ES2907068T3 - Detección específica de isoformas de clusterina - Google Patents
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Abstract
Un método para detectar clusterina específica del riñón que comprende (a) poner en contacto una muestra con (i) uno o más anticuerpos o sus fragmentos de unión a antígeno que se unen específicamente a la clusterina y (ii) una o más moléculas que se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de la clusterina específica del riñón y que no se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de isoformas de clusterina no específicas del riñón, transmitidas por la sangre, y (b) complejos de detección de la clusterina específica del riñón, el uno o más anticuerpos o sus fragmentos de unión a antígeno que se unen específicamente a la clusterina, y la una o más moléculas que se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de la clusterina específica del riñón y que no se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de isoformas de clusterina no específicas del riñón, transmitidas por la sangre.
Description
DESCRIPCIÓN
Detección específica de isotermas de clusterina
La presente invención se refiere a métodos para detectar clusterina específica del riñón, métodos relacionados para detectar enfermedad, lesión o daño renal y métodos para distinguir isotermas de clusterina específicas del riñón de isotermas de clusterina sérica o plasmática. La presente invención se refiere además a complejos que comprenden una o más moléculas de clusterina específicas del riñón, uno o más anticuerpos o sus fragmentos de unión a antígeno que se unen específicamente a clusterina y una o más lectinas que se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de la una o más moléculas de clusterina específicas del riñón, así como también kits para ser usados en los métodos anteriores.
La clusterina o apolipoproteína J es una proteína heterodimérica unida por disulfuro de 75-80 kDa. La clusterina es parte de muchos procesos fisiológicos, que incluyen la maduración de los espermatozoides, el transporte de lípidos, la inhibición del complemento, la remodelación de tejidos, el reciclaje de membranas, la estabilización de proteínas estresadas y la promoción de la inhibición de la apoptosis. La clusterina se sobreexpresa durante el daño tubular proximal y distal del riñón, se ha observado en varios carcinomas y se regula positivamente en la lesión renal.
Se han desarrollado y comercializado varios inmunoensayos para medir la clusterina en varios fluidos corporales, que incluyen el plasma, el suero y la orina. La clusterina específica del riñón puede usarse como marcador de daño o enfermedad renal. Sin embargo, la contaminación de las muestras de orina con sangre se observa comúnmente debido a infecciones, traumatismos, neoplasias, inflamación y contaminación accidental durante el cateterismo y la cistocentisis. Este es un problema más profundo en la medicina veterinaria. En poblaciones sanas, las concentraciones séricas de clusterina son 1o0o veces mayores (60-100 |jg/ml) que las concentraciones en orina (< 100ng/ml). La contaminación con sangre lleva a la orina isoformas de clusterina no específicas del riñón. Por lo tanto, es importante asegurarse de que la cuantificación de la isoforma de clusterina específica del riñón no se vea afectada por la contaminación de la clusterina sérica de la sangre. De lo contrario, pueden obtenerse resultados falsos positivos en los análisis de clusterina en orina. Se necesitan métodos en la técnica para diferenciar las isoformas de clusterina en muestras corporales.
En este contexto, Kapron y otros (Kapron, J. T. y otros.; Protein Science, 6(10); 1997; pp. 2120-2133) describe la identificación y caracterización de sitios de glicosilación en clusterina sérica humana.
La invención se establece en el conjunto de reivindicaciones adjunto.
En la presente descripción se describen métodos para detectar específicamente una primera isoforma de clusterina, que es específica del riñón.
Los métodos comprenden poner en contacto una muestra con uno o más anticuerpos o sus fragmentos de unión a antígeno que se unen específicamente a la clusterina y una o más moléculas que se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de la primera isoforma de clusterina y que no se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de otras isoformas de clusterina. Se detectan los complejos de la primera clusterina, el uno o más anticuerpos o sus fragmentos de unión a antígeno que se unen específicamente a la clusterina y la una o más moléculas que se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de la primera clusterina y que no se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de otras isoformas de clusterina.
También se describen en la presente descripción métodos para detectar clusterina específica del riñón. Los métodos comprenden poner en contacto una muestra con uno o más anticuerpos o sus fragmentos de unión a antígeno que se unen específicamente a la clusterina y una o más moléculas que se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de la clusterina específica del riñón y que no se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de otras isoformas de clusterina (por ejemplo, clusterina plasmática, clusterina sérica o clusterina no específica del riñón transmitida por la sangre). Se detectan los complejos de clusterina específica del riñón, el uno o más anticuerpos o sus fragmentos de unión a antígeno que se unen específicamente a la clusterina y la una o más moléculas que se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de la clusterina específica del riñón y que no se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de otras isoformas de clusterina. La una o más moléculas que se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de la clusterina específica del riñón y que no se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de otras isoformas de clusterina (por ejemplo, clusterina plasmática, clusterina sérica o clusterina no específica del riñón transmitida por la sangre), pueden ser una o más lectinas o una o más moléculas que se unen específicamente a N-acetilglucosamina. La una o más lectinas pueden ser lectinas que se unen específicamente a N-acetilglucosamina. Las lectinas pueden ser leucoaglutinina de Phaseolus vulgaris (PHA-L), aglutinina de germen de trigo (WGA), WGA1, WGA2, WGA3, sWGA, aglutinina-E de Phaseolus vulgaris (PHA-E), lectina de Lycopersicon esculentum (LEL), lectina de Datura stramonium (DSL), aglutinina de Pisum sativum (PSA) o lectina de Dolichos biflorus (DBA).
El uno o más anticuerpos o sus fragmentos de unión a antígeno pueden inmovilizarse en un soporte. La muestra y una o más moléculas marcadas de forma detectable que se unen específicamente a las porciones de carbohidratos
de la clusterina específica del riñón y que no se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de otras isoformas de clusterina (que pueden ser lectinas) pueden añadirse al soporte.
La una o más moléculas que se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de la clusterina específica del riñón y que no se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de otras isoformas de clusterina (que pueden ser lectinas) pueden inmovilizarse en un soporte. La muestra y uno o más anticuerpos o sus fragmentos de unión a antígeno marcados de forma detectable pueden añadirse al soporte.
El uno o más anticuerpos o sus fragmentos de unión a antígeno, la una o más moléculas que se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de la clusterina específica del riñón y no se unen a las porciones de carbohidratos de otras isoformas de clusterina (por ejemplo, clusterina plasmática, clusterina sérica o transmitida por la sangre, clusterina no específica del riñón), o ambos pueden marcarse con un marcador detectable.
La una o más lectinas pueden ser lectinas que no se unen específicamente a la clusterina sérica y plasmática. La muestra puede ser una muestra de orina. La detección puede completarse mediante un método seleccionado del grupo que consiste en un ensayo de flujo lateral, un ensayo de sándwich marcado quimioluminiscente y un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), un ensayo competitivo, un ensayo de aglutinación, un ensayo quimioluminiscente, un ensayo bioluminiscente ensayo, un método de inmunoensayo de electroforesis en gel, un ensayo de inmunohistoquímica, un radioinmunoensayo (RIA), un ensayo de biosensor sin marcador o un ensayo inmunorradiométrico. Los anticuerpos pueden unirse específicamente a la clusterina plasmática, la clusterina sérica, la clusterina recombinante, la clusterina específica del riñón o la clusterina derivada de MDCK. La clusterina específica del riñón puede ser humana, felina o canina.
Otras modalidades descritas en la presente descripción proporcionan métodos para detectar enfermedad renal, lesión renal o daño renal en un mamífero. Los métodos comprenden poner en contacto una muestra de un mamífero con uno o más anticuerpos o sus fragmentos de unión a antígeno que se unen específicamente a la clusterina y una o más moléculas que se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de la clusterina específica del riñón y que no se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de otras isoformas de clusterina (por ejemplo, clusterina plasmática, clusterina sérica o clusterina no específica del riñón transmitida por la sangre). Se detectan complejos de clusterina específica del riñón, uno o más anticuerpos o sus fragmentos de unión a antígeno que se unen específicamente a clusterina y una o más moléculas que se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de clusterina específica del riñón y que no se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de otras isoformas de clusterina. Si se detectan los complejos, entonces el mamífero tiene enfermedad renal, lesión renal o daño renal. Puede administrarse una terapia renal o un agente terapéutico renal al mamífero si el mamífero tiene enfermedad renal, daño renal o lesión renal. La enfermedad renal puede ser una infección del tracto urinario. El mamífero puede ser un humano, felino o canino.
Otras modalidades descritas en la presente descripción proporcionan métodos para distinguir las isoformas de clusterina específicas del riñón de las isoformas de clusterina sérica o plasmática. Los métodos comprenden poner en contacto una muestra con uno o más anticuerpos o sus fragmentos de unión a antígeno que se unen específicamente a la clusterina y una o más moléculas que se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de la una o más isoformas de clusterina y no se unen a las porciones de carbohidratos de las otras isoformas de clusterina. Se detectan los complejos de la una o más isoformas de clusterina, uno o más anticuerpos o sus fragmentos de unión a antígeno que se unen específicamente a la clusterina y la una o más moléculas que se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de la una o más isoformas de clusterina y que no se unen a las porciones de carbohidratos de las otras isoformas de clusterina. La una o más isoformas de clusterina pueden ser clusterina específica del riñón y las otras isoformas de clusterina pueden ser, por ejemplo, clusterina plasmática, clusterina sérica o clusterina no específica del riñón, transmitida por la sangre. La una o más isoformas de clusterina pueden ser isoformas de clusterina humana, felina o canina.
Se describe adicionalmente, pero no forma parte de la invención, un complejo que comprende una o más moléculas de clusterina, uno o más anticuerpos o sus fragmentos de unión a antígeno que se unen específicamente a la clusterina y una o más lectinas. El complejo puede comprender una o más moléculas de clusterina específicas del riñón, uno o más anticuerpos o sus fragmentos de unión a antígeno que se unen específicamente a clusterina y una o más moléculas que se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de la clusterina específica del riñón y que no se unen a las porciones de carbohidratos de otras isoformas de clusterina (por ejemplo, clusterina plasmática, clusterina sérica o clusterina no específica del riñón, transmitida por la sangre). El complejo puede inmovilizarse a cualquier tipo de soporte sólido. El complejo puede comprender adicionalmente uno o más marcadores detectables, que pueden estar asociados con una o más de las moléculas del complejo.
Se describe adicionalmente, pero no forma parte de la invención, un kit que comprende uno o más anticuerpos o sus fragmentos de unión a antígeno que se unen específicamente a la clusterina y la una o más moléculas que se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de la clusterina específica del riñón y que no se unen a las porciones de carbohidratos de otras isoformas de la clusterina (por ejemplo, clusterina plasmática, clusterina sérica o clusterina no específica del riñón, transmitida por la sangre). El uno o más anticuerpos o sus fragmentos de unión a antígeno, la una o más moléculas que se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de la clusterina
específica del riñón y que no se unen a las porciones de carbohidratos de otras isotermas de clusterina, o ambas, están marcadas con un marcador detectable. El marcador detectable puede ser una enzima, un conjugado de enzima, un compuesto fluorescente, un compuesto quimioluminiscente, un elemento radiactivo, un marcador visual directo o una partícula magnética.
Se describe adicionalmente, pero no forma parte de la invención, un método para mejorar la detección de clusterina e isoformas de clusterina. Los métodos comprenden poner en contacto una muestra con uno o más anticuerpos anti clusterina o sus fragmentos de unión específica y una o más moléculas que se unen específicamente a una o más porciones de carbohidratos de la clusterina. Los complejos de uno o más anticuerpos anti clusterina o sus fragmentos de unión específica y una o más moléculas que se unen específicamente a una o más porciones de carbohidratos de la clusterina se detectan con sensibilidad, especificidad o ambas mejoradas.
Por lo tanto, en la presente descripción se describen, pero no forman parte de la invención, métodos y composiciones para la detección y/o cuantificación de una primera isoforma específica de clusterina, opcionalmente en presencia de una o más segundas isoformas de clusterina, de modo que la una o más segundas isoformas de clusterina no interfieren significativamente con la detección y/o cuantificación de la primera isoforma específica de clusterina.
Los siguientes ejemplos 1-6 no están de acuerdo con la invención y están presentes únicamente con fines ilustrativos. Las figuras muestran:
Las Figuras 1A-B muestran los niveles de clusterina en la orina canina normal (es decir, saludable) que se enriqueció con diluciones variables de suero canino normal.
La Figura 2 muestra la unión de la clusterina a una fase sólida de lectina.
La Figura 3 muestra una comparación de un EIA de clusterina comercial y un inmunoensayo de la clusterina específica del riñón tanto en sangre total como en suero.
La Figura 4 muestra la medición de la clusterina específica del riñón en la orina de un modelo canino de gentamicina.
La Figura 5 muestra la medición de la clusterina específica del riñón en la orina de perros con lesión renal activa inducida por inflamación o isquemia.
La Figura 6 muestra la medición de la clusterina específica del riñón en pacientes con infecciones del tracto urinario (UTI).
La Figura 7 muestra una tinción con plata por SDS-PAGE y una transferencia Western de clusterina felina. Panel A. Tinción con plata de sobrenadantes de cultivos celulares de líneas celulares MDCK y CRFK de la ATCC. B. Transferencias Western que muestran la reactividad del anticuerpo monoclonal canino anti-clusterina con los carriles 2 y 3 clusterina de MDCK (canina), 4 y 5 clusterina en plasma (canina), y 6 y 7 clusterina de CRFK (felina).
La Figura 8 muestra la expresión de clusterina humana en células cultivadas en diversas condiciones de estrés. La Figura 9 muestra la unión de la clusterina anti-cadena beta de conejo a la clusterina de MDCK (carril 2, 4), sobrenadantes de células HEK 293 (carril 3) y el antígeno de cadena beta de la clusterina canina recombinante de control positivo (carril 5).
Como se usa en la presente, las formas singulares "un", "una" y "el" incluyen referentes plurales a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. El término "aproximadamente" en asociación con un valor numérico significa que el valor numérico puede variar más o menos en un 5 % o menos del valor numérico.
La clusterina específica del riñón es un biomarcador de lesión renal aguda (AKI) que aumenta durante y, como resultado de, la lesión renal en mamíferos como perros, gatos y humanos. Un kit comercial de EIA de Biovendor está disponible para la cuantificación de clusterina canina tanto en suero como en orina. Un estudio reciente validó el biomarcador mediante el uso de este kit en perros con leishmaniasis. Sin embargo, la contaminación de las muestras de orina con suero puede dar resultados falsos positivos debido a la alta concentración de clusterina en el suero. La contaminación de muestras de orina con sangre da como resultado la falta de especificidad en la detección de la clusterina específica del riñón debido a la contaminación por clusterina sérica.
Para demostrar las complicaciones de los falsos positivos de las mediciones generales de clusterina total, se asignó valor a una muestra de orina canina negativa mediante el uso de un kit comercial (Biovendor) y después se añadió suero canino negativo (0,002 % a 10 % v/v). Las mezclas resultantes se analizaron mediante el uso del kit comercial y los resultados obtenidos se muestran en la siguiente tabla:
El límite comercial es de aproximadamente 70 ng/ml. Cuando se mide la clusterina total (todas las isotermas), incluso pequeñas cantidades de sangre, que no son visibles a simple vista o detectables mediante un análisis de orina convencional (tira reactiva) pueden causar falsos positivos. Esto significa que las muestras de pacientes que tienen algún indicio de contaminación sanguínea deben evaluarse con mucho cuidado, ya que aumenta la posibilidad de falsos positivos que conduzcan a diagnósticos clínicos falsos. En la presente descripción se describen métodos para identificar isoformas específicas de clusterina en fluidos corporales, por ejemplo, la determinación de la presencia y/o cantidad de clusterina específica del riñón sin interferencia de la clusterina sérica. Es decir, la presente descripción puede usarse para detectar y/o cuantificar isoformas de clusterina específicas, por ejemplo, la clusterina específica del riñón en presencia de otras isoformas de clusterina.
Las estructuras primarias de todas las isoformas de clusterina son altamente homólogas. Sin embargo, se pensó que habría diferencias en los patrones de modificación postraduccionales entre varias isoformas de clusterina. Las estructuras específicas de oligosacáridos en las isoformas de clusterina están asociadas con la fuente del tejido, el estado fisiológico, el estado de la enfermedad y la especie. Los métodos descritos en la presente descripción aprovechan estas diferencias en el desarrollo de métodos de detección para isoformas de clusterina específicas (por ejemplo, isoformas de clusterina específicas de lesión renal) que están presentes en muestras de pacientes (por ejemplo, muestras de orina).
Isoformas de clusterina
Las "isoformas de clusterina", como se usa en la presente descripción, son moléculas de clusterina que son un producto de un evento de empalme o duplicación de genes, que se glicosilan (véase, por ejemplo, Ftizzi y otros, Adv. Cancer Res. 104:9 (2009); Prochnow y otros, PLOS One, 8:e75303 (2013)). Las isoformas de clusterina incluyen formas nucleares, citoplásmicas y secretadas. Una "isoforma de clusterina" también comprende glicoformas de clusterina, que son formas de clusterina que se glicosilan diferencialmente debido, por ejemplo, a la expresión en un tipo de tejido específico, expresión en un estado fisiológico específico, expresión en un tipo de especie específico, expresión en un estado de enfermedad específico o en condiciones de daño celular.
La "clusterina específica del riñón" o "isoforma de clusterina específica del riñón" es clusterina producida en el sistema renal (es decir, riñones, uréteres, uretra y vejiga) que puede estar presente en el sistema renal, que incluye la orina. Sin embargo, pequeñas cantidades de clusterina específica del riñón pueden filtrarse a la sangre, el suero o el plasma. Los niveles aumentados de clusterina específica del riñón pueden estar presentes en el sistema renal, que incluye la orina de animales y humanos con lesión renal, daño renal y/o enfermedad renal en comparación con animales y humanos sin lesión renal, daño renal y/o enfermedad renal.
La "clusterina sérica" y la "clusterina plasmática" son isoformas de clusterina que se sintetizan en tejidos como el corazón, el hígado y los pulmones y se liberan a la circulación en sangre, plasma o sus fracciones. La "clusterina sérica" y la "clusterina plasmática" no incluyen la clusterina específica del riñón que se originó en el sistema renal o la clusterina específica del riñón que se originó en el sistema renal y después se filtró a la sangre circulante, suero, plasma o sus fracciones. Las isoformas de clusterina no específicas del riñón son aquellas isoformas de clusterina que no se producen en el sistema renal (por ejemplo, clusterina sérica o plasmática). Las isoformas de clusterina transmitidas por la sangre son aquellas que están presentes en la sangre circulante, plasma, suero o sus fracciones. La clusterina segregada se produce a partir de una proteína precursora inicial, la psCLU presecretora (~60 kDa), fuertemente glicosilada y después escindida en el retículo endoplásmico (ER). Las cadenas peptídicas alfa y beta resultantes se mantienen unidas por 5 enlaces disulfuro en la forma de proteína heterodímera segregada madura (~75-80 kDa).
La glicosilación de la clusterina puede ser diferente para diferentes isoformas de clusterina. Por ejemplo, la clusterina específica del riñón y la clusterina sérica o plasmática pueden tener diferentes patrones de glicosilación. Esta diferencia en la glicosilación entre las isoformas de clusterina puede usarse para diferenciar una isoforma de clusterina de otras isoformas de clusterina.
Las isotermas de clusterina pueden diferenciarse, por ejemplo, en mamíferos, humanos, caninos, felinos, equinos, bovinos, ovinos, simios y otros animales mediante el uso de los métodos descritos en la presente descripción. La diferenciación incluye, por ejemplo, determinar la presencia o ausencia de una primera isoterma de clusterina en presencia de uno o más segundos tipos de isoformas de clusterina.
Anticuerpos
Los anticuerpos descritos en la presente descripción son moléculas de anticuerpo o sus fragmentos de unión a antígeno que se unen específicamente a la clusterina. Los anticuerpos o sus fragmentos de unión a antígeno pueden ser específicos para clusterina humana, canina, felina, equina, bovina, ovina o de simio. Los anticuerpos o sus fragmentos de unión a antígeno pueden ser específicos para cualquier tipo de isoforma de clusterina (por ejemplo, clusterina específica del riñón, clusterina plasmática o clusterina sérica). En las modalidades descritas en la presente descripción, un anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno se une específicamente a clusterina específica del riñón. En otras modalidades, un anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno se une específicamente a una o más isoformas de clusterina, todas las isoformas de clusterina, clusterina sérica o clusterina plasmática. Un anticuerpo descrito en la presente descripción puede ser un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo de cadena sencilla (scFv), un anticuerpo biespecífico, un anticuerpo multiespecífico, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo monovalente, un anticuerpo bivalente, un anticuerpo multivalente, un anticuerpo antiidiotípico anticuerpo, o un antígeno o fragmento de unión específica de un anticuerpo. Un fragmento de unión a antígeno o un fragmento de unión específica de un anticuerpo es una parte de un anticuerpo intacto que comprende el sitio de unión a antígeno o la región variable de un anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos incluyen Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fd, Fvs de cadena sencilla (scFv), Fvs enlazados por disulfuro (sdFv), fragmentos que comprenden un dominio Vl o Vh o un dominio Vl y un dominio Vh y fragmentos Fv.
Un anticuerpo descrito en la presente descripción puede ser cualquier clase de anticuerpo, que incluye, por ejemplo, IgG (IgG 1, lgG2a, lgG2b, lgG3, lgG4), IgM, IgA (lgA1, lgA2), IgD e IgE. Un anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno se une a uno o más epítopos de una molécula de clusterina, tal como una molécula de clusterina específica del riñón, una molécula de clusterina plasmática o una molécula de clusterina sérica. Puede prepararse un anticuerpo in vivo en animales de laboratorio adecuados o in vitro mediante el uso de técnicas de ADN recombinante. Los medios para preparar y caracterizar anticuerpos se conocen bien en la técnica. Véase, por ejemplo, Dean, Methods Mol. Biol. 80:23-37 (1998); Dean, Methods Mol. Biol. 32:361-79 (1994); Baileg, Methods Mol. Biol. 32:381-88 (1994); Gullick, Methods Mol. Biol. 32:389-99 (1994); Drenckhahn y otros Methods Cell. Biol.
37:7-56 (1993); Morrison, Ann. Rev. Immunol. 10:239-65 (1992); Wright y otros Crit. Rev. Immunol. 12:125-68 (1992). Por ejemplo, los anticuerpos policlonales pueden producirse tras administrar una molécula de clusterina o parte de una molécula de clusterina a un animal, como un ser humano u otro primate, ratón, rata, conejo, hámster, cabra, cerdo, perro, vaca, oveja, burro o caballo. Se recoge el suero del animal inmunizado y los anticuerpos se purifican del plasma, por ejemplo, mediante precipitación con sulfato de amonio, seguida de cromatografía, tal como cromatografía de afinidad. Las técnicas para producir y procesar anticuerpos policlonales se conocen en la técnica.
“Se une específicamente” o “específico para” significa que un primer antígeno, por ejemplo, una clusterina o una parte de esta, reconoce y se une a un anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno con mayor afinidad que otras moléculas no específicas. Una molécula no específica es un antígeno que no comparte un epítopo común con el primer antígeno. En las modalidades descritas en la presente descripción, una molécula no específica no es una isoforma de clusterina y no se relaciona con la clusterina. Por ejemplo, un anticuerpo producido contra un primer antígeno (por ejemplo, una molécula de clusterina) a la que se une más eficientemente que a un antígeno no específico puede describirse como que se une específicamente al primer antígeno. En las modalidades descritas en la presente descripción, un anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno se une específicamente a una molécula de clusterina o una parte de esta cuando se une con una afinidad de unión Ka de 107 l/mol o más. En la presente descripción, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede unirse específicamente a 2 o más isoformas de clusterina o puede unirse específicamente a solo una isoforma de clusterina, por ejemplo, clusterina específica del riñón. La unión específica puede evaluarse mediante el uso de, por ejemplo, un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), un radioinmunoensayo (RIA) o un ensayo de transferencia Western mediante el uso de una metodología que se conoce bien en la técnica.
Los anticuerpos descritos en la presente descripción pueden ser anticuerpos quiméricos (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos núm. 5,482,856), humanizados (véase, por ejemplo, Jones y otros, Nature 321:522 (1986); Reichmann y otros, Nature 332:323 (1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593 (1992)), caninizados, caninos o humanos. Los anticuerpos humanos pueden prepararse, por ejemplo, mediante inmortilización directa, exhibición de fagos, ratones transgénicos o una metodología Trimera, véase por ejemplo, Reisener y otros, Trends Biotechnol. 16:242-246 (1998).
Un ensayo para la detección de una molécula de clusterina puede usar un anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno o uno o más anticuerpos o fragmentos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 10 o más anticuerpos). Un ensayo para clusterina puede usar, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal específico para un epítopo de clusterina, una combinación de anticuerpos monoclonales específicos para epítopos de una molécula de clusterina, anticuerpos monoclonales específicos para epítopos de diferentes clusterinas, anticuerpos policlonales específicos para el
mismo epítopo de clusterina, anticuerpos policlonales específicos para diferentes epítopos de clusterina, o una combinación de anticuerpos monoclonales y policlonales. Los protocolos de ensayo pueden basarse, por ejemplo, en ensayos de competición, reacción directa o tipo sándwich mediante el uso de, por ejemplo, anticuerpos marcados.
Los anticuerpos descritos en la presente descripción pueden marcarse con cualquier tipo de marcador conocido en la técnica, que incluye, por ejemplo, marcadores fluorescentes, quimioluminiscentes, radiactivos, enzimáticos, de metal coloidal, de radioisótopos y bioluminiscentes.
Los anticuerpos que se unen específicamente a la clusterina incluyen, por ejemplo, 9H7, 3A4, 2F2, anticuerpos específicos para la cadena alfa de la clusterina, anticuerpos específicos para la cadena beta de la clusterina, isoforma de anti-clusterina en orina, Hs-3; 3R3-2; CLI-9; 1A11; 2F12; A4; 7D1; 3R3/2, anticuerpo anti clusterina del extremo C, isoforma I de anticuerpo anti clusterina, anticuerpo CLU (AA 1-333) (extremo N), anticuerpo CLU del extremo N (AA 79-99), anticuerpo CLU (AA 312-325), anticuerpo ClU (AA 44-58), anticuerpo CLU (a A 402-501), anticuerpo ClU (AA 75-501), anticuerpo CLU (AA 312-325); anticuerpo LS-B6759, anticuerpo LS-B3762, anticuerpo LS-B2937 y LS-B2852, anticuerpo 16B5. Un anticuerpo puede unirse específicamente a la clusterina específica del riñón o tanto a la clusterina específica del riñón como a otras formas de clusterina (por ejemplo, clusterina sérica o plasmática).
Lectinas
Las lectinas son proteínas que reconocen y se unen a estructuras específicas de monosacáridos u oligosacáridos (carbohidratos). Una lectina habitualmente contiene dos o más sitios de unión para unidades de carbohidratos. La especificidad de unión a carbohidratos de una determinada lectina está determinada por los residuos de aminoácidos que se unen al carbohidrato. La fuerza de unión de las lectinas a los carbohidratos puede aumentar con el número de interacciones moleculares. La constante de disociación para la unión de lectinas a carbohidratos es una Kd de aproximadamente 10'5 a 10'7. “Se une específicamente” o “específico para” significa que una primera lectina, por ejemplo, WGA reconoce y se une a un tipo de carbohidrato específico (por ejemplo, N-acetilglucosamina para w Ga ) con mayor afinidad que a otros tipos de carbohidratos no específicos. El tipo de carbohidrato específico se asocia con una isoforma de clusterina específica (por ejemplo, una clusterina específica del riñón o una clusterina específica de la especie) y no se asocia significativamente con una o más otras isoformas de clusterina (por ejemplo, clusterina sérica). Por ejemplo, una lectina que se une más eficientemente a un primer tipo de carbohidrato específico que a un carbohidrato no específico puede describirse como que se une específicamente al primer tipo de carbohidrato específico. En las modalidades descritas en la presente descripción, una lectina se une más eficientemente a un primer tipo de carbohidrato específico que a un carbohidrato no específico cuando se une al primer tipo de carbohidrato específico con una Kd que es menor en aproximadamente 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60 % o más cuando se compara con la unión del carbohidrato no específico. En las modalidades descritas en la presente descripción, una lectina se une específicamente a un tipo de carbohidrato específico cuando se une con una constante de disociación Kd de como 10'5 a 10'7. En la presente descripción, una lectina puede unirse específicamente a 2 o más tipos de carbohidratos específicos o puede unirse específicamente a solo un tipo de carbohidrato específico.
Las lectinas pueden marcarse con cualquier tipo de marcador conocido en la técnica, que incluye, por ejemplo, marcadores fluorescentes, quimioluminiscentes, radiactivos, enzimáticos, de metal coloidal, de radioisótopos y bioluminiscentes.
En las modalidades descritas en la presente descripción, se usan lectinas que se unen específicamente a la clusterina específica del riñón y que no se unen específicamente a la clusterina plasmática o sérica. En las modalidades descritas en la presente descripción, son útiles las lectinas que se unen específicamente a la N-acetilglucosamina. Tales lectinas incluyen, por ejemplo, WGA (aglutinina de germen de trigo), WGA1, WGA2, WGA3, sWGA, lectina DSL ("lectina de Datura stramonio), lectina que se une a manosa, PHA-L (leucoaglutinina de Phaseolus vulgaris), PHA-E (eritoaglutinina de Phaseolus vulgaris), y LEL (lectina de Lycopersicon esculentum (Tomate)). Otras lectinas que pueden usarse incluyen, por ejemplo, jacalina, lectina STL (Solanum tuberosum), lectina LCA (Lens culinaris), lectina PSA (aglutinina de Pisum sativum), lectina ECL (Erythina cristagalli), lectina RCA (Ricin communis), lectina DBA (Dolichos biflorus), lectina SBA (soja) y lectina CONA (concanavalina). Las lectinas están disponibles comercialmente en, por ejemplo, Vector Laboratories.
Pueden usarse lectinas que se unen específicamente a carbohidratos en isoformas de clusterina humana, canina, felina, equina, bovina, ovina o de simio. También pueden usarse lectinas que se unen específicamente a una o más isoformas de clusterina plasmática, sérica o de riñón y que no se unen a otras isoformas de clusterina.
Moléculas que se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de una primera isoforma de clusterina y que no se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de otras isoformas de clusterina
En las modalidades descritas en la presente descripción, una o más moléculas que se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de una primera isoforma de clusterina (por ejemplo, una clusterina específica del riñón o
una clusterina específica de la especie, por ejemplo, clusterina específica del riñón canino, felino o humano) y que no se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de otras isoformas de clusterina pueden usarse en los ensayos descritos en la presente descripción. Otras isoformas de clusterina pueden ser, por ejemplo, clusterina sérica o clusterina plasmática. En un ejemplo, la una o más moléculas que se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de una isoforma de clusterina específica del riñón y que no se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de isoformas de clusterina no específicas del riñón, transmitidas por la sangre pueden usarse en ensayos descritos en la presente invención. Los ejemplos de tales moléculas incluyen las lectinas discutidas anteriormente y las moléculas que se unen específicamente a la N-acetilglucosamina.
"Se une específicamente" o "específico para" significa que una primera molécula se une específicamente a las porciones de carbohidratos de una primera isoforma de clusterina (por ejemplo, una clusterina específica del riñón o una clusterina específica de la especie) y no se une específicamente a las porciones de carbohidratos de una o más otras isoformas de clusterina. La primera molécula reconoce y se une a un tipo de carbohidrato específico que se presenta en una primera isoforma de clusterina y no se presenta significativamente en una o más de las segundas isoformas de clusterina (por ejemplo, N-acetilglucosamina para la proteína del dominio 3 de unión a quitina bacteriana, en donde N-acetilglucosamina es un carbohidrato que se presenta en isoformas de clusterina específicas del riñón y que no se presenta significativamente en isoformas de clusterina sérica) con mayor afinidad que otros carbohidratos no específicos. Por ejemplo, una primera molécula que se une más eficientemente a un primer tipo de carbohidrato específico que a un carbohidrato no específico puede describirse como que se une específicamente al primer tipo de carbohidrato específico.
En las modalidades descritas en la presente descripción, una primera molécula que se une específicamente a las porciones de carbohidratos de una primera isoforma de clusterina y no se une específicamente a las porciones de carbohidrato de otras isoformas de clusterina, se une más eficientemente a un primer tipo de carbohidrato específico que a un carbohidrato no específico cuando se une al primer tipo de carbohidrato específico con una Kd que es menor en aproximadamente 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60 % o más cuando se compara con la unión del carbohidrato no específico. Una primera molécula que no se une específicamente a las porciones de carbohidrato de otras isoformas de clusterina significa que la molécula se une específicamente a través de las porciones de carbohidratos específicas de una primera isoforma de clusterina y no se une específicamente a las porciones de carbohidratos de una segunda isoforma de clusterina, de manera que la unión a la primera isoforma de clusterina puede detectarse y/o cuantificarse en presencia de la segunda isoforma de clusterina, en donde la presencia de la segunda isoforma de clusterina no interfiere significativamente con la detección y/o cuantificación de la primera isoforma de clusterina. En las modalidades descritas en la presente descripción, una primera molécula se une específicamente a un tipo de carbohidrato específico cuando se une con una constante de disociación Kd de aproximadamente 10'5 a 10'7. En la presente descripción, una primera molécula puede unirse específicamente a 2 o más tipos específicos de carbohidratos o puede unirse específicamente a solo un tipo de carbohidrato específico.
En las modalidades descritas en la presente descripción, pueden usarse una o más moléculas que se unen a la N-acetilglucosamina para unirse específicamente a la clusterina específica del riñón. Una o más moléculas que se unen a la N-acetilglucosamina incluyen, por ejemplo, una WGA de tipo salvaje (aglutinina de germen de trigo), formas mutadas de WGA (por ejemplo, WGA1, w Ga 2, WGA3, véase Parasuraman y otros J. Mol. Recognit (2014) 27:482-92), lectina de cebada (BL), lectina de arroz, aglutinina de Uritica dioica (UDA), heveína, quitinasa de Phaseolus vulgaris (PVC), proteína 1 inducible por herida de patata (WIN1), proteína 2 inducible por herida de patata (WIN2), quitinasa de Solarium tuberosum (STC), quitinasa de tabaco (TC), proteína inducible de herida de álamo (POP), proteína A de unión a N-acetilglucosamina bacteriana (GbpA) (a partir de, por ejemplo, CBP70 de Vibrio cholera, Shewanella onedensis, Shewanella baltica, Vibrio fascheri, Vibrio tapetis, Vibrio vulnificus, Yersinia mollaretii, Yersinia aldovae), proteínas de unión a GIcNAc Pf120, Pf83 y Pf45 de Plasmodium falciparum, proteína de unión a n-acetilglucosamina de Arsenophonus nasoniae, proteína de dominio 3 de unión a quitina bacteriana (de, por ejemplo, Bacillus thuringiensis, Bacillus cereus, Burkholderia ambifaria), N-acetil glucosamina quitinasa como lectina de Tamarindus indica, proteína 2 del floema (PP2, PP2-1A1) de Arabidopsis thaliana, NgcE de Streptomyces olivaceoviridis, proteína asociada al receptor de activación de plasminógeno de urocinasa/ENDO180, amelogenina y citomegalovirus murino atenuado.
Ensayos
Los métodos descritos en la presente descripción pueden usarse para detectar isoformas de la clusterina (por ejemplo, clusterina específica del riñón o clusterina específica de la especie, por ejemplo, clusterina específica del riñón canina, humana o felina) en una muestra de prueba, como una muestra biológica o una muestra de laboratorio. Una muestra de prueba puede comprender potencialmente (1) clusterina específica del riñón, (2) clusterina específica del riñón y clusterina sérica, (3) clusterina específica del riñón y uno o más tipos de otra clusterina no específica del riñón, (4) uno o más tipos de otra clusterina no específica del riñón; o (5) sin clusterina. Una muestra biológica puede incluir, por ejemplo, tejido, orina, sangre, suero, plasma, saliva, esputo, heces, líquido cefalorraquídeo, líquido amniótico o exudado de heridas de un mamífero como un caballo, bovino, ovino, gato, perro, ratón, rata, simio o humano. La muestra de prueba puede ser sin tratar, precipitada, fraccionada, separada, diluida, concentrada o purificada. En las modalidades descritas en la presente descripción, la clusterina específica del riñón se filtra a la sangre, el plasma o el suero y puede detectarse en los mismos.
Los métodos descritos en la presente descripción pueden usarse para mejorar la detección de la clusterina e isotermas de clusterina tras proporcionar ensayos que usan un anticuerpo anti clusterina o su fragmento de unión específica combinado con una molécula (por ejemplo, una lectina) que se une específicamente a una o más porciones de carbohidratos de la clusterina. Los métodos comprenden poner en contacto una muestra con uno o más anticuerpos anti clusterina o sus fragmentos de unión específica y una o más moléculas que se unen específicamente a una o más porciones de carbohidratos de la clusterina. Los complejos de uno o más anticuerpos anti clusterina o sus fragmentos de unión específica y una o más moléculas que se unen específicamente a una o más porciones de carbohidratos de la clusterina se detectan con sensibilidad, especificidad o ambas mejoradas. La sensibilidad o la especificidad puede mejorarse en aproximadamente 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50 % o más.
En ciertas modalidades, los métodos descritos en la presente descripción pueden usarse para detectar isoformas de clusterina específicas (por ejemplo, una clusterina específica del riñón o una clusterina específica de la especie). Los métodos comprenden poner en contacto uno o más anticuerpos o sus fragmentos de unión a antígeno que se unen específicamente a la clusterina y una o más otras moléculas que se unen específicamente a la clusterina específica del riñón (por ejemplo, moléculas que se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de la clusterina específica del riñón y no se unen a las porciones de carbohidratos de otras isoformas de clusterina) con una muestra de prueba en condiciones que permitan la formación de complejos de clusterina específica del riñón, su anticuerpo o fragmento de unión a antígeno y una o más otras moléculas que se unen específicamente a la clusterina específica del riñón. A continuación, se detectan los complejos. La presencia de complejos indica la presencia de clusterina específica del riñón. La ausencia de complejos indica la ausencia de clusterina específica del riñón. Un experto en la técnica está familiarizado con los ensayos y las condiciones que se usan para detectar la unión de complejos. Los complejos pueden comprender, por ejemplo, una o más moléculas de clusterina específicas del riñón, uno o más anticuerpos que se unen específicamente a la clusterina y una o más otras moléculas que se unen específicamente a la clusterina específica del riñón y que no se unen específicamente a otras isoformas de clusterina. Las otras formas de clusterina pueden ser, por ejemplo, isoformas de clusterina no específicas del riñón, transmitidas por la sangre. La cantidad de los complejos puede determinarse y puede usarse para establecer la gravedad de la enfermedad.
Los ensayos descritos en la presente descripción pueden usarse para, por ejemplo, distinguir la clusterina específica del riñón de otros tipos de isoformas de clusterina, para detectar la clusterina específica del riñón en una muestra, para cuantificar la clusterina específica del riñón en una muestra, para distinguir una o más isoformas de clusterina (por ejemplo, clusterina específica del riñón, clusterina sérica, clusterina plasmática, isoformas de clusterina específicas de la especie) de otras isoformas de clusterina, para cuantificar isoformas de clusterina en una muestra, o para detectar isoformas de clusterina específicas en una muestra.
Las modalidades descritas en la presente descripción proporcionan métodos para distinguir una isoforma de clusterina de otros tipos de isoformas de clusterina. Los métodos comprenden poner en contacto una muestra con uno o más anticuerpos o sus fragmentos de unión a antígeno que se unen específicamente a la clusterina y una o más moléculas que se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de la una o más isoformas de clusterina (por ejemplo, clusterina específica del riñón) y no se unen a las porciones de carbohidratos de las otras isoformas de clusterina (por ejemplo, clusterina plasmática, clusterina sérica o isoformas de clusterina no específicas del riñón, transmitidas por la sangre). Los complejos que comprenden la una o más isoformas de clusterina, uno o más anticuerpos o sus fragmentos de unión a antígeno que se unen específicamente a la clusterina y la una o más moléculas que se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de la una o más isoformas de clusterina y que no se unen a las porciones de carbohidratos se detectan de las otras isoformas de clusterina. La una o más isoformas de clusterina pueden ser isoformas de clusterina de mamífero, humana, canina, felina, equina, bovina, ovina o de simio.
Pueden usarse ensayos competitivos en los métodos descritos en la presente descripción. Por ejemplo, uno o más anticuerpos o sus fragmentos de unión a antígeno que se unen específicamente a la clusterina pueden inmovilizarse en un soporte. Se añaden al soporte clusterina específica del riñón unida a una lectina marcada de forma detectable y una muestra tratada con una lectina no marcada que se une específicamente a la clusterina específica del riñón. Se detecta la cantidad de clusterina específica del riñón-lectina marcada de forma detectable que no está unida al uno o más anticuerpos o sus fragmentos de unión a antígeno. La cantidad de clusterina específica del riñón-lectina marcada de forma detectable que no está unida al uno o más anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno es proporcional a la cantidad de clusterina específica del riñón en la muestra. Alternativamente, la clusterina específica del riñón-lectina marcada de forma detectable que no está unida al uno o más anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno se elimina por lavado y se detecta la clusterina específica del riñón-lectina marcada de forma detectable restante. Alternativamente, el ensayo puede comenzar con una o más lectinas que se unen específicamente a una isoforma de clusterina que se inmovilizan en el soporte. Se añaden al soporte la clusterina específica del riñón unida a uno o más anticuerpos marcados de forma detectable o sus fragmentos de unión a antígeno que se unen específicamente a la clusterina junto con una muestra tratada con anticuerpos no marcados que se unen específicamente a la clusterina específica del riñón. La detección se completa como se describió anteriormente.
Los métodos descritos en la presente descripción pueden usarse en el diagnóstico o detección de enfermedad renal, lesión renal o daño renal, se obtiene una muestra de prueba de, por ejemplo, un humano o mamífero sospechoso de
tener enfermedad renal o daño renal. Los métodos comprenden poner en contacto una muestra de un mamífero con uno o más anticuerpos que se unen específicamente a la clusterina y una o más moléculas que se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de una o más isoformas de clusterina (por ejemplo, clusterina específica del riñón) y que no se unen específicamente a otras isoformas de clusterina (por ejemplo, clusterina plasmática, clusterina sérica o isoformas de clusterina no específicas del riñón, transmitidas por la sangre). Un experto en la técnica es consciente de las condiciones que permiten y son apropiadas para la formación de complejos. Se detectan los complejos de clusterina específica del riñón, uno o más anticuerpos que se unen específicamente a la clusterina y una o más moléculas que se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de la clusterina y que no se unen específicamente a otras isoformas de clusterina que se unen específicamente a la clusterina específica del riñón. Si se detectan los complejos, entonces al mamífero se le diagnostica enfermedad renal, lesión renal o daño renal. La cantidad de complejos puede determinarse mediante cualquier metodología conocida en la técnica. Un nivel que es mayor que el formado en una muestra de control indica daño renal, lesión renal o enfermedad renal. Una muestra de control es una muestra que no contiene clusterina específica del riñón o clusterina específica del riñón en un nivel observado en humanos o mamíferos sin enfermedad renal, lesión renal o daño renal. Ambos tipos de muestras de control pueden usarse en un ensayo. Puede administrarse una terapia renal o un agente terapéutico renal al mamífero si el mamífero tiene enfermedad renal o daño renal.
En modalidades, la clusterina específica del riñón canina puede detectarse con uno o más anticuerpos de clusterina o sus fragmentos de unión a antígeno y una o más de lectinas PHA-L, WGA, sWGA, STL, LEL, PHA-E o DSL. En modalidades, la clusterina específica del riñón felino puede detectarse con uno o más anticuerpos anti clusterina o sus fragmentos de unión a antígeno y uno o más de lectinas jacalin, ECL, LCA, RCA, PHA-E, WGA, PSA, DSL, DBA, PHA-L, SBA, o CONA. En modalidades, la clusterina específica del riñón felina y canina pueden detectarse con uno o más anticuerpos anti clusterina o sus fragmentos de unión a antígeno y una o más lectinas WGA, sWGA, DSL, PHA-L o PHA-E. En modalidades, la clusterina específica del riñón humana y felina pueden detectarse con uno o más anticuerpos anti clusterina o sus fragmentos de unión a antígeno y una o más lectinas de PSA o DBA.
El daño renal, la lesión renal y la enfermedad renal incluyen, por ejemplo, lesión renal aguda (AKI; trastorno funcional y estructural o signos de daño renal, que incluye cualquier defecto a partir de análisis de sangre y orina, o imágenes de tejidos de menos de 3 meses), una lesión renal aguda progresiva o que empeora, AKI temprana, AKI leve, AKI moderada, AKI grave, enfermedad renal/renal crónica, nefropatía diabética, necrosis tubular aguda, nefritis intersticial aguda, glomerulonefropatía, glomerulonefritis, daño tubular proximal y distal, vasculitis renal, obstrucción de la arteria renal, lesión isquémica renal, síndrome de lisis tumoral, rabdomiolisis, obstrucción del tracto urinario, azotemia prerrenal, trombosis de la vena renal, síndrome cardiorrenal, síndrome hepatorrenal, síndrome renalpulmonar, síndrome del compartimiento abdominal, infección del tracto urinario, infección del tracto urinario superior, infección del tracto urinario inferior, lesión por un agente nefrotóxico, cáncer de vejiga, cáncer renal, cáncer urológico o nefropatía de contraste.
Los métodos descritos en la presente descripción pueden detectar la enfermedad renal, la lesión renal y el daño renal antes que los métodos conocidos (por ejemplo, ensayos de creatinina sérica). Los métodos descritos en la presente descripción pueden detectar la enfermedad renal, la lesión renal y el daño renal dentro de aproximadamente 5, 4, 3, 2, 1 o menos días desde el inicio de la detección de la enfermedad renal, la lesión renal y el daño renal.
En las modalidades descritas en la presente descripción, los complejos se detectan cuando un marcador detectable, como un conjugado enzimático u otro marcador detectable, que se une al uno o más anticuerpos, la una o más otras moléculas que se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de la clusterina específica del riñón y que no se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de otras isoformas de clusterina (por ejemplo, clusterina sérica, clusterina plasmática o isoformas de clusterina no específicas del riñón, transmitidas por la sangre), o ambas, cataliza o proporciona una reacción detectable. Opcionalmente, pueden aplicarse al complejo uno o más marcadores detectables que comprenden un compuesto generador de señales en condiciones que permitan la formación de un complejo marcador detectable. Un complejo marcador detectable comprende clusterina, uno o más anticuerpos o sus fragmentos de unión a antígenos que se unen específicamente a la clusterina, una o más otras moléculas que se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de la clusterina y que no se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de otras isoformas de clusterina y una o más moléculas marcadoras detectables. Se detecta el complejo marcador detectable. Opcionalmente, el uno o más anticuerpos o una o más otras moléculas que se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de la clusterina y que no se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de otras isoformas de clusterina pueden marcarse con un marcador detectable antes de la formación de un complejo marcador detectable. El método puede comprender opcionalmente un control positivo o negativo.
Un complejo que comprende clusterina, uno o más anticuerpos que se unen específicamente a la clusterina, una o más otras moléculas que se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de la clusterina específica del riñón y que no se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de otras isoformas de la clusterina (por ejemplo, clusterina plasmática, clusterina sérica o isoformas de clusterina no específicas del riñón, transmitidas por la sangre) también pueden detectarse mediante el uso de métodos que no requieren marcadores o reactivos de
marcadores detectables. Por ejemplo, pueden usarse biosensores de resonancia de plasmón superficial, biosensores Corning EPIC® o biosensores de reflectancia resonante colorimétrica para detectar los complejos descritos en la presente descripción sin marcadores.
Una modalidad descrita en la presente descripción comprende un complejo que comprende una o más moléculas de clusterina, uno o más anticuerpos o sus fragmentos de unión a antígeno que se unen específicamente a la clusterina y una o más lectinas. El complejo puede comprender una o más moléculas de clusterina específicas del riñón, uno o más anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno que se unen específicamente a la clusterina y una o más moléculas que se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de la clusterina específica del riñón y no se unen a las porciones de carbohidratos de otras isoformas de clusterina. (por ejemplo, clusterina plasmática, clusterina sérica o isoformas de clusterina no específicas del riñón, transmitidas por la sangre). El complejo puede comprender opcionalmente uno o más marcadores detectables que están unidos de forma covalente o no covalente a cualquier componente del complejo. El complejo puede inmovilizarse en un soporte sólido.
En las modalidades descritas en la presente descripción, uno o más anticuerpos que se unen específicamente a la clusterina se inmovilizan en una fase sólida o sustrato. Se añade una muestra de prueba al sustrato. Se añaden al sustrato una o más otras moléculas que se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de la clusterina específica del riñón y que no se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de otras isoformas de clusterina (por ejemplo, clusterina plasmática, clusterina sérica o isoformas de clusterina no específicas del riñón, transmitidas por la sangre). antes de la muestra de prueba, con la muestra de prueba o después de añadir la muestra de prueba al sustrato. La una o más otras moléculas que se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de la clusterina específica del riñón y que no se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de otras isoformas de clusterina pueden marcarse de forma detectable. Las etapas de lavado pueden realizarse antes de cada adición al sustrato. El marcador detectable puede detectarse directamente o detectarse indirectamente mediante, por ejemplo, un cromóforo o un sustrato enzimático que se añade para reaccionar con el marcador detectable. Se permite que se desarrolle una reacción detectable (por ejemplo, desarrollo de color). La reacción se detiene y la reacción detectable puede cuantificarse mediante el uso de, por ejemplo, un espectrofotómetro. Este tipo de ensayo puede cuantificar la cantidad de clusterina específica del riñón en una muestra de prueba.
En las modalidades descritas en la presente descripción, una o más otras moléculas que se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de la clusterina específica del riñón y que no se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de otras isoformas de clusterina (por ejemplo, clusterina plasmática, clusterina sérica o isoformas de clusterina no específicas del riñón, transmitidas por la sangre) están unidas a una fase sólida o sustrato. Se añade una muestra de prueba al sustrato. Uno o más anticuerpos que se unen específicamente a la clusterina específica del riñón se añaden al sustrato antes de la muestra de prueba, con la muestra de prueba o después de añadir la muestra de prueba al sustrato. El uno o más anticuerpos o sus fragmentos de unión a antígeno pueden marcarse de forma detectable. Las etapas de lavado pueden realizarse antes de cada adición al sustrato. El marcador de anticuerpo puede detectarse directamente o detectarse indirectamente mediante, por ejemplo, un sustrato cromóforo o enzimático que se añade al sustrato para que reaccione con el marcador detectable. Se permite que se desarrolle una reacción detectable (por ejemplo, color). La reacción detectable se detiene y la reacción puede cuantificarse mediante el uso de, por ejemplo, un espectrofotómetro. Este tipo de ensayo puede cuantificar la cantidad de clusterina específica del riñón en una muestra de prueba.
En las modalidades descritas en la presente descripción, se elimina una muestra de una primera isoforma de clusterina (o múltiples isoformas de clusterina) para detectar mejor una segunda isoforma de clusterina (u otras múltiples isoformas de clusterina). La muestra se pone en contacto con una o más lectinas que se unen específicamente a la primera isoforma de clusterina de manera que se forma un complejo de una o más lectinas y una o más primeras isoformas de clusterina. En un ejemplo, las lectinas DC-SIGN se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de la clusterina del semen, pero no se unen a las porciones de carbohidratos de la clusterina sérica. Alternativamente, una muestra puede ponerse en contacto con una o más moléculas que se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de las primeras isoformas de clusterina y que no se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de las segundas isoformas de clusterina, de manera que un complejo de una o más moléculas que se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de la primera isoforma de clusterina y que no se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de las segundas isoformas de clusterina y se forman una o más primeras isoformas de clusterina. A continuación, los complejos pueden eliminarse opcionalmente de la muestra, por ejemplo, mediante precipitación. Puede realizarse un ensayo para la segunda clusterina mediante el uso de, por ejemplo, cualquier ensayo descrito en la presente descripción. Como alternativa, puede realizarse cualquier ensayo para la segunda isoforma de clusterina una vez que la primera isoforma de clusterina se haya eliminado de la muestra (por ejemplo, se pone en contacto la muestra con uno o más anticuerpos específicos para clusterina y se realiza la detección de complejos de clusterina/anticuerpo). Pueden usarse ensayos sándwich que usan dos anticuerpos o ensayos directos que usan un anticuerpo.
En las modalidades descritas en la presente descripción, se elimina una muestra de clusterina no específica del riñón para detectar mejor la clusterina específica del riñón. Una muestra se pone en contacto con una o más lectinas que se unen específicamente a una o más isoformas de clusterina no específicas del riñón (por ejemplo, isoformas
de clusterina sérica o plasmática) de manera que se forma un complejo de una o más lectinas y una o más isotermas de clusterina no específicas del riñón. WGA no se une a la clusterina plasmática y se une a la clusterina específica del riñón. Alternativamente, una muestra puede ponerse en contacto con una o más moléculas que se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de la clusterina no específica del riñón y que no se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de isoformas de clusterina específicas del riñón de manera que se forme un complejo de una o más moléculas que se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de isoformas de clusterina no específicas del riñón y que no se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de isoformas de clusterina específicas del riñón y se forman una o más isoformas de clusterina no específicas del riñón. A continuación, los complejos pueden eliminarse de la muestra. Puede realizarse un ensayo para la clusterina específica del riñón, por ejemplo, cualquier ensayo descrito en la presente descripción. Alternativamente, puede realizarse cualquier ensayo para la clusterina específica del riñón una vez que las isoformas de clusterina no específicas del riñón se eliminan de la muestra (por ejemplo, se pone en contacto la muestra con uno o más anticuerpos específicos para clusterina y se realiza la detección de complejos de clusterina/anticuerpo). Pueden usarse ensayos sándwich que usan dos anticuerpos o ensayos directos que usan un anticuerpo.
Los ensayos descritos en la presente descripción incluyen, pero no se limitan a los basados en competición, reacción directa o ensayos de tipo sándwich, que incluyen, pero no se limitan a, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), ensayo competitivo, transferencia Western, IFA, radioinmunoensayo (RIA), ensayo de hemaglutinación (HA), ensayo de aglutinación, inmunoensayo de polarización de fluorescencia (FPIA) y ensayos de placa de microtitulación (cualquier ensayo realizado en uno o más pocillos de una placa de microtitulación). Un ensayo descrito en la presente descripción comprende un ensayo de unión cromatográfica de flujo reversible, por ejemplo, un ensayo SNAP®. Véase la patente de Estados Unidos núm. 5,726,010.
Los ensayos pueden usar fases sólidas, sustratos o soportes o pueden realizarse mediante inmunoprecipitación o cualquier otro método que no utilice soportes. Cuando se usa una fase, sustrato o soporte sólido, uno o más anticuerpos, una o más otras moléculas que se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de la clusterina específica del riñón y que no se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de otras isoformas de clusterina, o sus combinaciones, se unen directa o indirectamente a un soporte o sustrato, tal como un pocillo de microtitulación, una perla magnética, una perla no magnética, una columna, una matriz, una membrana, vidrio, poliestireno, dextrano, nailon, amilasas, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, agarosas, magletita, material fibroso compuesto de fibras sintéticas o naturales (por ejemplo, materiales a base de vidrio o celulosa o polímeros termoplásticos, como polietileno, polipropileno o poliéster), estructura sinterizada compuesta de materiales particulados (por ejemplo, vidrio o varios polímeros termoplásticos), o película de membrana fundida compuesta de nitrocelulosa, nailon, polisulfona o similares (generalmente de naturaleza sintética). En las modalidades descritas en la presente descripción, un sustrato son partículas finas sinterizadas de polietileno, comúnmente conocido como polietileno poroso, por ejemplo, polietileno poroso de 10-15 micras de Chromex Corporation (Albuquerque, NM). Todos estos materiales de sustrato pueden usarse en formas adecuadas, como películas, láminas o placas, o pueden recubrirse, unirse o laminarse a soportes inertes apropiados, como papel, vidrio, películas plásticas o telas. Los métodos adecuados para inmovilizar anticuerpos, proteínas y lectinas en fases sólidas incluyen interacciones iónicas, hidrofóbicas, covalentes y similares.
Los anticuerpos, lectinas o moléculas que se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de una o más isoformas de clusterina (por ejemplo, clusterina específica del riñón) y que no se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de otras isoformas de clusterina (por ejemplo, clusterina plasmática, clusterina sérica o transmitida por la sangre, isoformas de clusterina no específicas del riñón) pueden fijarse a un soporte sólido, por ejemplo, mediante adsorción o mediante enlace covalente de manera que las moléculas conserven su actividad de unión selectiva. Opcionalmente, pueden incluirse grupos espaciadores para que el sitio de unión de la molécula permanezca accesible. Las moléculas inmovilizadas pueden usarse después para unir moléculas de clusterina de una muestra, como una muestra biológica que incluye saliva, suero, esputo, sangre, orina, heces, líquido cefalorraquídeo, líquido amniótico, exudado de heridas o tejido.
La formación de un complejo (por ejemplo, un complejo de uno o más de los siguientes: (1) clusterina, anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno, moléculas que se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de una o más isoformas de clusterina (por ejemplo, isoformas específicas del riñón) y que no se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de otras isoformas de clusterina (por ejemplo, clusterina plasmática, clusterina sérica o isoformas de clusterina no específicas del riñón, transmitidas por la sangre); (2) marcador detectable, clusterina, anticuerpo o sus fragmentos de unión a antígeno, una o más otras moléculas que se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de una o más isoformas de clusterina (por ejemplo, clusterina específica del riñón) y que no se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de otras isoformas de clusterina (por ejemplo, clusterina plasmática, clusterina sérica o isoformas de clusterina no específicas del riñón, transmitidas por la sangre) puede detectarse, por ejemplo, mediante métodos radiométricos, colorimétricos, fluorométricos, de separación por tamaño, de biosensores, métodos de precipitación o métodos sin marcaje. Opcionalmente, la detección de un complejo puede realizarse mediante la adición de un anticuerpo secundario que se acopla a un marcador detectable. Los marcadores detectables que comprenden compuestos generadores de señales asociados con un complejo pueden detectarse mediante el uso de los métodos descritos anteriormente e incluyen agentes cromogénicos, catalizadores como conjugados enzimáticos, compuestos fluorescentes como fluoresceína y rodamina, compuestos
quimioluminiscentes como dioxetanos, acridinios, fenantridinios, rutenio y luminol, elementos radiactivos, marcadores visuales directos, así como también cofactores, inhibidores, partículas magnéticas y similares. Los ejemplos de conjugados enzimáticos incluyen fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante, beta-galactosidasa y similares. La selección de un marcador en particular no es crítica, pero será capaz de producir una señal por sí misma o junto con una o más sustancias adicionales.
La formación del complejo es indicativa de la presencia de una o más isoformas de clusterina (por ejemplo, clusterina específica del riñón) en una muestra de prueba. Los métodos descritos en la presente descripción pueden indicar la cantidad o el número de una o más isoformas de clusterina (por ejemplo, clusterina específica del riñón) en una muestra de prueba. Con muchos marcadores detectables, como los conjugados de enzimas, la cantidad de clusterina presente es proporcional a la señal generada. En dependencia del tipo de muestra de prueba, esta puede diluirse con un reactivo tampón adecuado, concentrarse o ponerse en contacto con una fase sólida sin manipulación alguna. Por ejemplo, las muestras de prueba pueden diluirse o concentrarse para determinar la presencia y/o la cantidad de clusterina.
Los ensayos descritos en la presente descripción también pueden usarse para monitorear el curso de la mejora de una enfermedad renal, lesión renal o daño renal. Tras medir el aumento o la disminución de la clusterina específica del riñón en una muestra de prueba de un sujeto, puede determinarse si un régimen terapéutico particular destinado a mejorar la enfermedad o el daño es efectivo.
Kits
En la presente descripción se describen además kits de ensayo (por ejemplo, manufacturados) para detectar la clusterina específica del riñón. Un kit puede comprender uno o más anticuerpos o sus fragmentos de unión a antígeno descritos en la presente descripción y una o más otras moléculas que se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de una o más isoformas de clusterina (por ejemplo, clusterina específica del riñón) y que no se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de otras isoformas. de clusterina (por ejemplo, clusterina plasmática, clusterina sérica o isoformas de clusterina no específicas del riñón, transmitidas por la sangre) y composiciones para determinar la unión específica de los anticuerpos, la una o más otras moléculas y la clusterina en la muestra. Estos componentes pueden comprender uno o más marcadores detectables (es decir, los marcadores detectables pueden inmovilizarse en uno o más de los componentes) o los marcadores detectables pueden proporcionarse por separado. Un kit puede comprender un dispositivo que contiene uno o más anticuerpos o sus fragmentos de unión a antígeno descritos en la presente descripción y una o más otras moléculas que se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de una o más isoformas de clusterina (por ejemplo, isoformas específicas del riñón) y que no se unen específicamente a las porciones de carbohidratos. de otras isoformas de clusterina (por ejemplo, clusterina sérica o plasmática) e instrucciones de uso de las moléculas para, por ejemplo, la identificación de enfermedad renal, lesión renal o daño renal en un mamífero. Un kit puede comprender un soporte con uno o más anticuerpos o sus fragmentos de unión a antígeno o una o más otras moléculas que se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de una o más isoformas de clusterina (por ejemplo, clusterina específica del riñón) y que no se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de otras isoformas de clusterina (por ejemplo, clusterina plasmática o sérica) o ambas inmovilizadas sobre el soporte. El kit comprende además material de empaque que comprende un marcador que indica que la una o más otras moléculas que se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de clusterina específica del riñón y que no se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de otras isoformas de clusterina y anticuerpos del kit pueden usarse para la identificación de la enfermedad renal, la lesión renal o el daño renal. Otros componentes tales como tampones, controles (por ejemplo, controles positivos como clusterina específica del riñón; controles negativos como clusterina plasmática, clusterina sérica o tampones) y similares, conocidos por los expertos en la técnica, pueden incluirse en dichos kits de prueba. La una o más otras moléculas que se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de clusterina específica del riñón y que no se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de otras isoformas de clusterina, anticuerpos, ensayos y kits descritos en la presente descripción son útiles, por ejemplo, en el diagnóstico de casos individuales de enfermedad renal, lesión renal o daño renal en un paciente, así como también estudios epidemiológicos de la enfermedad renal, la lesión renal o el daño renal.
Un kit comprende además una o más lectinas que se unen específicamente a una o más isoformas de clusterina no específicas del riñón (por ejemplo, isoformas de clusterina sérica o plasmática) para la formación de un complejo de una o más lectinas y una o más isoformas de clusterina no específicas del riñón. Un kit comprende además una o más moléculas que se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de la clusterina no específica del riñón y que no se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de isoformas de clusterina específicas del riñón, para la formación de complejos entre una o más isoformas de clusterina no específicas del riñón y la una o más moléculas.
La invención descrita de manera ilustrativa en la presente descripción puede practicarse adecuadamente en ausencia de cualquier elemento o elementos, limitación o limitaciones que no se describan específicamente en la presente descripción. Así, por ejemplo, en cada caso en la presente descripción, cualquiera de los términos "que comprende", "que consiste esencialmente en" y "que consiste en" puede sustituirse por cualquiera de los otros dos términos, mientras que conserva sus significados ordinarios. Los términos y expresiones que se han empleado se
usan como términos de descripción y no de limitación, y no hay intención de que en el uso de dichos términos y expresiones se excluyan los equivalentes de las características mostradas y descritas o sus partes
Además, cuando las características o aspectos de la invención se describen en términos de grupos Markush u otra agrupación de alternativas, los expertos en la técnica reconocerán que la invención también se describe en términos de cualquier miembro individual o subgrupo de miembros del grupo de Markush u otro grupo.
Lo siguiente se proporciona únicamente a modo de ejemplo y no pretende limitar el alcance de la invención descrita en términos generales anteriormente.
Ejemplos
Ejemplo 1
Contaminación de sangre
Se añadió el suero canino normal en la orina negativa (es decir, orina de caninos sanos) y se midió la cantidad de clusterina mediante el uso del EIA de clusterina comercial (Biovendor). Como se muestra en la Figura 1A-B, se miden niveles significativos de clusterina incluso a una dilución de 1:1000 (1 pl por ml). Por lo tanto, es importante poder detectar la isoforma de clusterina específica del riñón y excluir cualquier detección de isoforma de clusterina sérica o plasmática.
Ejemplo 2: Materiales
Aislamiento de moléculas de clusterina
La secuencia de clusterina canina se usó para diseñar y sintetizar un vector para expresar una molécula de clusterina canina etiquetada con his recombinante (Life Technologies). Después de la expresión y purificación de la proteína, la secuencia se confirmó por LC-MS. Esta molécula se denomina clusterina recombinante o clusterina recombinante etiquetada con his en la presente descripción.
La clusterina plasmática se purificó a partir del plasma agrupado de 30 caninos mediante cromatografía de afinidad. La clusterina derivada de células del riñón canino Madin-Darby (MDCK) (que es una clusterina específica del riñón) se obtuvo tras cultivar células MDCK hasta la confluencia en matraces T de 125 ml a 37 °C, 7,5 % de CO2 en medio MEM 1X suplementado con antibióticos. Se recolectaron los sobrenadantes y la clusterina se purificó por afinidad en una columna anti-clusterina mediante el uso de un sistema de cromatografía AKTA (GE Healthcare).
La clusterina específica del riñón se purificó mediante cromatografía de afinidad a partir de orina agrupada de caninos sospechosos de tener una lesión aguda en el riñón.
Preparación de anticuerpos
El antisuero policlonal contra la clusterina derivada del plasma se generó en conejos. Se generaron anticuerpos monoclonales en ratones mediante el uso de múltiples formas de clusterina como inmunógeno (Immunoprecise, Inc. Vancouver, BC). Las diversas formas incluían clusterina de molécula completa recombinante, cadena alfa de la clusterina, cadena beta de la clusterina, clusterina derivada de plasma, clusterina derivada de MDCK y clusterina derivada de orina (que es una clusterina específica del riñón).
Cromatografía de inmunoafinidad
Se usó clusterina recombinante para inmunizar conejos. La IgG anti-clusterina se purificó por cromatografía de proteína A. Los anticuerpos IgG anti clusterina recombinante se usaron para purificar la clusterina plasmática nativa a partir de un grupo de plasma canino mediante cromatografía de afinidad. Los anticuerpos monoclonales se produjeron tras inmunizar ratones con clusterina plasmática y los anticuerpos IgG anti-clusterina resultantes se purificaron mediante cromatografía de proteína A.
Anticuerpos de detección
Los anticuerpos monoclonales o policlonales anti-clusterina (nativos de plasma) se marcaron con peróxido de rábano picante (HRP) mediante química SMCC estándar (Thermo-Pierce).
Estándar de clusterina
La clusterina se purificó mediante cromatografía de afinidad a partir de los sobrenadantes de cultivo de la línea celular MDCK (ATCC) o plasma canino agrupado. La clusterina resultante se cuantificó mediante LCMS. Se asignaron valores (mg/ml) y se realizaron curvas estándar y controles.
Ejemplo 3: Protocolo general de ensayo de clusterina
Se preparó una curva estándar de clusterina en tampón de ensayo (PBS 1x que contenía BSA 1 % y Tween® (polisorbato) 20) 0,5 % por dilución en serie de un estándar de 500 ng/ml. Las muestras de orina se diluyeron 1:100 en tampón de ensayo y se incubaron 100 j l durante 1 hora a temperatura ambiente por duplicado en la placa. Después de 3 lavados con tampón PetChek® (IDEXX Laboratories), se incubaron 100 j l de anticuerpo anticlusterina marcado con peroxidasa de rábano picante durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de 3 lavados como anteriormente, se añadieron 50 j l de sustrato TMB (IDEXX Laboratories) y se dejó que se desarrollara el color durante 5 minutos. La reacción colorimétrica se detuvo mediante la adición de 100 j l de ácido (HCl 1 N). Las placas se leyeron inmediatamente a 450 nm.
Placas recubiertas de clusterina
Las placas de microvaloración se recubrieron con 5 jg/ml de clusterina plasmática, clusterina derivada de MDCK, clusterina etiquetada con His recombinante y BSA durante una noche a 4 °C en tampón de carbonato 0,05 M, pH 9,5. Después de 3 lavados con PBS-Tween® (polisorbato) 20 (0,1 %), las placas se bloquearon con albúmina de suero bovino (BSA) 1 % en PBST durante 2 horas. Las placas se secaron al vacío durante 4 horas después de 3 lavados adicionales con PBST.
Placas recubiertas de lectina
Se diluyeron lectinas biotiniladas (Vector Labs, Burlingame, CA) a 5 jg/ml en PBS, pH 7,4 y 100 j l y se añadieron a pocillos de placas recubiertas con estreptavidina (IDEXX Laboratories). Después de la unión durante la noche a 4 °C, las placas se lavaron 3 veces con PBST. Todas las placas se almacenaron, desecaron, a 4 °C hasta su uso. Ejemplo 4: Especificidad de lectina clusterina
Se incubaron placas de microvaloración recubiertas con clusterina durante 1 hora con 1 jg/ml de lectinas biotiniladas en PBST. Después de 3 lavados con PBST, se incubaron 100 j l de estreptavidina marcada con HRP durante 30 minutos a temperatura ambiente en un agitador de placas. Después de 3 lavados adicionales con PBST, se añadieron 100 j l de sustrato TMB, se incubó durante 5 minutos y se detuvo la reacción con 100 j l de HCL 1N. Las placas se leyeron a 450.
La reactividad de las preparaciones de clusterina a lectinas específicas se muestra en unidades O.D. 450 en la Tabla 2. Una OD > 0,5 se usó como respuesta positiva a una lectina. Se eligió esta DO porque la unión de proteínas no glicosiladas, la clusterina etiquetada con His y la BSA dieron como resultado valores < 0,4 unidades O.D. Se tomó una relación de unión de MDCK/plasma y las relaciones > 2.0 se seleccionaron para una caracterización adicional. Cuatro (4) lectinas cumplieron este criterio, PHA-E, PHA-L, WGA y LEL. Se seleccionó lectina de germen de trigo (WGA) para la caracterización adicional.
Ejemplo 5: Viabilidad de la detección de clusterina específica del riñón
Se diluyeron en serie varias formas de clusterina (clusterina derivada de MDCK, clusterina plasmática nativa y clusterina etiquetada con his recombinante) en tampón de ensayo y se detectaron con anticuerpo monoclonal marcado con HRP anti-clusterina. La Figura 2 muestra la unión de solo la preparación de clusterina derivada de MDCK de una manera dependiente de la dosis. La clusterina recombinante etiquetada con his, que no tiene carbohidrato, y la clusterina plasmática nativa, que contiene carbohidrato, no se unen a la fase sólida de lectina en ninguna concentración probada.
Especificidad de la lectina hacia la clusterina específica del riñón
Las muestras de clusterina plasmática nativa, clusterina derivada de MDCK y clusterina derivada de orina se diluyeron a 1 pg/ml en tampón de ensayo y se detectaron con anticuerpos monoclonales anti-clusterina HRP en diferentes fases sólidas de lectina. La Tabla 3 a continuación muestra la unión de solo la clusterina derivada de MDCK y la clusterina purificada de la orina a la fase sólida de WGA. Hubo una unión reducida a WGA succinilada (sWGA), lo que sugiere que los residuos de ácido siálico no juegan un papel en la unión.
Tabla 3. Antí eno de clusterina^ en fase sólida
Los anticuerpos anti-clusterina policlonales y monoclonales pueden unirse a la clusterina derivada de MDCK unida a múltiples fases sólidas de lectina y no se unen a la clusterina de fuentes de plasma porque la clusterina derivada del plasma no pudo unirse a las fases sólidas de lectina. La WGA es específica para la clusterina específica del riñón (derivada de MDCK y orina).
A continuación, las lectinas se cribaron en busca de antígenos de clusterina que fueron capturados en la fase sólida por anticuerpos monoclonales o policlonales. Los anticuerpos monoclonales 3A4, los anticuerpos monoclonales 9H7, los anticuerpos monoclonales 2E2, los anticuerpos monoclonales 2F2, los anticuerpos policlonales anti-clusterina de cadena alfa, los anticuerpos policlonales anti-clusterina de cadena beta o los anticuerpos policlonales anti-clusterina de orina se inmovilizaron en una fase sólida. Se añadió clusterina derivada de MDCK o derivada de plasma (1 pg/ml) a la fase sólida junto con WGA biotinilada, sWGA, Pha-L, Pha-E o tampón de control. Los resultados se muestran en la Tabla 4.
Tabla 4.
El anticuerpo monoclonal 9H7 y la clusterina policlonal anti-cadena beta, y la clusterina policlonal anti-orina exhiben la mejor sensibilidad. WGA, Pha-L, Pha-E se unieron específicamente a la clusterina derivada de MDCK y no se unieron específicamente a la clusterina derivada de plasma.
WGA (5 pg/ml), sWGA (5 pg/ml), anticuerpo policlonal anti-clusterina plasmática o tampón se unieron a una fase sólida. Se añadió clusterina derivada de plasma (1 pg/ml), clusterina derivada de MDKC (1 pg/ml), clusterina derivada de orina (1 pg/ml) o tampón. Los resultados se muestran en la Tabla 5. A continuación, se añadió el anticuerpo monoclonal 9H7 (100 ng/ml) conjugado con la peroxidasa de rábano picante. Se detectó unión específica. La clusterina derivada de MDCK y la clusterina derivada de la orina se unieron específicamente a la WGA inmovilizada y se detectaron por el anticuerpo 9H7. La clusterina derivada de plasma no se unió específicamente al WGA inmovilizado y no se detectó por el anticuerpo 9H7. Los resultados se muestran en la Tabla 5.
Tabla 5.
Se añadió suero recién preparado a la orina y se probó la formación de complejos inmunitarios en sándwich con una fase sólida que comprendía lectina WGA inmovilizada y lectina sWGA. Se detectaron complejos de clusterina específicos del riñón y lectina con anticuerpo monoclonal 9H7 conjugado con HRP. Los resultados se muestran en la Tabla 6. Los resultados sugieren que el complejo (WGA, clusterina específica del riñón y anticuerpo) se forma solo cuando la clusterina derivada de MDCK se añade a la orina sin reactividad significativa cuando el suero se añade a la orina entre 0,1 -10 %. Por lo tanto, el análisis no detecta la clusterina sérica.
Tabla 6.
Las muestras de clusterina recombinante etiquetada con His, clusterina derivada de plasma y clusterina derivada de MDCK se redujeron con DDT para separar las cadenas alfa y beta de la clusterina o permanecieron sin reducir. En transferencias de Western, se demostró que el anticuerpo monoclonal 9H7 se une tanto a la clusterina derivada de MDCK como a la clusterina derivada de plasma. Sin embargo, la lectina WGA se une solo a la clusterina derivada de MDCK no reducida o reducida. Véase la Tabla 7. WGA no se unió a la clusterina recombinante etiquetada con his no reducida o reducida o a la clusterina derivada de plasma no reducida o reducida.
Tabla 7.
Ejemplo 6 Niveles de clusterina en perros de campo con hematuria
La orina de caninos sanos se examinó con una tira reactiva UA (IDEXX Laboratories, Inc.) para detectar la presencia de sangre. Los niveles de clusterina específica del riñón se midieron mediante el uso del EIA de clusterina comercial de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Biovendor Research and Diagnostic Products). Como se muestra a continuación (Tabla 8), los caninos sanos con sangre no detectable en la orina tenían niveles de clusterina dentro del intervalo de referencia (70 ng/ml), mientras que los que tenían contaminación con sangre (muestras 5 a 8) tenían niveles de clusterina 10-100 veces superiores. el intervalo normal de referencia. Este resultado indica que la presencia de sangre en la orina puede dar como resultado mediciones altas de clusterina, lo que lleva a falsos positivos.
Tabla 8
Ejemplo 7 Especificidad del inmunoensayo de clusterina específico del riñón
Se diseñó un inmunoensayo de clusterina específico del riñón (KSCI) mediante el uso de un anticuerpo monoclonal (lgG2a, kappa) producido contra clusterina canina purificada a partir de plasma y lectina de germen de trigo (WGA).
La WGA se recubrió sobre pocilios de una placa de microtitulación. El anticuerpo monoclonal se marcó con HRP. Para ilustrar la especificidad del KSCI, se añadió sangre completa o plasma fresco de un perro sano a un tampón y se analizó mediante el ensayo KSCI y Commercial Clusterin EIA (Biovendor).
Como se muestra en la Figura 3, la clusterina se detectó a concentraciones altas tanto en sangre como en suero, pero no el KSCI. Teniendo en cuenta el hecho de que un alto porcentaje de muestras de orina de perros y gatos sanos tienen contaminación de sangre, la única forma de medir con precisión la clusterina es usar el inmunoensayo de clusterina específico del riñón.
Ejemplo 8: Clusterina específica del riñón en un modelo canino de gentamicina
La clusterina específica del riñón se midió en la orina de un modelo canino de gentamicina (Figura 4). En el sistema modelo, los perros recibieron 40 mg/kg de gentamicina diariamente durante 5 días. En este modelo canino, la creatinina sérica permaneció esencialmente sin cambios durante todo el estudio, mientras que la clusterina específica del riñón en la orina aumentó rápidamente, alcanzó aproximadamente 5 veces el valor inicial cuando se detuvo la dosificación y alcanzó un máximo de aproximadamente 10 veces el valor inicial en el día 11. Esto demuestra que la clusterina específica del riñón es un marcador más temprano y sensible que la creatinina sérica para la lesión renal activa.
Ejemplo 9: Clusterina renal específica en pacientes con lesión renal activa
Se midió la clusterina específica del riñón en la orina de perros que acudieron a una clínica con lesión renal activa inducida por inflamación o isquemia (Figura 5). Los datos muestran una clara separación en la concentración de clusterina específica del riñón entre pacientes sanos y aquellos diagnosticados con lesión renal activa. En conclusión, la clusterina específica del riñón es un marcador sensible y específico de la lesión renal activa.
Ejemplo 10: Clusterina específica del riñón en pacientes con infecciones del tracto urinario
Se midió la clusterina específica del riñón en gatos y perros con infecciones del tracto urinario (UTI) (Figura 6). Los niveles de clusterina específica del riñón aumentaron drásticamente en un subconjunto de pacientes con UTI. La clusterina específica del riñón es un marcador de UTI.
Ejemplo 11: Clusterina específica del riñón en gatos.
La clusterina felina se aisló a partir de células CRFK renales felinas (ATCC, Manassas, VA). El análisis de la clusterina felina soluble se realizó mediante el uso de transferencia Western SDS-PAGE y una matriz de cribado de lectina.
Los sobrenadantes de las líneas celulares renales canina y felina (MDCK y CRFK, respectivamente) y una preparación de clusterina purificada a partir de plasma canino se procesaron en SDS-PAGE y se transfirieron a nitrocelulosa. La transferencia se sondeó con un anticuerpo monoclonal anti-clusterina generado contra la clusterina canina. Los resultados (Figura 7) muestran que el anticuerpo monoclonal presentó reacción cruzada con la clusterina felina producida por el CRFK. Por lo tanto, el anticuerpo monoclonal puede usarse para la detección de la clusterina renal felina en el formato de inmunoensayo de dos sitios (ELISA).
Cribado de lectinas en muestras clínicas felinas
Las lectinas biotiniladas (Vector Labs) se recubrieron a 1 pg/ml en PBST (Tween 20® (polisorbato) 0,01 %) en placas recubiertas con estreptavidina durante una noche a 4 °C. Las placas se lavaron 3 veces y la clusterina felina se purificó por afinidad a partir de plasma (1 pg/ml) u orina clínica felina diluida 1:10 y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de 3 lavados, se añadieron 100 pl de anticuerpo monoclonal marcado con HRP producido contra la clusterina canina (250 ng/ml) y se incubó durante 30 minutos como anteriormente. Después de otros tres lavados, se añadieron 100 pl de TMB y se desarrolló el color durante 5 minutos, después de lo cual se añadieron 100 pl de HCL 1N para detener la reacción. La absorbancia se leyó a 450 nm. Los resultados se muestran en la Tabla 9.
Tabla 9
Doce lectinas (en negrita) fueron capaces de formar un sándwich con la clusterina felina y el anticuerpo monoclonal anti-clusterina. Como se muestra, WGA se une a la clusterina felina. Por lo tanto, el ensayo KSCI puede usarse para detectar la clusterina tanto en perros como en gatos.
Detección de clusterina urinaria en muestras clínicas mediante el uso de formato lectina
Se recogió orina de felinos que visitaban un hospital veterinario local, se diluyó 1:100 y se sometió al ensayo KSCI. Como se muestra, los animales representaron el intervalo del ensayo, lo que demuestra que el ensayo KSCI desarrollado para caninos tiene reactividad cruzada con muestras clínicas felinas. (< LOD = por debajo del límite de detección; > ULOQ = por encima del límite superior de cuantificación). Véase la Tabla 10.
Tabla 10.
Ejemplo 12: Clusterina específica del riñón en humanos
La línea celular de riñón epitelial embrionario humano adherente HEK293, la línea celular de riñón canino MDCK y la línea celular epitelial de riñón de mono verde Vero (ATCC, Manassas, VA) se cultivaron según las instrucciones del proveedor. Cuando las células fueron confluentes, las células se sometieron a estrés mediante el uso de un fármaco nefrotóxico, 0,2 mg/ml de gentamicina, se calentaron a 40 °C o se trataron con una combinación de calor y fármaco. Se recolectaron los sobrenadantes y se evaluó su reactividad en un ELISA de clusterina humana disponible comercialmente (Biovendor). Los resultados (Tabla 11) mostraron que el ELISA es reactivo con la clusterina expresada por las células HEK293.
Las líneas celulares renales se estresaron con un fármaco nefrotóxico gentamicina 0,2 mg/ml, calor a 40 °C durante 24 horas, o una combinación de fármaco (0,2 mg/ml) y calor (40 °C durante 24 horas). Los sobrenadantes se diluyeron 1:100 y se procesaron en el ELISA para clusterina humana (Biovendor). Como se muestra a continuación en la Figura 8, no se observó reactividad con el control de células renales caninas (MDCK). Se observó una ligera reactividad con la línea de riñón de mono verde Vero. La línea humana, HEK 293 mostró la reactividad más fuerte. Esto confirma que la línea celular HEK2993 secretaba clusterina humana cuando se cultivaba en diversas condiciones.
Anticuerpos reactivos con la clusterina expresada en riñones humanos
Con el fin de desarrollar un ELISA de dos sitios (ELISA tipo sándwich), se cribó una biblioteca de anticuerpos monoclonales y policlonales anti-clusterina canina generados contra la clusterina canina recombinante para determinar su unión a la clusterina humana. Los resultados indicaron que múltiples anticuerpos anti-clusterina contra la clusterina canina recombinante pudieron unirse a la clusterina humana. La confirmación de la transferencia Western, Figura 9, muestra la unión de la clusterina de cadena anti-beta de conejo a la clusterina de sobrenadantes celulares de MDCK (carril 2, 4), HEK 293 (carril 3) y el antígeno de cadena beta de clusterina canina recombinante de control positivo (carril 5).
ELISA de clusterina humana
Las placas se recubrieron con 10 pg/ml de anticuerpo policlonal de clusterina anti-cadena beta purificado durante una noche a 4 °C. Las placas se lavaron 3 veces y se bloquearon con BSA 0,1 % durante una noche, seguido de 3 lavados finales. Las placas se secaron durante 2 horas al vacío y se almacenaron a 4 °C hasta su uso. Los sobrenadantes de la línea celular de riñón humano y el control MDCK (canino) se diluyeron 1:10 con PBS y se colocaron 100 pl en pocillos por duplicado. Los sobrenadantes se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación. Después de 3 lavados, se añadieron 100 pl de lectinas biotiniladas (1 pg/ml) en PBS y se incubaron durante 1 hora como anteriormente. Después de tres lavados adicionales, las placas se incubaron durante 30 minutos con estreptavidina-HRP (1:5000) en PBS. Después de 3 lavados finales, las placas se revelaron con 100 pl de sustrato TMB durante 5 minutos y la reacción se detuvo con 100 pl de HCL 1M. La absorbancia se leyó a 450 nm. Véase la Tabla 12. Se demostró que dos lectinas (PSA, DBA) forman un sándwich con la clusterina humana y el anticuerpo policlonal anti-cadena beta canino.
Tabla 12: Es ecificidad de la lectina
Claims (14)
1. Un método para detectar clusterina específica del riñón que comprende
(a) poner en contacto una muestra con
(i) uno o más anticuerpos o sus fragmentos de unión a antígeno que se unen específicamente a la clusterina y
(ii) una o más moléculas que se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de la clusterina específica del riñón y que no se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de isoformas de clusterina no específicas del riñón, transmitidas por la sangre,
y
(b) complejos de detección de la clusterina específica del riñón, el uno o más anticuerpos o sus fragmentos de unión a antígeno que se unen específicamente a la clusterina, y la una o más moléculas que se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de la clusterina específica del riñón y que no se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de isoformas de clusterina no específicas del riñón, transmitidas por la sangre.
2. El método de la reivindicación 1, en donde la una o más moléculas que se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de la clusterina específica del riñón y que no se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de isoformas de clusterina no específicas del riñón, transmitidas por la sangre, son una o más lectinas, o son moléculas que se unen específicamente a la N-acetilglucosamina.
3. El método de la reivindicación 2, en donde la una o más lectinas son leucoaglutinina de Phaseolus vulgaris (PHA-L), aglutinina de germen de trigo (WGA), WGA1, WGA2, WGA3, aglutinina-E de Phaseolus vulgaris (PHA-E), o lectina de Lycopersicon esculentum (LEL).
4. El método de la reivindicación 1, en donde el uno o más anticuerpos o sus fragmentos de unión a antígeno o la una o más moléculas que se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de la clusterina específica del riñón y que no se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de las isoformas de clusterina no específica del riñón, transmitida por la sangre, se inmovilizan en un soporte.
5. El método de la reivindicación 1, en donde el uno o más anticuerpos o sus fragmentos de unión a antígeno, la una o más moléculas que se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de la clusterina específica del riñón y no se unen a las porciones de carbohidratos de isoformas de clusterina no específicas del riñón, transmitidas por la sangre, o ambos están marcados con un marcador detectable.
6. El método de la reivindicación 1, en donde la muestra es una muestra de orina.
7. Un método para detectar enfermedad renal, lesión renal o daño renal en un mamífero que comprende el método de la reivindicación 1, en donde si se detectan los complejos, entonces el mamífero tiene enfermedad renal, lesión renal o daño renal.
8. El método de la reivindicación 7, en donde la enfermedad renal es una infección del tracto urinario.
9. El método de la reivindicación 7, en donde el mamífero es un humano, felino o canino.
10. Un método para distinguir las isoformas de clusterina específicas del riñón de las isoformas de clusterina sérica o plasmática que comprende
(a) poner en contacto una muestra con
(i) uno o más anticuerpos o sus fragmentos de unión a antígeno que se unen específicamente a la clusterina y
(ii) una o más moléculas que se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de las isoformas de clusterina específicas del riñón y no se unen a las porciones de carbohidratos de las isoformas de clusterina sérica o plasmática,
y
(b) detectar complejos de isoformas de clusterina específicas del riñón, uno o más anticuerpos o sus fragmentos de unión a antígeno que se unen específicamente a la clusterina, y la una o más moléculas que se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de las isoformas de clusterina específicas del riñón y que no se unen a las porciones de carbohidratos de las isoformas de clusterina sérica o plasmática.
11. Un complejo que comprende una o más moléculas de clusterina específicas del riñón, uno o más anticuerpos o sus fragmentos de unión a antígeno que se unen específicamente a la clusterina y una o más lectinas que se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de la una o más moléculas de clusterina específicas del riñón.
12. El complejo de la reivindicación 11, en donde el complejo está inmovilizado en un soporte sólido.
13. Un kit que comprende uno o más anticuerpos o sus fragmentos de unión a antígeno que se unen específicamente a la clusterina y una o más moléculas que se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de la clusterina específica del riñón y que no se unen a las porciones de carbohidratos de isoformas de clusterina no específicas del riñón, transmitidas por la sangre, en donde la una o más moléculas son leucoaglutinina de Phaseolus vulgaris (PHA-L), aglutinina de germen de trigo (WGA), WGA1, WGA2, WGA3, aglutinina-E de Phaseolus vulgaris (PHA-E) o lectina de Lycopersicon esculentum (LEL).
14. El kit de la reivindicación 13, en donde el uno o más anticuerpos o sus fragmentos de unión a antígeno, la una o más moléculas que se unen específicamente a las porciones de carbohidratos de la clusterina específica del riñón y que no se unen a las porciones de carbohidratos de isoformas de clusterina no específicas del riñón, transmitidas por la sangre, o ambas están marcados con un marcador detectable.
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