CN108093648A - 簇集蛋白同种型的特异性检测 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于检测特定同种型的簇集蛋白的方法和组合物。

Description

簇集蛋白同种型的特异性检测
优先权
本申请要求于2015年4月30日提交的美国序列号62/155,175的权益，其通过引用以其整体结合到本文中。
发明背景
簇集蛋白或载脂蛋白J为75-80 kDa的连接有二硫化物的异二聚体蛋白。簇集蛋白是许多生理过程的部分，包括精子成熟、脂质运输、补体抑制、组织重塑、膜再循环、稳定应激蛋白和促进凋亡抑制。簇集蛋白在肾近端和远端管损害期间过表达，已经在多种癌中注意到，并且在肾损伤中上调。
已经开发了若干免疫测定并推向市场，用于测量多种体液中的簇集蛋白，包括血浆、血清和尿。肾特异性簇集蛋白可用作肾损害或疾病的标志。然而，由于感染、创伤、瘤形成、炎症以及置管和膀胱穿刺期间的意外污染，尿样品的血液污染是普遍观察到的事件。这在兽医学中是更深奥的问题。在健康群体中血清簇集蛋白浓度(60-100 µg/ml)是尿中浓度(<100 ng/ml)的1000倍。血液污染将非肾特异性簇集蛋白同种型带至尿中。因此，确保肾特异性簇集蛋白同种型的定量不受来自血液的血清簇集蛋白污染影响很重要。不能做到此可导致尿簇集蛋白测定中假阳性检验结果。本领域需要方法以区别身体样品中的簇集蛋白同种型。
发明概述
本发明提供特异性检测第一簇集蛋白同种型的方法。所述方法包括使样品接触特异性结合簇集蛋白的一种或多种抗体或其抗原结合片段和特异性结合至第一簇集蛋白同种型的碳水化合物部分并且不特异性结合至其它簇集蛋白同种型的碳水化合物部分的一种或多种分子。检测第一簇集蛋白、特异性结合簇集蛋白的一种或多种抗体或其抗原结合片段和特异性结合至第一簇集蛋白的碳水化合物部分并且不特异性结合至其它簇集蛋白同种型的碳水化合物部分的一种或多种分子的复合体。
本发明还提供检测肾特异性簇集蛋白的方法。所述方法包括使样品接触特异性结合簇集蛋白的一种或多种抗体或其抗原结合片段和特异性结合至肾特异性簇集蛋白的碳水化合物部分并且不特异性结合至其它簇集蛋白同种型(例如，血浆簇集蛋白、血清簇集蛋白或血源、非肾特异性簇集蛋白)的碳水化合物部分的一种或多种分子。检测肾特异性簇集蛋白、特异性结合簇集蛋白的一种或多种抗体或其抗原结合片段和特异性结合至肾特异性簇集蛋白的碳水化合物部分并且不特异性结合至其它簇集蛋白同种型的碳水化合物部分的一种或多种分子的复合体。所述特异性结合至肾特异性簇集蛋白的碳水化合物部分并且不特异性结合至其它簇集蛋白同种型(例如，血浆簇集蛋白、血清簇集蛋白或血源、非肾特异性簇集蛋白)的碳水化合物部分的一种或多种分子可为一种或多种外源凝集素或特异性结合N-乙酰氨基葡萄糖的一种或多种分子。所述一种或多种外源凝集素可为特异性结合N-乙酰氨基葡萄糖的外源凝集素。外源凝集素可为菜豆(Phaseolus vulgaris)白细胞凝集素(PHA-L)、麦胚凝集素(WGA)、WGA1、WGA2、WGA3、sWGA、菜豆凝集素-E (PHA-E)、番茄(Lycopersicon esculentum)外源凝集素(LEL)、曼陀罗(Datura stramonium)外源凝集素(DSL)、菜豆白细胞凝集素(PSA)或双花扁豆(Dolichos biflorus)外源凝集素(DBA)。
一种或多种抗体或其抗原结合片段可固体到载体上。样品和可检测地标记的特异性结合至肾特异性簇集蛋白的碳水化合物部分并且不特异性结合至其它簇集蛋白同种型的碳水化合物部分的一种或多种分子(可为外源凝集素)可加至载体。
特异性结合至肾特异性簇集蛋白的碳水化合物部分并且不特异性结合至其它簇集蛋白同种型的碳水化合物部分的一种或多种分子(可为外源凝集素)可固定到载体。样品和可检测地标记的一种或多种抗体或其抗原结合片段可加至载体。
一种或多种抗体或其抗原结合片段、特异性结合至肾特异性簇集蛋白的碳水化合物部分并且不结合至其它簇集蛋白同种型(例如，血浆簇集蛋白、血清簇集蛋白或血源、非肾特异性簇集蛋白)的碳水化合物部分的一种或多种分子或二者可用可检测的标记标记。
上述一种或多种外源凝集素可为不特异性结合血清和血浆簇集蛋白的外源凝集素。样品可为尿样品。检测可通过选自侧流测定、化学发光标记的夹心测定和酶联免疫吸附测定(ELISA)、竞争测定、凝集测定、化学发光测定、生物发光测定、凝胶电泳免疫测定方法、免疫组织化学测定、放射免疫测定(RIA)、无标记生物传感器测定或免疫放射测定的方法完成。抗体可特异性结合血浆簇集蛋白、血清簇集蛋白、重组簇集蛋白、肾特异性簇集蛋白或MDCK衍生的簇集蛋白。肾特异性簇集蛋白可为人的、猫的或犬的。
本发明的其它实施方案提供用于检测哺乳动物中的肾疾病、肾损伤或肾损害的方法。所述方法包括使来自哺乳动物的样品接触特异性结合簇集蛋白的一种或多种抗体或其抗原结合片段和特异性结合至肾特异性簇集蛋白的碳水化合物部分并且不特异性结合至其它簇集蛋白同种型(例如，血浆簇集蛋白、血清簇集蛋白或血源、非肾特异性簇集蛋白)的碳水化合物部分的一种或多种分子。检测肾特异性簇集蛋白、特异性结合簇集蛋白的一种或多种抗体或其抗原结合片段和特异性结合至肾特异性簇集蛋白的碳水化合物部分并且不特异性结合至其它簇集蛋白同种型的碳水化合物部分的一种或多种分子的复合体。如果检测到复合体，那么哺乳动物具有肾疾病、肾损伤或肾损害。如果哺乳动物具有肾疾病、肾损害或肾损伤，给予哺乳动物肾疗法或肾治疗学。肾疾病可为尿路感染。哺乳动物可为人、猫或犬。
本发明的其它实施方案提供区别一种或多种簇集蛋白同种型与其它类型的簇集蛋白同种型的方法。所述方法包括使样品接触特异性结合簇集蛋白的一种或多种抗体或其抗原结合片段和特异性结合至一种或多种簇集蛋白同种型的碳水化合物部分并且不结合至其它簇集蛋白同种型的碳水化合物部分的一种或多种分子。检测一种或多种簇集蛋白同种型、特异性结合簇集蛋白的一种或多种抗体或其抗原结合片段和特异性结合至一种或多种簇集蛋白同种型的碳水化合物部分并且不结合其它簇集蛋白同种型的碳水化合物部分的一种或多种分子的复合体。所述一种或多种簇集蛋白同种型可为肾特异性簇集蛋白并且其它簇集蛋白同种型可为，例如，血浆簇集蛋白、血清簇集蛋白或血源、非肾特异性簇集蛋白。所述一种或多种簇集蛋白同种型可为人的、猫的或犬的簇集蛋白同种型。
本发明的其它实施方案提供包含一种或多种簇集蛋白分子、特异性结合簇集蛋白的一种或多种抗体或其抗原结合片段和一种或多种外源凝集素的复合体。所述复合体可包含一种或多种肾特异性簇集蛋白分子、特异性结合簇集蛋白的一种或多种抗体或其抗原结合片段和特异性结合至肾特异性簇集蛋白的碳水化合物部分并且不结合至其它簇集蛋白同种型(例如，血浆簇集蛋白、血清簇集蛋白或血源、非肾特异性簇集蛋白)的碳水化合物部分的一种或多种分子。复合体可固定在任何类型的固体载体上。复合体可额外包含一种或多种可检测标记，其可与复合体的一种或多种分子关联。
本发明的其它实施方案提供试剂盒，其包括特异性结合簇集蛋白的一种或多种抗体或其抗原结合片段和特异性结合至肾特异性簇集蛋白的碳水化合物部分并且不结合其它簇集蛋白同种型(例如，血浆簇集蛋白、血清簇集蛋白或血源、非肾特异性簇集蛋白)的碳水化合物部分的一种或多种分子。所述一种或多种抗体或其抗原结合片段、特异性结合至肾特异性簇集蛋白的碳水化合物部分并且不结合至其它簇集蛋白同种型的碳水化合物部分的一种或多种分子或二者用可检测的标记标记。可检测的标记可为酶、酶缀合物、荧光化合物、化学放光化合物、放射活性元素、直接的视觉标记或磁粉。
本发明的其它实施方案提供改善簇集蛋白和簇集蛋白同种型检测的方法。所述方法包括使样品接触一种或多种簇集蛋白抗体或其特异性结合片段和特异性结合至簇集蛋白的一个或多个碳水化合物部分的一种或多种分子。以改善的灵敏度、特异性或二者检测一种或多种簇集蛋白抗体或其特异性结合片段和特异性结合至簇集蛋白的一个或多个碳水化合物部分的一种或多种分子的复合体。
因此，本发明提供用于检测和/或定量第一特定的簇集蛋白同种型的方法和组合物，任选在一种或多种第二簇集蛋白同种型存在下，使得所述一种或多种第二簇集蛋白同种型不显著干扰第一特定的簇集蛋白同种型的检测和/或定量。
附图简述
图1A-B显示掺入不同稀释的正常犬血清的正常(即，健康)犬尿中的簇集蛋白水平。
图2显示簇集蛋白对外源凝集素固相的结合。
图3显示市售簇集蛋白EIA和肾特异性簇集蛋白免疫测定在全血和血清二者中的比较。
图4显示来自犬庆大霉素模型的尿中肾特异性簇集蛋白的测量。
图5显示具有炎症性或缺血诱发的活动性肾损伤的狗的尿中肾特异性簇集蛋白的测量。
图6显示具有尿路感染(UTIs)的患者中肾特异性簇集蛋白的测量。
图7显示猫簇集蛋白的SDS-PAGE银染和蛋白质印记。组A. 来自ATCC的MDCK和CRFK细胞系的细胞培养物上清液的银染。B. 蛋白质印记显示抗簇集蛋白犬单克隆抗体的反应性，泳道2和3 MDCK (犬)簇集蛋白，4和5 血浆(犬)簇集蛋白，以及6和7 CRFK(猫)簇集蛋白。
图8显示在不同应激条件下生长的细胞中的人簇集蛋白表达。
图9显示结合至来自MDCK的簇集蛋白的兔抗β链簇集蛋白(泳道2、4)、HEK 293细胞上清液(泳道3)和阳性对照重组犬簇集蛋白β链抗原(泳道5)。
发明详述
如本文所使用的，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“所述”包括复数的指示对象，除非上下文另有清楚指示。与数值相关的术语“约”意指数值可加或减数值的5%或以下变化。
肾特异性簇集蛋白为急性肾损伤(AKI)生物标志，其在哺乳动物例如狗、猫和人中在肾损伤期间增加以及由于肾损伤增加。来自Biovendor的市售EIA试剂盒可用以定量血清和尿二者中的犬簇集蛋白。最近的研究使用该试剂盒在具有利什曼病的狗中确认了生物标志。然而，由于血清中高浓度的簇集蛋白，尿样品的血清污染可提供假阳性结果。由于血清簇集蛋白致使的污染，尿样品的血清污染导致肾特异性簇集蛋白的检测缺乏特异性。
为了证明来自一般总簇集蛋白测量的假阳性并发，将阴性犬尿样品使用市售试剂盒(Biovendor)赋予值，然后掺入阴性犬血清(0.002%-10% v/v)。将所得的混合物使用市售试剂盒分析，获得的结果在下表中显示：
市售的截断为约70 ng/ml。当测量总簇集蛋白(所有同种型)时，即使肉眼不可见的或常规尿分析(试纸(dipstick))检测不到的微小量的血液，即可导致假阳性。这意味着具有任何血液污染迹象的患者样品需要非常小心地评估，因为导致假临床诊断的假阳性的可能性增加。本发明提供鉴定体液中特定的簇集蛋白同种型的方法，例如，测定肾特异性簇集蛋白的存在情况和/或量而不受血清簇集蛋白干扰。即，本发明可用于在其它簇集蛋白同种型存在下检测和/或定量特定的簇集蛋白同种型的方法，例如肾特异性簇集蛋白。
所有簇集蛋白同种型的一级结构高度同源。然而，认为不同簇集蛋白同种型之间的翻译后修饰模式将会存在差异。簇集蛋白同种型上的特定寡糖结构与组织源、生理学状态、疾病状态和物种相关。本发明的方法利用这些差异开发用于患者样品(例如，尿样品)中特定的簇集蛋白同种型(例如，肾损伤特异性簇集蛋白同种型)的检测方法。
簇集蛋白同种型
如本文所使用的“簇集蛋白同种型”为作为基因剪接或重复事件的产物的簇集蛋白分子，其为糖基化的(参见，例如，Rizzi等人, Adv. Cancer Res. 104:9 (2009); Prochnow等人, PLOS One, 8:e75303 (2013))。簇集蛋白同种型包括核、细胞质和分泌的形式。“簇集蛋白同种型”还包括簇集蛋白糖形，其为由于，例如，在特定组织类型中表达、在特定生理学状态表达、在特定物种类型表达、在特定疾病状态中表达或在细胞损伤条件下表达而差别地糖基化的簇集蛋白形式。
“肾特异性簇集蛋白”或“肾特异性簇集蛋白同种型”为肾脏系统(即，肾、输尿管、尿路和膀胱)中产生的簇集蛋白，其可存在于肾脏系统包括尿中。然而，小量的肾特异性簇集蛋白可泄露入血液、血清或血浆中。与无肾损伤、肾损害和/或肾疾病的动物和人相比，增加的肾特异性簇集蛋白水平可存在于具有肾损伤、肾损害和/或肾疾病的动物和人的肾脏系统(包括尿)中。
“血清簇集蛋白”和“血浆簇集蛋白”为在组织例如心脏、肝脏和肺中合成并释放入血液、血浆或其级分的循环中的簇集蛋白同种型。“血清簇集蛋白”和“血浆簇集蛋白”不包括源于肾脏系统的肾特异性簇集蛋白或源于肾脏系统然后泄露入循环血液、血清、血浆或其级分的肾特异性簇集蛋白。非肾特异性簇集蛋白同种型为不在肾脏系统中产生的那些簇集蛋白同种型(例如，血清或血浆簇集蛋白)。血源簇集蛋白同种型为循环血液、血浆或血清或其级分中存在的那些。
分泌的簇集蛋白从初始的蛋白前体，前分泌psCLU (~60 kDa)产生，高度糖基化，然后在内质网(ER)中切割。所得的α-和β-肽链在成熟的分泌的异二聚体蛋白形式(~75-80kDa)中通过5个二硫键维持在一起。
簇集蛋白的糖基化对于不同的簇集蛋白同种型可不同。例如，肾特异性簇集蛋白和血清或血浆簇集蛋白可具有不同的糖基化模式。簇集蛋白同种型之间的这种糖基化差异可用于区别一个簇集蛋白同种型与其它簇集蛋白同种型。
簇集蛋白同种型可使用本发明方法在，例如，哺乳动物、人、犬、猫、马、牛、羊、类人猿和其它动物中区分。区分包括，例如，在一种或多种第二类型的簇集蛋白同种型存在下测定第一簇集蛋白同种型的存在或不存在情况。
抗体
本发明的抗体为特异性结合簇集蛋白的抗体分子或其抗原结合片段。抗体或其抗原结合片段对于人、犬、猫、马、牛、羊或类人猿簇集蛋白可以是特异的。抗体或其抗原结合片段对于任何类型的簇集蛋白同种型(例如，肾特异性簇集蛋白、血浆簇集蛋白或血清簇集蛋白)可以是特异的。在本发明的实施方案中，抗体或其抗原结合片段特异性结合肾特异性簇集蛋白。在其它实施方案中，抗体或其抗原结合片段特异性结合一种或多种簇集蛋白同种型、所有簇集蛋白同种型、血清簇集蛋白或血浆簇集蛋白。本发明的抗体可为多克隆抗体、单克隆抗体、单链抗体(scFv)、双特异性抗体、多特异性抗体、嵌合抗体、单价抗体、双价抗体、多价抗体、抗独特型抗体或抗体的抗原或特异性结合片段。抗体的抗原结合片段或特异性结合片段为完整抗体的一部分，包含完整抗体的抗原结合位点或可变区。抗原结合抗体片段的实例包括Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fd、单链Fvs (scFv)、二硫键连接的Fvs(sdFv)、包含VL或VH结构域或VL结构域和VH结构域的片段以及Fv片段。
本发明的抗体可为任何抗体类别，包括例如，IgG (IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgG4)、IgM、IgA (IgA1、IgA2)、IgD和IgE。抗体或其抗原结合片段结合簇集蛋白分子(例如肾特异性簇集蛋白分子、血浆簇集蛋白分子或血清簇集蛋白分子)的一个或多个表位。抗体可在合适的实验室动物中体内制造或使用重组DNA技术体外制造。用于制备和表征抗体的手段为本领域所熟知。参见，例如，Dean, Methods Mol. Biol. 80:23-37 (1998); Dean,Methods Mol. Biol. 32:361-79 (1994); Baileg, Methods Mol. Biol. 32:381-88(1994); Gullick, Methods Mol. Biol. 32:389-99 (1994); Drenckhahn等人 Methods Cell. Biol. 37:7-56 (1993); Morrison, Ann. Rev. Immunol. 10:239-65 (1992);Wright等人 Crit. Rev. Immunol. 12:125-68 (1992)。例如，多克隆抗体可通过将簇集蛋白分子或簇集蛋白分子的部分给予动物(例如人或其它灵长类、小鼠、大鼠、兔、荷兰猪、山羊、猪、狗、奶牛、绵羊、驴或马)来产生。收集来自免疫动物的血清，并且通过例如，用硫酸铵沉淀接着通过色谱(例如亲和色谱)从血浆纯化抗体。用于产生和处理多克隆抗体的技术为本领域所已知。
“特异性结合”或“对其特异”意指第一抗原，例如，簇集蛋白或其部分，识别并以比其它非特异性分子更高的亲和力结合至抗体或其抗原结合片段。非特异性分子为不与第一抗原共享共同表位的抗原。在本发明的实施方案中，非特异性分子不是簇集蛋白同种型并且与簇集蛋白无关。例如，针对第一抗原(例如，簇集蛋白分子)产生的抗体(其比对非特异性抗原更有效地结合至第一抗原)可描述为特异性结合至第一抗原。在本发明的实施方案中，当以107 l/mol或更高的结合亲和力Ka结合时，抗体或其抗原结合片段特异性结合至簇集蛋白分子或其部分。在本发明中，抗体或抗原结合片段可特异性结合至2种或更多种簇集蛋白同种型或仅可特异性结合至一种簇集蛋白同种型，例如，肾特异性簇集蛋白。特异性结合可使用，例如，酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)或蛋白质印记测定，使用本领域所熟知的方法学来检验。
本发明的抗体可为嵌合的(参见，例如，美国专利号5,482,856)、人源化的(参见，例如，Jones等人,Nature 321:522 (1986); Reichmann等人, Nature 332:323 (1988);Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593 (1992))、犬化的、犬或人抗体。人抗体可通过，例如，直接永生化、噬菌体展示、转基因小鼠或Trimera方法学制造，参见例如，Reisener等人,Trends Biotechnol. 16:242-246 (1998)。
用于检测簇集蛋白分子的测定可利用一种抗体或其抗原结合片段或一种或多种抗体或其片段(例如，1、2、3、4、5、10或更多的抗体)。用于簇集蛋白的测定可使用，例如，对于一个簇集蛋白表位特异的单克隆抗体、对于一个簇集蛋白分子的表位特异的单克隆抗体的组合、对于不同簇集蛋白的表位特异的单克隆抗体、对于同一簇集蛋白表位特异的多克隆抗体、对于不同簇集蛋白的表位特异的多克隆抗体、或单克隆和多克隆抗体的组合。测定方案可基于例如竞争、直接反应或夹心性测定，所述竞争、直接反应或夹心性测定使用例如标记的抗体。
本发明的抗体可用本领域已知的任何类型的标记标记，包括，例如，荧光、化学发光、放射性、酶、胶体金属、放射性同位素和生物发光标记。
特异性结合簇集蛋白的抗体包括，例如，9H7、3A4、2F2、对于簇集蛋白的α链特异的抗体、对于簇集蛋白的β链特异的抗体、抗簇集蛋白尿同种型、Hs-3、3R3-2、CLI-9、1A11、2F12、A4、7D1、3R3/2、簇集蛋白C-Term抗体、簇集蛋白同种型I抗体、CLU (AA 1-333)(N-Term)抗体、CLU N-Term (AA 79-99)抗体、CLU (AA 312-325)抗体、CLU (AA 44-58)抗体、CLU (AA 402-501)抗体、CLU (AA 75-501)抗体、CLU (AA 312-325)抗体、抗体LS-B6759、抗体LS-B3762、抗体LS-B2937和LS-B2852、抗体16B5。抗体可特异性结合肾特异性簇集蛋白或肾特异性簇集蛋白和其它形式的簇集蛋白(例如，血清或血浆簇集蛋白)这二者。
外源凝集素
外源凝集素为识别或结合特定单糖或寡糖结构(碳水化合物)的蛋白质。外源凝集素通常包含两个或更多个用于碳水化合物单元的结合位点。某一外源凝集素的碳水化合物结合特异性通过结合碳水化合物的氨基酸残基确定。外源凝集素对碳水合化物的结合强度可随分子相互作用的数目增加。外源凝集素对碳水化合物的结合解离常数为约Kd 10-5~10-7。“特异性结合”或“对其特异”意指第一外源凝集素(例如，WGA)识别并且以比对于其它非特异性类型的碳水化合物更大的亲和力结合至特定类型的碳水化合物(例如，对于WGA的N-乙酰氨基葡萄糖)。碳水化合物的特定类型与特定的簇集蛋白同种型(例如，肾特异性簇集蛋白或物种特异性簇集蛋白)相关，并且不与一种或多种其它簇集蛋白同种型(例如，血清簇集蛋白)显著相关。例如，比对非特异性碳水化合物更有效地结合至第一特定类型的碳水化合物的外源凝集素可描述为特异性结合至第一特定类型的碳水化合物。在本发明的实施方案中，当外源凝集素以比非特异性碳水合物的结合低约5、10、20、30、40、50、60%或更多的Kd结合至第一特定类型的碳水化合物时，外源凝集素比对非特异性碳水化合物更有效地结合至第一特定类型的碳水化合物。在本发明的实施方案中，当其以解离常数Kd约10-5~10-7结合时，外源凝集素特异性结合至特定类型的碳水化合物。在本发明中，外源凝集素可特异性结合至2种或更多种特定类型的碳水化合物或仅可特异性结合至一种特定类型的碳水化合物。
外源凝集素可用本领域已知的任何类型的标记标记，包括，例如，荧光、化学放光、放射性、酶、胶体金属、放射性同位素和生物发光标记。
在本发明的实施方案中，使用特异性结合肾特异性簇集蛋白并且不特异性结合血浆或血清簇集蛋白的外源凝集素。在本发明的实施方案中，特异性结合N-乙酰氨基葡萄糖的外源凝集素可用在本发明中。这样的外源凝集素包括，例如，WGA (麦胚凝集素)、WGA1、WGA2、WGA3、sWGA、DSL外源凝集素(曼陀罗外源凝集素)、甘露糖结合外源凝集素、PHA-L (菜豆白细胞凝集素)、PHA-E (菜豆赤凝集素(erythoagglutanin))和LEL(番茄(Lycopersicon esculentum)(西红柿)外源凝集素)。可使用的其它外源凝集素包括，例如木菠萝凝集素、STL外源凝集素(马铃薯(Solanum tuberosum))、LCA外源凝集素(兵豆(Lens culinaris))、PSA外源凝集素(菜豆白细胞凝集素)、ECL外源凝集素(鸡冠刺桐(Erythina cristagalli))、RCA外源凝集素(蓖麻(Ricin communis))、DBA外源凝集素(双花扁豆(Dolichos biflorus))、SBA外源凝集素(大豆)和CONA外源凝集素(伴刀豆凝集素)。外源凝集素可从例如Vector Laboratories市售获得。
可使用特异性结合人、犬、猫、马、牛、羊或类人猿簇集蛋白同种型上的碳水化合物的外源凝集素。也可使用特异性结合一种或多种血浆、血清或肾簇集蛋白同种型并且不结合其它簇集蛋白同种型的外源凝集素。
特异性结合至第一簇集蛋白同种型的碳水化合物部分并且不特异性结合至其它 簇集蛋白同种型的碳水化合物部分的分子
在本发明的实施方案中，特异性结合至第一簇集蛋白同种型(例如，肾特异性簇集蛋白或物种特异性簇集蛋白，例如，犬、猫或人肾特异性簇集蛋白)的碳水化合物部分并且不特异性结合至其它簇集蛋白同种型的碳水化合物部分的一种或多种分子可用在本发明的测定中。其它簇集蛋白同种型可为，例如，血清簇集蛋白或血浆簇集蛋白。在一个实例中，特异性结合至肾特异性簇集蛋白同种型的碳水化合物部分并且不特异性结合至血源、非肾特异性簇集蛋白同种型的碳水化合物部分的一种或多种分子可用在本发明的测定中。这样的分子的实例包括上文讨论的外源凝集素和特异性结合N-乙酰氨基葡萄糖的分子。
“特异性结合”或“对其特异”意指第一分子特异性结合至第一簇集蛋白同种型(例如，肾特异性簇集蛋白或物种特异性簇集蛋白)的碳水化合物部分并且不特异性结合至一种或多种其它簇集蛋白同种型的碳水化合物部分。所述第一分子识别和以比其它非特异性碳水化合物更大的亲和力结合至出现在第一簇集蛋白同种型上并且不显著出现在一种或多种第二簇集蛋白同种型上的特定类型的碳水化合物(例如，对于细菌几丁质-结合结构域3蛋白的N-乙酰氨基葡萄糖，其中N-乙酰氨基葡萄糖为出现在肾特异性簇集蛋白同种型上并且不显著出现在血清簇集蛋白同种型上的碳水化合物)。例如，比对非特异性碳水化合物更有效地结合第一特定类型的碳水化合物的第一分子可描述为特异性结合至第一特定类型的碳水化合物。
在本发明的实施方案中，当其以比对非特异性碳水合物的结合低约5、10、20、30、40、50、60%或更多的Kd结合至第一特定类型的碳水化合物时，特异性结合至第一簇集蛋白同种型的碳水化合物部分并且不特异性结合至其它簇集蛋白同种型的碳水化合物部分的第一分子比对非特异性碳水化合物更有效地结合至第一特定类型的碳水化合物。不特异性结合至其它簇集蛋白同种型的碳水化合物部分的第一分子意指所述分子经由第一簇集蛋白同种型的特定碳水化合物部分特异性结合至并且不特异性结合至第二簇集蛋白同种型的碳水化合物部分，以致于结合第一簇集蛋白同种型可在第二簇集蛋白同种型存在下检测和/或定量，其中第二簇集蛋白同种型的存在不显著干扰第一簇集蛋白同种型的检测和/或定量。在本发明的实施方案中，当其以解离常数Kd约10-5-10-7结合时，第一分子特异性结合至特定类型的碳水化合物。在本发明中，第一分子可特异性结合至2种或更多种特定类型的碳水化合物或仅可特异性结合至一种特定类型的碳水化合物。
在本发明的实施方案中，结合N-乙酰氨基葡萄糖的一种或多种分子可用于特异性结合肾特异性簇集蛋白。结合N-乙酰氨基葡萄糖的一种或多种分子包括，例如，野生型WGA(麦胚凝集素)、突变形式的WGA (例如，WGA1、WGA2、WGA3，参见Parasuraman等人 J. Mol.Recognit. (2014) 27:482-92)、大麦外源凝集素(BL)、水稻外源凝集素、荨麻(Uritica dioica)凝集素(UDA)、橡胶素、菜豆几丁质酶(PVC)、马铃薯伤口诱导蛋白1 (WIN1)、马铃薯伤口诱导蛋白2 (WIN2)、马铃薯几丁质酶(STC)、烟草几丁质酶(TC)、白杨伤口诱导蛋白(POP)、细菌N-乙酰氨基葡萄糖-结合蛋白A (GbpA) (来自，例如，霍乱弧菌(Vibriocholera)、奥奈达希瓦氏菌(Shewanella onedensis)、波罗的海希瓦氏菌(Shewanella baltica)、费氏弧菌(Vibrio fascheri)、南美林兔弧菌(Vibrio tapetis)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、莫氏耶尔森菌(Yersinia mollaretii)、阿氏耶尔森菌(Yersinia aldovae)) CBP70、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum) Pf120、Pf83和Pf45GlcNAc-结合蛋白、Arsenophonus nasonieae n-乙酰氨基葡萄糖-结合蛋白、细菌几丁质结合结构域3蛋白(来自，例如，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、Burkholderia ambifaria)、来自酸豆(Tamarindus indica)的N-乙酰氨基葡萄糖几丁质酶样外源凝集素、来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的韧皮部蛋白2(PP2、PP2-1A1)、橄榄绿链霉菌(Streptomyces olivaceoviridis) NgcE、尿激酶纤溶酶原激活受体相关蛋白/ENDO180、釉原蛋白和减毒的鼠巨细胞病毒。
测定
本发明的方法可用于检测检验样品，例如生物学样品或实验室样品中的簇集蛋白同种型(例如，肾特异性簇集蛋白或物种特异性簇集蛋白，例如犬、人或猫肾特异性簇集蛋白)。检验样品可潜在地包含(1) 肾特异性簇集蛋白，(2) 肾特异性簇集蛋白和血清簇集蛋白，(3) 肾特异性簇集蛋白和一种或多种类型的其它非肾特异性簇集蛋白，(4) 一种或多种类型的其它非肾特异性簇集蛋白；或(5) 无簇集蛋白。生物学样品可包括，例如，来自哺乳动物例如马、牛、羊、猫、狗、小鼠、大鼠、类人猿或人的组织、尿、血液、血清、血浆、唾液、痰、粪便、脑脊液、羊膜液或伤口渗出物。检验样品可为未处理的、沉淀的、分级的、分离的、稀释的、浓缩的或纯化的。在本发明的实施方案中肾特异性簇集蛋白渗漏入血液、血浆或血清中并且可在其中检测。
本发明的方法可用于通过提供使用与特异性结合至簇集蛋白的一个或多个碳水化合物部分的分子(例如，外源凝集素)组合的簇集蛋白抗体或其特异性结合片段这二者的测定，来改善簇集蛋白和簇集蛋白同种型的检测。所述方法包括使样品接触一种或多种簇集蛋白抗体或其特异性结合片段和特异性结合至簇集蛋白的一个或多个碳水化合物部分的一种或多种分子。以改善的灵敏度、特异性或二者检测一种或多种簇集蛋白抗体或其特异性结合片段和特异性结合至簇集蛋白的一个或多个碳水化合物部分的一种或多种分子的复合体。灵敏度或特异性可提高约2、5、10、20、30、40、50%或更多。
在某些实施方案中，本发明的方法可用于检测特定的簇集蛋白同种型(例如，肾特异性簇集蛋白或物种特异性簇集蛋白)。所述方法包括使特异性结合簇集蛋白的一种或多种抗体或其抗原结合片段和特异性结合肾特异性簇集蛋白的一种或多种其它分子(例如，特异性结合至肾特异性簇集蛋白的碳水化合物部分并且不结合其它簇集蛋白同种型的碳水化合物部分的分子)在允许肾特异性簇集蛋白、抗体或其抗原结合片段和特异性结合肾特异性簇集蛋白的一种或多种其它分子的复合体形成的条件下接触检验样品。然后检测复合体。复合体的存在情况指示肾特异性簇集蛋白的存在情况。复合体的不存在指示肾特异性簇集蛋白不存在。本领域技术人员熟悉用于检测复合体结合的测定和条件。复合体可包括，例如，一种或多种肾特异性簇集蛋白分子、特异性结合簇集蛋白的一种或多种抗体和特异性结合肾特异性簇集蛋白并且不特异性结合其它簇集蛋白同种型的一种或多种其它分子。其它形式的簇集蛋白可为，例如，血源、非肾特异性簇集蛋白同种型。复合体的量可测定并且可用于建立疾病的严重性。
本发明的测定可用于，例如，区别肾特异性簇集蛋白与其它类型的簇集蛋白同种型，检测样品中的肾特异性簇集蛋白，定量样品中的肾特异性簇集蛋白，区别一种或多种簇集蛋白同种型(例如，肾特异性簇集蛋白、血清簇集蛋白、血浆簇集蛋白、物种特异性簇集蛋白同种型)与其它簇集蛋白同种型，定量样品中的簇集蛋白同种型或检测样品中的特定簇集蛋白同种型。
本发明的实施方案提供区别一种或多种簇集蛋白同种型与其它类型的簇集蛋白同种型的方法。所述方法包括使样品接触特异性结合簇集蛋白的一种或多种抗体或其抗原结合片段和特异性结合一种或多种簇集蛋白同种型(例如肾特异性簇集蛋白)的碳水化合物部分并且不结合其它簇集蛋白同种型(例如，血浆簇集蛋白、血清簇集蛋白或血源、非肾特异性簇集蛋白同种型)的碳水化合物部分的一种或多种分子。检测包含一种或多种簇集蛋白同种型、特异性结合簇集蛋白的一种或多种抗体或其抗原结合片段和特异性结合至一种或多种簇集蛋白同种型的碳水化合物部分并且不结合至其它簇集蛋白同种型的碳水化合物部分的一种或多种分子的复合体。所述一种或多种簇集蛋白同种型可为哺乳动物、人、犬、猫、马、牛、羊或类人猿簇集蛋白同种型。
竞争测定可用在本发明的方法中。例如，特异性结合簇集蛋白的一种或多种抗体或其抗原结合片段可固定在载体上。将结合至可检测地标记的外源凝集素的肾特异性簇集蛋白和用特异性结合肾特异性簇集蛋白的未标记的外源凝集素处理的样品加至载体。检测未结合到一种或多种抗体或其抗原结合片段的可检测标记的外源凝集素-肾特异性簇集蛋白的量。未结合到一种或多种抗体或抗原结合片段的可检测标记的外源凝集素-肾特异性簇集蛋白的量与样品中肾特异性簇集蛋白的量成比例。或者，将未结合到一种或多种抗体或抗原结合片段的可检测标记的外源凝集素-肾特异性簇集蛋白洗去并检测剩余的可检测标记的外源凝集素-肾特异性簇集蛋白。或者，测定可以以将特异性结合簇集蛋白同种型的一种或多种外源凝集素固定在载体上开始。将结合至特异性结合簇集蛋白的一种或多种可检测标记的抗体或其抗原结合片段的肾特异性簇集蛋白连同用特异性结合肾特异性簇集蛋白的未标记的抗体处理的样品加至载体。检测如上所述完成。
本发明的方法可通过从，例如，疑似具有肾疾病或肾损害的人或哺乳动物获得检验样品用在诊断或检测肾疾病、肾损伤或肾损害中。所述方法包括使来自哺乳动物的样品接触特异性结合至簇集蛋白的一种或多种抗体和特异性结合至一种或多种簇集蛋白同种型(例如，肾特异性簇集蛋白)的碳水化合物部分并且不特异性结合至其它簇集蛋白同种型(例如，血浆簇集蛋白、血清簇集蛋白或血源、非肾特异性簇集蛋白同种型)的一种或多种分子。本领域技术人员知道使得能够并且适于形成复合体的条件。检测肾特异性簇集蛋白、特异性结合至簇集蛋白的一种或多种抗体和特异性结合至簇集蛋白的碳水化合物部分并且不特异性结合其它簇集蛋白同种型的一种或多种一种或多种分子的复合体，所述其它簇集蛋白同种型特异性结合肾特异性簇集蛋白。如果复合体检测到，那么哺乳动物诊断为肾疾病、肾损伤或肾损害。复合体的量可通过本领域已知的任何方法学测定。比对照样品中形成的水平更高的水平指示肾损害、肾损伤或肾疾病。对照样品为不包含肾特异性簇集蛋白或以在无肾疾病、肾损伤或肾损害的人或哺乳动物中观察到的水平包含肾特异性簇集蛋白的样品。两种类型的对照样品均可用在测定中。如果哺乳动物具有肾疾病或肾损害，可给予哺乳动物肾疗法或肾治疗学。
在实施方案中，犬肾特异性簇集蛋白可用一种或多种簇集蛋白抗体或其抗原结合片段和一种或多种PHA-L、WGA、sWGA、STL、LEL、PHA-E或DSL外源凝集素检测。在实施方案中，猫肾特异性簇集蛋白可用一种或多种簇集蛋白抗体或其抗原结合片段和一种或多种木菠萝凝集素、ECL、LCA、RCA、PHA-E、WGA、PSA、DSL、DBA、PHA-L、SBA或CONA外源凝集素检测。在实施方案中，猫和犬肾特异性簇集蛋白可用一种或多种簇集蛋白抗体或其抗原结合片段和一种或多种WGA、sWGA、DSL、PHA-L或PHA-E外源凝集素检测。在实施方案中，人和猫肾特异性簇集蛋白可用一种或多种簇集蛋白抗体或其抗原结合片段和一种或多种PSA或DBA外源凝集素检测。
肾损害、肾损伤和肾疾病包括，例如，急性肾损伤(AKI；肾损害的功能和结构病症或体征，包括来自血液和尿检验或小于3个月的组织成像的任何缺陷)、进展性或恶化的肾损伤、早期AKI、轻度AKI、中度AKI、严重AKI、慢性肾脏/肾疾病、糖尿病肾病、急性肾小管坏死、急性间质性肾炎、肾小球性肾病、肾小球肾炎、近端和远端管损害、肾血管炎、肾动脉阻塞、肾缺血性损伤、肿瘤溶解综合征、横纹肌溶解、尿路梗阻、肾前性氮血症、肾静脉血栓形成、心肾综合征、肝肾综合征、肺肾综合征、腹腔间隔室综合征、尿路感染、上尿路感染、下尿路感染、来自肾毒性剂的损伤、膀胱癌、肾癌、泌尿癌或或造影剂肾病。
本发明的方法可比已知方法(例如，血清肌酸酐测定)更早地检测肾疾病、肾损伤和肾损害。本发明的方法可在检测的肾疾病、肾损伤和肾损害发病约5、4、3、2、1或更少天内检测肾疾病、肾损伤和肾损害。
在本发明的实施方案中，当可检测标记(例如，酶缀合物或其它可检测标记)催化或提供可检测反应时，复合体被检测到，所述可检测标记结合至上述一种或多种抗体、上述特异性结合肾特异性簇集蛋白的碳水化合物部分并且不特异性结合其它簇集蛋白同种型(例如，血清簇集蛋白、血浆簇集蛋白或血源、非肾特异性簇集蛋白同种型)的碳水化合物部分的一种或多种其它分子，或这二者。任选地，在允许形成可检测的标记复合体的条件下，可将包含信号产生化合物的一种或多种可检测标记施用于复合体。可检测的标记复合体包括簇集蛋白、特异性结合簇集蛋白的一种或多种抗体或其抗原结合片段、特异性结合簇集蛋白的碳水化合物部分并且不特异性结合其它簇集蛋白同种型的碳水化合物部分的一种或多种其它分子和一种或多种可检测标记的分子。检测上述可检测的标记复合体。任选地，上述一种或多种抗体或特异性结合至簇集蛋白的碳水化合物部分并且不特异性结合至其它簇集蛋白同种型的碳水化合物部分的一种或多种其它分子可在形成可检测的标记复合体之前用可检测的标记标记。上述方法可任选包括阳性或阴性对照。
包含簇集蛋白、特异性结合簇集蛋白的一种或多种抗体、特异性结合肾特异性簇集蛋白的碳水化合物部分并且不特异性结合其它簇集蛋白同种型(例如血浆簇集蛋白、血清簇集蛋白或血源、非肾特异性簇集蛋白同种型)的碳水化合物部分的一种或多种其它分子的复合体也可使用不需要标记或可检测标记试剂的方法检测。例如，表面等离子体共振生物传感器、Corning EPIC®生物传感器或比色共振反射生物传感器可用于以无标记方式检测本发明的复合体。
本发明的一个实施方案包括包含一种或多种簇集蛋白分子、特异性结合簇集蛋白的一种或多种抗体或其抗原结合片段和一种或多种外源凝集素的复合体。上述复合体可包含一种或多种肾特异性簇集蛋白分子、特异性结合簇集蛋白的一种或多种抗体或抗原结合片段和特异性结合至肾特异性簇集蛋白的碳水化合物部分并且不结合其它簇集蛋白同种型(例如血浆簇集蛋白、血清簇集蛋白或血源、非肾特异性簇集蛋白同种型)的碳水化合物部分的一种或多种分子。上述复合体可任选包含共价或非共价结合至复合体的任何组分的一种或多种可检测标记。上述复合体可固定到固体载体。
在本发明的实施方案中，将特异性结合簇集蛋白的一种或多种抗体固定到固相或基底。将检验样品加至上述基底。将特异性结合肾特异性簇集蛋白的碳水化合物部分并且不特异性结合其它簇集蛋白同种型(例如血浆簇集蛋白、血清簇集蛋白或血源、非肾特异性簇集蛋白同种型)的碳水化合物部分的一种或多种其它分子在检验样品以前、与检验样品一起或在检验样品之后加至上述基底。可将上述特异性结合肾特异性簇集蛋白的碳水化合物部分并且不特异性结合其它簇集蛋白同种型的碳水化合物部分一种或多种其它分子可检测地标记。洗涤步骤可在每一次加至上述基底之前进行。上述可检测标记可直接检测或经由例如，加入以与可检测标记反应的生色团或酶底物，来间接检测。使得可检测的反应(例如，显色)发展。将反应终止并且可检测的反应可使用，例如，分光光度计定量。该类型的测定可定量检验样品中肾特异性簇集蛋白的量。
在本发明的实施方案中，将特异性结合至肾特异性簇集蛋白的碳水化合物部分并且不特异性结合至其它簇集蛋白同种型(例如血浆簇集蛋白、血清簇集蛋白或血源、非肾特异性簇集蛋白同种型)的碳水化合物部分的一种或多种其它分子附着到固相或基底上。将检验样品加至上述基底。将特异性结合肾特异性簇集蛋白的一种或多种抗体在检验样品之前、与检验样品一起或在检验样品之后加至基底。可将上述一种或多种抗体或其抗原结合片段可检测地标记。洗涤步骤可在每一次加至上述基底之前进行。上述抗体标记可直接检测或经由例如，加入上述衬底以与可检测标记反应的生色团或酶底物，来间接检测。让可检测的反应(例如，显色)发展。将可检测的反应终止并且反应可使用，例如，分光光度计定量。该类型的测定可定量检验样品中肾特异性簇集蛋白的量。
在本发明的实施方案中，将样品耗尽第一簇集蛋白同种型(或多个簇集蛋白同种型)以便更好地检测第二簇集蛋白同种型(或多个其它簇集蛋白同种型)。使样品接触特异性结合第一簇集蛋白同种型的一种或多种外源凝集素以致于形成一种或多种外源凝集素和一种或多种第一簇集蛋白同种型的复合体。在一个实例中，DC-SIGN外源凝集素特异性结合精液簇集蛋白的碳水化合物部分，但不结合血清簇集蛋白的碳水化合物部分。或者，使样品接触特异性结合至第一簇集蛋白同种型的碳水化合物部分并且不特异性结合至第二簇集蛋白同种型的碳水化合物部分的一种或多种分子，以致于形成特异性结合至第一簇集蛋白同种型的碳水化合物部分并且不特异性结合至第二簇集蛋白同种型的碳水化合物部分的一种或多种分子和一种或多种第一簇集蛋白同种型的复合体。上述复合体可然后任选通过例如沉淀，从样品移除。用于第二簇集蛋白的测定可使用例如，本发明的任何测定进行。或者，一旦第一簇集蛋白同种型从样品耗尽(例如，使所述样品接触一种或多种簇集蛋白特异性抗体和检测簇集蛋白/抗体复合体)，可进行用于第二簇集蛋白同种型的任何测定。使用两种抗体的夹心测定或使用一种抗体的直接测定均可使用。
在本发明的实施方案中，将样品耗尽非肾特异性簇集蛋白以便更好地检测肾特异性簇集蛋白。使样品接触特异性结合一种或多种非肾特异性簇集蛋白同种型(例如，血清或血浆簇集蛋白同种型)的一种或多种外源凝集素以致于形成一种或多种外源凝集素和一种或多种非肾特异性簇集蛋白同种型的复合体。WGA不结合血浆簇集蛋白并且结合肾特异性簇集蛋白。或者，样品可接触特异性结合至非肾特异性簇集蛋白的碳水化合物部分并且不特异性结合至肾特异性簇集蛋白同种型的碳水化合物部分的一种或多种分子，以致于形成特异性结合至非肾特异性簇集蛋白同种型的碳水化合物部分并且不特异性结合至肾特异性簇集蛋白同种型的碳水化合物部分的一种或多种分子和一种或多种非肾特异性簇集蛋白同种型的复合体。上述复合体可然后从样品移除。用于肾特异性簇集蛋白的测定可进行，例如，本发明的任何测定。或者，一旦非肾特异性簇集蛋白同种型从样品耗尽(例如，使样品接触一种或多种簇集蛋白特异性抗体和检测簇集蛋白/抗体复合体)，可进行用于肾特异性簇集蛋白的任何测定。使用两种抗体的夹心测定或使用一种抗体的直接测定均可使用。
本发明的测定包括，但不限于基于竞争、直接反应或夹心型测定的那些，包括，但不限于酶联免疫吸附测定(ELISA)、竞争测定、蛋白质印记、IFA、放射免疫测定(RIA)、血凝测定(HA)、凝集测定、荧光偏振免疫测定(FPIA)和微孔板测定(在微孔板的一个或多个孔中进行的任何测定)。本发明的一个测定包括可逆流动色谱结合测定，例如SNAP®测定。参见美国专利号5,726,010。
测定可使用固相、基底或载体或可通过免疫沉淀或不利用载体的任何其它方法进行。在使用固相、基底或载体时，将一种或多种抗体、特异性结合肾特异性簇集蛋白的碳水化合物部分并且不特异性结合其它簇集蛋白同种型的碳水化合物部分的一种或多种其它分子或其组合，直接或间接附着到载体或基底，例如微孔板、磁珠、非磁珠、柱、基质、膜、玻璃、聚苯乙烯、右旋糖酐、尼龙、淀粉酶类、天然和改性的纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖、磁铁矿(magletite)、包含合成或天然纤维的纤维垫(例如，玻璃或纤维素基材料或热塑性聚合物，例如，聚乙烯、聚丙烯或聚酯)、包含颗粒材料的烧结结构(例如，玻璃或各种热塑性聚合物)或包含硝酸纤维素、尼龙、聚砜等(一般为本质上合成的)的铸膜。在本发明的实施方案中基底为烧结的聚乙烯细粒，通常称为多孔聚乙烯，例如，来自Chromex Corporation(Albuquerque, NM)的10-15微米多孔聚乙烯。所有这些基底材料均可以以适当的形状使用，例如膜、片或板，或其可包覆到、结合到或层压到适当的惰性载体，例如纸、玻璃、塑料膜或织物上。适当的用于将抗体、蛋白质和外源凝集素固定到固相上的方法包括离子、疏水、共价相互作用等。
抗体、外源凝集素或的特异性结合至一种或多种簇集蛋白同种型(例如，肾特异性簇集蛋白)的碳水化合物部分并且不特异性结合至其它簇集蛋白同种型(例如血浆簇集蛋白、血清簇集蛋白或血源、非肾特异性簇集蛋白同种型)的碳水化合物部分的分子可通过例如吸附或通过共价键附着到固体载体，以致分子保留其选择性结合活性。任选地，可包括间隔基以使得分子的结合位点保持为可接近的。固定的分子可随后用于结合来自样品(例如生物学样品，包括唾液、血清、痰、血液、尿、排泄物、脑脊液、羊膜液、伤口渗出物或组织)的簇集蛋白分子。
复合体(例如，一种或多种下列：(1) 簇集蛋白、抗体或其抗原结合片段、特异性结合至一种或多种簇集蛋白同种型(例如，肾特异性同种型)的碳水化合物部分并且不特异性结合至其它簇集蛋白同种型(例如血浆簇集蛋白、血清簇集蛋白或血源、非肾特异性簇集蛋白同种型)的碳水化合物部分的分子；(2) 可检测标记、簇集蛋白、抗体或其抗原结合片段、特异性结合至一种或多种簇集蛋白同种型(例如，肾特异性簇集蛋白)的碳水化合物部分并且不特异性结合至其它簇集蛋白同种型(例如血浆簇集蛋白、血清簇集蛋白或血源、非肾特异性簇集蛋白同种型)的碳水化合物部分的一种或多种其它分子的复合体)的形成可通过例如，放射性测量、颜色测量、荧光测量、尺寸分离、生物传感器方法、沉淀方法或无标记方法检测。任选地，复合体的检测可为通过加入偶联至可检测标记的第二抗体。包括与复合体相关联的信号产生化合物的可检测标记可使用上文描述的方法检测，并且包括显色剂、催化剂例如酶缀合物、荧光化合物例如荧光素和罗丹明、化学发光化合物例如二噁二酮(dioxetanes)、吖啶类、菲啶类、钌和鲁米诺、放射性元素、直接视觉标记以及辅因子、抑制剂、磁粉等。酶缀合物的实例包括碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶等。具体标记的选择不是关键性的，但其将会能够自身或连同一种或多种额外的物质产生信号。
复合体的形成指示检验样品中存在一种或多种簇集蛋白同种型(例如，肾特异性簇集蛋白)。本发明的方法可指示检验样品中一种或多种簇集蛋白同种型(例如肾特异性簇集蛋白)的数量或量。用许多可检测标记，例如酶缀合物，存在的簇集蛋白的量与产生的信号成比例。根据检验样品的类型，其可用适当的缓冲剂稀释、浓缩或无任何操作地接触固相。例如，检验样品可稀释或浓缩以测定簇集蛋白的存在情况和/或量。
本发明的测定也可用于监测肾疾病、肾损伤或肾损害的改善过程。通过测量来自受试者的检验样品中肾特异性簇集蛋白的增加或减少，可确定旨在改善疾病或损害的具体治疗方案是否有效。
试剂盒
本发明进一步包括用于检测肾特异性簇集蛋白的测定试剂盒(例如，制造的制品)。试剂盒可包括本发明的一种或多种抗体或其抗原结合片段和特异性结合一种或多种簇集蛋白同种型(例如，肾特异性簇集蛋白)的碳水化合物部分并且不特异性结合其它簇集蛋白同种型(例如，血浆簇集蛋白、血清簇集蛋白或血源、非肾特异性簇集蛋白同种型)的碳水化合物部分的一种或多种其它分子以及用于测定抗体、一种或多种其它分子和样品中的簇集蛋白的特异性结合的组合物。这些组分可包含一种或多种可检测标记(即，上述可检测标记可固定到一种或多种组分)或可检测标记可单独提供。试剂盒可包括包含本发明的一种或多种抗体或其抗原结合片段和特异性结合至一种或多种簇集蛋白同种型(例如，肾特异性同种型)的碳水化合物部分并且不特异性结合至其它簇集蛋白同种型(例如，血清或血浆簇集蛋白)的碳水化合物部分的一种或多种其它分子的装置以及使用分子用于例如，鉴定哺乳动物中的肾疾病、肾损伤或肾损害的说明书。试剂盒可包括具有一种或多种抗体或其抗原结合片段或特异性结合一种或多种簇集蛋白同种型(例如肾特异性簇集蛋白)的碳水化合物部分并且不特异性结合其它簇集蛋白同种型(例如，血浆或血清簇集蛋白)的碳水化合物部分的一种或多种其它分子或这二者固定到载体上的载体。上述试剂盒可还包括包含标记的包装材料，其指示上述试剂盒的特异性结合肾特异性簇集蛋白的碳水化合物部分并且不特异性结合其它簇集蛋白同种型的碳水化合物部分的一种或多种其它分子和抗体可用于鉴定肾疾病、肾损伤或肾损害。其它组分例如缓冲液、对照(例如，阳性对照如肾特异性簇集蛋白；阴性对照如血浆簇集蛋白、血清簇集蛋白或缓冲液)等，为本领域技术人员所已知，可包括在这样的检验试剂盒中。本发明的特异性结合至肾特异性簇集蛋白的碳水化合物部分并且不特异性结合至其它簇集蛋白同种型的碳水化合物部分的一种或多种其它分子、抗体、测定和试剂盒可用于，例如，诊断患者中肾疾病、肾损伤或肾损害的个体病例，以及肾疾病、肾损伤或肾损害的流行病学研究。
试剂盒可还包括特异性结合一种或多种非肾特异性簇集蛋白同种型(例如，血清或血浆簇集蛋白同种型)的一种或多种外源凝集素，用于形成一种或多种外源凝集素和一种或多种非肾特异性簇集蛋白同种型的复合体。试剂盒可还包括特异性结合至非肾特异性簇集蛋白的碳水化合物部分并且不特异性结合至肾特异性簇集蛋白同种型的碳水化合物部分的一种或多种分子，用于形成一种或多种非肾特异性簇集蛋白同种型和一种或多种分子之间的复合体。
本文中任何地方提及的所有专利、专利申请和其它科学或技术写作通过引用以其整体结合到本文中。本文中说明性描述的发明适当地可在缺乏本文未具体公开的任何一个或多个元素、一个或多个限制下实践。因此，例如，在本文中的每一情况下，任何术语“包括”、“基本上由…组成”和“由…组成”可替换为两外两个术语，同时保留其普通含义。已经使用的术语和表述用作说明术语而非限制，并且无意图在使用这样的术语和表述时排除所显示或描述的特征的任何相等物或其部分，而是公认多种修饰在所要求的本发明的范围内是可能的。因此，应理解的是尽管本发明已经通过实施方案、任选特征具体公开，本文所公开的概念的修饰和变更可诉诸于本领域技术人员，并且这样的修饰和变更认为在如说明书和所附权利要求所定义的本发明的范围内。
另外，当本发明的特征或方面关于马库什群组或其它供选分组描述时，本领域技术人员将会认识到本发明由此也根据马库什群组或其它群组的任何个体成员或亚组来描述。
下列仅为了例示目的提供，并且不意在限制上文宽泛描述的本发明的范围。
实施例
实施例1
血液污染
将正常犬血清掺入阴性尿(即，来自健康犬的尿)中，簇集蛋白的量使用市售簇集蛋白EIA (Biovendor)测量。如图1A-B中所示，甚至在1:1000稀释(1 μl每ml)时，测量到显著的簇集蛋白水平。因此，能够检测肾特异性簇集蛋白同种型同时排除血清或血浆簇集蛋白同种型的任何检测是重要的。
实施例2：材料
簇集蛋白分子的分离
犬簇集蛋白的序列用于设计和合成载体以表达重组his标记的犬簇集蛋白分子(LifeTechnologies)。表达和纯化蛋白后，序列通过LC-MS确认。该分子在本文中称为重组簇集蛋白或his-标记的重组簇集蛋白。
血浆簇集蛋白从汇集的30只犬的血浆通过亲和色谱纯化。Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞衍生的簇集蛋白(其为肾特异性簇集蛋白)通过在125 ml T烧瓶中在37℃、7.5%CO2下，在具有抗生素的1X MEM补充培养基中，生长MDCK细胞至融合而获得。将上清液收集并将簇集蛋白在抗簇集蛋白柱上使用AKTA色谱系统(GE Healthcare)亲和纯化。
肾特异性簇集蛋白通过亲和色谱从汇集的疑似具有急性肾损伤的犬的尿纯化。
抗体制备
针对血浆衍生的簇集蛋白的多克隆抗血清在兔中产生。单克隆抗体在小鼠中使用多种形式的簇集蛋白作为免疫原(Immunoprecise, Inc. Vancouver, BC)生成。不同的形式包括重组全分子簇集蛋白、簇集蛋白的α链、簇集蛋白的β链、血浆衍生的簇集蛋白、MDCK衍生的簇集蛋白和尿衍生的簇集蛋白(其为肾特异性簇集蛋白)。
免疫亲和色谱
重组簇集蛋白用于免疫兔。抗簇集蛋白IgG通过蛋白A色谱纯化。抗重组簇集蛋白IgG抗体用于从犬血浆池通过亲和色谱纯化天然血浆簇集蛋白。单克隆抗体通过用血浆簇集蛋白免疫小鼠制造并且所得的抗簇集蛋白IgG抗体通过蛋白A色谱纯化。
检测抗体
抗簇集蛋白(血浆-天然的)单克隆或多克隆抗体用辣根过氧化物(HRP)通过标准SMCC化学(Thermo-Pierce)标记。
簇集蛋白标准品
簇集蛋白通过亲和色谱从MDCK细胞系(ATCC)的培养上清液或汇集的犬血浆纯化。所得的簇集蛋白通过LCMS定量。赋予值(mg/mL)，并制作标准曲线和对照。
实施例3：一般簇集蛋白测定方案
簇集蛋白标准曲线在测定缓冲液 (1x PBS，包含1% BSA和0.5 % Tween® (聚山梨酯)20)中通过500 ng/mL标准品的连续稀释制备。尿样品在测定缓冲液中1:100稀释并将100 μl在环境温度下以一式两份在板上孵育1小时。用PetChek®缓冲液(IDEXX Laboratories)洗涤3次后，将100 μl用辣根过氧化物酶标记的抗-簇集蛋白抗体在环境温度下孵育30分钟。如上洗涤3次后，将50 μl TMB底物(IDEXX Laboratories)加入并让颜色显现5分钟。颜色测量反应通过加入100 μl酸(1N HCL)终止。将板立即在450 nm处阅读。
簇集蛋白包覆的板
将微孔板用5 μg/ml血浆簇集蛋白、MDCK衍生的簇集蛋白、重组His-标记的簇集蛋白和BSA在4℃在0.05 M碳酸盐缓冲液pH 9.5中包覆过夜。用PBS-Tween® (聚山梨酯) 20(0.1%)洗涤3次后，将板用1%牛血清白蛋白(BSA)/PBST封闭2小时。用PBST另外洗涤3次后，将板在真空下干燥2小时。
外源凝集素包覆的板
将生物素化的外源凝集素(Vector Labs, Burlingame, CA)在PBS, pH 7.4中稀释至5μg/ml并将100 μl加入链霉亲和素包覆的板(IDEXX Laboratories)的孔中。在4℃结合过夜后，将板用PBST洗涤3次。所有的板均在4℃储存、干燥，直至使用。
实施例4：簇集蛋白外源凝集素特异性
将簇集蛋白包覆的微孔板用1μg/ml生物素化的外源凝集素/PBST孵育1小时。用PBST洗涤3次后，将100 μl HRP-标记的链霉亲和素在环境温度下在板振荡仪上孵育30分钟。用PBST另外洗涤3次后，将100 μl TMB底物加入并孵育5分钟，反应用100 μl 1N HCL终止。板在450处阅读。
。
簇集蛋白制备物对特定外源凝集素的反应性在表2中以O.D. 450单位示出。OD >0.5用作对外源凝集素的阳性反应。选择该O.D.是因为非糖基化的蛋白、His标记的簇集蛋白和BAS的结合导致值< 0.4 O.D.单位。获取MDCK/血浆比率并且选择比率> 2.0用于进一步表征。四(4)种外源凝集素满足该标准，PHA-E、PHA-L、WGA和LEL。麦胚外源凝集素(WGA)选择用于进一步表征。
实施例5：检测肾特异性簇集蛋白的可行性
将不同形式的簇集蛋白(MDCK衍生的簇集蛋白、天然血浆簇集蛋白和重组his-标记的簇集蛋白)在测定缓冲液中连续稀释并用抗簇集蛋白HRP标记的单克隆抗体检测。图2显示仅MDCK衍生的簇集蛋白制备物以剂量依赖方式结合。无碳水化合物的his-标记的重组簇集蛋白和包含碳水化合物的天然血浆簇集蛋白在检验的任何浓度下不结合外源凝集素固相。
外源凝集素对肾特异性簇集蛋白的特异性
将天然血浆簇集蛋白、MDCK衍生的簇集蛋白和尿衍生的簇集蛋白样品在测定缓冲液中稀释至1 μg/ml，并用抗簇集蛋白HRP单克隆抗体在不同的外源凝集素固相上检测。下表3显示仅MDCK衍生的簇集蛋白和从尿纯化的簇集蛋白结合到WGA固相。存在对琥珀酰化的WGA(sEGA)减少的结合，提示唾液酸残基在结合中不发挥作用。
。
多克隆和单克隆抗簇集蛋白抗体这二者均能够结合结合至多种外源凝集素固相的MDCK衍生的簇集蛋白并且不结合来自血浆源的簇集蛋白，这是因为血浆衍生的簇集蛋白不能结合至外源凝集素固相。WGA对肾特异性簇集蛋白(MDCK衍生的和尿)特异。
然后将外源凝集素筛选通过单克隆或多克隆抗体捕获在固相上的簇集蛋白抗原。将3A4单克隆抗体、9H7单克隆抗体、2E2单克隆抗体、2F2单克隆抗体、抗α链簇集蛋白多克隆抗体、抗β链簇集蛋白多克隆抗体或抗尿簇集蛋白多克隆抗体固定到固相。将MDCK衍生的或血浆衍生的簇集蛋白(1 μg/ml)连同生物素化的WGA、SWGA、Pha-L、Pha-E或缓冲液对照加至固相。结果在表4中示出。
表4
。
单克隆抗体9H7以及多克隆簇集蛋白抗β链和多克隆簇集蛋白抗尿显示最好的灵敏度。WGA、Pha-L、Pha-E特异性结合MDCK衍生的簇集蛋白并且不特异性结合血浆衍生的簇集蛋白。
将WGA (5 μg/ml)、sWGA (5 μg/ml)、多克隆抗血浆簇集蛋白抗体或缓冲液结合到固相。将血浆衍生的簇集蛋白(1 μg/ml)、MDKC衍生的簇集蛋白(1 μg/ml)、尿衍生的簇集蛋白(1 μg/ml)或缓冲液加入。结果在表5中示出。然后将缀合辣根过氧化物酶的单克隆抗体9H7 (100 ng/ml)加入。检测特异性结合。MDCK衍生的簇集蛋白和尿衍生的簇集蛋白特异性结合至固定的WGA并且通过9H7抗体检测到。血浆衍生的簇集蛋白不特异性结合至固定的WGA并且通过9H7抗体未检测到。结果在表5中示出。
表5
。
将新鲜制备的血清掺入尿中，夹心免疫复合体的形成用包括固定的WGA外源凝集素和sWGA外源凝集素的固相检验。外源凝集素和肾特异性簇集蛋白复合体用HRP缀合的9H7单克隆抗体检测。结果在表6中示出。结果提示复合体(WGA、肾特异性簇集蛋白和抗体)仅在MDCK衍生的簇集蛋白掺入尿中时形成，当将血清以0.1-10%掺入尿中时无显著反应性。因此，血清簇集蛋白不通过该测定检测到。
表6.
。
将His标记的重组簇集蛋白、血浆衍生的簇集蛋白和MDCK衍生的簇集蛋白样品用DTT还原以分离簇集蛋白的α和β链或保持非还原的。在蛋白质印记中，单克隆抗体9H7显示结合至MDCK衍生的簇集蛋白和血浆衍生的簇集蛋白这二者。然而，WGA外源凝集素仅结合非还原的或还原的MDCK衍生的簇集蛋白。参见表7。WGA不结合非还原或还原的his标记的重组簇集蛋白或者非还原或还原的血浆衍生的簇集蛋白。
表7
。
实施例6 具有血尿的田园狗的簇集蛋白水平
来自健康犬的尿通过UA试纸(IDEXX Laboratories, Inc.)检查血液的存在情况。肾特异性簇集蛋白水平使用市售簇集蛋白EIA按照制造商的说明(Biovendor Research andDiagnostic Products)测量。如下所显示(表8)，在其尿中无可检测的血液的健康犬具有参考范围(70 ng/ml)内的簇集蛋白水平，而具有血液污染的那些(样品5-8)具有正常参考水平以上10-100倍的簇集蛋白水平。该结果表明尿中血液的存在可能导致高簇集蛋白测量，引起假阳性。
表8
样品 市售簇集蛋白EIA UA试纸血液
1 <LOQ 阴性
2 <LOQ 阴性
3 29 阴性
4 <LOQ 阴性
5 1045 3
6 1015 3
7 760 3
8 65000 3
实施例7 肾特异性簇集蛋白免疫测定的特异性
肾特异性簇集蛋白免疫测定(KSCI)使用针对从血浆纯化的犬簇集蛋白产生的单克隆抗体(IgG2a, kappa)和麦胚外源凝集素(WGA)设计。将WGA包覆在微孔板的孔上。将单克隆抗体用HRP标记。为了说明KSCI的特异性，将来自健康狗的新鲜全血或血浆掺入缓冲液中并使用KSCI和市售簇集蛋白EIA (Biovendor)测定这二者分析。
如图3中所示，通过市售簇集蛋白EIA而非KSCI，簇集蛋白在全血和血清这二者中以高浓度检测到。考虑到高百分比的来自健康狗和猫的尿样品具有血液污染，准确测量簇集蛋白的唯一方法是使用肾特异性簇集蛋白免疫测定。
实施例8：犬庆大霉素模型中的肾特异性簇集蛋白
肾特异性簇集蛋白在来自犬庆大霉素模型的尿中测量(图4)。在模型系统中，每日给予狗40 mg/kg庆大霉素，持续5天。在该狗模型中，血清肌酸酐在整个研究中基本未改变，而尿中的肾特异性簇集蛋白迅速增加，当给剂停止时达到大约5倍基线，在第11天达到峰值大约10倍基线。这显示肾特异性簇集蛋白是比血清肌酸酐更早和更灵敏的用于活动性肾损伤的标志。
实施例9：具有活动性肾损伤的患者中的肾特异性簇集蛋白
肾特异性簇集蛋白在呈送给诊所的具有炎症性或缺血诱发的活动性肾损伤的狗的尿中测量(图5)。数据显示健康患者和诊断有活动性肾损伤的那些患者之间的肾特异性簇集蛋白浓度的清楚分离。总之，肾特异性簇集蛋白是灵敏和特异性的用于活动性肾损伤的标志。
实施例10：具有尿路感染的患者中的肾特异性簇集蛋白
肾特异性簇集蛋白在具有尿路感染(UTIs)的猫和狗中测量(图6)。肾特异性簇集蛋白水平在UTI患者子集中显著增加。肾特异性簇集蛋白是用于UTI的标志。
实施例11：猫中的肾特异性簇集蛋白
猫簇集蛋白从猫肾CRFK细胞(ATCC, Manassas, VA)分离。可溶性猫簇集蛋白的分析使用SDS-PAGE蛋白质印记和外源凝集素筛选阵列进行。
将来自犬和猫肾细胞系(分别为MDCK和CRFK)的上清液和从犬血浆纯化的簇集蛋白制备物在SDS-PAGE上泳动并印记到硝酸纤维素膜上。将印记用针对犬簇集蛋白产生的抗簇集蛋白单克隆体探查。结果(图7)显示单克隆抗体与CRFK产生的猫簇集蛋白交叉反应。因此，单克隆抗体可用于在两点免疫测定(ELISA)形式中检测猫肾簇集蛋白。
对猫临床样品筛选外源凝集素
在4℃以1 μg/ml/PBST (Tween 20® (聚山梨酯)，0.01%)将生物素化的外源凝集素(Vector Labs)包覆至链霉亲和素包覆的板过夜。将板洗涤3次，并将从血浆亲和纯化的猫簇集蛋白(1 μg/ml)或1:10稀释的猫临床尿在环境温度孵育1小时。洗涤3次后，将100 μlHRP标记的针对犬簇集蛋白产生的单克隆抗体(250 ng/ml)加入并如上孵育30分钟。另外洗涤3次后，将100 μl TMB加入并显色5分钟，之后将100 μl 1N HCL加入以终止反应。吸光度在450 nm处阅读。结果在表9中显示。
表9
。
12种外源凝集素(粗体)能够与猫簇集蛋白和抗簇集蛋白单克隆抗体形成夹心。如所显示的，WGA结合猫簇集蛋白。因此，KSCI测定可用于检测狗和猫这二者中的簇集蛋白。
使用外源凝集素形式检测临床样品中的尿簇集蛋白
尿从就诊地方兽医院的猫收集，1:100稀释，并经受KSCI测定。如所显示的，动物表现的测定范围证明为犬开发的KSCI测定与猫临床样品交叉反应。(<LOD = 低于检测限；>ULOQ =高于定量上限)。参见表10。
表10
猫 肾簇集蛋白(ng/mls)
1 31
2 53
3 144
4 <LOD
5 <LOD
6 208
7 325
8 >ULOQ
9 141
10 640
11 <LOD
12 125
13 <LOD
14 687
15 283
16 100
17 125
18 169
19 20
实施例12：人中的肾特异性簇集蛋白
将附着的人胚胎上皮肾细胞系HEK293、犬肾细胞系MDCK和绿猴肾上皮细胞系Vero(ATCC, Manassas, VA)按照供应商的说明生长。当细胞融合时，将细胞使用肾毒性药物庆大霉素0.2 mg/ml应激、在40℃加热或用加热和药物的组合处理。收集上清液并在市售可得的人簇集蛋白ELISA (Biovendor)中检验其反应性。结果(表11)显示ELISA与HEK293细胞表达的簇集蛋白反应。
表11：用于簇集蛋白表达的人细胞系的特异性
。
将肾细胞系用肾毒性药物庆大霉素0.2 mg/ml、40℃加热24小时或药物(0.2 mg/ml)和加热(40℃ 24 hrs)的组合应激。将上清液1:100稀释并在人簇集蛋白簇集蛋白ELISA(Biovendor)中运行。如下图8中所示，对于犬肾细胞对照(MDCK)未见到反应性。对绿猴肾Vero系见到轻微反应性。人系, HEK293显示最强的反应性。这证实当在各种条件下生长时HEK293细胞系分泌人簇集蛋白。
与人肾表达的簇集蛋白的抗体反应性
为了开发两点ELISA(夹心ELISA)，筛选针对重组犬簇集蛋白产生的单克隆和多克隆抗犬簇集蛋白抗体文库以测定其对人簇集蛋白的结合。结果表明多个针对重组犬簇集蛋白的抗簇集蛋白抗体能够结合人簇集蛋白。蛋白质印记证实，图9，显示兔抗β链簇集蛋白结合至来自MDCK(泳道2、4)、HEK 293细胞上清液(泳道3)的簇集蛋白和阳性对照重组犬簇集蛋白β链抗原(泳道5)。
人簇集蛋白ELISA
将板用10 μg/ml纯化的抗β链簇集蛋白多克隆抗体在4℃包覆过夜。将板洗涤3次并用1% BSA封闭过夜，接着3次最终洗涤。将板在真空下干燥2小时并储存在4℃直至使用。人肾细胞系和MDCK (犬)对照的上清液用PBS 1:10稀释并将100 μl一式两份放置在孔中。将上清液在室温摇动孵育1小时。洗涤3次后，将100 μl生物素化的外源凝集素 (1μg/ml)/PBS加入并如上孵育1小时。另外洗涤3次后，将板用链霉亲和素-HRP (1:5000)/PBS孵育30分钟。最后洗涤3次后，将板用100 μl TMB底物显色5分钟，反应用100 μl 1M HCL终止。吸光度在450 nm处阅读。参见表12。两种外源凝集素(PSA、DBA)显示与人簇集蛋白和犬抗β链多克隆抗体形成夹心。
表12：外源凝集素特异性
。

Claims (31)

1.检测肾特异性簇集蛋白的方法，包括使样品接触特异性结合簇集蛋白的一种或多种抗体或其抗原结合片段和特异性结合至肾特异性簇集蛋白的碳水化合物部分并且不特异性结合至非肾特异性、血源簇集蛋白同种型的碳水化合物部分的一种或多种分子，和检测肾特异性簇集蛋白、所述特异性结合簇集蛋白的一种或多种抗体或其抗原结合片段和所述特异性结合至肾特异性簇集蛋白的碳水化合物部分并且不特异性结合至非肾特异性、血源簇集蛋白同种型的碳水化合物部分的一种或多种分子的复合体。
2.权利要求1的方法，其中所述特异性结合至肾特异性簇集蛋白的碳水化合物部分并且不特异性结合至非肾特异性、血源簇集蛋白同种型的碳水化合物部分的一种或多种分子为一种或多种外源凝集素。
3.权利要求1的方法，其中所述特异性结合至肾特异性簇集蛋白的碳水化合物部分并且不结合至非肾特异性、血源簇集蛋白同种型的碳水化合物部分的一种或多种分子为特异性结合N-乙酰氨基葡萄糖的分子。
4.权利要求2的方法，其中所述一种或多种外源凝集素为特异性结合N-乙酰氨基葡萄糖的外源凝集素。
5.权利要求2的方法，其中所述一种或多种外源凝集素为菜豆(Phaseolus vulgaris)白细胞凝集素(PHA-L)、麦胚凝集素(WGA)、WGA1、WGA2、WGA3、sWGA、菜豆(Phaseolus vulgaris)凝集素-E (PHA-E)、番茄(Lycopersicon esculentum)外源凝集素(LEL)、曼陀罗(Datura stramonium)外源凝集素(DSL)、菜豆(Phaseolus vulgaris)白细胞凝集素(PSA)、木菠萝外源凝集素、STL外源凝集素(马铃薯(Solanum tuberosum))、LCA外源凝集素(兵豆(Lens culinaris))、鸡冠刺桐(Erythina cristagalli)外源凝集素(ECL)、蓖麻(Ricin communis)外源凝集素(RCA)、SBA外源凝集素(大豆)、CONA外源凝集素(伴刀豆凝集素)或双花扁豆(Dolichos biflorus)外源凝集素(DBA)。
6.权利要求1的方法，其中将所述一种或多种抗体或其抗原结合片段固体到载体。
7.权利要求6的方法，其中将所述样品和可检测地标记的特异性结合至肾特异性簇集蛋白的碳水化合物部分并且不特异性结合至非肾特异性、血源簇集蛋白同种型的碳水化合物部分的一种或多种分子加至所述载体。
8.权利要求7的方法，其中所述可检测地标记的特异性结合至肾特异性簇集蛋白的碳水化合物部分并且不特异性结合至非肾特异性、血源簇集蛋白同种型的碳水化合物部分的一种或多种分子为外源凝集素。
9.权利要求1的方法，其中将所述特异性结合至肾特异性簇集蛋白的碳水化合物部分并且不特异性结合至非肾特异性、血源簇集蛋白同种型的碳水化合物部分的一种或多种分子固定到所述载体。
10.权利要求9的方法，其中将所述样品和可检测地标记的一种或多种抗体或其抗原结合片段加至所述载体。
11.权利要求9的方法，其中所述特异性结合至肾特异性簇集蛋白的碳水化合物部分并且不特异性结合至非肾特异性、血源簇集蛋白同种型的碳水化合物部分的一种或多种分子为外源凝集素。
12.权利要求1的方法，其中所述一种或多种抗体或其抗原结合部分、所述特异性结合至肾特异性簇集蛋白的碳水化合物部分并且不结合至非肾特异性、血源簇集蛋白同种型的碳水化合物部分的一种或多种分子或这二者用可检测的标记标记。
13.权利要求2的方法，其中所述一种或多种外源凝集素不特异性结合血清和血浆簇集蛋白。
14.权利要求1的方法，其中所述样品为尿样品。
15.权利要求1的方法，其中所述检测通过选自侧流测定、化学发光标记的夹心测定以及酶联免疫吸附测定(ELISA)、竞争测定、凝集测定、化学发光测定、生物发光测定、凝胶电泳免疫测定方法、免疫组织化学测定、放射免疫测定(RIA)、无标记生物传感器测定或免疫放射测定的方法完成。
16.权利要求1的方法，其中所述抗体特异性结合血浆簇集蛋白、血清簇集蛋白、重组簇集蛋白、肾特异性簇集蛋白或MDCK衍生的簇集蛋白。
17.权利要求1的方法，其中所述肾特异性簇集蛋白为人的、猫的或犬的。
18.用于在哺乳动物中检测肾疾病、肾损伤或肾损害的方法，包括使来自哺乳动物的样品接触特异性结合簇集蛋白的一种或多种抗体或其抗原结合片段和特异性结合至肾特异性簇集蛋白的碳水化合物部分并且不特异性结合至非肾特异性、血源簇集蛋白同种型的碳水化合物部分的一种或多种分子和检测肾特异性簇集蛋白、特异性结合簇集蛋白的一种或多种抗体或其抗原结合片段和特异性结合至肾特异性簇集蛋白的碳水化合物部分并且不特异性结合至非肾特异性、血源簇集蛋白同种型的碳水化合物部分的一种或多种分子的复合体，其中如果检测到所述复合体，则所述哺乳动物具有肾疾病、肾损伤或肾损害。
19.权利要求18的方法，进一步包括如果所述哺乳动物具有肾疾病、肾损害或肾损伤，给予所述哺乳动物肾疗法或肾治疗学。
20.权利要求18的方法，其中所述肾疾病为尿路感染。
21.权利要求18的方法，其中所述哺乳动物为人、猫或犬。
22.将一种或多种簇集蛋白同种型从其它类型的簇集蛋白同种型区分的方法，包括使样品接触特异性结合簇集蛋白的一种或多种抗体或其抗原结合片段和特异性结合至所述一种或多种簇集蛋白同种型的碳水化合物部分并且不结合至其它簇集蛋白同种型的碳水化合物部分的一种或多种分子，和检测所述一种或多种簇集蛋白同种型、特异性结合簇集蛋白的一种或多种抗体或其抗原结合片段和所述特异性结合所述至一种或多种簇集蛋白同种型的碳水化合物部分并且不结合至其它簇集蛋白同种型的碳水化合物部分的一种或多种分子的复合体。
23.权利要求22的方法，其中所述一种或多种簇集蛋白同种型为肾特异性簇集蛋白并且其它簇集蛋白同种型为血清或血浆簇集蛋白。
24.权利要求22的方法，其中所述一种或多种簇集蛋白同种型为人、猫或犬的簇集蛋白同种型。
25.一种复合体，包含一种或多种簇集蛋白分子、特异性结合簇集蛋白的一种或多种抗体或其抗原结合片段和一种或多种外源凝集素。
26.权利要求25的复合体，包含一种或多种肾特异性簇集蛋白分子、特异性结合簇集蛋白的一种或多种抗体或其抗原结合片段和特异性结合至肾特异性簇集蛋白的碳水化合物部分并且不结合非肾特异性、血源簇集蛋白同种型的碳水化合物部分的一种或多种分子。
27.权利要求25的复合体，其中所述复合体固定到固体载体。
28.一种试剂盒，包括特异性结合簇集蛋白的一种或多种抗体或其抗原结合片段和特异性结合至肾特异性簇集蛋白的碳水化合物部分并且不结合非肾特异性、血源簇集蛋白同种型的碳水化合物部分的一种或多种分子。
29.权利要求28的试剂盒，其中所述一种或多种抗体或其抗原结合片段、所述特异性结合至肾特异性簇集蛋白的碳水化合物部分并且不结合非肾特异性、血源簇集蛋白同种型的碳水化合物部分的一种或多种分子或这二者用可检测的标记标记。
30.权利要求29的试剂盒，其中所述可检测的标记为酶、酶缀合物、荧光化合物、化学发光化合物、放射性元素、直接的视觉标记或磁性颗粒。
31.改善簇集蛋白和簇集蛋白同种型的检测的方法，包括使样品接触一种或多种簇集蛋白抗体或其特异性结合片段和特异性结合至簇集蛋白的一个或多个碳水化合物部分的一种或多种分子。
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