胞激活中的重要性，这是一种对葡萄糖刺激的胰岛素分泌重要的“肿胀-分泌”偶联形式。
脂肪细胞
脂肪细胞经过数亿年的优化，通过形成大的脂滴来最大化能量储存，脂滴与质膜仅被细胞质的薄边缘(约300nm)隔开，细胞核和其他细胞器被推到一边。脂肪细胞在其巨大的体积膨胀能力方面也是独一无二的，在肥胖的情况下增加30多倍，以适应丰裕时期不断膨胀的脂滴(Farnier等人,Int J Obes Relat Metab Disord,27,1178-1186(2003))。这些发现引出了一些令人感兴趣的问题：不断增长的脂滴能否与质膜机械相互作用以增加膜张力？脂肪细胞质膜内是否存在可向脂质生长途径发出信号的活跃的分子“拉伸”传感器？生物工程领域最近有几项研究将脂肪细胞脂滴膨胀与脂肪细胞硬度增加和膜顺应性降低联系起来(Shoham等人,Biophys J,106,1421-1431(2014))，除膜张力与成脂MAP激酶信号传导途径的激活之间的关系外(Shoham的人,Am J Physiol Cell Physiol,302,C429-441(2012)；Pellegrinelli等人,The Journal of pathology,233,183-195(2014))。此外，脂肪细胞大小与肥胖(与数量相反)和相关疾病(如糖尿病和胰岛素抵抗)的严重程度相关(Salans等人,J Clin Invest,47,153-165(1968)；Weyer等人,Diabetologia,43,1498-1506(2000)；Khan等人,Molecular and cellular biology,29,1575-1591(2009))。其他研究提出，小窝允许扩增脂肪细胞基于机械脂滴-质膜相互作用自动调控脂质含量，并响应于脂肪细胞肿胀调节胰岛素信号传导(Briand等人,Diabetes,63,4032-4044(2014)；Eduardsen等人,Cell Physiol Biochem,28,1231-1246(2011))。
离子通道是可响应于膜拉伸发出信号的膜蛋白。哺乳动物细胞中有许多候选拉伸/机械敏感离子通道，包括TRPM7、TRPV2、TRPV4、TRPC6和Piezo-1/Piezo-2。许多这些离子通道在脂肪细胞中表达，并且对于脂肪生成、脂肪酸感测、氧化代谢、炎症和能量内稳态具有重要的信号传导作用(Che等人,Pflugers Arch,466,947-959(2014)；Sukumar等人,CircRes,111,191-200(2012)；Ye等人,Cell,151,96-110(2012))。
如本文所述，通过将膜片钳技术应用于通过细胞内施加正压或通过低渗溶液渗透肿胀而机械肿胀的新鲜分离的成熟鼠和人脂肪细胞来探索脂肪细胞中肿胀激活的离子通道信号传导。使用这种方法，在由基因LRRC8a编码的脂肪细胞中发现了显著肿胀激活的氯粒子电流(SAC)，所述基因是含富含亮氨酸重复序列(LRR)的蛋白质的成员(Voss等人,Science,344,634-638(2014)；Qiu等人,Cell,157,447-458(2014))；由Qiu和同事更名为SWELL1。如本文所述，假设SWELL1可在生理或病理生理脂肪细胞扩增过程中感测脂肪细胞体积并参与胰岛素-PI3K-AKT信号传导，从而将脂肪细胞大小与生长和胰岛素敏感性结合起来。在本文中，体积敏感性SWELL1分子与脂肪细胞胰岛素信号传导、生长和全身葡萄糖内稳态有关。因此，提出了一种模型，其中SWELL1追踪脂肪细胞扩增，并相应地调节胰岛素介导的生长激活和葡萄糖输入途径。这一发现允许开发用于治疗非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的改进的方法。
肿胀激活的分子SWELL1在脂肪细胞中高度表达，在肥胖中脂肪细胞肥大的背景下被富集和激活，并且是通过LRRD介导的GRB2与胰岛素-PI3K-AKT2信号传导途径的相互作用维持脂肪细胞大小、胰岛素敏感性和葡萄糖内稳态所必需的。这些发现将体积敏感性分子SWELL1与脂肪细胞胰岛素-PI3K信号传导联系起来，并为脂肪细胞膜张力对脂肪生成和细胞内信号传导的影响提供分子机制。基于本文呈现的数据，提出了一种工作模型，其中在脂肪细胞肥大期间通过脂肪细胞体积的增加激活SWELL1，并且这通过C末端LRRD与GRB2-Cav1-IRS1-IR的相互作用增强胰岛素-PI3K-AKT2信号传导以支持胰岛素介导的葡萄糖输入和脂肪生成。在这种模型中，SWELL1感测脂肪细胞体积膨胀并充当前馈扩增子，以进一步促进脂肪细胞扩增、能量储存并在热量过量(进食)期间增强胰岛素敏感性。
虽然通过SWELL1构象变化或离子渗透将SWELL1介导的通道活性与其信号传导作用联系起来是诱人的，但不打算受此假设的限制，替代可能性是SWELL1富含亮氨酸的重复序列结构域(LRRD)提供对接表面进行蛋白质-蛋白质相互作用，并被动地促进胰岛素信号传导级联(GRB2)或其他信号传导途径的组分的关联。在这种情况下，SWELL1介导的通道激活与胰岛素-PI3K-AKT信号传导之间可能没有直接关系。此外，SWELL1与LRRC8b-e形成异源多聚体，这修饰通道门控，并且还可基于LRRC8b-e的相对丰度影响与不同蛋白质配偶体的分子相互作用的多样性。因此，有可能，取决于不同组织中LRRC8蛋白的表达谱，细胞内信号传导的SWELL1调节可以细胞类型依赖性方式变化。
有趣的观察结果是，尽管AKT1信号传导组成性增加，但SWELL1缺乏特异性地阻止胰岛素-PI3K-AKT2信号传导和葡萄糖摄取。事实上，细胞和体内表型两者与之前的AKT2选择性功能丧失研究(包括胰岛素抵抗、肥胖减少和葡萄糖耐受不良)完全一致。相反，AKT1对于维持葡萄糖内稳态不是必需的，而是生物体生长和发育所必需的。此外，最近的工作强调AKT2超过AKT1，这是肥胖情况下脂肪生成所必需的。因此，靶向SWELL1-PI3K-AKT2轴可代表在不改变脂肪组织发育的情况下特异性地调节AKT2对脂肪过度和胰岛素敏感性的影响的一种新方法。还需要进一步的分子研究来确定相对于AKT1信号传导的偏倚SWELL1-PI3K-AKT2机制。
LRRD介导的SWELL1-GRB2-Cav1分子相互作用将SWELL1与胰岛素-PI3K-AKT2信号传导连接起来与淋巴细胞中报告的SWELL1(LRRC8a)-GRB2-GAB2-LCK复合物一致，并且还为观察到的脂肪细胞SWELL1消融后胰岛素-PI3K-AKT2信号传导中的缺陷提供分子机制。同样，SWELL1-Cav1相互作用也引人注目，因为这将SWELL1定位于在脂肪细胞中丰富的小窝内，被认为形成胰岛素信号传导微结构域，并且是正常胰岛素和PI3K-AKT信号传导所必需的。事实上，就肥胖和胰岛素敏感性而言，HFD的Cav1 KO小鼠在表型上与AAV/Rec2介导的SWELL1 KD小鼠相似。
胰岛素刺激减少SWELL1-GRB2和Cav1-GRB2，但不会减少WT 3T3-F442A脂肪细胞中的SWELL1-Cav1相互作用。这表明胰岛素刺激诱导GRB2从胰岛素信号传导复合物中解离。奇怪的是，这种胰岛素介导的GRB2从Cav1解离在SWELL1消融后被消除，这意味着SWELL1可通过滴定GRB2与胰岛素信号传导复合物组分的相互作用来调节胰岛素信号传导。这一有趣的假设值得进一步研究。
B细胞
正常人免疫系统发育需要正常的SWELL1功能。在一个实例中，由SWELL1的一个等位基因中的易位引起的截短的SWELL1蛋白的表达抑制正常B细胞发育，从而导致无丙种球蛋白血症5(AGM5)。(Sawada等人,J Clin Invest.2003年12月；112(11):1707-13；Kubota等人,FEBS Lett.2004年4月23日；564(1-2):147-52)因为不同类型的免疫系统细胞(例如B淋巴细胞和T淋巴细胞)使用相似的细胞内信号传导途径，因此可能其他免疫系统细胞(例如T淋巴细胞、巨噬细胞和/或NK细胞)的发育和/或功能也将受到SWELL1表达或功能不足的影响。可增加SWELL1表达和/或功能的疗法可用于治疗由于基于SWELL1的异常免疫细胞发育和/或功能所致的免疫缺陷。
精子
目前，男性不育的分子原因仅被部分了解。在缺乏SWELL1的小鼠中，晚期精细胞在发育成精子期间未能减少其细胞质，并且具有紊乱线粒体鞘与成角鞭毛，从而导致精子活力降低。这表明SWELL1也是正常精细胞发育和男性生育能力所必需的。(Lück等人,J BiolChem.2018年7月27日；293(30):11796-11808)可增加SWELL1的表达或功能的疗法可用于治疗由于基于SWELL1的异常精子发育和/或功能所致的男性不育症。
SWELL1调节剂
本发明的实施方案涉及SWELL1调节剂用于治疗疾病如非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)和调控血管紧张度、全身动脉和/或肺动脉血压和/或血流量的用途。
DCPIB
DCPIB(4-[(2-丁基-6,7-二氯-2-环戊基-2,3-二氢-1-氧代基-1H-茚-5-基)氧基]丁酸)(一种选择性SWELL1抑制剂)是大鼠胰腺β细胞中的体积敏感性阴离子通道(VSAC)和各种心血管组织中的ICl,swell的有效和选择性抑制剂。DCPIB是在本发明的某些实施方案的实践中有用的SWELL1调节剂的实例。
Figure BDA0003498502270000221
其他SWELL1调节剂包括克罗米芬、萘福昔定和他莫昔芬以及如下所述的化合物或其盐。
因此，在某些实施方案中，SWELL1调节剂是式I化合物
Figure BDA0003498502270000222
其中：
X1a和X2a独立地是卤基；
R1a是C1-6烷基、3-6元环烷基或苯基，其中所述C1-6烷基任选地被3-6元环烷基取代；
R2a是氢或C1-6烷基，其中C1-6烷基任选地被羧基取代；并且
R3a是C1-6烷基；
或其药学上可接受的盐。
在某些实施方案中，所述化合物是下式化合物或其盐(参见：US 4,465,850)
Figure BDA0003498502270000231
在某些实施方案中，SWELL1调节剂是式II化合物
Figure BDA0003498502270000232
其中：
R1b是氢、卤基或甲氧基；
R2b中仅一个是–O(CH2)n-NR3bR4b；
另一个R2b是氢、卤基或甲氧基；
R3b和R4b中的每一个独立地是H或C1-6烷基，或者R3b和R4b与它们所连接的氮一起形成氮杂环丙烷子基、氮杂环丁烷子基、吗啉代、哌嗪子基、吡咯烷子基或哌啶子基；
n是2至4的整数；并且
X是卤基；
或其药学上可接受的盐。
在某些实施方案中，所述化合物是下式化合物或其盐(参见：US 2,914,563)
Figure BDA0003498502270000241
在某些实施方案中，SWELL1调节剂是式III化合物
Figure BDA0003498502270000242
其中：
R1c和R2c中的每一个独立地是H或C1-8烷基，或者R1c和R2c与它们所连接的氮一起形成氮杂环丙烷子基、氮杂环丁烷子基、吗啉代、哌嗪子基、吡咯烷子基或哌啶子基；其中所述氮杂环丙烷子基、氮杂环丁烷子基、吗啉代、哌嗪子基、吡咯烷子基或哌啶子基任选地被一个或多个C1-6烷基取代；
m是2至6的整数，
R3c是C1-C8烷氧基；并且
p是1至4的整数；
或其药学上可接受的盐。
在某些实施方案中，所述化合物是下式化合物或其盐。
(参见US 3,274,213)
Figure BDA0003498502270000251
在某些实施方案中，SWELL1调节剂是式IV化合物
Figure BDA0003498502270000252
其中：
R1d和R2d中的每一个独立地是H或C1-6烷基，或者R1d和R2d与它们所连接的氮一起形成氮杂环丙烷子基、氮杂环丁烷子基、吗啉代、哌嗪子基、吡咯烷子基或哌啶子基；
R3d和R4d中的每一个独立地是芳基，所述芳基任选地被一个或多个选自C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6二烷基氨基或卤基的基团取代；
R5d是C1-6烷基或C1-6烯基，其中所述C1-6烷基任选地被芳基取代；并且
q是2至6的整数；
或其药学上可接受的盐。
在某些实施方案中，所述化合物是下式化合物或其盐(参见：US 4,536,516)
Figure BDA0003498502270000261
如本文所用，“全身性递送”是指引起活性剂在生物体内的广泛生物分布的剂的递送。施用的一些技术可引起某些剂的全身性递送，但不会引起其他剂的全身性递送。全身性递送意指将有用量，优选地治疗量的剂暴露于身体的大多数部分。为了获得广泛生物分布，通常需要血液寿命，使得剂在到达远离施用部位的所需部位之前不会被快速降解或清除(如通过首过器官(肝脏、肺等)或通过快速非特异性细胞结合)。活性剂(例如，SWELL1调节剂)的全身性递送可通过本领域中已知的任何方式实现，包括例如静脉内、皮下和腹膜内。在优选的实施方案中，全身性递送通过静脉内递送实现。
如本文所用，“局部递送”是指直接向生物体内的靶部位递送活性剂如siRNA。例如，剂可通过直接注射至疾病部位、其他靶部位或靶器官如肝脏、心脏、胰腺、肾脏等中来局部递送。
术语“药学上可接受的载体、佐剂或媒介物”是指不会破坏与其一起配制的化合物的药理活性的无毒载体、佐剂或媒介物。可用于本发明的组合物中的药学上可接受的载体、佐剂或媒介物包括但不限于：离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白(如人血清白蛋白)、缓冲物质(如磷酸盐)、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐或电解质(如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐)、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、基于纤维素的物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物、聚乙二醇以及羊毛脂。
剂(例如，药物制剂)的“有效量”是指在必需剂量下并且持续必需的时间有效实现所需治疗或预防结果的量。在一些实施方案中，有效量是指SWELL1调节剂的量，其(i)治疗特定的疾病、疾患或病症；(ii)减弱、改善或消除特定疾病、疾患或病症的一种或多种症状；或(iii)预防或延缓本文所述的特定疾病、疾患或病症的一种或多种症状的发作。
“治疗(treatment)”(及变型如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指尝试改变受所治疗个体或细胞的自然进程的临床干预，并且可为了预防而实施或在临床病理学过程中实施。理想的治疗效果包括包括以下中的一者或多者：阻止疾病的发生或复发、缓解症状、消除疾病的任何直接或间接病理学结果、稳定(即，不恶化)疾病的状态、降低疾病进程的速率、改善或减轻疾病状态、与未接受治疗时的预期存活期相比延长存活期以及消退或改善预后。在某些实施方案中，SWELL1调节剂用于延缓疾病或病症的发展或者减缓疾病或病症的进展。需要治疗的那些个体包括已经患有疾患或病症的那些个体以及易于患有疾患或病症(例如，通过基因突变或者基因或蛋白质的异常表达)的那些个体或者其中要预防疾患或病症的那些个体。
如本文所用，“延迟疾病的进展”是指推迟、阻碍、减缓、延迟、稳定和/或推迟疾病(如非酒精性脂肪性肝病(NAFLD))的发展。取决于疾病史和/或治疗的个体，这种延缓可以有不同的时间长度。对本领域技术人员显而易见的是，足够或显著的延迟实际上可涵盖预防，因为个体不发展疾病。
本文进一步提供包含用于本文所述的方法中(例如治疗非酒精性脂肪性肝病(NAFLD))的包含SWELL1调节剂的药物组合物。在一个实施方案中，所述组合物还包含药学上可接受的载体、佐剂或媒介物。在另一个实施方案中，所述组合物还包含可有效可测量地抑制SWELL1、调节SWELL1活性或提高SWELL1表达水平或相关蛋白质配偶体的量的化合物。在某些实施方案中，所述组合物被配制用于施用至有需要的患者。
包含SWELL1调节剂或其盐的组合物可口服、胃肠外、通过吸入喷雾、局部、经皮、直肠、经鼻、经颊、舌下、阴道、腹膜内、肺内、皮内、硬膜外或通过植入的储库施用。如本文所用的术语“胃肠外”包括皮下、静脉内、肌肉内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内以及颅内注射或输注技术。
在一个实施方案中，包含SWELL1调节剂或其盐的组合物被配制成为用于口服施用的固体剂型。用于口服施用的固体剂型包括胶囊、片剂、丸剂、粉末和颗粒剂。在某些实施方案中，包含SWELL1调节剂或其盐的固体口服剂型还包含以下中的一者或多者：(i)惰性、药学上可接受的赋形剂或载体，如柠檬酸钠或磷酸二钙；和(ii)填充剂或增量剂，如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇或硅酸；(iii)粘合剂，如羧甲基纤维素、海藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖或阿拉伯胶；(iv)保湿剂，如甘油；(v)崩解剂，如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐或碳酸钠；(vi)溶解阻滞剂，如石蜡；(vii)吸收促进剂，如季铵盐；(viii)润湿剂，如鲸蜡醇或甘油单硬脂酸酯；(ix)吸收剂如高岭土或膨润土；和(x)润滑剂，如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、聚乙二醇或月桂基硫酸钠。在某些实施方案中，固体口服剂型被配制为胶囊、片剂或丸剂。在某些实施方案中，固体口服剂型还包含缓冲剂。在某些实施方案中，用于固体口服剂型的此类组合物可配制为软填充和硬填充明胶胶囊中的填充剂，所述胶囊包含一种或多种赋形剂，如乳糖(lactose)或乳糖(milk sugar)、聚乙二醇等。
在某些实施方案中，包含SWELL1调节剂或其盐的组合物的片剂、糖锭剂、胶囊、丸剂和颗粒剂任选地包含包衣或壳如肠溶包衣。它们可任选地包含乳浊剂并且也可具有仅在或优选在肠道的某一部分，任选地以延迟的方式释放活性成分的组合物。包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡，其也可用作使用此类赋形剂如乳糖(lactose)或乳糖(milk sugar)以及高分子量聚乙二醇等的软填充和硬填充明胶胶囊中的填充剂。
在另一个实施方案中，组合物包含微包封的SWELL1调节剂或其盐，并且任选地，还包含一种或多种赋形剂。
在另一个实施方案中，组合物包含用于口服施用的包含SWELL1调节剂或其盐的液体剂型制剂，并且任选地还包含一种或多种药学上可接受的乳液、微乳液、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂。在某些实施方案中，所述液体剂型任选地还包含以下中的一者或多者：惰性稀释剂如水或其他溶剂；增溶剂和乳化剂，如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(特别是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇或脱水山梨糖醇的脂肪酸酯，以及它们的混合物。在某些实施方案中，液体口服组合物任选地还包含一种或多种佐剂，如润湿剂、悬浮剂、甜味剂、调味剂和芳香剂。
可注射制剂，例如无菌可注射水性或油性悬浮液，可根据已知技术使用合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂来配制。无菌可注射制剂也可以是在胃肠外可接受的无毒稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液、混悬液或乳剂，例如，作为1,3-丁二醇中的溶液。可采用的可接受的媒介物和溶剂是水、林格氏溶液(U.S.P.)和等渗氯化钠溶液。此外，无菌的不挥发性油通常用作溶剂或悬浮介质。出于这一目的，可采用任何温和的不挥发性油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，脂肪酸如油酸用于制备可注射制剂。
可注射制剂可例如通过经由细菌滞留过滤器过滤，或通过并入呈无菌固体组合物形式的灭菌剂来灭菌，所述无菌固体组合物可在使用前溶解或分散于无菌水或其他无菌可注射介质中。
为了延长SWELL1调节剂的作用，通常需要减慢来自皮下或肌内注射的化合物的吸收。这可通过使用水溶性不良的结晶或非晶物质的液体悬浮液来实现。化合物的吸收速率则取决于其溶解速率，而溶解速率进而可取决于晶体大小和晶形。或者，胃肠外施用的化合物形式的延迟吸收通过将化合物溶解或悬浮于油性媒介物中来实现。可注射贮库形式是通过在可生物降解聚合物如聚丙交酯-聚乙交酯中形成化合物的微胶囊基质而制备。取决于化合物与聚合物的比率和所采用的特定聚合物的性质，可控制化合物的释放速率。其他可生物降解的聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。贮库式可注射制剂还通过将化合物包埋于可与身体组织相容的脂质体或微乳液中加以制备。
在某些实施方案中，用于直肠或阴道施用的组合物被配制为栓剂，其可通过将SWELL1调节剂或其盐与合适的非刺激性赋形剂或载体如可可脂、聚乙二醇或栓剂蜡混合来制备，例如在环境温度下为固体但在体温下为液体并且因此在直肠或阴道腔中融化并释放SWELL1调节剂的那些。
用于局部或经皮施用SWELL1调节剂的示例性剂型包括软膏、糊剂、乳膏、洗剂、凝胶、粉末、溶液、喷雾剂、吸入剂或贴剂。SWELL1调节剂或其盐在无菌条件下与药学上可接受的载体和任选的防腐剂或缓冲剂混合。另外的制剂实例包括眼用制剂、滴耳剂、滴眼剂、透皮贴剂。可通过将SWELL1调节剂或其盐溶解或分散在介质例如乙醇或二甲亚砜中来制备透皮剂型。还可使用吸收增强剂来增加穿过皮肤的化合物的通量。速率可通过提供速率控制膜或通过将化合物分散于聚合物基质或凝胶中来控制。
SWELL1调节剂或其盐的鼻气雾剂或吸入制剂可制备为盐水溶液，其采用苯甲醇或其他合适的防腐剂、吸收促进剂以提高生物利用度、碳氟化合物和/或其他常规增溶剂或分散剂。
在某些实施方案中，药物组合物可与食物一起或不与食物一起施用。在某些实施方案中，药学上可接受的组合物不与食物一起施用。在某些实施方案中，本发明的药学上可接受的组合物与食物一起施用。
用于任何特定患者的具体剂量和治疗方案将取决于多种因素，包括年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、施用时间、排泄率、药物组合、治疗医师的判断以及所治疗的特定疾病的严重程度。组合物中所提供的SWELL1调节剂或其盐的量还将取决于组合物中的特定化合物。
在一个实施方案中，每剂量胃肠外施用的化合物的有效量将在约0.01-100mg/kg，可替代地每天约0.1至20mg/kg患者体重的范围内，所用化合物的典型初始范围是0.3至15mg/kg/天。在另一个实施方案中，口服单位剂型如片剂和胶囊含有约5至约100mg的本发明化合物。
示例性片剂口服剂型包含约2mg、5mg、25mg、50mg、100mg、250mg或500mg的SWELL1调节剂或其盐，并且还包含约5-30mg的无水乳糖，约5-40mg的交联羟甲基纤维素钠、约5-30mg的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)K30以及约1-10mg的硬脂酸镁。配制片剂的方法包括将粉末化成分混合在一起并进一步与PVP溶液混合。可将所得到的组合物干燥、颗粒化、与硬脂酸镁混合并且使用常规设备压制成片剂形式。气雾剂制剂的实例可通过将约2-500mg式I化合物或其盐溶解于合适的缓冲溶液例如磷酸缓冲液并且在需要时加入张力调节剂例如盐(如氯化钠)来制备。可例如使用0.2微米过滤器过滤溶液以除去杂质和污染物。
SWELL1抑制剂或调节剂或其盐可单独使用或与其他剂组合使用，以用于如上所述的治疗。例如，药物组合制剂或给药方案的第二剂可对SWELL1调节剂具有互补活性以使得它们不会不利地影响彼此。化合物可在单一药物组合物中一起施用或单独施用。
术语“共同施用”是指同时施用或以任何方式单独连续施用SWELL1调节剂或其盐与一种或多种其他活性药物成分。如果不是同时施用，则化合物在彼此紧邻的相近时间内施用。此外，化合物是否以相同剂型施用并不重要，例如，一种化合物可局部施用并且另一种化合物可口服施用。典型地，可共同施用具有针对所治疗的疾病或疾患的活性的任何剂。
如本文所用的术语“患者”或“个体”是指动物，如哺乳动物，如人。在一个实施方案中，患者或个体是指人。
术语“哺乳动物”是指任何哺乳动物物种，如人、小鼠、大鼠、犬、猫、仓鼠、豚鼠、兔、家畜等。
除非本文另外指明，否则本文中值范围的列举仅仅意图用作个别地表示属于所述范围的各单独值的速记方法，并且犹如本文个别描述地那样将各单独值并入到本说明书中。
如本领域技术人员所了解，提及“约”某一值或参数包括(并且描述)有关所述值或参数本身的实施方案。例如，对“约X”的描述包括对“X”的描述。
除非在本文另外指明或与上下文明显矛盾，否则在描述本发明实施方案的上下文中，术语“一个/种(a/an)”和“所述”以及类似术语的使用应解释为涵盖单数和复数两者。除非另外指出，否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应解释为开放式术语(即意指“包括但不限于”)。应理解，本文中描述的本发明的方面和实施方案包括由方面和实施方案组成和/或主要由方面和实施方案组成。
本发明的某些实施方案现在将通过以下非限制性实施例加以说明。
实施例1.
2型糖尿病(T2D)的特征是靶组织的胰岛素敏感性丧失，并且最终胰腺β细胞的胰岛素分泌受损(Del Guerra等人,Diabetes,54,727-735,2005；Ashcroft等人,Cell,148,1160-1171,2012；Rorsman等人,Annu Rev Physiol,75,155-179,2013)。最近发现SWELL1(LRRC8a)消融损害脂肪胰岛素-pAKT2信号传导(Zhang等人,Nat Cell Biol,19,504-517,2017)、β细胞胰岛素分泌(Kang等人,Nat Commun,9,367,2018；Stuhlmann等人,NatCommun,9,1974,2018)和全身血糖(Xie等人,Channels(Austin),11(6):673–677,2017；Zhang等人,Nat Cell Biol,19,504-517,2017；Kang等人,Nat Commun,9,367,2018；Stuhlmann等人,Nat Commun,9,1974,2018)表明SWELL1功能障碍可促成T2D发病机制(Xie等人,Channels(Austin),11(6):673–677,2017；Osei-Owusu等人,Curr Top Membr,81,177-203,2018)。在本文中，显示ICl,SWELL/SWELL1蛋白在T2Dβ细胞和脂肪细胞中减少，并且SWELL1蛋白表达调控胰岛素-AKT2-AS160信号传导。DCPIB(Smod1)(一种选择性ICl,SWELL抑制剂)上调SWELL1蛋白，从而增强培养的脂肪细胞中的SWELL1依赖性胰岛素信号传导。在体内，Smod1(5mg/kg i.p.)在两种T2D小鼠模型(HFD诱导和KKAy)中通过增强全身胰岛素敏感性和来自胰岛的胰岛素分泌两者来增加SWELL1表达并使全身血糖正常化，而不会导致非T2D小鼠的低血糖症。Smod1治疗在T2D小鼠中增加白色脂肪组织和心肌中的葡萄糖摄取，增加肝脏、脂肪和骨骼肌将葡萄糖并入糖原的能力，抑制肝葡萄糖产生，并改善非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)。这些发现揭示，小分子SWELL1调节剂可代表通过同时增强全身胰岛素敏感性和胰岛素分泌来治疗T2D、代谢综合征和相关的NAFLD的“一流”治疗方法。
SWELL1/LRRC8a消融损害靶组织中的胰岛素信号传导(Xie等人,Channels(Austin),11(6):673–677,2017；Zhang等人,Nat Cell Biol,19,504-517,2017)和来自胰腺β细胞的胰岛素分泌(Kang等人,Nat Commun,9,367,2018；Stuhlmann等人,Nat Commun,9,1974,2018)，从而诱导葡萄糖耐受不良的糖尿病前期状态(Xie等人,Channels(Austin),11(6):673–677,2017；Zhang等人,Nat Cell Biol,19,504-517,2017；Kang等人,NatCommun,9,367,2018)。这些最近的发现表明SWELL1的减少可促成2型糖尿病(T2D)。为了确定T2D中SWELL1介导的电流是否发生改变，测量了与非T2D对照相比，从用HFD喂养5-7个月的T2D小鼠(图1a)和从T2D患者(图1b，表1和2)新鲜分离的胰腺β细胞中的ICl,SWELL。在小鼠和人T2Dβ细胞两者中，在低渗肿胀刺激后的最大ICl,SWELL电流密度(在+100mV下测量)与非-T2D对照相比显著降低(鼠5.9倍；人2.7倍，图1c和d)，类似于分别在SWELL1敲除(KO)和敲低(KD)鼠和人β细胞中观察到的降低(Kang等人,Nat Commun,9,367,2018)。T2D环境中β细胞ICl,SWELL的这些减少与先前在鼠KKAyT2D模型中的VRAC/ICl,SWELL测量值一致(Inoue等人,Am JPhysiol Cell Physiol,298,C900-909,2010)，其与非T2D对照相比，从T2D KKAy小鼠分离的脂肪细胞中的ICl,SWELL低>2倍(Inoue等人,Am J Physiol Cell Physiol,298,C900-909,2010)。同样，在来自肥胖T2D患者(BMI＝52.3，HgbA1c＝6.9％；葡萄糖＝148-151mg/dl)的分离的人脂肪细胞中测量的SWELL1介导的ICl,SWELL显示出与我们之前报道的肥胖非T2D患者相比降低1.9倍的趋势(Zhang等人,Nat Cell Biol,19,504-517,2017)，并且与来自瘦患者的脂肪细胞中的ICl,SWELL没有区别(图1e，表3)。由于SWELL1/LRRC8a是ICl,SWELL/VRAC(Qiu等人,Cell,157,447-458,2014；Voss等人,Science,344,634-638,2014)在脂肪组织(Xie等人,Channels(Austin),11(6):673–677,2017；Zhang等人,Nat Cell Biol,19,504-517,2017)和β-细胞(Kang等人,Nat Commun,9,367,2018；Stuhlmann等人,Nat Commun,9,1974,2018)两者中的关键组分，我们询问了T2D环境中ICl,SWELL的这些减少(Inoue等人,Am JPhysiol Cell Physiol,298,C900-909,2010)是否与SWELL1蛋白表达的减少相关。事实上，与亲本对照KKAa或C57BL/6小鼠相比，T2D KKAy小鼠的脂肪组织中的SWELL1蛋白表达降低(图1f)。类似地，与来自血糖正常的肥胖患者(BMI＝50.2HgbA1c＝5.0％；葡萄糖＝84-97mg/dl，图1g，表4)的脂肪组织相比，来自肥胖T2D患者(BMI＝53.7，HgbA1c＝8.0％，葡萄糖＝183-273mg/dl)的脂肪组织中的SWELL1蛋白较低。综上所述，这些发现表明脂肪细胞和β细胞(以及可能的其他组织)中SWELL1活性降低可能是与T2D相关的胰岛素抵抗和胰岛素分泌受损的基础。这一观点与以下观察结果一致，即与血糖正常的个体相比，来自高血糖的β细胞中LRRC8a表达降低(Taneera等人,Cell Metab,16,122-134,2012；Osei-Owusu等人,Curr Top Membr,81,177-203,2018)。此外，在早期血糖正常性肥胖的情况下，脂肪组织和肝脏两者中的SWELL1蛋白表达增加(Xie等人,Channels(Austin),11(6):673–677,2017)，并且shRNA介导的对这种SWELL1诱导的抑制加剧胰岛素抵抗和葡萄糖耐受不良(Xie等人,Channels(Austin),11(6):673–677,2017)。因此，我们推测外周组织中SWELL1表达/信号传导的维持或诱导可支持胰岛素敏感性和分泌，以在T2D的情况下保持全身血糖。
小鼠 年龄(周) 性别 饮食 体重(g) 葡萄糖(mg/dL)
非T2D 12-13(n＝4) M 常规饲料 28.6±0.51 148±6.49
T2D 23-27(n＝3) M 高脂肪饮食 52.7±2.99 229±21.4
表1.从其分离鼠β细胞以用于图1a和c中的β细胞膜片钳的非T2D和T2D小鼠(HFD)的特征.
Figure BDA0003498502270000351
表2.从其分离β细胞以用于图1b和d中的膜片钳的非T2D和T2D患者.
Figure BDA0003498502270000352
表3.从其分离原代脂肪细胞以用于图1e中的膜片钳研究的瘦非T2D和T2D减肥手术患者。#来自瘦和肥胖非T2D患者的数据之前在Zhang,Y等人(2017)中报告.
Figure BDA0003498502270000361
表4.从其获得脂肪样品以测量图1g中的SWELL1蛋白表达水平的瘦、肥胖非T2D和肥胖的T2D患者.
为了首先测试SWELL1调控胰岛素信号传导的概念，我们在WT和SWELL1 KO 3T3-F442A脂肪细胞中过表达了全长SWELL1-3xFlag标记的(SWELL1 O/E)，并测量了胰岛素刺激的pAKT2作为胰岛素敏感性的读数(图2a)。与WT脂肪细胞相比，SWELL1 KO 3T3-F442A脂肪细胞表现出显著减弱的胰岛素介导的pAKT2信号传导，如前所述(Zhang等人,Nat CellBiol,19,504-517,2017)，并且通过在SWELL1 KO脂肪细胞中重新表达SWELL1(KO+SWELL1O/E，图2a)以及响应于低渗刺激恢复SWELL1介导的ICl,SWELL(图2b和图21a-c)完全挽救了这一点。值得注意的是，在SWELL1 KO脂肪细胞中观察到的总AKT2蛋白表达的降低并未通过SWELL1重新表达挽救，从而表明SWELL1蛋白表达的瞬时变化优先调控胰岛素-pAKT2信号传导，而不是AKT2蛋白表达。SWELL1在WT脂肪细胞中的过表达还增加WT脂肪细胞中基础和胰岛素刺激的pAKT2和下游pAS160信号传导(图2c&d)。我们证实，当在WT和SWELL1 KO脂肪细胞两者中表达时，SWELL1-3xFlag正常转运至质膜，如使用抗Flag和抗SWELL1抗体两者通过免疫荧光(IF)可视化的(图21d)。事实上，在WT和SWELL1 KO脂肪细胞中表达的质膜SWELL1-3xFlag的特征性点状模式(图21d)与内源性SWELL1的模式非常相似，如通过IF使用我们敲除验证的定制SWELL1抗体可视化的(图21e)。总体而言，这些数据表明SWELL1对于脂肪细胞中的胰岛素-PI3K-AKT2-AS160信号传导是必要且足够的。重要的是，这些数据表明在T2D情况下外周组织中的药理学SWELL1诱导可增强胰岛素信号传导，并改善全身胰岛素敏感性和葡萄糖内稳态。
4-[(2-丁基-6,7-二氯-2-环戊基-2,3-二氢-1-氧代基-1H-茚-5-基)氧基]丁酸(DCPIB，图2e)属于一系列结构多样的(酰基芳氧基)乙酸衍生物，其在20世纪70年代后期合成并针对利尿特性进行研究(Woltersdorf等人,J Med Chem,20,1400-1408,1977；deSolms等人,J Med Chem,21,437-443,1978)，并在20世纪80年代被评价为脑水肿的潜在治疗方法(Cragoe等人,J Med Chem,25,567-579,1982；Cragoe等人,Eur.Pat.Appl.(1982),EP47011A1 19820310,1982).随后，DCPIB已被用作选择性VRAC/ICl,SWELL抑制剂(Decher等人,Br J Pharmacol,134,1467-1479,2001；Zhang等人,Nat Cell Biol,19,504-517,2017；Kang等人,Nat Commun,9,367,2018)(图2f)，在位于精氨酸103(R103；图2e)的收缩点结合在SWELL1-LRRC8六聚体的孔内(Deneka等人,Nature,2018；Kasuya等人,Nat Struct MolBiol,25,797-804,2018；Kefauver等人,Elife,7,2018；Kern等人,Elife,8,2019)，IC50为约2-4μM(Decher等人,Br J Pharmacol,134,1467-1479,2001；Best等人,Eur J Pharmacol,489,13-19,2004)。在信号传导研究中旨在药理性抑制VRAC/ICl,SWELL的实验中，我们注意到DCPIB(在本文重命名为Smod1)当施加96小时时增加3T3-F442前脂肪细胞(3倍)和脂肪细胞(1.5倍；图2g-i)中的SWELL1蛋白表达，与增强的胰岛素刺激pAKT2(图2g-h和j)和胰岛素刺激的pAS160(图2k)相关。这些Smod1介导的对胰岛素-AKT2-AS160信号传导的影响在SWELL1KO 3T3-F442A脂肪细胞中不存在，这与中靶SWELL1介导的作用机制一致(图2h和j)。
为了确定观察到的Smod1对培养的脂肪细胞的影响是否对体内胰岛素信号传导和葡萄糖内稳态具有活性，我们治疗了两种T2D小鼠模型：肥胖、HFD喂养的小鼠和具有Smod1的多基因KKAy小鼠模型(5mg/kg i.p.持续4-10天)。在体内，Smod1使HFD喂养的T2D小鼠脂肪组织中的SWELL1表达增加2.3倍(图3a)。类似地，Smod1使KKAy脂肪SWELL1表达增加至与非T2D C57/B6小鼠和亲本KKAa亲本品系相当的水平(图3b)。SWELL1表达的这种恢复与HFD诱导的T2D小鼠和多基因2型糖尿病KKAy模型中的正常化空腹血糖(FG)、葡萄糖耐受性(GTT)和显著改善的胰岛素耐受性(ITT)相关(图3c-f)。值得注意的是，以相同的治疗剂量(5mg/kg x 4-10天)用Smod1治疗对照KKAa亲本品系不会引起低血糖症，也不会改变葡萄糖和胰岛素耐受性(图3d-f)。类似地，与媒介物治疗的小鼠相比，用Smod1治疗的瘦、非T2D、葡萄糖耐受小鼠具有相似的FG、GTT和ITT(图3g和h以及图22a-c，单独的小鼠群组)，但是当用Smod1重新治疗时，在HFD喂养16周后，这些HFD诱导的T2D小鼠在FG(图3i)、GTT和ITT(图3j)方面表现出显著改善。这些数据表明，Smod1在T2D情况下优先有效地使血糖正常化，而在非T2D小鼠中缺乏显著活性，并且因此预示着诱发低血糖症的风险较低。此外，尽管对葡萄糖耐受性有显著影响，但Smod1在慢性注射方案中耐受性良好，每天注射长达8周没有明显的毒性迹象(图22d)。
为了检查Smod1介导的来自胰腺β细胞的胰岛素分泌增强的可能贡献，我们接下来测量了经受21周HFD的小鼠中葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)。我们发现，基于血清胰岛素测量值(图3k)和来自分离胰岛的灌注GSIS(图3l)，在Smod1治疗的HFD小鼠中，长期HFD(21周HFD)情况下通常观察到的葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)受损得到显著改善，与胰腺β细胞中SWELL1诱导的预测效果一致(Kang等人,Nat Commun,9,367,2018；Stuhlmann等人,Nat Commun,9,1974,2018)。与媒介物治疗的KKAy小鼠相比，在Smod1中进行的灌注测定中获得了类似的结果(图3m)。事实上，如果循环水平足以显著阻断去极化β细胞ICl,SWELL并损害刺激分泌，则Smod1介导的对胰腺β细胞中ICl,SWELL的抑制预计潜在导致高血糖症(Best等人,Eur J Pharmacol,489,13-19,2004)。为了检查这种可能性，我们在注射Smod1后30分钟测量了随机葡萄糖，并且没有观察到高血糖症加剧的证据(图23)。总的来说，这些数据表明Smod1介导的T2D中全身血糖的改善是通过增加外周胰岛素敏感性和β细胞胰岛素分泌两者而发生——这是体内功能丧失性研究的相反表型(Xie等人,Channels(Austin),11(6):673–677,2017；Zhang等人,Nat Cell Biol,19,504-517,2017；Kang等人,Nat Commun,9,367,2018；Stuhlmann等人,Nat Commun,9,1974,2018)。
为了更稳健地评价Smod1对T2D小鼠中的胰岛素敏化和葡萄糖代谢的影响，与媒介物相比，我们使用3H-葡萄糖和14C-葡萄糖两者在用Smod1治疗的KKAy小鼠中进行了追踪血糖正常性高胰岛素血症性钳夹。与媒介物相比，Smod1治疗的KKAy小鼠需要更高的葡萄糖输注率(GIR)来维持血糖正常(GIR,Smod1＝33.58±3.4mg/kg/min和GIR,Veh＝23.23±2.4mg/kg/min，p<0.05)，与增强的全身胰岛素敏感性一致(图4a)。来自糖异生和/或糖原分解(Ra，葡萄糖出现率)的肝葡萄糖产生在Smod1治疗的KKAy小鼠在基线时减少了约1.6倍(基础，图4b)，并在葡萄糖/胰岛素输注过程中进一步抑制了4.8倍(钳夹，图4b)。这些数据反映了Smod1介导的肝脏胰岛素敏感性的改善。肝脏胰岛素敏感性改善的机制尚不清楚，但可能与Smod1对脂肪组织的影响有关，例如由于增强的脂肪-胰岛素敏感性和胰岛素诱导的脂肪分解减少而降低从脂肪至肝脏的非酯化脂肪酸(NEFA)通量。
由于Smod1介导的SWELL1诱导预期增强胰岛素-pAKT2-pAS160、GLUT4易位和葡萄糖摄取(Zhang等人,Nat Cell Biol,19,504-517,2017)，我们接下来测量了通过脂肪、心肌和骨骼肌中的2-脱氧葡萄糖(2-DG)确定的葡萄糖组织摄取。Smod1增强胰岛素刺激的2-DG摄取至腹股沟白色脂肪组织(iWAT-Smod1＝7.0±0.78nmol/min/g；iWAT-Veh＝3.5±0.57nmol/min/g，p<0.01)、内脏白色脂肪组织(gWAT-Smod1＝11.99±2.75nmol/min/g；gWAT-Veh＝5.0±0.5nmol/min/g,p<0.05)和心肌(心脏-Smod1＝451.3±24.63nmol/min/g；心脏-Veh＝318.15±23.48nmol/min/g，p<0.01)中(图4c)，但不摄取至棕色脂肪或骨骼肌中(图24)。由于脂肪细胞SWELL1消融显著降低胰岛素-pAKT2-pGSK3β调控的细胞糖原含量(Zhang等人,Nat Cell Biol,19,504-517,2017)，我们接下来询问Smod1介导的SWELL1表达增强是否可反过来在T2D的情况下增加葡萄糖并入组织糖原中。事实上，在Smod1治疗的小鼠中，肝脏、脂肪和骨骼肌葡萄糖并入糖原中显著增加(图4d)，与SWELL1介导的胰岛素-pAKT2-pGSK3β-糖原合酶功能获得一致。
我们接下来询问长期Smod1治疗以及相关的葡萄糖内稳态的持续改善是否可能对非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)产生有益影响，NAFLD是目前尚无批准的疗法的代谢综合征相关的常见疾病。在21周的时间内用Smod1长期和间歇治疗的小鼠群组中(图4e)，我们注意到肝脏重量(图4f)、组织学上的肝脂肪变性(图4g和图25)和肝脏甘油三酯(图4h)显著减少。与媒介物治疗的对照小鼠相比，NAFLD活动型得分(NAS)(其整合肝脂肪变性、小叶炎症和肝脏气球样变(图4i))在Smod1治疗的小鼠也显著改善。综上所述，这些数据表明Smod1增加SWELL1表达和SWELL1介导的信号传导，从而同时增强全身胰岛素敏感性和胰腺β细胞胰岛素分泌两者，以使T2D小鼠模型中的全身血糖正常化。这种改善的代谢状态消除了与肥胖和T2D相关的异位脂质沉积和NAFLD。
我们目前的工作模型是，从“代偿期”肥胖(糖尿病前期，血糖正常)到“失代偿期”肥胖(T2D，高血糖症)的转变尤其反映了外周胰岛素敏感性组织(Inoue等人,Am J PhysiolCell Physiol,298,C900-909,2010；Xie等人,Channels(Austin),11(6):673–677,2017)和胰腺β细胞(Taneera等人,Cell Metab,16,122-134,2012；Osei-Owusu等人,Curr TopMembr,81,177-203,2018)中SWELL1蛋白表达和信号传导的相对减少–代谢上表型复制SWELL1功能丧失模型(Xie等人,Channels(Austin),11(6):673–677,2017；Zhang等人,NatCell Biol,19,504-517,2017；Kang等人,Nat Commun,9,367,2018；Stuhlmann等人,NatCommun,9,1974,2018)。因此，我们推测纠正这种SWELL1缺陷状态可通过胰岛素敏化和分泌机制两者改善总体全身血糖。奇怪的是，我们发现了Smod1/DCPIB(一种选择性ICl,SWELL抑制剂)(Decher等人,Br J Pharmacol,134,1467-1479,2001；Best等人,Eur J Pharmacol,489,13-19,2004)出人意料地诱导SWELL1蛋白，其进而增加胰岛素敏感性和β细胞胰岛素分泌-从而在T2D小鼠中使全身血糖正常化并减轻NAFLD，而不会在非T2D对照中引起低血糖症。虽然Smod1的作用机制可能看起来有些矛盾——一种实际上增强其靶标信号传导活性的抑制剂——但它与β-阻滞剂在心力衰竭情况下改善心脏功能的作用机制并无不同(Baker等人,Trends Pharmacol Sci,32,227-234,2011)。就像β-阻滞剂的故事一样，完全阐明Smod1作用的分子机制来解释这些观察结果将需要进一步的工作，因为详细的分子途径可能比基于我们目前对这一新兴领域的理解所推测的更复杂(Qiu等人,Cell,157,447-458,2014；Voss等人,Science,344,634-638,2014)。一种有趣的分子机制可能与需要SWELL1来形成大分子信号传导复合物有关，所述复合物包括SWELL1和LRRC8b-e的异六聚体，其化学计量可能因组织而异。我们提出形成稳定的SWELL1信号传导复合物可能具有挑战性，且因此产生经受蛋白质降解的一部分错误组装的复合物。在与T2D状态相关的内质网(ER)应激升高的情况下，这种情况预期会进一步恶化(Back等人,Exp Diabetes Res,2012,618396,2012；Back等人,Annu Rev Biochem,81,767-793,2012；Cnop等人,Trends MolMed,18,59-68,2012)，并且可能解释在T2D中观察到的SWELL1蛋白和SWELL1介导的ICl,SWELL的减少。在这种情况下，使SWELL1-LRRC8复合物的形成稳定的小分子，如Smod1/DCPIB(Kern等人,Elife,8,2019)可有助于通过增强SWELL1-LRRC8异聚体通过内质网和高尔基体而增加SWELL1蛋白和活性SWELL1-LRRC8信号传导复合物数量，尤其是在T2D相关内质网应激的情况下。事实上，具有结合在孔中的DCPIB的LRRC8a/SWELL1同源六聚体的最近结构意味着DCPIB有助于使脂质纳米盘中用于冷冻-EM成像的SWELL1六聚体稳定(Kern等人.,Elife,8,2019)，并且表明DCPIB样小分子也可在体内稳定SWELL1-LRRC8复合物。此外，小分子抑制剂充当治疗性分子伴侣(Buchner,J Biol Chem,294,2074-2075,2019)以支持蛋白质(包括离子通道)的折叠、组装和转移的概念已针对C型尼曼-匹克病(Niemann-Pick C disease)(Pipalia等人,Proc Natl Acad Sci U S A,108,5620-5625,2011；Pipalia等人,J LipidRes,58,695-708,2017)、先天性高胰岛素血症(SUR1-KATP通道突变体)(Pratt等人,J BiolChem,284,7951-7959,2009；Chen等人,J Biol Chem,288,20942-20954,2013；Martin等人,J Biol Chem,291,21971-21983,2016)和囊性纤维化(CFTR突变体)(Loo等人,Biochem J,413,29-36,2008；Pedemonte等人,Front Pharmacol,3,175,2012)证明，从而为假设的作用机制提供了先例。
目前的研究为使用SWELL1调节剂(Smods)治疗多个内稳态结点(包括脂肪、肝脏和胰腺β细胞)的代谢综合征对SWELL1信号传导的药理学诱导提供了初步概念验证。因此，Smod1可代表一种工具化合物，可从中衍生出新的药物类别来治疗T2D、代谢综合征和相关疾病如NAFLD，后者目前缺乏治疗选择，并且因此代表了重要的未满足的需求。
方法
患者获得人胰岛和脂肪细胞并如先前所述培养(Zhang等人,Nat Cell Biol,19,504-517,2017；Kang等人,Nature Communications,9,367,2018)。参与研究的患者是匿名的，并且诸如性别、年龄、HbA1c、血糖水平和BMI的信息仅供研究团队使用。所述研究是根据爱荷华大学机构审查委员会(University of Iowa Institutional Review Board，IRB)的指导方针获得批准和实施的。
动物所有涉及小鼠的实验程序都得到了爱荷华大学和华盛顿大学圣路易斯分校的机构动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee of theUniversity of Iowa and Washington University at St.Louis)的批准。参与研究的所有C57BL/6小鼠均购自Charles River Labs。参与研究的KK.Cg-Ay/J(KKAy)和KK.Cg-Aa/J(KKAa)小鼠都是从Jackson Labs(库存编号：002468)获得的性别和年龄匹配的小鼠，并针对实验进行饲养。小鼠随意喂食常规饲料(RC)或高脂肪饮食(Research Diets,Inc.，60kcal％脂肪)，自由饮水，并圈养在光照、温度和湿度受控的房间中。对于高脂肪饮食(HFD)研究，仅使用雄性小鼠并在6-9周龄开始采用HFD方案。对于所有涉及KKAy和KKAa小鼠的实验，雄性和雌性两者以大约50/50的比例使用。在所有涉及小鼠的实验中，研究人员在实验和随后的分析过程中都保持不知情。
Smod1(DCPIB)治疗将Smod1(DCPIB,Tocris,#D1540)溶解于
Figure BDA0003498502270000431
EL(Sigma,#C5135)中。使用1cc注射器/26G/12英寸针头每天注射(腹膜内，i.p.)媒介物(
Figure BDA0003498502270000432
EL)或Smod1(5mg/体重kg/天)持续4-10天，并且在一项实验中，每天持续8周。
腺病毒具有d5-RIP2-GFP(4.1X 1010PFU/ml)和Ad5-CAG-Lox P-stop-LoxP-3XFlag-SWELL1(1X 1010PFU/ml)的5型腺病毒获自Ve ctor Biolabs。具有Ad5-CMV-Cre-wt-IRES-eGFP(8X 1010PFU/ml)的5型腺病毒从爱荷华大学病毒载体中心(University of IowaViral Vector Core)获得。
细胞培养将野生型(WT)和SWELL1敲除(KO)3T3-F442A(Sigma-Aldrich)细胞如先前所述进行培养和分化(Zhang等人,Nat Cell Biol,19,504-517,2017)。将前脂肪细胞保持在胶原包被(大鼠尾I型胶原，Corning)板上的含有10％胎牛血清(FBS)和100IU青霉素以及100μg/ml链霉素的90％DMEM(25mM D-葡萄糖和4mM L-谷氨酰胺)中。达到汇合后，使细胞在补充有5μg/ml胰岛素(Cell Applications)的上述培养基中分化，并且每隔一天补充分化培养基。对于有或没有SWELL1过表达(O/E)的WT和KO脂肪细胞的胰岛素信号传导研究，使细胞分化10天，并在第11天在含有2％FBS的分化培养基中用Ad5-CAG-LoxP-stop-LoxP-3XFlag-SWELL1病毒(MOI 12)转导。为了诱导过表达，在第13天将Ad5-CMV-Cre-wt-IRES-eGFP(MOI 12)添加在含有2％FBS的分化培养基中。然后从第15天至第17天将细胞切换到含有10％FBS的分化培养基。在第18天，将细胞在无血清培养基中饥饿6小时，并用0和10nM胰岛素刺激5或15分钟。单独Ad5-CAG-LoxP-stop-LoxP-3XFlag-SWELL1或Ad5-CMV-Cre-wt-IRES-eGFP病毒转导的细胞用作对照。基于GFP荧光，病毒转导效率是约90％。
对于3T3-F442A前脂肪细胞中Smod1(DCPIB)介导的SWELL1诱导和的胰岛素信号传导研究，将细胞与媒介物(DMSO)或10μM Smod1一起孵育96小时。将细胞血清饥饿6小时(+DMSO或Smod1)并用含有0、3和10nM胰岛素的培养基(-DMSO或Smod1)如上所述刺激15分钟，并收集裂解物。在3T3-F442A脂肪细胞的情况下，将WT和KO细胞在分化7-11天后用媒介物(DMSO)或10μM Smod1治疗96小时，然后用0和10nM胰岛素刺激15分钟，如上所述。将人胚肾(HEK)细胞在含有10％胎牛血清(FBS)和100IU青霉素以及100μg/ml链霉素培养基的90％DMEM(25mM D-葡萄糖和4mM L-谷氨酰胺)中培养和维持。
电生理学β细胞和成熟脂肪细胞的膜片钳记录如先前所述进行(Zhang等人,NatCell Biol,19,504-517,2017；Kang等人,Nature Communications,9,367,2018)。3T3-F442A WT和KO前脂肪细胞如以上细胞培养部分所述制备。对于SWELL1过表达记录，前脂肪细胞首先在2％FBS培养基中用Ad5-CAG-LoxP-stop-LoxP-3XFlag-S WELL1(MOI 12)转导两天，然后通过在2％FBS培养基中添加Ad5-CMV-Cre-wt-IRES-eGFP(MOI 10-12)再诱导过表达两天，并更换为含有10％FBS的培养基，并基于GFP表达进行选择(约2-3天)。对于β细胞记录，用Ad-RIP2-GFP转导胰岛，然后在48-72小时后分散用于膜片钳实验。GFP+细胞标记了被选择用于膜片钳记录的β细胞。使用pClamp 10.4软件，使用与Digidata 1550数字化仪配对的Axop atch 200B放大器测量记录。用于低渗刺激的细胞外缓冲液组合物含有90mM NaCl、2mM CsCl、1mM MgCl2、1mM CaCl2、10mM HEPES、10mM甘露醇(pH 7.4)，含NaOH(210mOsm/kg)。除了甘露醇浓度为110mM(300mOsm/kg)外，细胞外等渗缓冲液的组成与上述相同。细胞内缓冲液的组成是120mM L-天冬氨酸、20mM CsCl、1mM MgCl2、5mM EGTA、10mM HEPES、5mMMgATP、120mM CsOH、0.1mM GTP(pH 7.2)，含CsOH。所有记录均在室温(RT)下进行，β细胞和3T3-F442A细胞在全细胞配置中进行，并且人脂肪细胞在穿孔贴片配置中进行，如前(Zhang等人,Nat Cell Biol,19,504-517,2017；Kang等人,Nature Communications,9,367,2018)。
蛋白质印迹将细胞在冰冷的磷酸盐缓冲盐水中洗涤两次，并RIPA缓冲液(150mMNacl、20mM HEPES、1％NP-40、5mM EDTA，pH 7.4)中用蛋白酶/磷酸酶抑制剂(Roche)裂解。将细胞裂解物以10秒的循环间隔进一步超声处理2-3次，并在4℃下以14000rpm离心20分钟。收集上清液并使用DC蛋白质测定试剂盒(Bio-Rad)进一步估计蛋白质浓度。将脂肪组织均质化并以与上述类似的方式悬浮在含有抑制剂的RIPA缓冲液中。通过在4X laemmli缓冲液中煮沸进一步制备蛋白质样品。将大约10-20μg的总蛋白质负载于4％-15％梯度凝胶(Bio-Rad)中进行分离，并将蛋白质转移到PVDF膜(Bio-Rad)上。将膜在TBST缓冲液(0.2MTris、1.37M NaCl、0.2％Tween-20，pH 7.4)中的5％BSA(或对于SWELL1，5％牛奶)中封闭1小时，并与适当的一级抗体(5％BSA或牛奶)一起在4℃下孵育过夜。在室温下将二级抗体(Bio-Rad，山羊抗兔，#170-6515)添加于TBST缓冲液中的1％BSA(或对于SWELL1，1％牛奶)中持续1小时之前，将膜进一步在TBST缓冲液中洗涤。通过化学发光(Pierce)产生信号并使用Chemidoc成像系统(Biorad)进行可视化。使用ImageJ软件进一步分析图像的条带强度。使用了以下一级抗体：来自Cell Signaling的抗磷酸-AKT2(#8599s)、抗-AKT2(#3063s)、抗-磷酸-AS160(#4288s)、抗-AS160(#2670s)和抗β-肌动蛋白(#8457s)；如前所述的抗SWELL1。
免疫荧光3T3-F442A前脂肪细胞(WT,KO)和没有或有SWELL1过表达的分化脂肪细胞(WT+SWELL1 O/E，KO+SWELL1 O/E)如细胞培养部分所述制备。然后将细胞涂铺在胶原包被的盖玻片上，并在-20℃下在冰冷的丙酮中固定15分钟。然后将细胞用1X PBS洗涤四次，并在室温下用1X PBS中的0.1％Triton X-100透化5分钟，然后在室温下用5％正常山羊血清封闭1小时。向细胞添加抗SWELL1(1:400)或抗Flag(1:1500，Sigma#F3165)抗体并在4℃下孵育过夜。然后在室温下添加1:1000Alexa Flour 488/568二级抗体(抗兔，#A11034或抗小鼠，#A11004)持续1小时之前和之后，将细胞洗涤3次(1X PBS)。将细胞用核TO-PRO-3(Life Technologies，#T3605)染色20分钟，然后用1X PBS洗涤3次。将盖玻片进一步安装在带有ProLong Diamond抗褪色介质的载玻片上。所有图像均使用具有63X物镜(NA 1.4)的Zeiss LSM700/LSM510共聚焦显微镜捕获。
代谢表型分析在葡萄糖耐受性测试(GTT)之前，使小鼠禁食6小时。在0分钟时间点的基线血糖水平(空腹血糖，FG)是使用血糖仪(Bayer Healthcare LLC)从剪尾采集的血液样品中测量的。分别向瘦小鼠或HFD小鼠注射(i.p.)1g或0.75g D-葡萄糖/体重kg，并在注射后7、15、30、60、90和120分钟的时间点测量葡萄糖水平。对于胰岛素耐受性测试(ITT)，使小鼠禁食4小时。与GTT类似，在0分钟时间点和胰岛素(HumulinR，对于瘦小鼠为1U/体重kg，或对于HFD小鼠为1.25U/体重kg)注射(i.p.)后的15、30、60、90和120分钟时间点测量基线血糖水平。在最后一次注射后约24小时，进行Smod1(或媒介物)治疗组的GTT或ITT。对于胰岛素分泌测定，将媒介物或Smod1治疗的HFD小鼠禁食6小时并注射(i.p.)0.75g D-葡萄糖/体重kg，并在0、7、15和30分钟时间点在微量采血管毛细管(SARSTEDT，#16.444)中收集血液样品并在4℃下以5000rpm离心20分钟。然后通过使用超敏感小鼠胰岛素ELISA试剂盒(Crystal Chem，#90080)测量收集的血浆中的胰岛素含量。在进行实验时对所有小鼠和治疗组进行盲评估。
鼠胰岛分离和灌注测定对于涉及原代小鼠β细胞的膜片钳研究，通过注射Avertin(H2O中0.0125g/ml)来将小鼠麻醉，然后颈椎脱位。将用媒介物或Smod1治疗的HFD或多基因KKAy小鼠用1％-4％异氟烷麻醉，然后颈椎脱位。如前所述进一步分离胰岛(Kang等人,Nature Communications,9,367,2018)。使用来自Biorep Technologies的PERI4-02进行胰岛灌注。对于每个实验，手动挑选大约50个新鲜分离的胰岛(均来自同一分离批次)以匹配样品中胰岛的大小，并由同一位经验丰富的操作员将其负载到两层聚丙烯酰胺-微珠浆液(Bio-Gel P-4，BioRad)之间。灌注缓冲液含有(以mM计)：120NaCl、24NaHCO3、4.8KCl、2.5CaCl2、1.2MgSO4、10HEPES、2.8葡萄糖、27.2甘露醇、0.25％w/v牛血清白蛋白(pH 7.4)，含NaOH(300mOsm/kg)。保持在37℃的灌注缓冲液以120μl/min循环。用2.8mM葡萄糖溶液洗涤48分钟以稳定化后，按以下顺序刺激胰岛：16.7mM葡萄糖16分钟、2.8mM葡萄糖40分钟、30mM KCl 10分钟和2.8mM葡萄糖12分钟。在制备含有16.7mM葡萄糖的溶液时，通过调整甘露醇浓度来匹配渗透压。每1或2分钟将系列样品收集到保持在4℃的96个孔中。使用可商购获得的ELISA试剂盒(Mercodia)进一步测定胰岛素浓度。计算50至74/84分钟之间时间点的高葡萄糖诱导的胰岛素释放的曲线下面积(AUC)。实验结束后，通过添加RIPA缓冲液进一步裂解胰岛，并通过ELISA检测胰岛素的量。
高胰岛素血症性血糖正常性钳夹在异氟烷麻醉下将无菌硅酮导管(Dow-Corning)放入小鼠的颈静脉中。将放置的导管用盐水中的200U/mL肝素冲洗，并且将导管的自由端通过钝的14号无菌针头皮下引导，并连接至通过动物的背部离开的小管装置。允许小鼠从手术中恢复3天，然后接受媒介物或Smod1(5mg/kg)的IP注射持续4天。在手术后第8天对无约束、有意识的小鼠进行高胰岛素血症性血糖正常性钳夹，如别处所述(Kim等人,J ClinInvest,105,1791-1797,2000；Ayala等人,J Vis Exp,2011)，具有一些修改。使小鼠禁食6小时，此时开始胰岛素和葡萄糖输注(时间0)。在时间0前80分钟进行基础采样，其中在灌注5μCi推注1分钟后，通过输注0.05μCi/min D-[3-3H]-葡萄糖(Perkin Elmer)追踪全身葡萄糖通量。在基础期之后，从时间0开始，以0.2μCi/min速率连续输注D-[3-3H]-葡萄糖，并以80mU/kg/min的推注开始输注胰岛素(Humulin，Eli Lilly)，然后在整个测定过程中以8mU/kg/min的剂量连续输注胰岛素。在开始胰岛素输注的同时开始以可变速率(GIR)输注50％的右旋糖(Hospira)，以将血糖正常维持在150mg/dL(8.1mM)的目标水平。使用Contour血糖仪(Bayer)通过尾静脉采样每十分钟进行血糖(BG)测量。在小鼠达到稳定BG和GIR后(通常，在开始胰岛素输注75分钟后；对于一些小鼠，需要更长的时间来达到稳态)，施用96μl盐水中的12μCi的[1-14C]-2-脱氧-D-葡萄糖(Perkin Elmer)的单次推注。用于测定示踪剂富集、葡萄糖水平和胰岛素浓度的血浆样品(从离心血液收集)在时间-80、-20、-10、0和从胰岛素后80分钟开始每10分钟(施用[1-14C]-2-脱氧-D-葡萄糖推注后5分钟)获得直至测定在140分钟结束。然后在异氟烷麻醉下从目标器官(例如肝脏、心脏、肾脏、白色脂肪组织、棕色脂肪组织、腓肠肌、比目鱼肌等)收集小鼠的组织样品，以用于测定1-14C]-2-脱氧-D-葡萄糖示踪剂摄取。
血浆和组织样品如前所述进行加工(Ayala等人,J Vis Exp,2011)。简言之，用Ba(OH)2和ZnSO4对血浆样品进行脱蛋白并干燥以除去氚化水。葡萄糖转换率(mg/kg-min)计算为示踪剂输注率(dpm/min)除以每kg小鼠体重校正的血浆葡萄糖比活性(dpm/mg)。稳态的波动通过使用斯蒂尔模型来解释。使用Analox GMD9系统(Analox Technologies)测量血浆葡萄糖。
将组织样品(各自约30mg)在750μl的0.5％高氯酸中均质化，用10M KOH中和并离心。然后将上清液用于首先测量总[1-14C]信号的丰度(源自1-14C-2-脱氧-D-葡萄糖、1-14C-2-脱氧-D-葡萄糖6磷酸两者)，并且在使用0.3N Ba(OH)3和0.3N ZnSO4的沉淀步骤后，用于测量非磷酸化的1-14C-2-脱氧-D-葡萄糖。
如所述(Shiota,Animal Models in Diabetes Research,229-253,2012)，通过乙醇沉淀从30％KOH组织裂解物中分离糖原。
使用Stellux ELISA啮齿动物胰岛素试剂盒(Alpco)测量T0和T140时血浆中的胰岛素水平。
肝脏分离、甘油三酯和组织学将用媒介物或Smod1治疗的HFD小鼠用1％-4％异氟烷麻醉，然后颈椎脱位。测量肝脏总重量并解剖来自肝脏右内侧叶的相同切片用于进一步检查。通过在1.5ml氯仿:甲醇(2:1v/v)中均质化10-50mg组织并在4℃下以12000rpm离心10分钟来测定总甘油三酯含量。将20ul等分试样在1.5ml微量离心管中蒸发30分钟。通过将100μl的Infinity甘油三酯试剂(Fisher Scientific)添加至干燥的样品中、然后在室温下孵育30分钟来测定甘油三酯含量。然后将样品与标准品(0-2000mg/dl)一起转移到96孔板中，并测量540nm处的吸光度，并通过针对组织重量进行归一化来确定最终浓度。对于组织学检查，将肝脏切片固定在10％福尔马林锌中，并且石蜡包埋用于切片。然后评估苏木精和伊红(H&E)染色切片的脂肪变性分级、小叶炎症和非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的肝细胞气球样变评分，如所述(Kleiner等人,Hepatology,41,1313-1321,2005；Liang等人,PLoSOne,9,e115922,2014；Rauckhorst等人,Mol Metab,6,1468-1479,2017)。
统计分析在比较两组的同时进行标准未配对或配对双尾学生t检验。对于GTT和ITT，使用了双因素方差分析(Anova)。小于0.05的p值被认为具有统计学意义。*、**和***分别表示小于0.05、0.01和0.001的p值。所有数据均表示为平均值±SEM。所有统计分析都在相应的图例中指示。
实施例2
内皮对调控血管紧张度、血管生成、全身动脉和/或肺动脉血压和血流量的各种化学和机械因素有响应。内皮体积调控性阴离子通道(eVRAC)被认为是机械敏感的，以响应于流体流动/静水压力而激活，并假定调控血管反应性和血管生成。在此，显示含富含亮氨酸重复序列的蛋白质8a，即LRRC8a(SWELL1)在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中功能性编码eVRAC。内皮SWELL1(eSWELL1)表达通过eSWELL1-GRB2-Cav1-eNOS信号复合物正调控胰岛素和拉伸诱导的AKT2-eNOS信号传导，同时负调控mTOR信号传导、HUVEC大小和迁移，与VRAC电流振幅无关。内皮限制性SWELL1 KO(eSWELL1KO)小鼠在基质胶血管生成测定中表现出来自离体主动脉环外植体的管形成增强，响应于慢性血管紧张素II输注发展高血压，并且视网膜血流量受损，在2型糖尿病(T2D)的情况下伴有弥漫性和局灶性血管变窄。这些数据表明SWELL1完全相反地调控内皮中的AKT-eNOS和mTOR信号传导，并且是维持血管功能所必需的，尤其是在T2D的情况下。
SWELL1在内皮中高度表达并在功能上编码VRAC
几十年来，已测量和表征了内皮细胞中的体积调控性阴离子电流(VRAC)，但这种内皮离子通道的分子特性仍然难以捉摸(Barakat,Int J Mol Med,4,323-332,1999；Barakat等人,Circ Res,85,820-828,1999；Nilius等人,Physiol Rev,81,1415-1459,2001)。为了确定最近在细胞系中鉴定的含富含亮氨酸重复序列的膜蛋白SWELL1(LRRC8a)(Qiu等人,Cell,157,447-458,2014；Voss等人,Science,344,634-638,2014)是否是内皮细胞中的VRAC所必需的，就像在脂肪细胞(Zhang等人,Nat Cell Biol,19,504-517,2017)、胰腺β细胞(Kang等人,Nat Commun,9,367,2018；Stuhlmann等人,Nat Commun,9,1974,2018)、结状神经元(Wang等人,JCI Insight,2,e90632,2017)和精子(Luck等人,J Biol Chem,293,11796-11808,2018)中一样，我们首先通过蛋白质印迹(图10A)和免疫染色(图10B)在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中证实了稳健SWELL1表达。与乱序对照(Ad-shSCR-mCherry)相比，这种SWELL1表达在使用针对SWELL1的短发夹RNA(Ad-shSWELL1-mCherry)进行腺病毒转导后显著降低。接下来，我们测量了HUVEC中低渗诱导的(210mOsm)内皮VRAC电流。这些经典的外向整流VRAC电流在HUVEC中很突出，并且在shSWELL1介导的SWELL1敲低后受到显著抑制(图10C-E)，与SWELL1功能性编码内皮VRAC一致。
SWELL1调控内皮中的胰岛素-PI3K-AKT-eNOS、ERK和mTOR信号传导
脂肪细胞中的我们先前研究表明SWELL1调控胰岛素-PI3K-AKT信号传导、脂肪细胞扩增和全身血糖，由此SWELL1功能丧失诱导胰岛素抵抗糖尿病前期状态(Xie等人,Channels(Austin),11(6):673–677,2017；Zhang等人,Nat Cell Biol,19,504-517,2017)。胰岛素信号传导在调控内皮和血管功能方面也是重要的(Duncan等人,Diabetes,57,3307-3314,2008；Kearney等人,Exp Physiol,93,158-163,2008；Muniyappa等人,Rev EndocrMetab Disord,14,5-12,2013)。此外，2型糖尿病(T2D)中的胰岛素抵抗被认为是全身性病症，并且推测胰岛素抵抗内皮是T2D中血管功能受损的基础(Kearney等人,Exp Physiol,93,158-163,2008；Muniyappa等人,Rev Endocr Metab Disord,14,5-12,2013)。由于SWELL1在内皮中高度表达(图10)，并且PI3K-AKT-eNOS信号传导对内皮依赖性血管功能至关重要(Morello等人,Cardiovasc Res,82,261-271,2009)，我们接下来检查了与对照HUVEC相比，SWELL1 KD中胰岛素刺激的AKT-eNOS、ERK1/2和mTOR信号传导。在SWELL1 KD后，pAKT2、pAS160、pERK和peNOS的胰岛素刺激(10和100nM)的增加在HUVEC中显著消除(图11A和B)，从而表明SWELL1是内皮中胰岛素PI3K、ERK信号传导所必需的，从而充当胰岛素信号传导的正调控因子-类似于脂肪细胞(Zhang等人,Nat Cell Biol,19,504-517,2017)。奇怪的是，与对照相比，SWELL1 KD HUVEC中胰岛素刺激的pS6核糖体(mTOR信号传导)增加，从而表明SWELL1是内皮中mTOR的负调控因子(图11A)。超过6小时胰岛素刺激的时程实验揭示，这些影响也是时间依赖性的(图12)，但遵循相同的趋势。为了补充这些SWELL1功能丧失实验，我们进行了SWELL1功能获得实验并检查了这些相同的信号传导途径。超过内源性SWELL1蛋白水平的过表达SWELL1足以增加HUVEC中胰岛素刺激的pAKT、eNOS、p-eNOS和pERK(MAP激酶信号传导)，同时减少p-p70、pS6核糖体蛋白(mTOR信号传导，图13)。为了确定SWELL1过表达后信号传导的这些变化是否与SWELL1介导的VRAC的增加相关，我们测量了Ad-shSCR、Ad-shSWELL1和Ad-SWELL1转导的HUVEC中的VRAC。与常见细胞系中的先前报告类似(Qiu等人,Cell,157,447-458,2014；Voss等人,Science,344,634-638,2014)，而SWELL1功能丧失降低VRAC，HUVEC中的SWELL1过表达不会使VRAC电流增加至高于基础WT水平。这些数据表明SWELL1对内皮中的胰岛素-AKT、eNOS、ERK和mTOR信号传导是必要且足够的，并且这种信号传导与SWELL1介导的质膜VRAC活性无关。
SWELL1与GRB2、Cav1和eNOS相互作用并介导拉伸依赖性eNOS信号传导
在脂肪细胞中，SWELL1介导的PI3K-Akt信号传导调控的机制涉及SWELL1/GRB2/Cav1分子相互作用。为了确定SWELL1是否存在于内皮中类似的大分子信号传导复合物中，我们对来自HUVEC的内源性GRB2进行了免疫沉淀(IP)。在GRB2 IP后，我们在shSCR治疗的HUVEC中检测到SWELL1蛋白，并且在shSWELL1介导的SWELL1 KD后检测到更少的IP SWELL1，这与SWELL1-GRB相互作用(图14A和B)一致，除Cav1(图14A和B)和eNOS(图14B)两者以外。这些数据表明内皮SWELL1存在于包含GRB2、Cav1和eNOS的信号传导复合物中，这与GRB2和Cav1相互作用以及Cav1通过直接相互作用调控eNOS的发现一致(Ju等人,J Biol Chem,272,18522-18525,1997；Venema等人,Biochem Biophys Res Commun,236,155-161,1997；Goligorsky等人,Am J Physiol Renal Physiol,283,F1-10,2002)。此外，这些数据也与以下观点一致：小窝形成机械敏感性微结构域(Sedding等人,Circ Res,96,635-642,2005；Sinha等人,Cell,144,402-413,2011；Nassoy等人,Trends Cell Biol,22,381-389,2012)，所述微结构域调控VRAC(Trouet等人,J Physiol,520Pt 1,113-119,1999；Trouet等人,Biochem Biophys Res Commun,284,461-465,2001)，并且VRAC可被多种细胞类型(包括内皮)中的机械刺激激活(Barakat,Int J Mol Med,4,323-332,1999；Nakao等人,Am JPhysiol,276,C238-249,1999；Nilius等人,Physiol Rev,81,1415-1459,2001；Romanenko等人,Am J Physiol Cell Physiol,282,C708-718,2002；Browe等人,J Gen Physiol,122,689-702,2003；Browe等人,J Gen Physiol,127,237-251,2006)。鉴于内皮细胞对拉伸刺激作出响应以通过激活eNOS来调控血管紧张度，我们接下来检查了HUVEC中拉伸AKT、ERK1/2和eNOS信号传导的SWELL1依赖性(图15)。与胰岛素刺激类似，5％拉伸足以刺激HUVEC中的AKT和ERK1/2信号传导，并且这在SWELL1 KD HUVECS中被消除，从而表明SWELL1还调控HUVEC中的拉伸依赖性AKT和ERK1/2信号传导(图15A)。类似地，与对照相比，我们观察到在SWELL1 KD HUVECS中在5％拉伸下时间依赖性p-eNOS信号传导的消除(图15B)。总之，这些数据将SWELL1定位为通过SWELL1-GRB2-Cav1-eNOS大分子复合物，内皮中胰岛素和拉伸介导的PI3K-AKT-eNOS信号传导的调控因子。
SWELL1调控内皮细胞大小、迁移和萌芽血管生成
鉴于SWELL1调控内皮中的mTOR信号传导(图11)并且mTOR是细胞大小和迁移的已知调控因子，我们接下来评估了SWELL1依赖性HUVEC大小和迁移。与SWELL1 KD HUVEC中胰岛素刺激的对mTOR信号传导的诱导一致，我们发现与对照相比，SWELL1 KD HUVEC显著大4倍(图16A)，并且在划痕测定中迁移快>5倍(图16B)。相反，SWELL1过表达使迁移速率显著减慢至对照水平(图16C)，正如SWELL1介导的mTOR信号传导减少情况下所预期的那样(图13)。
为了检查体内内皮SWELL1消融的功能后果，我们通过将SWELL1侧接LoxP(floxed)小鼠与内皮限制性CDH5-Cre小鼠杂交来产生内皮靶向的SWELL1 KO小鼠(eSWELL1 KO)(图17A)。主动脉环外植体的免疫荧光染色揭示了来自从外植体萌芽的CD31+原代内皮细胞的SWELL1的消融(图17B)。与划痕测定中观察到的SWELL1介导的HUVEC迁移的调控一致(图16B)，与SWELL1侧接LoxP小鼠相比，基于eSWELL1 KO小鼠的管长度和顶端细胞的数量两者，离体萌芽血管生成在SWELL1消融后也显著增强(图17B)。总之，这些数据表明SWELL1可通过mTOR信号传导调控血管生成。
事实上，与对照相比，SWELL1 KD HUVEC的全基因组转录组分析(RNA测序)揭示调控血管生成、迁移和肿瘤发生的多种丰富的途径，包括GADD45、IL-8、p70S6K、TREM1、血管生成素和HGF信号传导(图18)。此外，与细胞粘附和肾素-血管紧张素信号传导相关的途径得到富集——在动脉粥样硬化和2型糖尿病(T2D)的情况下，血管系统中发生改变的途径。
eSWELL1 KO小鼠在2型糖尿病的情况下表现出轻度血管紧张素II刺激的高血压和视网膜血流量受损
基于我们的发现，即SWELL1调控内皮中的AKT-eNOS信号传导，并且eNOS信号传导对于全身动脉和/或肺动脉血压调控至关重要，我们接下来与WT对照(SWELL1fl/fl小鼠)相比，检查了eSWELL1KO小鼠中的全身动脉血压。雄性小鼠未表现出在基础条件下收缩性全身动脉血压的显著差异(图19A)，而雌性小鼠相对于WT小鼠有轻度高血压(图19B)。然而，在血管紧张素-II输注(Ang II)4周后，与AngII治疗的WT小鼠相比，雄性eSWELL1 KO小鼠发展加剧的收缩期高血压(图19C)。这些数据与eSWELL1 KO小鼠中的内皮功能障碍和血管松弛受损、从而导致收缩期高血压的倾向一致。
由于内皮功能障碍也可导致血流量受损，我们在腹膜内注射荧光素期间进行了视网膜成像，以定量以常规饮食和高脂肪高蔗糖(HFHS)饮食饲养的WT和eSWELL1 KO小鼠中的视网膜血管血流量和形态。基于视网膜动脉中荧光素信号的相对上升速率，以常规饮食饲养的小鼠具有视网膜血流量的轻微损伤。与WT小鼠相比，eSWELL1 KO中的视网膜血管也轻度变薄，主要是在雌性小鼠中。在以HFHS饮食饲养的小鼠中，与WT小鼠相比，eSWELL1 KO小鼠的视网膜血流量受损更严重，具有显著局灶性和弥漫性视网膜血管变窄(图20)，并且与雄性小鼠相比，雌性小鼠的情况明显更糟。
总之，我们的发现表明SWELL1在内皮中高度表达，并在功能上编码内皮VRAC。SWELL1调节内皮中的胰岛素和拉伸刺激的AKT-eNOS和mTOR信号传导，并存在于SWELL1-GRB2-Cav1-eNOS信号传导复合物中，以调控体内内皮细胞迁移、血管生成和血管反应性，尤其是T2D的情况下。
本文引用的所有文献以引用的方式并入。虽然描述了本发明的某些实施方案，并且出于说明的目的已经阐述了许多细节，但是在不脱离本发明的基本原理的情况下可改变某些细节。
除非在本文另外指明或与上下文明显矛盾，否则在描述本发明实施方案的上下文中，术语“一个/种(a/an)”和“所述”以及类似术语的使用应解释为涵盖单数和复数两者。除非另外指出，否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应解释为开放式术语(即意指“包括但不限于”)。除非本文另外指明，否则本文中值范围的列举仅仅意图用作个别地表示属于所述范围的各单独值的速记方法，并且犹如本文个别描述地那样将各单独值并入到本说明书中。除本文详述的顺序外，除非本文另外指明或上下文明显矛盾，否则可按任何适合的顺序来执行本文所述的全部方法。本文所提供的任何以及所有实例或示例性语言(例如，“如”)的使用仅意图更好地说明本发明的实施方案，并且除非在权利要求书中另外具体说明，否则不一定对本发明的范围施加限制。本说明书中的语言不应解释为将任何非要求保护的要素指示为实践本发明所必需。

Claims (19)

1.一种用于预防和/或治疗需要这种疗法的患者的非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的SWELL1调节剂。
2.SWELL1调节剂用于预防和/或治疗非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的用途。
3.一种用于调控需要这种治疗的患者中的血管紧张度、全身动脉和/或肺动脉血压和/或血流量的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的SWELL1调节剂。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的SWELL1调节剂以调控血管紧张度。
5.如权利要求3所述的方法，其中所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的SWELL1调节剂以调控全身动脉和/或肺动脉血压。
6.如权利要求3所述的方法，其中所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的SWELL1调节剂以调控血流量。
7.SWELL1调节剂用于调控血管紧张度、全身动脉和/或肺动脉血压和/或血流量的用途。
8.一种用于预防和/或治疗需要这种疗法的患者的丙种球蛋白血症或其他免疫缺陷的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的SWELL1调节剂。
9.SWELL1调节剂用于预防和/或治疗丙种球蛋白血症或其他免疫缺陷的用途。
10.一种用于预防和/或治疗需要这种疗法的患者的男性不育症的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的SWELL1调节剂。
11.SWELL1调节剂用于预防和/或治疗男性不育症的用途。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法或用途，其中所述SWELL1调节剂是DCPIB、克罗米芬、萘福昔定或他莫昔芬。
13.如权利要求1-11中任一项所述的方法或用途，其中所述SWELL1调节剂是DCPIB。
14.如权利要求1-11中任一项所述的方法或用途，其中所述SWELL1调节剂是式I化合物或其盐
Figure FDA0003498502260000021
其中：
X1a和X2a独立地是卤基；
R1a是C1-6烷基、3-6元环烷基或苯基，其中所述C1-6烷基任选地被3-6元环烷基取代；
R2a是氢或C1-6烷基，其中所述C1-6烷基任选地被羧基取代；并且
R3a是C1-6烷基。
15.如权利要求1-11中任一项所述的方法或用途，其中所述SWELL1调节剂是式II化合物或其盐
Figure FDA0003498502260000031
其中：
R1b是氢、卤基或甲氧基；
R2b中仅一个是–O(CH2)n-NR3bR4b；
另一个R2b是氢、卤基或甲氧基；
R3b和R4b中的每一个独立地是H或C1-6烷基，或者R3b和R4b与它们所连接的氮一起形成氮杂环丙烷子基、氮杂环丁烷子基、吗啉代、哌嗪子基、吡咯烷子基或哌啶子基；
n是2至4的整数；并且
X是卤基。
16.如权利要求1-11中任一项所述的方法或用途，其中所述SWELL1调节剂是式III化合物或其盐
Figure FDA0003498502260000032
其中：
R1c和R2c中的每一个独立地是H或C1-8烷基，或者R1c和R2c与它们所连接的氮一起形成氮杂环丙烷子基、氮杂环丁烷子基、吗啉代、哌嗪子基、吡咯烷子基或哌啶子基；其中所述氮杂环丙烷子基、氮杂环丁烷子基、吗啉代、哌嗪子基、吡咯烷子基或哌啶子基任选地被一个或多个C1-6烷基取代；
m是2至6的整数，
R3c是C1-C8烷氧基；并且
p是1至4的整数。
17.如权利要求1-11中任一项所述的方法或用途，其中所述SWELL1调节剂是式IV化合物或其盐
Figure FDA0003498502260000041
其中：
R1d和R2d中的每一个独立地是H或C1-6烷基，或者R1d和R2d与它们所连接的氮一起形成氮杂环丙烷子基、氮杂环丁烷子基、吗啉代、哌嗪子基、吡咯烷子基或哌啶子基；
R3d和R4d中的每一个独立地是芳基，所述芳基任选地被一个或多个选自C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6二烷基氨基或卤基的基团取代；
R5d是C1-6烷基或C1-6烯基，其中所述C1-6烷基任选地被芳基取代；并且
q是2至6的整数。
18.如权利要求1-17中任一项所述的方法或用途，其中所述SWELL1调节剂和/或SWELL1-LRRC8结合分子的施用或使用足以上调SWELL1的表达和/或SWELL1-LRRC8复合物的稳定性和/或组装和/或膜转运和/或SWELL1-LRRC8信号传导，或者改变SWELL1相关蛋白(例如，LRRC8b、c、d、e、GRB2、Cav1、IRS1或IRS2)的表达和/或相关。
19.如权利要求1-18中任一项所述的方法或用途，其中所述SWELL1调节剂的施用或使用足以上调SWELL1的表达。
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