KR20190008216A

KR20190008216A - 허혈 환자의 진단 및 위험도 계층화를 위한 방법 및 키트

Info

Publication number: KR20190008216A
Application number: KR1020187032609A
Authority: KR
Inventors: 마에스트로 리나 바디몬; 라폴스 주딧 쿠베도; 캅마니 테레사 파드로
Original assignee: 푼다시오 인스티튜트 드 레세르카 드 로’스피딸 드 라 산타 크루 아이 상 파우; 콘세호 수페리오르 데 인베스티가시오네스 시엔티피카스
Priority date: 2016-04-12
Filing date: 2017-04-12
Publication date: 2019-01-23
Also published as: KR102344344B1; MX2018012580A; MA44658A; IL262245B; EP3443353B1; CA3020666A1; EP3443353A1; AU2017251355A1; JP7075894B2; BR112018070971A2; US11486884B2; JP2019516966A; EP3232200A1; RU2018139780A; WO2017178521A1; CN109154620B; RU2018139780A3; SG11201808820QA; CN109154620A; US20190128900A1

Abstract

본 발명은 글리코실화된 Apo J의 수준의 검출에 기초하여 허혈(ischemia) 또는 허혈성 조직 손상(ischemic tissue damage)을 진단하는 방법, 허혈성 사건을 겪은 환자에서 허혈의 진행을 예측하는 방법, 허혈성 사건을 겪은 환자에서 예후를 결정하는 방법, 또는 안정형 관상동맥 질환(stable coronary disease)을 가진 환자가 재발성 허혈 사건(recurrent ischemic event)을 겪을 위험을 결정하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 샘플에서 글리코실화된 Apo J을 결정하는 방법에 관한 것이다.

Description

허혈 환자의 진단 및 위험도 계층화를 위한 방법 및 키트

본 발명은 심근 허혈(myocardial ischemia) 또는 뇌 허혈(cerebral ischemia) 또는 이들와 관련된 조직 허혈성 손상을 가진 개체의 예후예측, 진단 및 위험도 계층화(risk stratification)를 위한, 그리고 안정형(stable) 관상동맥 질환(coronary artery disease, CAD)을 가진 환자에서 재발성 허혈 사건(recurrent ischemic event)의 제시를 위한, 바이오마커에 관한 것이다.

급성 관상동맥 증후군(Acute coronary syndrome, ACS) 및 뇌혈관 사건(cerebrovascular event)은 죽상혈전증(atherothrombosis)의 가장 빈번한 임상적 징후이고, 전세계적으로 사망과 장애의 주요 원인에 해당한다. 조기 혈관재건술(revascularization)의 중요성 및 사망의 높은 위험 및/또는 삶의 질의 상실로 인해, 조기 진단이 필수적이다. 이러한 측면에서, ACS 의심 환자의 진단, 환자 분류(triage), 위험도 계층화(risk stratification) 및 관리를 위한 임상 평가를 보완하기 위한, 그리고 허혈성 vs. 출혈성 뇌졸중을 감별하기 위한 중요한 도구로서 바이오마커가 떠오르고 있다. 이들 바이오마커는 병리적 과정(pathological process)에 유용한 정보를 제공해야 하며 보다 복잡하고 비용이 드는 진단 기술들(특히, 자기공명)에 대한 대안을 제시해야 한다.

실제로, 응급실에 입원하는 높은 비율이 심장 허혈 사건과 유사한 증상들(호흡기 또는 근육 병리학으로 인한 통증)을 가지는 비-심장성 문제들로 인한 것이다. 뇌혈관 질환의 경우, 출혈성 vs. 허혈성 뇌졸중의 식별하여 이에 따라 신속히 환자 관리가 개시될 수 있도록 하는 식별자에 대한 절실한 요구가 존재한다.

따라서, 허혈에 대한 조기의, 특이적이고 민감한 검출을 위한 새로운 바이오마커들의 동정에 대한 충족되지 않은 요구가 존재한다. 지금까지, 염증, 심장기능, 및 괴사의 마커들이 연구되었다. 그러나, 이들의 측정이 허혈 증후군(ischemic syndrome)의 진단 및 예후 예측에도 유용할 것인지 명확하지 않다. 허혈성 기관 손상은 보통 조직 괴사보다 먼저 일어나고 적시에 검출될 경우 반전될 수 있다. 허혈의 정확한 조기 진단에 대한 현존하는 마커의 결핍은 전세계적으로 불필요한 경제적 비용의 상승을 초래한다.

요즘에는, 급성 관상동맥 증후군(ACS)의 진단 및 관리가 임상 평가, 심전도 결과 및 트로포닌 수준(유일하게 허용된 바이오마커 그룹)에 기초한다. 이러한 프로토콜의 적용은, 심근 허혈(myocardial ischemia) 환자들의 관리를 위한 새로운 마커들의 검색이 꼭 필요하게 만드는, 여러가지 제한점들을 수반한다. 그 첫번째 약점은 심장 프로포닌(cardiac troponin, cTn)이 심근 병변의 진행성 단계(advanced stage) 인, 비가역적인 괴사(세포 죽음)의 마커라는 점이다. 또한, 고감도 cTn 분석(high-sensitivity cTn assays, hs-cTn)은 확실한 비특이성을 가지는 것으로 밝혀졌다. 또한, 최근의 지침은 급성 흉통을 가진 환자들을 적절히 분류하기 위해서는 반복적인 hs-cTn 측정이 수행될 필요가 있음을 강조한다.

아포지질단백질 J(apolipoprotein J, Apo J)의 아형들의 분포 프로파일에서의 변화에 기초하여 허혈성 조직 손상을 검출하는 방법이 공개문헌 WO2011098645 및 Cubedo, J., et al.,(J. Proteome Res., 2011, 10: 211-220)에 기술되어 있다. 이들 연구에서, Apo J 아형들의 서로 다른 두 그룹인, Apo J-15 및 Apo J-29가, 이차원 전기영동 및 질량분석법에 의해 확인되었다. 이들 Apo J 형태들은 조직 손상, 특히, AMI 로 인한 심장 손상과 관련되었다. 허혈성 손상에서, 조직의 비가역적인 손상을 초래할 수 있는 허혈성 사건의 진행을 방지하기 위해서는, 허혈성 사건의 적시의 정확한 검출이 중요하다. 이러한 상황에서, Apo J 분포 프로파일에서의 변화를 결정하기 위한 이차원 전기영동 및 질량분석에 기초한 방법론은, 허혈 진단에 사용하기에는 너무 복잡하고, 시간과 비용이 많이 소요되기 때문에, 임상 실무에 사용될 수 없었다.

따라서, 당 업계에는, 특히 혈관 손상 및 AMI의 검출을 위한 개선된 방법에 대한 요구가 존재한다.

첫번째 양태로서, 본 발명은 개체의 샘플에서 N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 잔기를 함유하는 글리코실화된 Apo J의 수준 또는 N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 및 시알산 잔기를 함유하는 글리코실화된 Apo J의 수준을 결정하는 단계를 포함하는, 개체에서 허혈 또는 허혈성 조직 손상을 진단하는 방법, 또는 개체의 샘플에서 다투라 스트라모니움(Datura stramonium) 렉틴에 특이적으로 결합할 수 있는 글리코실화된 Apo J의 수준 또는 트리티쿰 불가리스(Triticum vulgaris) 렉틴에 특이적으로 결합할 수 있는 글리코실화된 Apo J의 수준을 결정하는 단계를 포함하는, 개체에서 허혈 또는 허혈성 조직 손상을 진단하는 방법에 관한 것이다.

두 번째 양태로서, 본 발명은 환자의 샘플에서 글리코실화된 Apo J의 수준을 결정하는 단계를 포함하는, 허혈성 사건을 겪은 환자에서 허혈의 진행을 예측하거나 허혈성 사건을 겪은 환자에서 예후를 결정하는 방법으로서, 기준값 대비 글리코실화된 Apo J의 감소된 수준이, 허혈이 진행중임을 나타내거나 환자의 나쁜 예후를 나타내는 것인, 방법에 관한 것이다.

다른 양태로서, 본 발명은 환자의 샘플에서 글리코실화된 Apo J의 수준을 결정하는 단계를 포함하는, 안정형 관상동맥 질환(stable coronary disease)을 가진 환자가 재발성 허혈 사건(recurrent ischemic event)을 겪을 위험을 결정하는 방법으로서, 기준값 대비 글리코실화된 Apo J의 감소된 수준이, 환자가 재발성 허혈 사건을 가질 증가된 위험을 보여준다는 것을 나타내는 것인, 방법에 관한 것이다.

또다른 양태로서, 본 발명은

a. 아세틸글루코사민 및 시알산에서 선택되는 글리칸 잔기에 특이적으로 결합하는 렉틴인, 제1시약, 및

b. Apo J 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 수 있는, 제2시약

을 포함하는, 키트에 관한 것이다.

또다른 양태로서, 본 발명은 환자에서 허혈 또는 허혈성 조직 손상을 진단하거나, 허혈성 사건을 겪은 환자에서 허혈의 진행을 결정하거나, 허혈성 사건을 겪은 환자에서 예후를 예측하거나, 또는 안정형 관상동맥 질환(stable coronary disease)을 가진 환자가 재발성 허혈 사건(recurrent ischemic event)을 겪을 위험을 결정하기 위한, 본 발명에 따른 키트에 관한 것이다.

또다른 양태로서, 본 발명은

(i) 샘플내 글리코실화된 Apo J와 렉틴 간에 복합체가 형성되기에 적절한 조건 하에서, 샘플을 글리코실화된 Apo J에 존재하는 글리칸 잔기에 특이적으로 결합하는 렉틴과 접촉시키는 단계, 및

(ii) 렉틴 및 글리코실화된 Apo J를 함유하는 복합체의 양을 검출하는 단계를 포함하는, 샘플에서 글리코실화된 Apo J를 결정하는 방법에 관한 것이다.

Diagnostic methods for ischemia tissue damage 허혈 조직 손상의 진단 방법

본 말명의 발명자들은 허혈의 초기에 GlcNAc 잔기들을 함유하는-Apo J의 수준 또는 GlcNAc 및 시알산(Neu5Ac)을 함유하는-Apo J의 수준이 대조군 개체들에서 관찰되는 수준에 비하여 감소한다는 것을 발견하였다. 글리코실화된 Apo J의 수준과 심장 허혈 환자들 간의 관련성이 기존에 보고되어 있으나, 기존의 연구는 α-만노스, α-글루코스, (GlcNAc)₂ 및 Neu5Ac 잔기들을 함유하는 글리칸들에 결합할 수 있는 렉틴의 혼합물을 사용하여 글리코실화된 Apo J의 수준을 결정함으로써 수행되었다. 이 방법으로는 대조군 개체들로부터 환자들을 감별하는데 우선적으로 기여하는 글리코실화된 Apo J의 형태들을 식별할 수 없었다. 본 발명의 발명자들은 대조군 샘플들로부터 허혈을 가진 환자들의 샘플을 감별하는데 우선적으로 기여하는 ApoJ의 글리코실화된 형태들을 식별할 수 있었다. 사실, 기존 연구의 연구자들은, Apo J-29가 AMI 전(pre-AMI) 허혈 환자에서 증가하는 것을 보고하였는데, 이는 GlcNAc 잔기들을 함유하는-Apo J 또는 GlcNAc 및 시알산(Neu5Ac)을 함유하는-Apo J에서 일어나는 변화와는 상반된다. 또한, AMI 전 허혈 환자들이 α-만노스, α-글루코스, (GlcNAc)₂ 및 Neu5Ac 잔기들을 가진 검출된 Apo J의 25% 감소를 나타내는 것으로 보고되었지만, GlcNAc 잔기들을 함유하는-Apo J 또는 GlcNAc 및 시알산(Neu5Ac)을 함유하는-Apo J의 특이적인 검출은 AMI 전 허혈 환자들에서 45-50% 감소를 야기하였다. 따라서, 이러한 Apo J의 글리코실화된 형태들의 결정은, 종래 기술에서 기술된 방법을 사용하여 결정된 글리코실화된 Apo J 형태들을 사용하여 수행된 진단에 비하여, 증가된 민감도 및 특이도로 허혈의 진단을 가능하게 한다.

따라서, 첫번째 양태로서, 본 발명은 개체의 샘플에서 N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 잔기를 함유하는 글리코실화된 Apo J의 수준 또는 N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 및 시알산 잔기를 함유하는 글리코실화된 Apo J의 수준을 결정하는 단계를 포함하는, 개체에서 허혈 또는 허혈성 조직 손상을 진단하는 방법으로서, 기준값 대비 N-아세틸글루코사민 잔기를 함유하는 Apo J의 감소된 수준 또는 기준값 대비 N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 및 시알산 잔기를 함유하는 Apo J 의 감소된 수준이, 환자가 허혈 또는 허혈성 조직 손상을 가지고 있음을 나타내는 것인, 방법(이하, 본 발명의 진단 방법이라 함)에 관한 것이다. 본 발명은 또한 개체의 샘플에서 다투라 스트라모니움(Datura stramonium) 렉틴에 특이적으로 결합할 수 있는 글리코실화된 Apo J의 수준 또는 트리티쿰 불가리스(Triticum vulgaris) 렉틴에 특이적으로 결합할 수 있는 글리코실화된 Apo J의 수준을 결정하는 단계를 포함하는, 개체에서 허혈 또는 허혈성 조직 손상을 진단하는 방법으로서, 기준값 대비 다투라 스트라모니움(Datura stramonium) 렉틴에 특이적으로 결합할 수 있는 Apo J의 감소된 수준 또는 트리티쿰 불가리스(Triticum vulgaris) 렉틴에 특이적으로 결합할 수 있는 Apo J의 감소된 수준이 환자가 허혈 또는 허혈성 조직 손상을 가지고 있음을 나타내는 것인, 방법에 관한 것이다.

본 발명의 진단 방법은 관련된 기관 또는 조직의 비가역적인 괴사성 손상 전에 (ACS 의 경우 트로포닌 수준과는 독립적으로), 급성 허혈성 사건(acute ischemic event)의 검출을 가능하게 한다는 점에서 특히 유리하다. 이는 사건이 발생한 후 최초 6시간 이내의 허혈의 존재에 대해 진단적 가치를 제공한다.

본 발명의 측면에서, 용어 "진단"은, 본원에 개시된 방법을 적용 할 때, 심근 허혈 또는 뇌 허혈 또는 이들과 관련된 허혈성 조직 손상을 가진 환자의 샘플과 이러한 장해 및/또는 손상을 가지지 않는 개체의 샘플을 감별하는 능력과 관련된다. 당업자가 이해할 바와 같이, 이러한 검출은 모든 샘플에 대해 100% 정확할 것을 의도하는 것은 아니다. 그러나, 통계적으로 유의한 수의 분석된 샘플들이 정확하게 분류될 것을 요구한다. 통계학적으로 유의한 양은 다른 통계적 수단들, 예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니지만, 신뢰구간의 결정, p값의 결정, Student's t 검정 및 Fisher의 판별함수를 사용함으로써 당업계 전문가에 의해 설정될 수 있다. 바람직하게, 신뢰 구간은 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 미만이다. 바람직하게, p 값은 0.05, 0.01, 0.005 또는 0.0001 미만이다. 바람직하게, 본 발명은 테스트된 특정 그룹 또는 인구의 개체들의 60% 이상, 70%이상, 80%이상, 또는 90% 이상에서 허혈 또는 허혈성 손상을 정확하게 검출할 수 있다.

용어, "허혈(ischemia)"은 본원에서 "허혈성 사건(ischemic event)"과 호환가능하게 사용되며 조직의 기관으로의 혈류의 감소 또는 중단에서 비롯되는 임의의 상황을 말한다. 허혈은 일과성(transient)이거나 영구적(permanent)일 수 있다.

"허혈성 조직 손상(ischemic tissue damage)", "허혈성 조직 장해(ischemic tissue injury)", "허혈로 인한 조직 손상(tissue damage due to ischemia)", "허혈과 관련된 조직 손상(tissue damage associated with ischemia)", "허혈의 결과로서 조직 손상(tissue damage as a result of ischemia)", 허혈에 의해 야기된 손상된 조직(tissue damaged caused by ischemia)", 및 "허혈-손상된 조직(ischemic-damaged tissue)"은 일정시간 허혈의 결과로서 기관 또는 조직 또는 세포에 대한 형태학적, 생리학적 및/또는 분자적 손상을 말한다.

일 구체예에서, 허혈에 의해 야기된 손상은 심장 조직의 손상이다. 보다 바람직한 구체예에서, 심장 조직의 손상은 심근 허혈에 의해 야기된다.

용어 "심근 허혈(myocardial ischemia)"은 관상동맥 죽상경화증(oronary atherosclerosis) 및/또는 심근으로의 불충분한 산소 공급에 의해 야기된 순환 장애를 말한다. 예를 들어, 급성 심근경색증(acute myocardial infarction, AMI)은 심근 조직에 대한 비가역적인 허혈성 공격(ischemic insult)을 나타낸다. 이러한 공격은 관상 순환에서 폐색적(예를 들어, 혈전증의 또는 색전증의) 사건을 일으키고, 심근 대사성 요구들(myocardial metabolic demands)이 심근 조직으로의 산소 공급을 초과하는 환경을 생성한다.

다른 구체예에서, 손상은 미세혈관 협심증(microvascular angina)에 의해 야기된다. 본원에서 용어, "미세혈관 협심증(microvascular angina)"은 작은 심장 혈관들을 통한 불충분한 혈류에서 비롯되는 상태를 말한다.

일 구체예에서, 허혈에 의해 야기되는 손상은 뇌 조직의 손상이다. 다른 구체예에서, 뇌 조직에 대한 손상은 허혈성 뇌졸중에 의해 야기된다. 용어 "허혈성 뇌졸중(ischemic stroke)"이란 (뇌의 산소 결핍을 초래하는) 뇌로의 혈관 또는 폐색에 의해 야기되는 뇌 기능의 갑작스런 상실을 말하며, 대뇌 사고(cerebral accident) 또는 대뇌혈관사고(cerebrovascular accident)라고도 하고, 근육 조절의 상실, 감각 또는 의식의 감소 또는 상실, 현기증(dizziness), 불분명발음(slurred speech), 또는 뇌에 대한 손상의 중증도와 정도가 다양한 기타 증상들을 특징으로 한다. 용어 "뇌 허혈(cerebral ischemia)" (또는 "뇌졸중(stroke)")은 뇌로 공급되는 혈액의 결핍을 말하며, 보통 뇌에 대한 산소의 부족을 초래한다.

용어 "개체" 또는 "개인" 또는 "동물" 또는 "환자"는 치료가 요망되는 임의의 개체, 특히 포유동물 개체를 포함한다. 포유동물 개체는 인간, 가축, 농장 동물, 같은 애완 동물 또는 동물원의 동물 등을 포함하며, 예를 들어, 개, 고양이, 기니아 피그, 토끼, 랫트, 마우스, 말, 소(cattle 또는 cow) 등을 포함한다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 개체는 포유동물이다. 본 발명의 보다 바람직한 구체예에서, 개체는 인간이다.

본원에서 용어 "샘플" 또는 "생물학적 샘플(biological sample)"은 개체로부터 단리된 생물학적 재료를 말한다. 생물학적 샘플은 목적 단백질, 예를 들어, Apo J 의 글리코실화된 형태의 수준을 검출하기에 적합한 임의의 생물학적 재료를 포함한다. 샘플은 임의의 적합한 조직, 또는 혈액, 타액, 혈장, 혈청, 뇨, 뇌척수액(cerebrospinal liquid, CSF) 또는 분변과 같은 생물학적 유체(biological fluid)일 수 있다. 본 발명의 상세한 구체예에서, 샘플은 조직 샘플 또는 체액(biofluid)이다. 본 발명의 보다 상세한 구체예에서, 체액은 혈액, 혈청 또는 혈장으로 이루어진 군에서 선택된다.

바람직하게, Apo J의 상이한 글리코실화된 형태의 수준을 결정하는데 사용되는 샘플은, 그러한 결정이 상대적으로 이루어지는 경우, 기준값을 결정하는데 사용되는 샘플과 동일한 종류이다. 예를 들어, GlcNAc 잔기를 함유하는-Apo J 또는 GlcNAc 및 시알산 잔기를 함유하는-Apo J의 결정이 혈장 샘플에서 수행된다면, 기준값을 결정하는 데도 혈장 샘플이 사용될 것이다. 샘플이 체액이라면, 기준 샘플 역시 동일한 종류의 체액, 예를 들어 혈액, 혈청, 혈장, 뇌척수액에서 결정될 것이다.

본원에서 용어 "Apo J"는 "클루스테린(clusterin)", "테스토스테론-억제된 전립선 메시지(testosterone-Repressed Prostate Message)", "아포리포단백질 J(Apolipoprotein J)", "보체-관련 단백질 SP-40,40(complement-Associated Protein SP-40,40)", "보체 세포용해 저해제(complement cytolysis inhibitor)", "보체 용해 저해제(complement Lysis Inhibitor)", "황산화 당단백질(sulfated glycoprotein)", "Ku70-결합 단백질(Ku70-Binding Protein)", "NA1/NA2", "TRPM-2", "KUB1", "CLI" 로도 알려진 폴리펩티드를 말한다. 인간 Apo J는 UniProtKB/Swiss-Prot 데이터베이스(2016년 3월 16일자 Entry version 187)에서 등록번호 P10909로 제공된다.

본원에서 용어 "GlcNAc 잔기를 함유하는 Apo J"는 하나 이상의 글리칸 사슬에서 GlcNAc 의 하나 이상의 반복체를 포함하는 임의의 Apo J 분자를 말한다. 전형적으로, Apo J는 각 글리칸 사슬에서 하나 이상의 N-아세틸 글루코사민을 함유할 것이다. "GlcNAc 잔기를 함유하는 Apo J"는 고-만노스 N-글리칸, 복합형 N-글리칸, 하이브리드 올리고당 N-글리칸 또는 O-글리칸에서 하나 이상의 GlcNAc 잔기를 함유하는 Apo J 분자를 포함한다. N-글리칸의 종류에 따라, GlcNAc는 폴리펩티드 사슬이 직접적으로 부착되거나 N-글리칸 내 먼 위치에서 발견될 수 있다.

용어 "GlcNAc" 또는 "N-아세틸 글루코사민"은 아세트산에 의한 글루코사민의 아미드화에서 생성된 글루코스 유도체를 말하며 다음의 일반 구조식을 가진다:

일 구체예에서, GlcNAc 잔기를 함유하는-Apo J는 GlcNAc 두 잔기를 함유하며, 본원에서는 이를 (GlcNAc)₂로 지칭한다. (GlcNAc)₂잔기를 함유하는 Apo J 분자는, (GlcNAc)₂가 고-만노스 N-글리칸, 복합형 N-글리칸, 하이브리드 올리고당 N-글리칸 또는 O-글리칸에서 발견되는 분자들을 포함한다. N-글리칸의 종류에 따라, (GlcNAc)₂는 폴리펩티드 사슬이 직접적으로 부착되거나 N-글리칸 내 먼 위치에서 발견될 수 있다.

바람직한 구체예에서, GlcNAc 또는 (GlcNac)₂잔기를 함유하는 글리코실화된 Apo J의 수준은 다투라 스트라모니움(Datura stramonium) 렉틴에 특이적으로 결합할 수 있는 Apo J 의 수준으로 정의된다.

Apo J 의 글리코실화된 형태에 렉틴이 결합하는 것을 언급하기 위하여 본원에서 사용되는 용어 "특이적으로 결합하는"은, 비-특이적 결합에 비하여 실질적으로 높은 친화력을 가진 두 분자의 삼차원적 구조들 간의 상보성(complementarity)을 통해서 렉틴이 Apo J 의 글리코실화된 형태에 특이적으로 결합하는 능력으로 이해되며, 따라서 상기 렉틴과 Apo J 의 글리코실화된 형태 간의 결합은 바람직하게는 이들 분자들 중 어떠한 것이라도 반응 혼합물 내 존재하는 다른 분자들과 결합하기 전에 먼저 일어난다. 이로 인하여 렉틴은 Apo J 분자 내에 존재하거나 존재하지 않을 수 있는 다른 글리칸들과 교차-반응하지 않는다. 렉틴의 교차-반응성(cross-reactivity)은, 예를 들어, 통상적인 조건 하에 상기 렉틴이 관심 글리칸 또는 (구조적으로 및/또는 기능적으로) 밀접하게 관련된 다수의 글리칸들과 결합하는 것을 평가함으로써, 실험적으로 테스트될 수 있다. 렉틴이 관심 글리칸에 결합하지만 다른 임의의 글리칸들에는 결합하지 않거나 필수적으로 결합하지 않는 경우에만, 관심 글리칸에 대해 특이적이라고 고려된다. 예를 들어, 렉틴과 글리코실화된 Apo J 간의 결합 친화력이 10^-6 M 미만, 10^-7 M 미만, 10^-8 M 미만, 10^-9 M 미만, 10^-10 M 미만, 10^-11 M 미만, 10^-12 M 미만, 10^-13 M 미만, 10 ¹⁴ M 미만 또는 10^-15 M 미만의 해리 상수(Kd)를 가지는 경우 결합이 특이적이라고 고려될 수 있다.

바람직한 구체예에서, "GlcNAc 잔기를 함유하는-Apo J"에는 N-결합된 또는 O-결합된 다른 종류의 탄수화물들이 실질적으로 존재하지 않는다(substantially free). 일 구체예에서, "GlcNAc 잔기를 함유하는 Apo J"는 N-결합된 또는 O-결합된 α-만노스 잔기를 함유하지 않는다. 다른 구체예에서, "GlcNAc 잔기를 함유하는-Apo J"는 N-결합된 또는 O-결합된 α-글루코스 잔기를 함유하지 않는다. 다른 구체예에서, "GlcNAc 잔기를 함유하는-Apo J"는 N-결합된 또는 O-결합된 α-만노스 잔기 또는 N-결합된 또는 O-결합된 α-글루코스 잔기를 함유하지 않는다.

본원에서 용어 "GlcNAc 및 시알산 잔기를 함유하는-Apo J"는 이의 글리칸 사슬에 N-아세틸-글루코스의 하나 이상의 반복체 및 시알산 잔기의 하나 이상의 반복체를 함유하는 임의의 Apo J 분자를 말한다.

본원에서 용어 "시알산"은 N-아세틸뉴라미닉산(N-acetylneuraminic acid, Neu5Ac)으로 알려진 단당류(monosaccharide)를 말하며 다음의 일반 구조식을 가진다:

일 구체예에서, Apo J는 두 개의 GlcNAc 잔기 및 한 개의 시알산 잔기를 포함한다 (이하 (GlcNAc)₂-Neu5Ac 라고 지칭함). 다른 구체예에서, GlcNAc 및 시알산 잔기들은 하나 이상의 단당류에 의해 연결된다.

일 구체예에서, N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 및 시알산 잔기들을 함유하는 글리코실화된 Apo J의 수준은 트리티쿰 불가리스(Triticum vulgaris) 렉틴에 특이적으로 결합할 수 있는 Apo J의 수준과 일치한다.

바람직한 구체예에서, "GlcNAc 및 시알산 잔기를 함유하는-Apo J"에는 N-결합된 또는 O-결합된 다른 종류의 탄수화물들이 실질적으로 존재하지 않는다(substantially free). 일 구체예에서, "GlcNAc 및 시알산 잔기를 함유하는-Apo J"는 N-결합된 또는 O-결합된 α-만노스 잔기를 함유하지 않는다. 다른 구체예에서, "GlcNAc 및 시알산 잔기를 함유하는-Apo J"는 N-결합된 또는 O-결합된 α-글루코스 잔기를 함유하지 않는다. 다른 구체예에서, "GlcNAc 및 시알산 잔기를 함유하는-Apo J"는 N-결합된 또는 O-결합된 α-만노스 잔기 또는 N-결합된 또는 O-결합된 α-글루코스 잔기를 함유하지 않는다

바람직한 구체예에서, "T. vulgaris 렉틴에 특이적으로 결합할 수 있는 글리코실화된 Apo J"는하나 이상의 시알산 잔기 또는 하나 이상의 GlcNAc 잔기를 함유하는 Apo J의 임의의 글리코실화된 형태에 해당하며, N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 잔기를 함유하지만 시알산 잔기는 함유하지 않는 Apo J, (GlcNAc)₂ 잔기를 함유하지만 시알산 잔기는 함유하지 않는 Apo J, N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 및 시알산 잔기를 함유하는 Apo J, (GlcNAc)₂, 시알산 잔기를 함유하는 Apo J, 또는 시알산을 함유하지만 GlcNAc 또는 (GlcNAc)₂ 잔기를 함유하지 않는 Apo J를 포함한다.

바람직한 구체예에서, "D. stramonium 렉틴에 특이적으로 결합할 수 있는 글리코실화된 Apo J"는 하나 이상의 GlcNAc 잔기를 함유하는 Apo J의 임의의 글리코실화된 형태에 해당하며, N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 잔기를 함유하는 Apo J 및 (GlcNAc)₂ 잔기를 함유하는 Apo J 를 포함하는, 하나 이상의 GlcNAc 잔기를 함유하는 Apo J를 포함한다.

N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 잔기를 함유하는 글리코실화된 Apo J 의 수준과 관련된 용어 "감소된 수준" 또는 "낮은 수준"은 기준값보다 낮은, 샘플 내 N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 잔기를 함유하는 Apo J의 임의의 발현 수준에 관한 것이다. 따라서, N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 잔기를 함유하는 Apo J 발현 수준이 이의 기준값보다 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 100%, 적어도 110%, 적어도 120%, 적어도 130%, 적어도 140%, 적어도 150% 또는 그 이상 더 낮을 때, 이의 기준값보다 감소되거나 낮은 것으로 이해된다.

N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 및 시알산 잔기를 함유하는 글리코실화된 Apo J 의 수준과 관련된 용어 "감소된 수준" 또는 "낮은 수준"은 기준값보다 낮은, 샘플 내 N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 및 시알산 잔기를 함유하는 Apo J의 임의의 발현 수준에 관한 것이다. 따라서, N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 및 시알산 잔기를 함유하는 Apo J 발현 수준이, 이의 기준값보다 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 100%, 적어도 110%, 적어도 120%, 적어도 130%, 적어도 140%, 적어도 150% 또는 그 이상 더 낮을 때, 이의 기준값보다 감소되거나 낮은 것으로 이해된다.

T. vulgaris 렉틴에 특이적으로 결합할 수 있는 글리코실화된 Apo J 의 수준과 관련된 용어 "감소된 수준" 또는 "낮은 수준"은 기준값보다 낮은, 샘플 내 T. vulgaris 렉틴에 특이적으로 결합할 수 있는 글리코실화된 Apo J 의 임의의 발현 수준에 관한 것이다. 따라서, T. vulgaris 렉틴에 특이적으로 결합할 수 있는 글리코실화된 Apo J의 발현 수준은, 이의 기준값보다 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 100%, 적어도 110%, 적어도 120%, 적어도 130%, 적어도 140%, 적어도 150% 또는 그 이상 더 낮을 때, 이의 기준값보다 감소되거나 낮은 것으로 이해된다.

D. stramonium 렉틴에 특이적으로 결합할 수 있는 글리코실화된 Apo J 의 수준과 관련된 용어 "감소된 수준" 또는 "낮은 수준"은 기준값보다 낮은, 샘플 내 D.stramonium 렉틴에 특이적으로 결합할 수 있는 글리코실화된 Apo J 의 임의의 발현 수준에 관한 것이다. 따라서, D. stramonium 렉틴에 특이적으로 결합할 수 있는 글리코실화된 Apo J의 발현 수준은, 이의 기준값보다 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 100%, 적어도 110%, 적어도 120%, 적어도 130%, 적어도 140%, 적어도 150% 또는 그 이상 더 낮을 때, 이의 기준값보다 감소되거나 낮은 것으로 이해된다.

본 발명의 진단 방법은 연구에서 개체에서 얻어진 수준을 기준값과 비교하는 단계를 포함하며, N-아세틸글루코사민를 함유하는 Apo J의 기준값보다 감소된 수준 또는 N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 및 시알산 잔기를 함유하는 Apo J의 기준값보다 감소된 수준이, 환자가 허혈 또는 허혈성 조직 손상을 앓고 있음을 나타낸다. 본 발명의 진단 방법은, 대안적으로, 연구에서 개체에서 얻어진 수준을 기준값과 비교하는 단계를 포함하며, D. stramonium 렉틴에 결합할 수 있는 Apo J의 기준값보다 감소된 수준 또는 T. vulgaris 렉틴에 결합할 수 있는 Apo J의 기준값보다 감소된 수준이, 환자가 허혈 또는 허혈성 조직 손상을 앓고 있음을 나타낸다.

본원에서 용어 "기준값(reference value)"은 개체에서 수집된 샘플들로부터 수득된 데이터 또는 값을 평가하기 위한 참조로서 사용되는 미리 결정된 기준(criteria)과 관련된다. 기준값 또는 기준 수준은 절대값, 상대값, 상한 또는 하한을 가진 값, 일련의 값, 평균값(average value), 중앙값, 평균값(mean value), 또는 특정 대조값 또는 기저치(control or baseline value)로 표현되는 값일 수 있다. 기준값은 개별 샘플에서 획득한 값, 예를 들면 테스트할 환자에서 얻은 샘플에서 획득하였지만, 이전 시점에 획득한 값을 기반으로 할 수 있다. 기준값은 다수의 샘플, 예를 들어, 생활연령 일치 그룹으로부터의 개체군에서 얻은 샘플들 또는 테스트할 샘플을 포함하거나 제외하는 샘플 풀(pool)로부터 얻는 샘플들을 기반으로 할 수 있다. 일 구체예에서, 기준값은, 건강한 개체에서 결정된, GlcNAc 잔기를 함유하는-Apo J의 수준, GlcNAc 및 시알산(Neu5Ac)을 함유하는-Apo J의 수준, T. vulgaris 렉틴에 특이적으로 결합할 수 있는 Apo J의 수준, 또는 D. stramonium 렉틴에 특이적으로 결합할 수 있는 Apo J의 수준에 해당하며, 이에 의해 건강한 개체는, GlcNAc 잔기를 함유하는-Apo J의 수준, GlcNAc 및 시알산(Neu5Ac)을 함유하는-Apo J의 수준, T.vulgaris 렉틴에 특이적으로 결합할 수 있는 Apo J의 수준, 또는 D. stramonium 렉틴에 특이적으로 결합할 수 있는 Apo J의 수준을 결정할 시점에 허혈성 조직 손상을 나타내지 않으며, 바람직하게는 허혈성 손상의 병력을 나타내지 않는 개체로 이해된다.

다른 구체예에서, 기준값은 임상적 관점에서 문서에 의해 충분히 입증된, 그리고 질환이 없는, 구체적으로는 허혈성 손상 질환을 앓고 있지 않은, 구체적으로는 허혈성 심근 손상 또는 허혈성 뇌 손상을 앓고 있지 않은 환자군으로부터 수득된 샘플 풀(pool)로부터 결정된, 대응하는 바이오마커의 평균 수준(average or mean level)에 해당한다. 상기 샘플에서, 발현 수준은, 예를 들어 기준 집단(reference population)에서 평균적인 발현 수준을 결정함으로써 결정될 수 있다. 기준값의 결정에서, 연령, 성별, 신체 상태 또는 환자의 다른 특성들과 같은, 샘플 종류의 일부 특성들을 고려할 필요가 있다. 예를 들어, 집단이 통계적으로 유의하도록, 적어도 2명, 적어도 10명, 적어도 100명 내지 1000명 이상의 개체군에서 동등한 양을 기준 샘플로 취할 수 있다.

본 발명의 진단 방법에 따라 환자의 진단에 사용되는 기준값은, 동일 종류의 샘플로부터 수득된, 진단에 고려되고 있는 마커와 동일한 바이오마커의 값으로 이해될 것이다. 따라서, 진단 방법이 GlcNAc 또는 (GlcNAc)₂를 함유하는 글리코실화된 Apo J의 수준을 결정함으로써 수행된다면, 상기 진단에 사용된 기준값 역시 GlcNAc 또는 (GlcNAc)₂를 함유하는 글리코실화된 Apo J의 발현 수준이며, 이 경우 건강한 개체로부터 또는 상기 정의된 바와 같은 샘플 풀로부터 수득될 수 있다. 다른 구체예에서, 진단 방법이 GlcNAc 및 시알산 잔기를 함유하는 글리코실화된 Apo J의 수준을 결정함으로써 수행된다면, 상기 진단에 사용된 기준값 역시 상기 설명된 바와 같이 수득된, N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 및 시알산 잔기를 함유하는 글리코실화된 Apo J의 발현 수준이다. 다른 구체예에서, 진단 방법이 D. stramonium 렉틴에 특이적으로 결합할 수 있는 글리코실화된 Apo J 의 수준을 결정함으로써 수행된다면, 상기 진단에 사용된 기준값 역시 상기 설명된 바와 같이 수득된, D. stramonium 렉틴에 특이적으로 결합할 수 있는 글리코실화된 Apo J 의 발현 수준이다. 다른 구체예에서, 진단 방법이 T. vulgaris 렉틴에 특이적으로 결합할 수 있는 글리코실화된 Apo J 의 수준을 결정함으로써 수행된다면, 상기 진단에 사용된 기준값 역시 상기 설명된 바와 같이 수득된, T. vulgaris 렉틴에 특이적으로 결합할 수 있는 글리코실화된 Apo J 의 발현 수준이다.

다른 구체예에서, 바이오마커가 심근 조직 손상을 진단하기 위해 결정된다면, 기준값은 심근 조직 손상을 나타내지 않는, 그리고 바람직하게는 심근 조직 손상을 앓았던 기록이 없는 건강한 개체로부터의 동일한 바이오마커의 수준일 것이다. 기준값이 개체들로부터의 샘플 풀로부터 수득된 동일한 바이오마커의 평균 수준이라면, 그 준비된 샘플 풀이 유래한 개체들은 심근 조직 손상을 나타내지 않는, 그리고 바람직하게는 심근 조직 손상을 앓았던 기록이 없는 건강한 개체이다.

다른 구체예에서, 바이오마커가 뇌 조직 손상을 진단하기 위해 결정된다면, 기준값은 뇌 조직 손상을 나타내지 않는, 그리고 바람직하게는 뇌 조직 손상을 앓았던 기록이 없는 건강한 개체로부터의 동일한 바이오마커의 수준일 것이다. 기준값이 개체들로부터의 샘플 풀로부터 수득된 동일한 바이오마커의 평균 수준이라면, 그 준비된 샘플 풀이 유래한 개체들은 뇌 조직 손상을 나타내지 않는, 그리고 바람직하게는 뇌 조직 손상을 앓았던 기록이 없는 건강한 개체이다.

본 발명의 진단 방법에 사용된 기준값은 요망되는 특이도 및 민감도를 얻기 위해 최적화될 수 있다.

일 구체예에서, 심근 허혈의 진단에 사용되는 기준값은, 97%의 민감도 및 71%의 특이도가 요망될 때, 332 μg/mL의 Apo　J-GlcNAc+Neu5Ac + Apo　J-GlcNAc 또는 393 μg/mL의 Apo　J-GlcNac이고, 81%의 민감도 및 72%의 특이도 가 요망될 때, 393 μg/mL의 Apo　J-GlcNac이다 (즉, 본 발명에 따른 진단 방법은, 환자가 332 μg/mL 미만의 Apo　J-GlcNAc+Neu5Ac + Apo　J-GlcNAc 를 나타낼 때 97%의 민감도 및 71%의 특이도로, 또는 환자가 393 μg/mL 미만의 Apo　J-GlcNAc 를 나타낼 때 81%의 민감도 및 72%의 특이도로 심근 허혈을 진단할 수 있도록 한다.).

다른 구체예에서, 뇌 허혈 진단에 사용되는 기준값은, 66%의 민감도 및 51%의 특이도가 요망될 때, 424 μg/mL의 Apo　J-GlcNAc+Neu5Ac + Apo　J-GlcNAc 이다(즉, 본 발명에 따른 진단 방법은, 환자가 424 μg/mL 미만의 Apo　J-GlcNAc+Neu5Ac + Apo　J-GlcNAc 를 나타낼 때 66%의 민감도 및 51%의 특이도로 뇌 허혈을 진단할 수 있도록 한다.).

일 구체예에서, 심근 허혈의 진단에 사용되는 기준값은, 97%의 민감도 및 71%의 특이도가 요망될 때 332 μg/mL의 T. vulgaris 렉틴에 결합할 수 있는 Apo J, 또는 81%의 민감도 및 72%의 특이도가 요망될 때 393 μg/mL의 D. stramonium 렉틴에 결합할 수 있는 Apo J 이다 (즉, 본 발명에 따른 진단 방법은, 환자가 332 μg/mL미만의 T. vulgaris 렉틴에 결합할 수 있는 Apo J 를 나타낼 때 97%의 민감도 및 71%의 특이도로 또는 환자가 393 μg/mL 미만의 D. stramonium 렉틴에 결합할 수 있는 Apo J 를 나타낼 때 81%의 민감도 및 72%의 특이도로 심근 허혈을 진단할 수 있도록 한다.).

다른 구체예에서, 뇌 허혈의 진단에 사용되는 기준값은, 66%의 민감도 및 51%의 특이도가 요망될 때 424μg/mL의 T. vulgaris 렉틴에 결합할 수 있는 Apo J 이다 (즉, 본 발명에 따른 진단 방법은, 환자가 424 μg/mL미만의 T. vulgaris 렉틴에 결합할 수 있는 Apo J 를 나타낼 때 66%의 민감도 및 51%의 특이도로 뇌 허혈을 진단할 수 있도록 한다.).

바람직한 구체예에서, N-아세틸글루코사민(GlcNAc)을 함유하는 글리코실화된 Apo J의 수준, N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 및 시알산 잔기를 함유하는 글리코실화된 Apo J의 수준, D. stramonium 렉틴에 특이적으로 결합할 수 있는 Apo J의 수준, 또는 T. vulgaris 렉틴에 특이적으로 결합할 수 있는 Apo J의 수준의 결정은, 샘플 내 괴사성 마커(necrosis marker)의 검출가능한 증가가 검출될 수 있기 전에 수행된다. 바람직한 구체예에서, 괴사성 마커는 T-트로포닌 또는 CK이다. 다른 구체예에서, -아세틸글루코사민(GlcNAc)을 함유하는 글리코실화된 Apo J의 수준, N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 및 시알산 잔기를 함유하는 글리코실화된 Apo J의 수준, D.stramonium 렉틴에 특이적으로 결합할 수 있는 Apo J의 수준, 또는 T. vulgaris 렉틴에 특이적으로 결합할 수 있는 Apo J의 수준의 결정은, 허혈 손상의 증상들이 발생하기 1 시간, 2 시간, 3 시간, 4 시간, 5 시간, 6 시간, 7 시간, 8 시간, 9 시간, 10 시간, 12 시간, 14 시간, 16 시간, 18 시간, 20 시간, 30 시간, 40 시간, 50 시간 이상 이내에 수득된 샘플에서 수행된다. 바람직한 구체예에서, 심근 허혈 손상의 경우, 증상들은 보통 흉통, 호흡곤란(shortness of breath), 발한(diaphoresis), 무력증, 어지러움증, 구역, 구토, 및 심계 항진(palpitation)이다. 일 구체예에서, 환자는 pre-AMI 환자이다.

다른 바람직한 구체예에서, 뇌 허혈 손상의 경우, 허혈 손상의 증상은, 이에 제한되는 것은 아니나, 후각, 미각, 청각 또는 시각의 변화, 안검하수증 또는 안근 무력화, 빛에 대한 교액 반응도, 삼킴 반응도, 동공 반응도의 감소, 감각 감소 및 안면 근육 무력화, 균형감각 상실 및 안구진탕(nystagmus), 실어증, 실행증(apraxia)(수의적 운동 변화), 시야 결함, 구음장애(dysarthria), 기억력 결함, 편측무시증(hemineglect), 와해적 사고, 정신착란, 성욕과잉 행동 (전두엽 관련), 통상적으로 뇌졸중과 관련된, 무능에 대한 통찰 결핍, 걸음걸이의 변화, 이동조절의 변화, 현기증 또는 균형감각 상실이다.

다른 구체예에서, 본 발명의 진단 방법에 따른 Apo J의 글리코실화된 형태의 수준의 결정은, 허혈을 감소시키거나 허혈 조직 손상을 감소시킬 목적으로 환자가 임의의 의약을 투여하기 전에 수득되었던 환자의 샘플에서 수행된다. 일 구체예에서, 심근 조직 손상의 경우, Apo J의 글리코실화된 형태의 수준의 결정은, 환자가 스타틴류, 항-혈소판제(anti-platelet) 및/또는 항-응고제(anti- coagulant)로 치료받기 전에 수득되었던 환자의 샘플에서 수행된다.

일 구체예에서, 뇌 조직 손상의 경우, Apo J의 글리코실화된 형태의 수준의 결정은, 환자가 조직 플라스미노젠 활성화 인자 (tissue plasminogen activator), 항-혈소판제(anti-platelet) 및/또는 항-응고제(anti-coagulant)로 치료받기 전에 수득되었던 환자의 샘플에서 수행된다.

허혈 손상을 가진 환자들의 예후 예측 방법

본 발명의 발명자들은, 예상치 못하게도, 글리코실화된 Apo J의 수준이 진행중인(ongoing) 허혈 사건의 검출 뿐만 아니라 허혈 사건을 겪은 환자들의 예후 예측에도 유용하다는 것을 또한 발견하였다.

따라서, 다른 양태로서, 본 발명은 환자의 샘플에서 글리코실화된 Apo J의 수준을 결정하는 단계를 포함하는, 허혈성 사건을 겪은 환자에서 허혈의 진행을 예측하거나 허혈성 사건을 겪은 환자에서 예후를 결정하는 방법으로서, 기준값 대비 글리코실화된 Apo J의 감소된 수준이, 허혈이 진행중임을 나타내거나 환자의 나쁜 예후를 나타내는 것인, 방법(이하, 본 발명의 예후 예측 방법이라고 함)에 관한 것이다.

본 발명의 측면에서, 용어 "진행을 예측하는 것"은 본원에 개시된 방법을 적용했을 때 허혈 또는 이와 관련된 허혈성 조직 손상을 앓은 후 질환의 추이를 예측하는 능력과 관련된다. 이러한 검출은, 통상의 기술자가 이해하는 바와 같이, 모든 샘플에 대해 100% 정확할 것을 의도하지 않는다. 그러나, 통계적으로 유의한 수의 분석된 샘플이 정확하게 분류될 것이 요구된다. 통계적으로 유의한 양은 이 분야의 전문가에 의해 다양한 통계적 도구, 예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니지만 신뢰 구간의 결정, p 값 결정, Student's t 검정 및 Fisher의 판별함수를 사용함으로써 설정될 수 있다. 바람직하게, 신뢰 구간은 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 미만이다. 바람직하게, p 값은 0.05, 0.01, 0.005 또는 0.0001 미만이다. 바람직하게, 본 발명은 테스트할 특정 그룹 또는 집단의 개체들의 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 또는 90% 이상에서 허혈 또는 허혈성 손상을 정확하게 검출할 수 있다.

본 발명의 측면에서, 용어 "예후를 결정하는 것"은 "예후 예측(prognosis)"과 호환가능하게 사용되며 본원에 개시된 방법을 적용했을 때 심근 허혈 또는 뇌 허혈 또는 이들과 관련된 허혈성 조직 손상을 앓은 후 환자의 결과(outcome)을 예측하는 능력과 관련된다. 이러한 검출은, 통상의 기술자가 이해하는 바와 같이, 모든 샘플에 대해 100% 정확할 것을 의도하지 않는다. 그러나, 통계적으로 유의한 수의 분석된 샘플이 정확하게 분류될 것이 요구된다. 통계적으로 유의한 양은 이 분야의 전문가에 의해 다양한 통계적 도구, 예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니지만 신뢰 구간의 결정, p 값 결정, Student's t 검정 및 Fisher의 판별함수를 사용함으로써 설정될 수 있다. 바람직하게, 신뢰 구간은 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 미만이다. 바람직하게, p 값은 0.05, 0.01, 0.005 또는 0.0001 미만이다. 바람직하게, 본 발명은 테스트할 특정 그룹 또는 집단의 개체들의 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 또는 90% 이상에서 허혈 또는 허혈성 손상을 정확하게 검출할 수 있다.

바람직한 구체예에서, 환자의 예후 예측은 6개월내 재발(6 months recurrence)의 위험으로 결정된다. 6개월내 재발의 위험을 결정하는 경우, 재발은 첫번째 허혈 사건 후 최초 6개월 이내에 발생하는 두번째 허혈 사건을 말하는 것으로 이해될 것이다. 일 구체예에서, 두번째 허혈 사건은 첫번째 허혈 사건과 동일한 종류이다. 즉, 첫번째 허혈 사건이 심근 허혈이고 예후 예측은 환자가 두번째 심근 허혈 사건을 겪을 위험성으로서 결정된다. 다른 구체예에서, 두번째 허혈 사건은 첫번째 허혈 사건과 다른 종류이다. 즉, 첫번째 허혈 사건이 심근 허혈이라면, 예후 예측은 환자가 뇌 허혈을 겪을 위험성으로 결정된다.

다른 구체예에서, 두번째 허혈 사건은 첫번째 허혈 사건과는 다른 종류이다. 즉, 첫번째 허혈 사건이 심근 허혈이라면, 예후는 환자가 뇌 허혈 사건을 겪을 위험성으로 결정되거나 또는 그 반대이고, 첫번째 허혈 사건이 뇌 허혈 사건이라면, 예후는 환자가 심근 허혈 사건을 겪을 위험성으로 결정된다.

다른 구체예에서, 환자의 예후는 병원 사망(in-hospital mortality)의 위험으로 결정된다.

바람직한 구체예에서, 환자의 예후는 6개월내 사망(6-months mortality)의 위험으로 결정된다.

용어 "Apo J", "환자", "허혈 사건" 및 "샘플" 은 본 발명에서 진단 방법의 측면에서 상세하게 설명되었고 본원의 방법에 동등하게 적용가능하다.

일 구체예에서, 샘플은 체액(biofluid)이다. 다른 구체예에서, 체액은 혈장 또는 혈청이다.

일 구체예에서, 허혈 사건은 심근 허혈 사건이다. 다른 구체예에서, 심근 허혈 사건은 ST-상승 심근경색(ST-elevation myocardial infarction, STEMI)이다. 다른 구체예에서, 허혈 사건은 뇌 허혈 사건이다.

본원에서 용어 "글리코실화된 Apo J"는, 폴리펩티드 사슬에 부착된 하나 이상의 N-결합 또는 O-결합 올리고당 사슬을 함유하는 Apo J의 임의의 형태를 말한다. 용어 "글리코실화된 Apo J"는 N-결합 및 O-결합 올리고당을 함유하는 두 변이체를 모두 포함한다. 상기 용어는 또한 N-결합 복합형 올리고당, 고만노스 올리고당 또는 하이브리드형 올리고당을 함유하는 Apo J를 포함한다.

일 구체예에서, 본 발명의 예후 예측 방법에서 결정된 글리코실화된 Apo J는 N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 잔기를 함유하는 글리코실화된 Apo J이다. 보다 바람직한 구체예에서, N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 잔기를 함유하는 글리코실화된 Apo J의 수준은 다투라 스트라모니움(Datura stramonium) 렉틴에 특이적으로 결합할 수 있는 Apo J의 수준에 해당한다. 일 구체예에서, 본 발명의 예후 예측 방법에서 결정된 글리코실화된 Apo J는 다투라 스트라모니움(Datura stramonium) 렉틴에 특이적으로 결합할 수 있는 글리코실화된 Apo J이다.

다른 구체예에서, 본 발명의 예후 예측 방법에서 결정된 글리코실화된 Apo J는 N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 및 시알산 잔기를 함유하는 글리코실화된 Apo J이다. 보다 바람직한 구체예에서, N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 및 시알산 잔기를 함유하는 글리코실화된 Apo J의 수준은 트리티쿰 불가리스(Triticum vulgaris)의 렉틴에 특이적으로 결합할 수 있는 글리코실화된 Apo J의 수준에 해당한다. 일 구체예에서, 본 발명의 예후 예측 방법에서 결정된 글리코실화된 Apo J는 트리티쿰 불가리스(Triticum vulgaris)에 특이적으로 결합할 수 있는 글리코실화된 Apo J이다.

글리코실화된 Apo J 의 수준과 관련된 용어, "감소된 수준" 또는 "낮은 수준"은, 기준값보다 낮은, 샘플 내 글리코실화된 Apo J의 임의의 발현 수준에 관한 것이다. 따라서, 글리코실화된 Apo J 수준이 이의 기준값보다 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 100%, 적어도 110%, 적어도 120%, 적어도 130%, 적어도 140%, 적어도 150% 또는 그 이상 낮을 때, 이의 기준값보다 감소되거나 낮은 것으로 고려된다. 바람직한 구체예에서, N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 잔기를 함유하는 글리코실화된 Apo J의 수준은 기준 샘플에서의 수준보다 낮다. 다른 구체예에서, N-아세틸글루코사민(GlcNAc)₂을 함유하는 글리코실화된 Apo J 의 수준은 기준 샘플에서의 수준보다 낮다. 다른 구체예에서, T. vulgaris 렉틴에 특이적으로 결합할 수 있는 글리코실화된 Apo J의 수준은 기준 샘플에서의 수준보다 낮다. 다른 구체예에서, D. stramonium 렉틴에 특이적으로 결합할 수 있는 글리코실화된 Apo J의 수준은 기준 샘플에서의 수준보다 낮다.

본 발명의 예후 예측 방법을 언급할 때, 용어 "기준값(reference value)"은, 개체에서 수집된 샘플들로부터 수득된 데이터 또는 값을 평가하기 위한 참조로서 사용되는 미리 결정된 기준(criteria)과 관련된다. 기준값 또는 기준 수준은 절대값, 상대값, 상한 또는 하한을 가진 값, 일련의 값, 평균값(average value), 중앙값, 평균값(mean value), 또는 특정 대조값 또는 기저치(control or baseline value)로 표현되는 값일 수 있다. 기준값은 개별 샘플에서 획득한 값, 예를 들면 테스트할 환자에서 얻은 샘플에서 획득하였지만, 이전 시점에 획득한 값을 기반으로 할 수 있다. 기준값은 다수의 샘플, 예를 들어, 생활연령 일치 그룹으로부터의 개체군에서 얻은 샘플들 또는 테스트할 샘플을 포함하거나 제외하는 샘플 풀(pool)로부터 얻는 샘플들을 기반으로 할 수 있다. 일 구체예에서, 기준값은, 허혈 사건을 겪고 허혈이 진행되지 않은 개체 또는 또는 좋은 진행(good progression)을 가진 개체에서 결정된 글리코실화된 Apo J의 수준에 해당한다. 진행이 6개월내 재발의 위험으로 결정되는 경우, 기준값은, 허혈 사건 시점에 얻어진 환자의 샘플로서 상기 환자가 첫번째 허혈 사건 후 적어도 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 18개월, 24개월, 36개월, 48개월 또는 그 이상 후에 어떠한 허혈 사건도 겪지 않은 환자의 샘플에서의 글리코실화된 Apo J 수준으로 선택될 수 있다. 다른 구체예에서, 진행이 병원 사망(in-hospital mortality)의 위험으로 결정되는 경우, 기준값은, 허혈 사건 시점에 얻어진 환자의 샘플로서 병원에서 퇴원한 환자의 샘플에서의 글리코실화된 Apo J 수준으로 선택될 수 있다. 진행이 6개월내 사망 위험으로 결정되는 경우, 기준값은, 허혈 사건 시점에 얻어진 환자의 샘플로서 상기 환자가 상기 허혈 사건 후 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 18개월, 24개월, 36개월, 48개월 또는 그 이상 여전히 살아있는 환자의 샘플에서의 글리코실화된 Apo J 수준으로 선택될 수 있다.

다른 구체예에서, 기준값은 임상적 관점에서 문서에 의해 충분히 입증된, 그리고 허혈 사건을 겪은 후에 이전 단락에서 정의한 바와 같은 좋은 예후를 나타내는 환자군으로부터 수득된 샘플 풀(pool)로부터 결정된, 대응하는 바이오마커의 평균 수준(average or mean level)에 해당한다. 상기 샘플에서, 발현 수준은, 예를 들어 기준 집단(reference population)에서 평균적인 발현 수준을 결정함으로써 결정될 수 있다. 기준값의 결정에서, 연령, 성별, 신체 상태 또는 환자의 다른 특성들과 같은, 샘플 종류의 일부 특성들을 고려할 필요가 있다. 예를 들어, 집단이 통계적으로 유의하도록, 적어도 2명, 적어도 10명, 적어도 100명 내지 1000명 이상의 개체군에서 동등한 양을 기준 샘플로 취할 수 있다.

본 발명의 예후 예측 방법에 따라 환자의 예후 예측에 사용되는 기준값은, 동일 종류의 샘플로부터 수득된, 진단에 고려되고 있는 마커와 동일한 바이오마커의 값으로 이해될 것이다. 따라서, 예후 예측 방법이 GlcNAc 또는 (GlcNAc)₂를 함유하는 글리코실화된 Apo J의 수준을 결정함으로써 수행된다면, 상기 예후 예측에 사용된 기준값 역시 GlcNAc 또는 (GlcNAc)₂를 함유하는 글리코실화된 Apo J의 발현 수준이며, 이 경우 건강한 개체로부터 또는 상기 정의된 바와 같은 샘플 풀로부터 수득될 수 있다. 다른 구체예에서, 예후 예측 방법이 GlcNAc 및 시알산 잔기를 함유하는 글리코실화된 Apo J의 수준을 결정함으로써 수행된다면, 상기 예후 예측에 사용된 기준값 역시 상기 설명된 바와 같이 수득된, N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 및 시알산 잔기를 함유하는 글리코실화된 Apo J의 발현 수준이다.

예후 예측 방법이 D. stramonium 렉틴에 특이적으로 결합할 수 있는 글리코실화된 Apo J 의 수준을 결정함으로써 수행된다면, 상기 예후 예측에 사용된 기준값 역시 상기 설명된 바와 같이 수득된, D. stramonium 렉틴에 특이적으로 결합할 수 있는 글리코실화된 Apo J 의 발현 수준이다. 다른 구체예에서, 예후 예측 방법이 T.vulgaris 렉틴에 특이적으로 결합할 수 있는 글리코실화된 Apo J 의 수준을 결정함으로써 수행된다면, 상기 예후 예측에 사용된 기준값 역시 상기 설명된 바와 같이 수득된, T. vulgaris 렉틴에 특이적으로 결합할 수 있는 글리코실화된 Apo J 의 발현 수준이다.

다른 구체예에서, 바이오마커가 심근 조직 손상을 겪은 환자의 예후를 결정하기 위해 결정된다면, 기준값은 심근 허혈 사건을 겪은 후, 상기 정의된 임의의 기준에 따라 좋은 예후를 나타낸 환자(6개월 후 허혈 사건의 재발의 부재, 병원 사망 없음, 또는 6개월 후 사망 없음)로부터의 동일한 바이오마커의 수준일 것이다. 기준값이 개체들로부터의 샘플 풀로부터 수득된 동일한 바이오마커의 평균 수준이라면, 그 준비된 샘플 풀이 유래한 개체들은 심근 허혈 사건을 겪은 후 상기 정의된 임의의 기준(6개월 후 허혈 사건의 재발의 부재, 병원 사망 없음, 또는 6개월 후 사망 없음)에 따라 좋은 예후를 나타낸 개체들이다.

다른 구체예에서, 바이오마커가 뇌 조직 손상을 겪은 환자의 예후를 결정하기 위해 결정된다면, 기준값은 뇌 허혈 사건을 겪은 후, 상기 정의된 임의의 기준(6개월 후 허혈 사건의 재발의 부재, 병원 사망 없음, 또는 6개월 후 사망 없음)에 따라 좋은 예후를 나타낸 환자로부터의 동일한 바이오마커의 수준일 것이다. 기준값이 개체들로부터의 샘플 풀로부터 수득된 동일한 바이오마커의 평균 수준이라면, 그 준비된 샘플 풀이 유래한 개체들은 뇌 허혈 사건을 겪은 후 상기 정의된 임의의 기준(6개월 후 허혈 사건의 재발의 부재, 병원 사망 없음, 또는 6개월 후 사망 없음)에 따라 좋은 예후를 나타낸 개체들이다.

본 발명의 예후 예측 방법에 사용된 기준값은 요망되는 특이도 및 민감도를 얻기 위해 최적화될 수 있다.

특정 구체예에서, 사망 및 재발 사건의 예후 예측에 사용되는 기준값은, 58%의 민감도 및 51%의 특이도가 요망될 때, 287 μg/mL의 Apo　J-GlcNAc 이다 (즉, 본 발명에 따른 예후 예측 방법은, 환자가 287 μg/mL 미만의 Apo　J-GlcNAc를 나타낼 때 58%의 민감도 및 51%의 특이도로 사망 또는 재발성 사건의 예후를 예측할 수 있도록 한다.).

특정 구체예에서, 사망 및 재발 사건의 예후 예측에 사용되는 기준값은, 55%의 민감도 및 65%의 특이도가 요망될 때, 398 μg/mL의 Apo　J-GlcNAc+Neu5Ac + Apo　J-GlcNAc이다 (즉, 본 발명에 따른 예후 예측 방법은, 환자가 398 μg/mL 미만의 Apo　J-GlcNAc+Neu5Ac + Apo　J-GlcNAc 를 나타낼 때 55%의 민감도 및 65%의 특이도로 사망 및 재발 사건의 예후를 예측할 수 있도록 한다.).

특정 구체예에서, 사망 및 재발 사건의 예후 예측에 사용되는 기준값은, 55%의 민감도 및 65%의 특이도가 요망될 때, 398 μg/mL 의 T. vulgaris 렉틴에 특이적으로 결합할 수 있는 Apo J이다 (즉, 본 발명에 따른 예후 예측 방법은, 환자가 398 μg/mL 미만의 T. vulgaris 렉틴에 특이적으로 결합할 수 있는 Apo J를 나타낼 때 55%의 민감도 및 65%의 특이도로 사망 및 재발 사건의 예후를 예측할 수 있도록 한다.).

특정 구체예에서, 사망 및 재발 사건의 예후 예측에 사용되는 기준값은, 사망 및 재발 사건의 예후 예측을 위해 58%의 민감도 및 51%의 특이도가 요망될 때, 287 μg/mL의 D. stramonium 렉틴에 특이적으로 결합할 수 있는 Apo J이고, 사망의 예후 예측을 위해 64%의 민감도 및 50%의 특이도가 요망될 때, 273 μg/mL의 D. stramonium 렉틴에 특이적으로 결합할 수 있는 Apo J이다 (즉, 본 발명에 따른 예후 예측 방법은, 환자가 287 μg/mL 미만의 D. stramonium 렉틴에 특이적으로 결합할 수 있는 Apo J를 나타낼 때 58%의 민감도 및 51%의 특이도로 사망과 재발 사건의 예후를 예측할 수 있도록 하고, 환자가 273 μg/mL 미만의 D. stramonium 렉틴에 특이적으로 결합할 수 있는 Apo J를 나타낼 때 64%의 민감도 및 50%의 특이도로 사망의 예후를 예측할 수 있도록 한다.).

본 발명의 위험도 계층화(Risk stratification) 방법

본 발명의 발명자들은 글리코실화된 Apo J의 수준, 특히 GlcNAc 및 Neu5Ac를 함유하는 글리코실화된 Apo J의 수준이, 안정형(stable) 관상동맥 질환(coronary artery disease, CAD)을 가진 환자가 재발성 허혈 사건을 겪을 위험성을 결정하기 위한 바이오마커로도 유용하는 것을 보여주었다. 이 방법은 이들이 허혈 사건을 겪을 위험성에 따라 환자들을 계층화(stratification)하는 것을 가능하게 하여, 상기 위험성에 따라 환자들에 대해 특이적인 예방적 치료들을 부과하는데 유용하다.

따라서, 다른 양태에서, 본 발명은 환자의 샘플에서 글리코실화된 Apo J의 수준을 결정하는 단계를 포함하는, 안정형 관상동맥 질환을 가진 환자가 재발성 허혈 사건을 겪을 위험성을 결정하는 방법으로서, 기준값 대비 글리코실화된 Apo J의 감소된 수준이, 환자가 재발성 허혈 사건을 가질 증가된 위험을 보여준다는 것을 나타내는 것인, 방법(이하, 본 발명의 위험도 계층화 방법이라고 함)에 관한 것이다.

본 발명의 측면에서, 용어 "위험성을 결정하는 것" 또는 "위험도 계층화(risk stratification)"는, a) 심근 허혈 또는 뇌 허혈 또는 이들과 관련된 허혈 조직 손상을 겪은 후 환자들이 추가적인 임상적 합병증을 겪거나, 및/또는 b) 본원에 기술된 방법을 적용하였을 때 심근 허혈 또는 뇌 허혈 또는 이들과 관련된 허혈 조직 손상에 대한 특이적 치료로부터 유익을 얻을 위험성 또는 개연성을 결정하는 능력과 관련된다. 당업자가 이해할 바와 같이, 이러한 검출은 모든 샘플에 대해 100% 정확할 것을 의도하는 것은 아니다. 그러나, 통계적으로 유의한 수의 분석된 샘플들이 정확하게 분류될 것을 요구한다. 통계학적으로 유의한 양은 다른 통계적 수단들, 예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니지만 신뢰구간의 결정, p값의 결정, Student's t 검정 및 Fisher의 판별함수를 사용함으로써 당업계 전문가에 의해 설정될 수 있다. 바람직하게, 신뢰 구간은 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 미만이다. 바람직하게, p 값은 0.05, 0.01, 0.005 또는 0.0001 미만이다. 바람직하게, 본 발명은 테스트된 특정 그룹 또는 인구의 개체들의 60% 이상, 70%이상, 80%이상, 또는 90% 이상에서 허혈 또는 허혈성 손상을 정확하게 검출할 수 있다.

본 발명의 진단 및 예후 예측 방법의 측면에서 상세하게 기술된 용어 "환자", "허혈성 사건", "샘플", "Apo J" 및 "글리코실화된 Apo J"은, 본 발명의 위험도 계층화 방법에 동등하게 적용된다.

일 구체예에서, 재발성 허혈 사건은 급성 관상동맥 증후군, 뇌졸중, 또는 일과성 허혈 사건(a transient ischemic event)이다.

일 구체예에서, 허혈성 사건은 심근 허혈 사건이다. 다른 구체예에서, 심근 허혈 사건은 ST-상승 심근경색(ST-elevation myocardial infarction, STEMI)이다. 다른 구체예에서, 허혈 사건은 뇌 허혈 사건이다.

일 구체예에서, 본 발명의 예후 에측 방법에서 결정된 글리코실화된 Apo J는 N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 잔기를 함유하는 글리코실화된 Apo J이다. 다른 구체예에서, N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 잔기를 함유하는 글리코실화된 Apo J의 수준은 다투라 스트라모니움(Datura stramonium) 렉틴에 특이적으로 결합할 수 있는 글리코실화된 Apo J이다.

다른 구체예에서, 본 발명의 예후 예측 방법에서 결정된 글리코실화된 Apo J 는 N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 및 시알산 잔기를 함유하는 글리코실화된 Apo J이다. 다른 구체예에서, N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 및 시알산 잔기를 함유하는 글리코실화된 Apo J 의 수준은 트리티쿰 불가리스(Triticum vulgaris) 렉틴에 특이적으로 결합할 수 있는 글리코실화된 Apo J이다.

용어 "안정형 관상동맥 질환(stable coronary disease)" 및 "안정형 관상동맥 심장질환(stable coronary heart disease)"은 동일한 의미를 가지며 호환가능하게 사용된다. 두 용어 모두 질병 안정형 관상동맥 질환(stable coronary artery disease, SCAD)을 포함한다. 용어 "안정형 심혈관계 질환(stable cardiovascular disease)", "안정형 관상동맥 질환(stable coronary disease)" 또는 "안정형 관상동맥 심장질환(stable coronary heart disease)"에서 "안정형(stable)"이란, 급성 심혈관 사건(acute cardiovascular event)이 없는, 진단된 심혈관 질환의 임의의 상태로 정의된다. 따라서, 예를 들어, 안정형 관상동맥 질환은, 심장 동맥 혈전증(coronary artery thrombosis)이 임상 표현 (clinical presentation)의 가장 중요한 특징이 되는 상황(급성 관상동맥 증후군)을 제외하고는, 관상동맥 질환의 상이한 진화 단계(evolutionary phase)들을 정의한다. SCAD를 가진 환자들은 다음 상태 중 하나 이상에 의해 정의된다: 양성 ECG 스트레스 테스트(positive ECG stress test) 또는 양성 심근신티그래피(myocardial scintigraphy)를 가진 안정형 협심증(stable angina pectoris) 또는 관상동맥 질환의 >50%의 협착증(stenosis), 급성 관상동맥 증후군의 병력, 3개월 이상 안정적 용량의 항-혈소판제, 항-응고제 및/또는 스타틴류에 의한 치료.

바람직한 구체예에서, 안정형 관상동맥 질환을 가진 환자는 안정형 관상동맥 질환 전에 급성 관상동맥 증후군을 겪었다. 바람직한 구체예에서, 안정형 관상동맥 질환을 가진 환자는 안정형 관상동맥 질환 전 적어도 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 18개월, 24개월, 36개월, 48개월, 60개월 또는 그 이상 전에 급성 관상동맥 증후군을 겪었다.

본 발명의 예후 예측 방법에서 글리코실화된 Apo J의 수준과 관련된 용어 "감소된 수준" 또는 "낮은 수준"은 은, 기준값보다 낮은, 샘플 내 글리코실화된 Apo J의 임의의 발현 수준에 관한 것이다. 따라서, 글리코실화된 Apo J 수준이 이의 기준값보다 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 100%, 적어도 110%, 적어도 120%, 적어도 130%, 적어도 140%, 적어도 150% 또는 그 이상 낮을 때, 이의 기준값보다 감소되거나 낮은 것으로 고려된다. 바람직한 구체예에서, N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 잔기를 함유하는 글리코실화된 Apo J의 수준은 기준 샘플에서의 수준보다 낮다. 다른 구체예에서, N-아세틸글루코사민(GlcNAc)₂을 함유하는 글리코실화된 Apo J 의 수준은 기준 샘플에서의 수준보다 낮다. 다른 구체예에서 N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 및 시알산을 함유하는 글리코실화된 Apo J 의 수준은 기준 샘플에서의 수준보다 낮다. 다른 구체예에서, T. vulgaris 렉틴에 특이적으로 결합할 수 있는 글리코실화된 Apo J의 수준은 기준 샘플에서의 수준보다 낮다. 다른 구체예에서, D. stramonium 렉틴에 특이적으로 결합할 수 있는 글리코실화된 Apo J의 수준은 기준 샘플에서의 수준보다 낮다.

본 발명의 위험도 게층화 방법을 언급할 때, 용어 "기준값(reference value)"은, 개체에서 수집된 샘플들로부터 수득된 데이터 또는 값을 평가하기 위한 참조로서 사용되는 미리 결정된 기준(criteria)과 관련된다. 기준값 또는 기준 수준은 절대값, 상대값, 상한 또는 하한을 가진 값, 일련의 값, 평균값(average value), 중앙값, 평균값(mean value), 또는 특정 대조값 또는 기저치(control or baseline value)로 표현되는 값일 수 있다. 기준값은 개별 샘플에서 획득한 값, 예를 들면 테스트할 환자에서 얻은 샘플에서 획득하였지만, 이전 시점에 획득한 값을 기반으로 할 수 있다. 기준값은 다수의 샘플, 예를 들어, 생활연령 일치 그룹으로부터의 개체군에서 얻은 샘플들 또는 테스트할 샘플을 포함하거나 제외하는 샘플 풀(pool)로부터 얻는 샘플들을 기반으로 할 수 있다. 일 구체예에서, 기준값은, 안정형 관상동맥 질환을 가지나 임의의 재발성 허혈 사건을 가지지 않는 개체에서 결정된 글리코실화된 Apo J의 수준에 해당한다. 이 경우, 기준값으로 결정될 수 있는 적절한 환자들은, 안정형 관상동맥 질환을 가지며, 안정형 관상동맥 질환의 발생 후 적어도 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 18개월, 24개월, 36개월, 48개월 또는 그 이상에 허혈성 재발 사건을 가지지 않은 환자들일 수 있다.

다른 구체예에서, 기준값은 임상적 관점에서 문서에 의해 충분히 입증된, 그리고 안정형 관상동맥 질환을 가지지만 안정형 관상동맥 질환의 발생 후 적어도 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 18개월, 24개월, 36개월, 48개월 또는 그 이상 후에 허혈성 재발 사건을 가지지 않은 환자군으로부터 수득된 샘플 풀(pool)로부터 결정된, 대응하는 바이오마커의 평균 수준(average or mean level)에 해당한다. 상기 샘플에서, 발현 수준은, 예를 들어 기준 집단(reference population)에서 평균적인 발현 수준을 결정함으로써 결정될 수 있다. 기준값의 결정에서, 연령, 성별, 신체 상태 또는 환자의 다른 특성들과 같은, 샘플 종류의 일부 특성들을 고려할 필요가 있다. 예를 들어, 집단이 통계적으로 유의하도록, 적어도 2명, 적어도 10명, 적어도 100명 내지 1000명 이상의 개체군에서 동등한 양을 기준 샘플로 취할 수 있다.

본 발명의 위험도 계층화 방법에 따라 환자의 위험도 계층화에 사용되는 기준값은, 동일 종류의 샘플로부터 수득된, 진단에 고려되고 있는 마커와 동일한 바이오마커의 값으로 이해될 것이다. 따라서, 위험도 계층화 방법이 GlcNAc 또는 (GlcNAc)₂를 함유하는 글리코실화된 Apo J의 수준을 결정함으로써 수행된다면, 상기 위험도 계층화에 사용된 기준값 역시 GlcNAc 잔기 또는 (GlcNAc)₂를 함유하는 글리코실화된 Apo J의 발현 수준이며, 이 경우 개체로부터 또는 상기 정의된 바와 같은 샘플 풀로부터 수득될 수 있다. 다른 구체예에서, 위험도 계층화 방법이 GlcNAc 및 시알산 잔기를 함유하는 글리코실화된 Apo J의 수준을 결정함으로써 수행된다면, 상기 위험도 계층화에 사용된 기준값 역시 상기 설명된 바와 같이 수득된, N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 및 시알산 잔기를 함유하는 글리코실화된 Apo J의 발현 수준이다.

다른 구체예에서, 위험도 계층화 방법이 T. vulgaris 렉틴에 특이적으로 결합할 수 있는 글리코실화된 Apo J 의 수준을 결정함으로써 수행된다면, 상기 위험도 계층화에 사용된 기준값 역시 상기 설명된 바와 같이 수득된, T. vulgaris 렉틴에 특이적으로 결합할 수 있는 글리코실화된 Apo J 의 발현 수준이다. 다른 구체예에서, 위험도 계층화 방법이 D. stramonium 렉틴에 특이적으로 결합할 수 있는 글리코실화된 Apo J 의 수준을 결정함으로써 수행된다면, 상기 위험도 계층화에 사용된 기준값 역시 상기 설명된 바와 같이 수득된, D. stramonium 렉틴에 특이적으로 결합할 수 있는 글리코실화된 Apo J 의 발현 수준이다.

본 발명의 위험도 계층화 방법에 사용된 기준값은 요망되는 특이도 및 민감도를 얻기 위해 최적화될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 위험도 계층화 방법에 사용된 기준값은 94%의 민감도 및 64%의 특이도가 요망될 때, 485 μg/mL의 Apo　J-GlcNAc+Neu5Ac + Apo　J-GlcNAc 이다 (즉, 본 발명에 따른 위험도 계층화 방법은, 환자가 485 μg/mL 미만의 Apo　J-GlcNAc+Neu5Ac + Apo　J-GlcNAc 를 나타낼 때 94%의 민감도 및 64%의 특이도로 재발 사건을 예측할 수 있도록 한다.).

다른 구체예에서, 본 발명의 위험도 계층화 방법에 사용된 기준값은, 94%의 민감도 및 64%의 특이도가 요망될 때, 485 μg/mL 의 T. vulgaris 렉틴에 특이적으로 결합할 수 있는 Apo J이다 (즉, 본 발명에 따른 위험도 계층화 방법은, 환자가485 μg/mL 미만의 T. vulgaris 렉틴에 특이적으로 결합할 수 있는 Apo J를 나타낼 때 94%의 민감도 및 64%의 특이도로 CAD 를 가진 환자의 재발 사건을 예측할 수 있도록 한다.).

본 발명에 따른 바이오마커의 결정을 위한 키트

본 발명의 발명자들은 본원에서 언급된 질환 및 글리코실화된 Apo J가 관여하는 다른 질환들의 진단에 적절한 글리코실화된 Apo J의 검출을 가능하게 하는 키트를 또한 수득하였다.

따라서, 다른 양태에서, 본 발명은

b. Apo J 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 수 있는, 제2시약

을 포함하는, 키트에 관한 것이다.

본원 발명에서 사용된 용어 "아세틸글루코사민 및 시알산에서 선택되는 글리칸 잔기에 특이적으로 결합하는 렉틴"은, 임의의 생물체 및 재조합적 방식으로 수득된 변이체에서 기원하는 당에 결합하는 능력을 가진, 항체와는 상이한 임의의 단백질을 말하며, 당단백질 내 당 잔기에 특이적으로 결합하는 능력을 유지한다. 본 발명에 사용하기에 적절한 렉틴의 예시는, 이에 제한되는 것은 아니나, 코나발리아 엔시포르미스(Conavalia ensiformis), 앵귈라 앵귈라(Anguilla anguilla), 트리티쿰 불가리스(Triticum vulgaris), 다투라 스트라모니움 (Datura stramonium), 갈란투스 니발리스(Galanthus nivalis), 막키아 아무렌시스 (Maackia amurensis), 아라치스 하이포가에아(Arachis hypogaea), 삼부커스 니그라(Sambucus nigra), 에리스리나 크리스타갈리 (Erythtina cristagalli), 렌스 쿨리나리스 (Lens culinaris), 글리신 맥스(Glycine max), 파세러스 불가리스(Phaseolus vulgaris), 알로미리나 디코토마 (Allomyrina dichotoma), 도리코스 비프로루스(Dolichos biflorus), 로투스 테트라고놀로부스(Lotus tetragonolobus), 울렉스 오이로패우스(Ulex europaeus), 및 리시누스 콤뮤니스 (Ricinus communis)로부터 분리된 렉틴이다.

본 발명에 사용하기에 적절한 렉틴의 예시는, 이에 제한되는 것은 아니나, 표에 나타내었다. 표는 렉틴의 일반명, 렉틴이 유래한 생물체, 및 상기 렉틴이 특이적으로 결합하는 당을 나타낸다.

바람직한 구체예에서, 렉틴은 트리티쿰 불가리스(Triticum vulgaris)에서 유래한 렉틴, 다투라 스트라모니움(Datura stramonium)에서 유래한 렉틴, 또는 이들의 조합이다.

바람직한 구체예에서, 제2시약은 항-Apo J 항체 또는 이의 항원-결합 부위를 포함하는 이의 단편이다.

본 발명의 측면에서, 용어 "Apo J 항체"는 면역글로불린 분자 및 면역학적으로 활성인 이의 단편, 즉, 본원에 정의된 바와 같은 글리코실화된 Apo J에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 분자를 말한다. 본 발명에 따른 용도에 적합한 항체들은, 그 결합이 N-결합 또는 O-결합 탄수화물의 존재에 의해 영향을 받지 않는다면, 글리코실화된 Apo J의 폴리펩티드 부분에 위치한 하나 이상의 에피토프를 인지하는 항체를 포함한다. 이들 항체는 Apo J의 글리코실화된 형태 및 이의 비-글리코실화된 형태 모두에 결합할 수 있다.

면역학적으로 활성인 면역글로불린 분자의 단편의 예시는, 펩신과 같은 효소로 항체를 처리함으로써 생성될 있는 F(ab) 및 F(ab')₂ 를 포함한다. 이들 항체는 다클론항체(전형적으로, 상이한 결정기 또는 에피토프에 작용하는 상이한 항체들을 포함함) 또는 단클론항체(항원 상의 하나의 결정기에 작용함). 항체는 또한, 재조합 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 합성 항체 또는 이들 중에서의 임의의 조합일 수 있다.

일 구체예에서, 렉틴은 고정화된다. 고정화는 일반적으로 지지체에 결합함으로써 달성된다. 본원에서 사용되는 용어, "지지체"는 본 발명의 구성요소가 물리적으로 결합하여 고정되는, 임의의 고체 재료를 말한다. 본 발명의 이러한 사용에 적절한 고체 지지체는, 이에 제한되는 것은 아니나, 실리콘, 유리, 석영, 폴리이미드, 아크릴레이트, 폴리메틸메타크릴레이트, 세라믹, 니트로셀룰로스, 금속, 비정질 실리콘 카바이드, 폴리스티렌, 및 마이크로제조(micromanufacture) 또는 마이크로리소그래피(microlithography)에 적합한 기타 임의의 재료들을 포함한다.

렉틴은 수소결합, 소수성 상호작용 또는 이온 결합과 같은 비-공유결합에 의해, 또는 공유 결합에 의해 지지체에 고정화될 수 있다. 적절한 마이크로어레이 및 지지체의 일반적인 리뷰는 Shalon 등(Genome Research 6: 639-645 (1996)), LeGendre (BioTechniques 9: 788-805 (1990)), US6197599 및 US6140045 에 기술되어 있다. 대안적으로, 에폭시기, 비닐설폰기, 활성 에스테르기, 알데히드기, 카르복실기, 아미노기, 티올기, 이소티오시아네이트기 등의 수단에 의해 활성화된 지지체를 사용하는 것이 가능하다. 지지체가 에폭시기에 의해 활성화되는 경우, 이들 기는 3-글리시독시프로필트리메톡시실란 (GTMS), 2-(3,4-에폭시사이클로헥실)에틸트리메톡시실란, 3-글리시독시프로필메틸디에톡시실란, 3-글리시독시프로필트리메톡시실란 등을 포함한다.

일 구체예에서, 본 발명에 따른 키트의 구성요소는 표지자(label)를 포함한다. 원칙적으로, 본 발명은, 키트의 구성요소 b 에 대한 공유적 접합이 가능하다면, 그리고 이것이 상기 구성요소의 연속적인 검출을 가능하게 한다면, 임의의 표지자의 사용을 고려한다. 바람직한 구체예에서, 표지자는 화학적, 전기적 또는 자성 성질의 하나 이상에서의 변화에 의해 검출가능할 수 있다.

따라서, 본 발명은 ³H, ¹¹C, ¹⁴C, ¹⁸F, ³²P, ³⁵S, ⁶⁴Cu, ⁶⁸Ga, ⁸⁶Y, ⁹⁹Tc, ¹¹¹In, ¹²³I, ¹²⁴I, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹³³Xe, ¹⁷⁷Lu, ²¹¹At 또는 ²¹³B 의 방사성 동위원소에 의한 단백질의 변형 가능성을 고려한다. 방사성 동위원소에 의한 표지화는 전형적으로 DOTA, DOTP, DOTMA, DTPA 및 TETA(Macrocyclics, Dallas, Tex.)와 같은 금속이온과 착물을 형성할 수 있는 킬레이트 리간드(chelating ligand)를 사용함으로써 수행된다.

또한, 바람직한 구체예에서, 구성요소 a 는 형광기(fluorescent group)로 표지된다. 본 발명에 사용되기에 적절한 적절한 형광 화합물은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 에티디움 브로마이드(ethidium bromide), SYBR Green, 플루오레세인 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate, FITC), 테트라메틸 로다민 이소티올(tetramethyl rhodamine isothiol, TRIT), 5-카르복시플루오레세인, 6-카르복시플루오레세인, 플루오레세인, HEX (6-카르복시-2',4,4',5',7,7'-헥사클로로플루오레세인), Oregon Green 488, Oregon Green 500, Oregon Green 514, 조 (6-카르복시-4',5'-디클로로-2',7'-디메톡시플루오레세인), 5-카르복시-2',4',5',7'-테트라클로로플루오레세인, 5-카르복시로다민, 로다민, 테트라메틸로다민(Tamra), Rox (carboxy-X-rhodamine), R6G (rhodamine 6G), 프탈로시아닌류, 아조메틴류, 시아닌류 (Cy2, Cy3 and Cy5), Texas Red, Princeston Red, BODIPY FL-Br2, BODIPY 530/550, BODIPY TMR, BODIPY 558/568, BODIPY 564/570, BODIPY 576/589, BODIPY 581/591, BODIPY TR, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665, DABCYL, 에오신, 에리트로신, 에티디움 브로마이드, 녹색 형광 단백질(GFP) 및 이들의 유사체들, 반도체 나노결정(Quantum dot)과 같은 무기 형광 표지들, Eu3+ 및 Sm3+와 같은 란탄 계열 원소들에 근거한 형광 표지자 등을 포함한다.

다른 구체예에서, 키트는 구성요소 b 에 특이적으로 결합할 수 있는 제3 구성요소 (구성요소 c)를 포함한다. 이 경우, 렉틴에 의해 지지체 안에서 포획된 Apo J의 검출은 구성요소 b 을 직접적으로 검출함으로써 수행되기 보다는, 일단 구성요소 c 가 구성요소 b 에 결합하면 구성요소 c를 검출함으로써 수행될 수 있다.

구성요소 b에 특이적으로 결합할 수 있다면, 임의의 분자들이 키트의 제3 구성요소로 사용될 수 있다. 일 구체예에서, 구성요소 b는 결합 쌍(binding pair)의 제1 구성원에 의해 변형되고, 구성요소 c 는 결합 쌍의 제2 구성원에 의해 변형된다.

용어 "결합 쌍(binding pair)"은 생화학적, 생리학적 및/또는 화학적 상호작용을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 종류의 분자간 상호작용에 의해 특이적으로 결합하는 능력을 가지는 한 쌍의 분자들(결합 쌍의 제1 및 제2 구성원으로 지칭됨)을 말한다. 결합 쌍은 항원/항체, 항원/항체 단편, 합텐/항-합텐과 같은 면역형의 상호작용 뿐만 아니라, 아비딘/비오틴, 아비딘/비오티닐화 분자, 폴산/폴산 결합 단백질, 호르몬/호르몬 리셉터, 렉틴/탄수화물, 렉틴/탄수화물로 변형된 분자, 효소/효소 기질, 효소/효소 저해제, 단백질 A/항체, 단백질 G/항체, 상보적 핵산들(DNA, RNA 또는 PNA(peptide nucleic acid) 서열을 포함함), 폴리뉴클레오티드/폴리뉴클레오티드-결합 단백질 등과 같은 비-면역형의 임의의 상호작용을 포함한다.

용어 결합쌍의 "제1" 및 "제2" 구성원은 상대적이며 상술한 구성원들 각각이 결합 쌍의 제1 또는 제2 구성원으로 볼 수 있는 것으로 이해될 것이다.

보다 더 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 키트의 구성요소 b 는 항체이고, 제3 구성요소가 상기 구성요소 b에 특이적으로 결합할 수 있는 항체이다. 이 경우, 제2 항체는 표지를 포함한다. 키트의 제3 구성요소에 적절한 표지는, 상기에서 키트의 구성요소 b에 대하여 언급한 것과 동일하다. 키트의 제3 구성요소의 표지는 형광기, 발광성 기 또는 효소이다. 검출가능한 화합물이 효소라면, 이 효소는, 예를 들어, 활성화제(activator), 기질, 증폭 시약 등을 첨가한 후, 검출가능한 신호를 생성할 수 있어야 한다. 본 발명에 대한 검출가능한 태그로서 절절한 효소들 및 대응되는 기질들은 다음을 포함한다:

● 알칼리포스파타제(Alkaline phosphatase):

○ 발색 기질: p-니트로페닐 포스페이트 (p-NPP), 5-브로모-4-클로로-3-인돌일 포스페이트/니트로블루 테트라졸륨 (BCIP/NBT), Fast-Red/나프톨 포스페이트-AS-TS을 기반으로 한 기질

○ 형광 기질: 4-메틸움베리페릴 포스페이트(4-MUP), 2-(5'-클로로-2'- 포스포릴옥시페닐)-6-클로로-4-(3H)-퀴나졸리논(CPPCQ), 3,6-플루오레세인 디포스페이트 (3,6-FDP), Fast Blue BB의 디아조늄 염, Fast Red TR, 또는 Fast Red Violet LB.

● 페록시다제(Peroxidase):

○ 2,2-아지노비스(3-에틸벤조티아졸린-6-술폰산)(ABTS), o-페닐렌디아민 (OPT), 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB), o-디아니시딘, 5-아미노살리실산, 3--디메틸아미노벤조산 (DMAB) 및 3-메틸-2-벤조티아졸린히드라존 (MBTH), 3-아미노-9-에틸카르바졸 (AEC) 및 3,3'-디아미노벤지딘 (DAB) 테트라히드로클로라이드를 기재료 하는 발색 기질

○ 형광 기질: 4-하이드록시-3-메톡시페닐아세트산, Amplex® Red 시약, Amplex UltraRed 시약 및 환원된 디히드록사텐을 포함하는 환원된 페녹사진 및 환원된 벤조티아진.

● 글리코시다제(Glycosidase):

○ 발색 기질: β-D-갈락토시다제에 대한 o-니트로페닐-β-D-갈락토시드 (O-NPG), p-니트로페닐-β-D-갈락토시드 및 4-메틸움베리페닐-β-D-갈락토시드(MUG).

○ 형광 기질: 레조루핀 β-D-갈락토피라노시드, 플루오레세인 디갈락토시드(FDG), 플루오레세인 디글루쿠로니드, 4-메틸움베리페닐-β-D-갈락토피라노시드, 카르복시움벨리페릴-β-D-갈락토피라노시드 및 플루오르화 쿠마린 β-D-갈락토피라노시드.

● 산화환원효소 (루시퍼라제):

○ 발광 기질: 루시페린.

효소적 표지의 경우, 키트는 추가적인 구성요소로서 효소의 하나 이상의 기질을 포함할 수 있다.

보다 더 바람직한 구체예에서, 결합 쌍의 제2 구성원에 결합하는 검출가능한 화합물은 형광 화합물(fluorescent compound)이다. 본 발명에서 사용되는 용어 "형광 화합물"은 결정된 파장 또는 파장 범위에서 빛을 흡수하고 다른 파장 또는 파장 범위에서 빛을 발산하는 모든 화합물을 지칭한다. 본 발명에 사용하기에 적합한 형광 화합물은, 이에 제한되는 것은 아니나, 에티디움 브로마이드(ethidium bromide), SYBR Green, 플루오레세인 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate, FITC), 테트라메틸 로다민 이소티올(tetramethyl rhodamine isothiol, TRIT), 5-카르복시플루오레세인, 6-카르복시플루오레세인, 플루오레세인, HEX (6-카르복시-2',4,4',5',7,7'-헥사클로로플루오레세인), Oregon Green 488, Oregon Green 500, Oregon Green 514, 조 (6-카르복시-4',5'-디클로로-2',7'-디메톡시플루오레세인), 5-카르복시-2',4',5',7'-테트라클로로플루오레세인, 5-카르복시로다민, 로다민, 테트라메틸로다민(Tamra), Rox (carboxy-X-rhodamine), R6G (rhodamine 6G), 프탈로시아닌류, 아조메틴류, 시아닌류 (Cy2, Cy3 및 Cy5), Texas Red, Princeston Red, BODIPY FL-Br2, BODIPY 530/550, BODIPY TMR, BODIPY 558/568, BODIPY 564/570, BODIPY 576/589, BODIPY 581/591, BODIPY TR, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665, DABCYL, 에오신, 에리트로신, 에티디움 브로마이드, 녹색 형광 단백질(GFP) 및 이들의 유사체들, 반도체 나노결정(Quantum dot)과 같은 무기 형광 표지들, Eu3+ 및 Sm3+와 같은 란탄 계열 원소들에 근거한 형광 표지자 등을 포함한다.

선택적으로, 추가적인 구체예에서, 키트는 백그라운드 대조군(background control)으로서 블랭크(blank) 및/또는 글리코실화된 Apo J의 댜양한 농도를 함유하는 표준 곡선을 포함한다.

추가적인 양태에서, 본 발명은 상기 정의된, 개체에서 허혈 또는 허혈 조직 손상을 진당하는 방법, 허혈성 사건을 겪는 환자에서 허혈의 진행을 예측하는 방법, 허혈성 사건을 겪는 환자에서 예후를 결정하는 방법, 또는 안정형 관상동맥 질환을 겪는 환자가 재발성 허혈 사건을 겪을 위험성을 결정하는 방법에 있어서 본 발명에 따른 키트의 사용에 관한 것이다.

샘플에서 글리코실화된 Apo J 의 결정 방법

다른 양태로서, 본 발명은,

(ii) N-아세틸글루코사민(GlcNAc)에 대한, 렉틴 및 글리코실화된 Apo J를 함유하는 복합체의 양을 검출하는 단계

를 포함하는, 샘플에서 글리코실화된 Apo J를 결정하는 방법에 관한 것이다.

용어 "Apo J", "샘플", "글리코실화된 Apo J에 존재하는 글리칸 잔기에 특이적으로 결합하는 렉틴" 은 본 발명에서 진단 및 예후 예측 방법의 측면에서, 그리고 본 발명에 따른 키트의 측면에서 상세하게 설명되었고 본원에 따른 글리코실화된 Apo J를 결정하는 방법에 동등하게 적용가능하다.

단계 (i)에서, 글리코실화된 Apo J를 결정하는 방법은, 샘플내 글리코실화된 Apo J와 렉틴 간에 복합체가 형성되기에 적절한 조건 하에서, 샘플을 글리코실화된 Apo J에 존재하는 글리칸 잔기에 특이적으로 결합하는 렉틴과 접촉시키는 단계를 포함한다.

상기 복합체가 형성되기에 적절한 조건은 당업자에 의해 결정될 수 있으며, 적절한 온도, 배양 시간 및 pH 를 포함한다. 특정 구체예에서, 온도는 4 내지 40℃ 범위이고, 상세하게는 10 내지 35℃, 더욱 상세하게는 15 내지 30℃, 바람직하게는 20 내지 25℃(실온)이다. 특정 구체예에서, pH 는 pH 2 내지 pH 10, 바람직하게는 pH 4 내지 pH 10 범위이다. 특정 구체예에서, 단계 (i)은 1분 이상 동안, 바람직하게는 5분 이상 동안, 더 바람직하게는 30분 이상 동안, 보다 더 바람직하게는 60분 이상 동안 진행된다.

일부 구체예에서, 샘플은 렉틴과 접촉하기 전 희석된다. 샘플의 적절한 희석은 1:10 내지 1:100000 범위이고, 바람직하게는 1:100 내지 1:1000 범위, 보다 바람직하게는 혈장 샘플의 희석이 1:200 또는 1:1500 이다.

일 구체예에서, 단계 (i)에 사용된 렉틴은 N-아세틸글루코사민에 특이적으로 결합하는 렉틴이거나, N-아세틸글루코사민 및 시알산에 특이적으로 결합하는 렉틴이다. 보다 바람직한 구체예에서, N-아세틸글루코사민에 특이적으로 결합하는 렉틴이 다투라 스트라모니움(Datura stramonium)의 렉틴이거나, 상기 N-아세틸글루코사민 및 시알산에 특이적으로 결합하는 렉틴이 트리티쿰 불가리스(Triticum vulgaris)의 렉틴이다.

다른 구체예에서, 글리칸 잔기에 특이적으로 결합하는 렉틴은 고정화된다. 적절한 지지체는 본 발명의 키트에서 설명한 바와 동일하다.

일단 단계 (i) 가 샘플내 존재하는 글리코실화된 Apo J와 렉틴 간에 복합체가 형성되기에 충분한 시간 동안 진행되면, 단계 (ii) 가 수행된다. 단계 (ii)에서, 글리코실화된 Apo J를 결정하는 방법은 렉틴 및 글리코실화된 Apo J를 함유하는 복합체의 양을 검출하는 단계를 포함한다.

일 구체예에서, 단계 (i)에서 수득된 복합체는, 비-특이적 결합을 통해 지지체에 부착될 수 있는 임의의 Apo J 를 제거하기 위하여, 단계 (ii)를 시작하게 전에 세척된다. 단계 (i) 후의 세척은 세척 용액을 사용하여 수행된다. 특정 구체예에서, 세척 용액은 하나 이상의 염을 함유한다. 바람직하게, 세척 용액에 함유되는 염은, 트리스 완충액(TBS) 또는 인산 완충액(PBS)에 포함되는 NaCl이다. 추가적으로 또는 대안적으로, 세척 용액은 하나 이상의 계면활성제를 함유한다. 바람직하게, 계면활성제는 폴리소르베이트 20(Tween 20) 및 트리톤 X-100(Triton X-100)으로 이루어진 군에서 선택된다.

글리코실화된 Apo J와 렉틴을 함유하는 복합체의 양의 검출은, 통상적으로 Apo J 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 시약을 사용하여 수행된다. 바람직한 구체예에서, Apo J 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 시약은 항체 또는 이의 항원-결합 부위를 함유하는 단편이다.

글리코실화된 Apo J를 검출하는 방법의 단계 (ii)에서 사용에 적절한 항체는 본 발명에 따른 키트의 측면에서 정의되었고 여기에 동등하게 적용가능하다. 일 구체예에서, 항체는 검출가능한 표지와 커플링된다. 항-Apo J 항체에 대한 적절한 표지는 본 발명에 따른 키트의 측면에서 상기에서 정의되었다. 바람직한 구체예에서, 표지는 화학적, 전기적 또는 자성 성질의 하나 이상에서의 변화에 의해 검출된다.

다른 구체예에서, 글리코실화된 Apo J와 렉틴을 함유하는 복합체의 양의 검출은, Apo J 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 시약에 특이적으로 결합할 수 있는 시약을 사용하여 수행된다. 다른 구체예에서, Apo J 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 시약에 특이적으로 결합할 수 있는 제3시약은 항체, 또는 이의 항원-결합 부위를 포함하는 단편이다. 이는 검출가능한 표지를 함유하는 항체를 사용하여 시행될 수 있다. 항체에 사용되는 적절한 표지는 본 발명에 따른 키트의 측면에서 상기에서 정의되었다. 표지는 형광 표지 또는 효소적 표지일 수 있다.

도 1. Apo J 2-DE 프로파일. 대조군 및 AMI 전(pre-AMI) 허혈 환자의 혈청 샘플들로부터의 2-DE 겔에서 Apo J 클러스터의 대표적인 페턴. 혈청 내 Apo J는 4.5 내지 5.0 범위의 pI 및 37.1 내지 47.3 kDa 범위의 분자 질량을 가진 13개 스팟들의 클러스터로 검출되었다. Apo J로 확인된 스팟들은 산성에서 염기성 pH 방향으로 번호를 매겼다. 2번 스팟은 AMI 전 허혈 환자들에서만 선명했다. 1, 3, 7, 8, 10, 11, 및 13번으로 표시된 스팟들은 AMI 전 허혈 환자들에서 증가된 검출 수준을 나타낸 반면, 6번 및 9번 스팟들은 AMI 전 허혈 환자 겔에서 대조군에 비하여 감소된 강도를 나타내었다. 3, 7, 8 및 11번 스팟은 Apo J-29이고, 6번 및 9번 스팟은 Apo J-15 이다.
도 2. 글리코실화된 Apo J 형태들. (A) 건강한 공여자 및 (B) AMI 전 허혈 환자들로부터의 글리코실화된 혈청 분획(콘카발린 A 및 트리티쿰 불가리스 렉틴의 혼합물에의 결합을 통해 분리됨)에서 Apo J 클러스터의 대표적인 2-DE 사진. 총 혈청에서의 pI 및 MW 에 대응되는 여섯 개의 스팟들(1, 2, 4, 5, 8, 및 11)이 검출되었다. 도1에서와 마찬가지로, 스팟들은 산성에서 염기성 pH 방향으로 번호를 매겼다. Apo J 스팟들의 강도는 대조군에서보다 AMI 전 허혈 환자들에서 더 낮았다. 이러한 감소는 4번 및 8번 스팟에서 더 뚜렷했다.
도 3. O- 글리코실화된 Apo J 형태들. O-글리코실화된 혈청 분획(아르토카르푸스 인테그리폴리아(Artocarpus integrifolia) 렉틴에의 결합을 통해 분리됨)에서 Apo J 클러스터의 대표적인 2-DE 사진. 총 혈청에서의 pI 및 MW 에 대응되는 아홉 개의 스팟들(1, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 11 및 12)이 검출되었다. 도 1 및 도 2와 마찬가지로, 스팟들은 산성에서 염기성 pH 방향으로 번호를 매겼다.
도 4. Apo J 글리코실화된 형태들의 양(abundance). 막대 그래프는 인간 혈장 샘플에서 신규하고 독창적인 면역친화성 효소-당화 분석 또는 EGA 를 이용하여 특이적으로 검출된 다양한 Apo J 글리코실화된 형태의 양(abundance)를 나타낸다.
도 5. 진단적 가치. (A) 초기 단계의 허혈(N=38) 및 건강한 개체(N=144)에서 Apo J-GlcNAc+Neu5Ac + Apo J-GlcNAc 수준을 보여주는 박스 플롯(box-plot). (B) 0.934의 곡선하 면적(area under curve, AUC) 과(P<0.0001), 97%의 민감도 및 71%의 특이도의 332 μg/mL의 컷-오프값(cut-off value)으로, Apo J-GlcNAc+Neu5Ac + Apo J-GlcNAc 수준이 심근 허혈의 존재에 대한 진단적 가치가 있음을 보여주는 수신자 판단 특성 곡선(receiver operating curve, ROC).
도 6. STEMI -환자들에서 진단적 가치. (A) 입원 시점에서의 STEMI-환자들(N=212) 및 건강한 개체들(N=144)에서 Apo J-GlcNAc+Neu5Ac + Apo J-GlcNAc 수준을 보여주는 박스 플롯. (B) 0.713의 곡선하 면적(AUC) 과(P<0.0001), 80%의 민감도 및 53%의 특이도의 409 μg/mL의 컷-오프값(cut-off value)으로, Apo J-GlcNAc+Neu5Ac + Apo J-GlcNAc 수준이 허혈의 존재를 식별하는 가치가 있음을 보여주는 수신자 판단 특성 곡선(ROC). (C) 입원 시점에서 STEMI-환자들(N=340) 및 건강한 개체들(N=139)에서 Apo J-GlcNAc 수준을 보여주는 박스 플롯. (D) 0.830의 곡선하 면적(area under curve, AUC) 과(P<0.0001), 81%의 민감도 및 72%의 특이도의 393 μg/mL의 컷-오프값(cut-off value)으로, Apo J-GlcNAc 수준이 허혈의 존재에 대해 식별하는 가치가 있음을 보여주는 수신자 판단 특성 곡선(ROC).
도 7. 허혈 진행. (A) 입원시와 허혈 시간(ischemia time)에 Apo J-GlcNAc+Neu5Ac + Apo J-GlcNAc 수준 간의 유의적인 및 역상관적인 관련성을 보여주는 회귀 플롯(regression plot). (B) 입원 후 3일 후(t=72h) 82명의 STEMI-환자들에서 Apo J-GlcNAc+Neu5Ac + Apo J-GlcNAc 수준의 지속적인 감소를 보여주는 박스 그림. (C) 입원시와 허혈 시간에 Apo J-GlcNAc 수준 간의 유의적인 및 역상관적인 관련성을 보여주는 회귀 플롯.
도 8. 예후인자로서의 가치. (A) 병원 사망 및 6개월 내 사망과 직접적으로 관련있는 것으로 알려진, 최종 TIMI 혈류등급(TIMI flow grade) 및 (B) STEMI 를 겪은 후 보다 나쁜 예후와 관련된, 심인성 쇼크(cardiogenic shock)의 존재(심인성 쇼크를 가진 65명 환자와 없는 147명 환자)와 관련하여, 입원시 Apo J-GlcNAc+Neu5Ac + Apo J-GlcNAc 수준의 유의적인 차이를 나타내는 박스 플롯.
도 9. 위험도 계층화. (A) 입원시 Apo J-GlcNAc+Neu5Ac + Apo J-GlcNAc 수준과 GRACE Risk 점수 간의 유의적인 및 역상관적인 관련성을 보여주는 회귀 플롯. (B) STEMI-환자들의 입원 후 3일 후 Apo J-GlcNAc+Neu5Ac + Apo J-GlcNAc 수준의 감소와 가장 높은 GRACE Risk 점수 간의 관련성을 보여주는 박스 그림. (C) 입원시 Apo J-GlcNAc 수준과 GRACE Risk 점수 간의 유의적인 및 역상관적인 관련성을 보여주는 회귀 플롯.
도 10. STEMI 환자들에서 추적 6개월 후 재발성 사건 및 사망.
재발성 허혈 사건 또는 추적 6개월 후의 사망의 존재에 대한, 입원시의 Apo J-GlcNAc+Neu5Ac + Apo J-GlcNAc (A) 및 T-트로포닌(B) 수준의 영향을 보여주는 카플란-마이어 곡선(Kaplan-Meier curve); 및 추적 6개월 후 사망(C) 또는 추적 6개월 후 재발성 허혈 사건과 사망의 조합(D)에 대한 입원시 Apo J-GlcNAc 수준의 영향을 보여주는 카플란-마이어 곡선.
도 11. Apo J- GlcNAc + Neu5Ac + Apo J- GlcNAc 혈장 수준의 예cmr인자로서의 가치. (A) 샘플 수집 전 평균 0.6±0.04 년전에 급성 관상동맥 증후군(ACS)을 겪고 그후 2.3±0.3 년 동안 추적(follow-up)된 안정형 CAD 환자들의 샘플 수집 및 추적 시기를 나타내는 도식. (B) 재발성 사건을 겪지 개체들(N=18)과 비교하여 추적시 허혈성 재발 사건을 겪은 만성 CAD 환자들(N=16)의 Apo J-GlcNAc+Neu5Ac + Apo J-GlcNAc 수준을 보여주는 박스 플롯. (C) 안정형 CAD 환자들에서 재발성 허혈 사건의 제시를 위한 Apo J-GlcNAc+Neu5Ac + Apo J-GlcNAc 수준의 예측인자로서의 가치를 보여주는 수신자 판단 특성 곡선(ROC).
도 12. 뇌 허혈에서 Apo J- GlcNAc + Neu5Ac + Apo J- GlcNAc 의 진단적 가치. 뇌졸중 환자(N=174) 및 건강한 개체(N=164)에서 Apo J-GlcNAc+Neu5Ac + Apo J-GlcNAc 혈장 수준을 보여주는 박스 플롯.

본 발명은 다음의 실시예에 의해 구체화될 것이나, 이것이 본 발명의 범위를 제한하는 것을 의도하는 것은 아니다.

실시예

실시예 1

심장 허혈에서 Apo J- GlcNAc + Neu5Ac + Apo J- GlcNAc 및 Apo J- GlcNAc 의 진단적 가치

심장 허혈 환자들에서 Apo J 단백질 프로파일이 2차원 전기영동(bi-dimensional electrophoresis, 2-DE) 과 질량 분석법에 의하여 이전에 확인된 바 있다(Cubedo, J., et al., 2011, Journal of proteome research 10: 211-220). 상기 연구에서는, 사건 발생 후 최초 6시간 내에 특이적 Apo J 형태들이 증가하거나(Apo J-29) 또는 감소한(Apo J-15) 것을 보여주었다 (도 1). 이러한 기준을 적용함으로써, 특이적 Apo J 형태 (Apo J-15 및 Apo J-29)가 급성 심근경색(AMI) 후 유도된 조직 손상의 마커로 제안되었다. 동 연구에서는 또한, Apo J-15 및 Apo J-29에서 검출된 변화가 Apo J 의 당화 프로파일의 변화로 인한 것인지 여부가 분석되었다. 특히, 혈청 당단백질이 콘카발린(Concavalin) A와 (α-만노스, α-글루코스, (GlcNAc)₂ 및 Neu5Ac 잔기들을 가진 단백질에 결합하는) 트리티쿰 불가리스(Triticum vulgaris) 렉틴의 혼합물에서 분리되었다. 이 분리된 단백질들은 2-DE 분석과 질량분석법에 의해 분석되었다. 이 분석에서(도 2), 오직 1, 2, 4, 5, 8 및 11번 스팟들만이 α-만노스, α-글루코스, (GlcNAc)₂ 및 Neu5Ac 잔기들을 함유한 반면, 3, 6, 7, 9, 10, 12 및 13번 스팟들은 상기 잔기들을 가지지 않는 것으로 나타났다. α-만노스, α-글루코스, (GlcNAc)₂ 및 Neu5Ac 잔기들을 가진 글리코실화된 Apo J 스팟들의 강도는 대조군에서보다 AMI 전(pre-AMI) 허혈 환자들에서 더 낮았다. 이러한 감소는 형태 4 및 8에서 더 분명하였다. 허혈의 초기에 α-만노스, α-글루코스, (GlcNAc)₂ 및 Neu5Ac로 글리코실화된 Apo J 강도가 총 25% 감소하였다. 반면, 이러한 잔기들이 없는 Apo J 형태들(3, 6, 7, 10, 12 및 13)은 허혈 초기에 증가하였다.

그러나, 상기 기술한 분석에서 사용된 렉틴의 다중 특이성(multiple specificity)으로 인하여, 이들 분석은 Apo J 의 다양한 글리코실화된 형태들(α-만노스를 함유하는 형태, α-글루코스를 함유하는 형태, (GlcNAc)₂ 를 함유하는 형태, 및/또는 Neu5Ac 잔기를 함유하는 형태) 중 어떤 것이 실제로 허혈 손상과 관련된 바이오마커인지를 구별할 수 없었다. 또한, O-글리칸에서만 발견되는 α-갈락토스 및 GalNAc 잔기들을 가진 단백질에 결합하는 아르토카르푸스 인테그리폴리아(Artocarpus integrifolia) 렉틴을 사용함으로써, 1, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 11 및 12번 스팟들만이 α-갈락토스 및 GalNAc 잔기들을 함유한 반면, 2, 5, 10 및 13번 스팟들은 이러한 잔기들을 가지지 않는 것으로 나타났다 (도 3). 따라서, 1, 2, 4, 5, 8 및 11번 스팟들 중 일부는 O-글리코실화된 잔기들 및 더 특이적인 α-갈락토스 및 GalNAc 잔기들 또한 함유하고 있기 때문에, 이들 스팟에서 이전에 보고된 바와 같은 감소가 α-만노스, α-글루코스, (GlcNAc)₂ 및 Neu5Ac 잔기들을 함유하는 형태들의 감소만을 나타내는 것은 아니다.

Apo J 에서 다른 종류의 잔기들의 존재를 식별하기 위하여, 다른 방법을 사용하였다. 이 방법(이하, 면역친화성 효소-당화 분석(immunoaffinity enzymatic-glycosylation assay) 또는 EGA 라고 함)은 다양한 글리코실화된 Apo J 형태들의 정량화 및 특이적 검출을 가능하게 한다. 이러한 EGA는 다음을 기반으로 한다: 1) 단백질들이 특이적 당화 잔기에 결합함으로써 고정화되는, 제1단계 (표 1), 2) Apo J 가 Apo J 서열에 대한 단클론항체 또는 다클론항체로 검출되는, 제2단계, 및 3) 특이적으로 고정화된 글리코실화된 Apo J 형태의 양이 리포터 시스템 또는 분자에 의해 추가적으로 검출되고 정량화되는, 최종 단계. 이러한 리포터 시스템은 다음으로 구성될 수 있다: a) 비오틴-스트렙타비딘-HRP 과 같은 리포터 시스템을 포함하는 2차 항체와 같은, 표색 시스템; 또는 b) 상기 시스템에서 생리화학적 변화 (즉, 화학적, 전기적, 또는 자성 변화).

표 1. Apo J 에 존재하는 글리칸 및 탄수화물 구조들과, 이를 검출하는데 사용되는 특이적 렉틴-기반의 방법론적 접근

다양한 렉틴들을 이용한 방법을 사용함으로써, 글리코실화된 Apo J가 다음의 글리칸 잔기들을 가질 수 있다는 것이 발견되었다: a) (GlcNAc)₂ + Neu5Ac; b) αNeu5Ac(2->6)gal + GalNAc; c) α-L-fucose; d) GalNAc 단독; 및 e) (GlcNAc)₂ 단독 (도 4).

다음으로, 38명의 AMI 전 허혈 환자들 및 144명의 건강한 대조군들의 혈장 샘플에서 (GlcNAc)₂ + Neu5Ac 잔기들 (Apo J-GlcNAc+Neu5Ac + Apo J-GlcNAc)을 가진 Apo J를 특이적으로 측정하기 위하여 EGA 를 적용하였다. AMI 전 허혈 환자들은, 대조군과 비교하여, 허혈 초기에 Apo J-GlcNAc+Neu5Ac + Apo J-GlcNAc 수준의 45% 감소를 나타내었다 (AMI 전 허혈환자: 264±18 vs. 대조군: 473±6 μg/mL; P<0.0001; 도 5A). AMI 전 허혈 환자들의 샘플은, 흉통의 발생 후 최초 6시간 이내 및 괴사성 마커들(T-트레포닌 및 CK)이 상승하기 전, 입원시(t=0)에 취하였다. 이 시점에 환자들은 사건 발생으로 인하여 어떤 치료도 받지 않았다. C-통계적 분석(C-statistics analysis) 결과, EGA에 의한 Apo J-GlcNAc+Neu5Ac + Apo J-GlcNAc 수준의 측정이, 0.934의 곡선하 면적(area under curve, AUC) 과(P<0.0001), 97%의 민감도 및 71%의 특이도의 332 μg/mL의 컷-오프값(cut-off value)으로, 심근 허혈의 존재를 고도로 식별해내는 값을 나타내는 것이 확인되었다(도 5B 및 표 2). 따라서, Apo J-GlcNAc+Neu5Ac + Apo J-GlcNAc 수준의 측정은 허혈 진단의 바이오마커로 사용될 수 있다.

본 발명자들은 212명의 STEMI-환자에서 EGA 방법을 사용하여 Apo J-GlcNAc+Neu5Ac + Apo J-GlcNAc 수준을 추가적으로 분석하였다. 입원시 양성 T-트로포닌 검출을 나타낸 환자들(괴사를 가진 환자군)을 포함하여, 허혈성 통증의 다양한 진화 시간(1h-60h)을 가진 (de novo 및 이차 사건을 포함하는) 환자들에서, 입원시 샘플을 취하였다. STEMI-환자들은 대조군과 비교시 입원시 Apo J-GlcNAc+Neu5Ac + Apo J-GlcNAc 혈장 수준의 15% 감소를 나타내었다 (STEMI: 402±8 vs. C: 473±6 μg/mL; P<0.0001; 도 6A). C-통계적 분석 결과, EGA에 의한 Apo J-GlcNAc+Neu5Ac + Apo J-GlcNAc 수준의 측정이, 0.713의 곡선하 면적(area under curve, AUC) 과(P<0.0001), 80%의 민감도 및 53%의 특이도의 409 μg/mL의 컷-오프값(cut-off value)으로, 심근 허혈의 존재를 식별해내는 능력을 나타내는 것이 확인되었다 (도 6B).

다음으로 다투라 스트라모니움(Datura stramonium) 렉틴을 이용하여 340명의 STEMI-환자들과 139명의 건강한 대조군에서 (GlcNAc)₂ 잔기들을 가진 Apo J를 특이적으로 측정하기 위하여 EGA 를 적용하였을 때, 입원 당시 STEMI-환자들에서 Apo J-GlcNAc 혈장 수준의 35% 감소가 확인되었다 (STEMI: 328±7 vs. C: 506±12 μg/mL; P<0.0001; 도 6C). C-통계적 분석 결과, Apo J-GlcNAc 수준의 측정이, 0.830의 곡선하 면적(AUC) 과(P<0.0001), 81%의 민감도 및 72%의 특이도의 393 μg/mL의 컷-오프값(cut-off value)으로, 심근 허혈의 존재를 고도로 식별해내는 능력을 나타내는 것이 확인되었다(도 6D).

표 2. 대응되는 민감도 및 특이도 값들과 함께 심근 손상을 진단하는 방법, 뇌 허혈을 진단하는 방법, 재발성 사건과 사망의 예후를 예측하는 방법, 및 안정형 CAD 환자에서 위험도 계층화 방법에 적용가능한 컷-오프값(Cut-off values) 및 관련된 민감도 및 특이도

실시예 2

Apo J-GlcNAc+Neu5Ac + Apo J-GlcNAc 및 Apo J-GlcNAc 의 예후인자로서의 가치

두번째 단계로서, 본 발명자들은 글리코실화된 Apo J형태의 특이적 정량화가 예후인자로서 가치를 가질 수 있는지를 평가하였다. Apo J-GlcNAc+Neu5Ac + Apo J-GlcNAc 수준은 허혈 시간(증상의 발생과 입원 사이에 경과된 시간으로 정의됨)과 유의적인 및 역상관적인 관련성이 있었다 (R=-0.259 P=0.0003; 도 7A). 또한, 입원 후 3일간 82명의 STEMI-환자에서 Apo J-GlcNAc+Neu5Ac + Apo J-GlcNAc 수준의 측정은, 입원 당시와 비교했을 때 지속적인 감소를 나타내었다 (t=72h: 331±10 vs. t=0: 402±8 μg/mL; P<0.0001; 도 7B). Apo J-GlcNAc 수준만을 분석했을 때에도 허혈 시간과 유의적인 및 역상관적인 관련성이 있었다 (R=-0.113 P=0.048; 도 7C). 이러한 결과는 Apo J-GlcNAc+Neu5Ac + Apo J-GlcNAc 및 Apo J-GlcNAc가 허혈 진행의 신규 바이오마커임을 나타낸다.

또한, 병원 사망 및 6개월 내 사망의 증가된 위험으로 인하여 불량한 예후와 관련이 있는, 최종 TIMI 혈류등급(TIMI flow grade) 0 또는 1을 가진 STEMI-환자들은, 최종 TIMI 혈류등급이 =2 인 STEMI-환자들에 비하여, 유의적으로 더 낮은 Apo J-GlcNAc+Neu5Ac + Apo J-GlcNAc 혈장 수준을 나타내었다. 또한, STEMI 를 겪은 후 더 나쁜 예후와 관련된, 심인성 쇼크(cardiogenic shock)를 겪은 환자들은, 심인성 쇼크를 가지지 않은 사람에 비하여, 입원시 12% 더 낮은 Apo J-GlcNAc+Neu5Ac + Apo J-GlcNAc 혈장 수준을 나타내었다 (도 8B).

또한, Apo J-GlcNAc+Neu5Ac + Apo J-GlcNAc 수준과, 사망과 관련된 GRACE Risk 점수 간에는 유의적인 및 역상관적인 관련성이 있었다 (R=-0.257 P=0.0002; 도9A). 또한, 82명의 STEMI-환자들의 추적(follow-up)에서 Apo J-GlcNAc+Neu5Ac 수준의 변화를 살펴보면서, 본 발명자들은 입원시보다 사건 3일 후에 Apo J-GlcNAc+Neu5Ac + Apo J-GlcNAc 수준이 훨씬 더 낮은 환자들이, 더 높은 GRACE Risk점수 값을 나타낸다는 것을 관찰하였다 (P=0.002; 도 9B). 유사하게, Apo J-GlcNAc 수준 또한 GRACE Risk 점수와 유의적인 및 역상관적인 관련성이 있었다 (R=-0.184 P=0.0006; 도 9C). 이 모든 결과는 허혈 사건에서 위험 계층화 마커로서의 Apo J-GlcNAc+Neu5Ac + Apo J-GlcNAc 및 Apo J-GlcNAc 의 예상치 못한 역할을 나타낸다.

또한, 카플란-마이어 생존 분석(Kaplan-Meier survival analysis) 결과, 입원시 STEMI 군의 중앙값보다 낮은 Apo J-GlcNAc+Neu5Ac + Apo J-GlcNAc 수준을 가진 환자들이, 재발성 허혈 사건의 출현 및 추적 6개월 후 사망률에 있어 유의적인 차이를 나타내었다(P=0.008; 도 10A). 이러한 효과는, 동일한 분석을 T-트로포닌으로 수행했을 때에는 보여지지 않았던 것이다(P=0.363; 도 10B). 또한, 카플란-마이어 생존 분석에서, 입원시 가장 낮은 사분위수 범위(<236.8 μg/mL) 의 Apo J-GlcNAc 수준을 가진 STEMI 환자들이, 추적 6개월에 생존률의 유의적인 감소를 나타낸 것으로 밝혀졌으므로(P=0.015; 도 10C), Apo J-GlcNAc 수준이 예후인자로서도 가치를 가진다. 입원시 가장 낮은 사분위수 범위(<236.8 μg/mL) 의 Apo J-GlcNAc 수준을 가진 STEMI 환자들과 입원시 더 높은 Apo J-GlcNAc 값을 나타낸 환자들 간의 카플란-마이어 생존 분석에서, 추적 6개월 후 재발성 허혈 사건의 출현 및 사망 모두를 종점(endpoint)으로 취했을 때에도 유의적인 차이가 관찰되었다(P=0.031; 도 10D). 따라서, 이러한 결과는 허혈 제시 후 예후 예측 마커로서의 Apo J-GlcNAc+Neu5Ac + Apo J-GlcNAc 및 Apo J-GlcNAc 혈장 수준의 역할을 뒷받침한다.

실시예 3

안정형 관상동맥 질환(CAD)에서 (심장 또는 뇌) 재발성 허혈 사건의 제시를 위한 Apo J-GlcNAc+Neu5Ac + Apo J-GlcNAc의 예측인자로서의 가치

본 실시예는 안정형 관상동맥 질환(CAD)에서 (심장 또는 뇌의) 재발성 허혈 사건의 제시에 대한 예측인자로서의 가치라는, Apo J-GlcNAc+Neu5Ac + Apo J-GlcNAc 의 또다른 예상치 못한 성질을 보여준다. 본 발명자들은 샘플 수집 전 평균 0.6±0.04 년전에 급성 관상동맥 증후군(ACS)을 겪고 그후 2.3±0.3 년 동안 추적(foolow-up)된 만성 CAD(N=34) 군에서 Apo J-GlcNAc+Neu5Ac + Apo J-GlcNAc 수준을 분석하였다 (도 11A). 두 환자 그룹에서 샘플을 수득하였다: 추적(follow-up)시 급성 허혈 사건(급성 관상동맥 증후군(ACS), 뇌졸중 또는 일과성 허혈 사건(TIA))을 겪은 환자군 (N=16) 및 추적 기간 동안 급성 허혈 사건을 겪지 않은 환자군 (N=18). 연령, 당뇨병과 고혈압의 발생, 및 두 그룹 간의 콜레스테롤 파라미터들에는 유의적인 차이가 없었다. 포함된 환자들은 모두 흡연자가 아니며 이들 모두 샘플 수집 당시 항-혈소판 치료 하에 있었다. 재발성 사건을 겪은 환자들은, 추적 당시 어떠한 사건도 겪지 않은 환자들에 비해, 사건을 겪기 전에 28% 더 낮은 Apo J-GlcNAc+Neu5Ac + Apo J-GlcNAc 수준을 나타내었다 (도 11B). 실제로, 수신자 판단 특성 곡선(receiver operating curve, ROC)은 안정형 CAD 환자에서 재발성 허혈의 제시에 대한 Apo J-GlcNAc+Neu5Ac + Apo J-GlcNAc 수준의 예측인자로서의 가치를 보여주었다 (도 11C). 특히, 본 실시예에서, 485 μg/mL 미만의 Apo J-GlcNAc+Neu5Ac + Apo J-GlcNAc 수준은 안정형 CAD 환자에서 94%의 민감도 및 64%의 특이도로 재발성 허혈 사건의 제시를 예측할 수 있었다 (표 2). 따라서, Apo J-GlcNAc+Neu5Ac + Apo J-GlcNAc는 안정형 CAD 환자에서 재발성 급성 허혈 사건의 제시 전에 "침묵(silent)" 허혈성 과정의 마커로서 추가적인 가치를 나타낸다.

실시예 4

뇌 허혈 바이오마커로서 Apo J-GlcNAc+Neu5Ac + Apo J-GlcNAc 의 역할

추가적으로, 174명 뇌졸중 환자에서의 Apo J-GlcNAc+Neu5Ac + Apo J-GlcNAc 수준의 측정은, 164명의 건강한 대조군과 비교했을 때 8% 감소한 것으로 나타났는데 (뇌졸중: 418±7 vs. 대조군: 453±7 μg/mL; P=0.0008; 도 12), 이는 Apo J-GlcNAc+Neu5Ac + Apo J-GlcNAc가 뇌 허혈의 바이오마커이기도 함을 강조하는 결과이다.

Claims

개체의 샘플에서 N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 잔기를 함유하는 글리코실화된 Apo J의 수준 또는 N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 및 시알산 잔기를 함유하는 글리코실화된 Apo J의 수준을 결정하는 단계를 포함하는, 개체에서 허혈(ischemia) 또는 허혈성 조직 손상(ischemic tissue damage)을 진단하는 방법으로서, 기준값 대비 N-아세틸글루코사민 잔기를 함유하는 Apo J의 감소된 수준 또는 기준값 대비 N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 및 시알산 잔기를 함유하는 Apo J 의 감소된 수준이, 환자가 허혈 또는 허혈성 조직 손상을 가지고 있음을 나타내는 것인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 허혈이 심근 허혈(myocardial ischemia) 또는 뇌 허혈(cerebral ischemia)인, 방법.
제2항에 있어서, 상기 심근 허혈이 급성 심근 허혈(acute myocardial ischemia) 또는 미세혈관 협심증(microvascular angina)인, 방법.
제2항에 있어서, 상기 뇌 허혈이 뇌졸중인, 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자가 허혈성 사건(ischemic event)을 겪은 것으로 의심되는 환자인, 방법.
제5항에 있어서, 상기 결정은 의심되는 허혈성 사건이 발생한 후 최초 6시간 이내, 하나 이상의 괴사성 마커의 수준이 상승하기 전, 또는 환자가 의심되는 허혈성 사건에 대한 임의의 치료를 받기 전에 수행되는 것인, 방법.
환자의 샘플에서 글리코실화된 Apo J의 수준을 결정하는 단계를 포함하는, 허혈성 사건을 겪은 환자에서 허혈의 진행을 예측하거나 허혈성 사건을 겪은 환자에서 예후를 결정하는 방법으로서, 기준값 대비 글리코실화된 Apo J의 감소된 수준이, 허혈이 진행중임을 나타내거나 환자의 나쁜 예후를 나타내는 것인, 방법.
제7항에 있어서, 상기 글리코실화된 Apo J가 N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 잔기를 함유하는 글리코실화된 Apo J, 또는 N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 및 시알산 잔기를 함유하는 글리코실화된 Apo인, 방법.
제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 허혈성 사건이 심근 허혈성 사건(myocardial ischemic event)인, 방법.
제9항에 있어서, 상기 심근 허혈성 사건이 ST-상승 심근경색(ST-elevation myocardial infarction)인, 방법.
제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자의 예후가 6개월내 재발의 위험, 병원 사망(in-hospital mortality)의 위험, 또는 6개월내 사망 위험으로 결정되는 것인, 방법.
환자의 샘플에서 글리코실화된 Apo J의 수준을 결정하는 단계를 포함하는, 안정형 관상동맥 질환(stable coronary disease)을 가진 환자가 재발성 허혈 사건(recurrent ischemic event)을 겪을 위험을 결정하는 방법으로서, 기준값 대비 글리코실화된 Apo J의 감소된 수준이, 환자가 재발성 허혈 사건을 겪을 증가된 위험을 보여준다는 것을 나타내는 것인, 방법.
제12항에 있어서, 상기 글리코실화된 Apo J가 N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 잔기를 함유하는 글리코실화된 Apo J, 또는 N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 및 시알산 잔기를 함유하는 글리코실화된 Apo인, 방법
제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 안정형 관상동맥 질환을 가진 환자가 안정형 관상동맥 질환 전에 급성 관상동맥 증후군(acute coronary syndrome)을 가졌던 환자인, 방법.
제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재발성 허혈 사건이 급성 관상동맥 증후군, 뇌졸중 또는 일과성 허혈 사건(a transient ischemic event)인, 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 잔기를 함유하는 글리코실화된 Apo J의 수준이 다투라 스트라모니움(Datura stramonium) 렉틴에 특이적으로 결합할 수 있는 Apo J 의 수준과 일치하거나, 상기 N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 및 시알산 잔기를 함유하는 글리코실화된 Apo의 수준이 트리티쿰 불가리스(Triticum vulgaris) 렉틴에 특이적으로 결합할 수 있는 Apo J 의 수준과 일치하는 것인, 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플이 체액(biofluid)인, 방법.
제17항에 있어서, 상기 체액이 혈장 또는 혈청인, 방법.
a. 아세틸글루코사민(GlcNAc) 및 시알산에서 선택되는 글리칸 잔기에 특이적으로 결합하는 렉틴인, 제1시약, 및
b. Apo J 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 수 있는 제2시약
을 포함하는, 키트.
제19항에 있어서, 상기 렉틴이 트리티쿰 불가리스(Triticum vulgaris)의 렉틴이거나 다투라 스트라모니움(Datura stramonium)의 렉틴이거나 이들의 조합인, 키트.
제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 제2시약이 항체, 또는 이의 항원-결합 부위를 포함하는 단편인, 키트.
제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1시약이 고정화된 것인, 키트.
제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2시약이 표지자(label)를 포함하는 것인, 키트.
제23항에 있어서, 상기 표지자가 이의 화학적, 전기적 또는 자성 성질의 하나 이상에서의 변화에 의해 검출될 수 있는 것인, 키트.
제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 제2시약에 특이적으로 결합할 수 있는 제3시약을 더욱 포함하는, 키트.
제25항에 있어서, 상기 제3시약이 항체, 또는 이의 항원-결합 부위를 포함하는 단편인, 키트.
환자에서 허혈 또는 허혈성 조직 손상을 진단하거나, 허혈성 사건을 겪은 환자에서 허혈의 진행을 결정하거나, 허혈성 사건을 겪은 환자에서 예후를 예측하거나, 또는 안정형 관상동맥 질환(stable coronary disease)을 가진 환자가 재발성 허혈 사건(recurrent ischemic event)을 겪을 위험을 결정하기 위한, 제19항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 키트의 용도.
(i) 샘플내 글리코실화된 Apo J와 렉틴 간에 복합체가 형성되기에 적절한 조건 하에서, 샘플을 글리코실화된 Apo J에 존재하는 글리칸 잔기에 특이적으로 결합하는 렉틴과 접촉시키는 단계, 및
(ii) 렉틴 및 글리코실화된 Apo J를 함유하는 복합체의 양을 검출하는 단계를 포함하는, 샘플에서 글리코실화된 Apo J를 결정하는 방법.
제28항에 있어서, 상기 단계 (i)에 사용되는 렉틴이 N-아세틸글루코사민에 특이적으로 결합하는 렉틴이거나, N-아세틸글루코사민 및 시알산에 특이적으로 결합하는 렉틴인, 방법.
제28항 또는 제29항에 있어서, 상기 N-아세틸글루코사민에 특이적으로 결합하는 렉틴이 다투라 스트라모니움(Datura stramonium)의 렉틴이거나, 상기 N-아세틸글루코사민 및 시알산에 특이적으로 결합하는 렉틴이 트리티쿰 불가리스(Triticum vulgaris)의 렉틴인, 방법.
제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 글리칸 잔기에 특이적으로 결합하는 렉틴이 고정화된 것인, 방법.
제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (ii)의 복합체가 Apo J 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 시약을 사용하여 검출되는 것인, 방법.
제32항에 있어서, 상기 Apo J 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 시약이 항체, 또는 이의 항원-결합 부위를 포함하는 단편인, 방법.
제33항에 있어서, 상기 항체가 검출가능한 표지자(detectable label)와 커필링된 것인, 방법.
제34항에 있어서, 상기 표지자가 이의 화학적, 전기적 또는 자성 성질의 하나 이상에서의 변화에 의해 검출될 수 있는 것인, 방법.
제28항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 검출이 Apo J 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 시약에 특이적으로 결합할 수 있는 시약을 사용하여 수행되는 것인, 방법.
제36항에 있어서, Apo J 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 시약에 특이적으로 결합할 수 있는 제3시약이 항체, 또는 이의 항원-결합 부위를 포함하는 단편인, 방법.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 잔기를 함유하는 글리코실화된 Apo J의 수준 또는 N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 및 시알산 잔기를 함유하는 글리코실화된 Apo J의 수준의 결정이, 제19항 내지 제26항 중 어느 한 항에 정의된 키트 또는 제28항 내지 제37항 중 어느 한 항에 정의된 방법을 사용하여 결정되는 것인, 방법.