KR20040039177A - 국소빈혈을 위한 진단 마커 - Google Patents

국소빈혈을 위한 진단 마커 Download PDF

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Abstract

본 발명은 국소빈혈을 진단하고 모니터링하는 방법에 관한 것으로서, 진단 대상은 심근 및 대뇌의 국소빈혈을 포함하나 그에 제한되지 않고, 전기 방법은 국소빈혈 증상이 있는 조직으로부터는 유래하지 않는 분자농도를 측정함으로써 가능한데, 국소빈혈 상태의 결과로서 혈액 및 다른 체액에서의 전기 농도가 변화한다.

Description

국소빈혈을 위한 진단 마커{Diagnostic Markers for Ischemia}
국소빈혈은 혈류의 감소이다. 이러한 감소는, 혈전증(thrombosis), 색전증(embolism), 동맥류(aneurysm), 연축(spasm) 또는 노화에 의한 혈관의 허탈(collapse) 등의 다양한 이유로서 일어날 수 있다. 혈류의 감소로 인해, 조직은 세포 통합을 유지하지 못 할 정도로 더 이상 충분한 영양을 받지 못하게 될 수 있고, 세포 노폐물을 충분히 제거 못 할 수도 있으며, 산소와 이산화탄소 같은 혈액에서의 기체 교환이 부적절하게 일어날 수도 있다. 세포로의 충분한 산소 전달의 실패는 국소빈혈과 동일한 결과를 가져올 수 있으며, 본 발명에서 청구된 동일한 방법으로 감지될 수 있다.
국소빈혈이 오랜 시간 동안 유지되면, 다시 말해서, 산소를 포함한 혈류가회복되지 않는다면, 조직의 세포는 혈류가 정상적으로 공급되지 않아 괴사할 것이다. 이러한 현상은 오랜 기간 동안 점진적으로 일어날 수 있으며, 많은 세포 파괴가 일어나서 개체의 기능이 심각하게 훼손되기 전까지 인지가 되지 않을 수도 있다. 일 예는 점진적인 악화에서 극단적인 것까지 있을 수 있으며, 당뇨병에서 일어난 다른 신체 부분일 수도 있다. 혈류의 이상은 좀 더 급성으로 일어날 수 있다. 이러한 것은, 관상동맥을 통한 혈류의 감소, 뇌빈혈에서 일시적인 색전증 및 신장과 사지에서의 유사한 증상을 초래하는, 혈전 형성을 포함하지만 거기에만 국한되는 것은 아니다.
만성이거나 급성 모두, 국소빈혈/저산소증 상태가 조기에 감지된다면, 빨리 완화치료가 수행될 수 있으며, 그로 인한 조직과 개체에 대한 더 좋은 결과를 얻을 수 있다. 예를 들어, 당뇨병에 의해 유발된 국소빈혈의 조기발견은 절단 수술을 피할 수 있게 하며, 심장이나 뇌로의 급성 차폐에 대한 조기발견과 치료는 사망률을 상당히 감소시킬 수 있다.
불행히도, 국소빈혈/저산소증의 조기발견은 종종 불가능하다. 예를 들어, 급성 관상 증후군의 기본적인 조기진단 기구인 ECG는 그 민감도가 40%를 밑돈다. 뇌졸중(stroke) 환자들을 위한 유일한 기구는 CT 스캔이나 MRI인데, 모두 환자가 증상이 시작한 이후 처음 몇 시간내에 출혈이 있는지 결정할 수만 있다. 아주 나중에만, 이미 국소빈혈성 뇌졸중의 치료인 혈전용해(thrombolytic) 치료를 수행하기 늦을 때, 국소빈혈성 뇌졸중이 발생했는지 결정할 수 있는 이미지 방법이 있을 뿐이다. 혈전용해 치료는 증상이 시작한지 3시간 내에 수행되어야 한다. 다른 장기들을 위한 잘 확립된 국소빈혈의 조기발견 방법은 존재하지 않는다. 그러므로, 환자의 진단과 치료를 위한, 민감하고 정확하며 신속한 국소빈혈 검사법이 필요하다.
국소빈혈 말기에, 세포들은 괴사(necrosis)하기 시작할 때, 혈액속으로 그들의 세포 내용물을 방출하게 된다. 이것들은 대부분 정상적인 장벽인 세포막이 세포사멸과 관련된 생화학적 변화에 수반되어 방출되는 세포내 단백질이다. 종종 이러한 분자들은 조직 특이적인데, 예를 들어, 심장의 경우 심장 트로포닌(troponin)이 그것이다. 비록, 이러한 분자들은 병의 존재를 정확히 반영하지만, 일반적으로 혈액내 중요 수준까지 도달한 후 몇시간이 요구되며 그것들은 오직 사멸하거나 사멸해가는 세포에서만 방출된다. 그러므로, 민감도와 정확도에 추가하여, 국소빈혈 검사를 위한 중요한 특징은 세포괴사 이전에 국소빈혈 상태를 감지하는 능력이다.
괴사의 마커가 되는 국소빈혈 조직의 분자 방출에 추가하여, 국소빈혈 증상은, 혈액이나 국소빈혈 조직에서 유래되지 않은 다른 체액내 분자들의 농도변화를 수반하는 일련의 생화학적 변화를 생성할 수 있다. 이런 것들을 본 발명에서 국소빈혈 마커라 한다. 예를 들어, 국소빈혈 조직이 이후 비국소빈혈 조직에 의해 다른 분자들로 전환되는 분자들을 생성하거나, 국소빈혈 조직이 비국소빈혈 조직으로부터 체액으로 다른 분자들 방출을 활성화시키는 분자들을 생성할 때, 국소빈혈 마커의 생성이 생긴다. 이것의 예는, 국소빈혈 심장이나 대뇌 조직에 의한 노르에피네프린(norepinephrine), TNFα및 나트륨배설증가(natriuretic) 펩티드 등이 있다.그렇게 생성된 노르에피네프린, TNFα및 나트륨배설증가 펩티드는 지방조직에서의 지방분해를 활성화시켜, 혈액내 유리 자방산을 증가시킨다. 다른 예에서, 국소빈혈 심근에서 방출된 스핑고신(sphingosine)은 혈소판에서 스핑고신-1-포스페이트(sphingosine-1-phosphate)로 전환되어, 혈액속에서 검출될 수 있다(참조: Yatomi et al.(1997) Journ. Biol. Chem. vol. 272:5291-5297; 미국특허 제 6,210,976호).
병의 유무를 진단하는 것에 추가로, 국소빈혈의 마커 수준은 미래의 악화된 위험을 예견할 수 있다. 더욱이, 충분한 수준의 이러한 분자들은 스스로, 악화된 결과를 일으키는 세포내 작용을 매개할 수도 있다. 예를 들어, 명백히 건강한 사람들에 대한 장기간 동안의 연구에 의해, 전체 혈청 유리 지방산(FFA)의 증가되는 수준이, 비록 정상적 범위내지만, 22살 이후의 급사(sudden death) 위험의 증가와 연관된다라는 것을 알게 되었다. 이러한 사망의 증가된 비율은, 유리 지방산에 의해 유도된 심장 박동의 불규칙성의 결과였다라고 생각되어졌다. 또다른 예에서, 급성 심근경색으로 고생하는 환자의 포도당-인슐린-칼륨의 조합 사용은, 상대적으로 그것을 사용하지 않는 환자에 비해 사망률의 중대한 감소를 나타낸다. 그러므로, 더 장기간의 질병 위험을 평가하고, 만성적인 국소빈혈 상태와 연관될 수 있는 증가된 위험을 감소시키기 위한 치료의 유형을 결정하는데 도움을 주기 위해, 국소빈혈 마커를 모니터링할 수 있는 필요가 있다.
발명의 요약
본 발명은 국소빈혈의 진단과 모니터링에서, 혈액 및/또는 국소빈혈 조직에서 유래되지 않은 분자들의 다른 체액에서의 농도 측정 방법을 설명한다. 이러한 분자들은 국소빈혈 마커라 불리운다. 비국소빈혈 상태에 상대적인, 이러한 국소빈혈 마커의 농도변화는 어떤 국소빈혈을 지시하는 것이다.
일 실시태양에서, 본 발명은 포유동물에서의 국소빈혈을 지시하는 상태를 감지하는 방법이 나와있는데, (a) 포유동물의 체액에서 유래한 검사용 표본에서 국소빈혈 마커의 수준을 측정하는 단계; 및, (b) 검사용 표본에서 측정된 국소빈혈 마커의 수준이 포유동물의 국소빈혈과 상관이 있는지 결정하는 단계를 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 포유동물은 사람이다. 검사용 표본에 사용되는 체액은 혈청, 혈장, 타액, 담즙, 위액, 뇌척수액, 임파액, 세포간액 또는 소변을 포함하지만 이것들에만 국한되지 않는 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 검사용 표본에 사용될 체액은 혈액이다.
일 실시태양에서, 국소빈혈 마커는 지질이다. 지질은, 류코트리엔 (leukotriene), 프로스타싸이클린(prostacyclin), 프로스타글란딘(prostaglandin) 및 트롬복세인(thromboxane) 등을 포함한 스핑고리피드(sphingolipid), 리소리피드(lysolipid), 당지질(glycolipid), 스테로이드(steroid) 및 아이코사노이드(eicosanoid)로 구성된, 하지만 그것에 제한되지 않은, 군으로부터 선택될 수 있다. 일 실시태양에서, 국소빈혈 마커로 사용된 스핑고리피드는, 예를 들어, 스핑고신이거나, 세라미드(ceramide), 스핑고신-1-포스페이트, 스핑고실포스포릴콜린(sphingosylphosphorylcholine) 또는 디하이드로스핑고신(dihydrosphingosine)을 포함한, 그것으로부터의 대사물일 수 있다. 좀 더 바람직한 실시태양에서, 지질은 지방산이다.
개시된 방법은 심장, 뇌, 신장 또는 사지를 포함하지만 국한되지는 않은 국소빈혈의 감지에 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시태양에서, 수용완충액에 용해될 수 있는 국소빈혈 마커의 요소가 감지된다.
국소빈혈 마커는 UV/VIS, 적외선, 극초단파, 라디오파, 흡수 또는 방출 분광기를 포함하지만 국한되지 않는 분광 수단에 의해 감지될 수 있다. 크로마토그래피 절차 또한 본 발명에 포함되는데, HPLC, 저압 크로마토그래피, 중압 크로마토그래피 및 기체 크로마토그래피 등을 포함하지만 국한되지는 않는다. 스핀 라벨을 이용한 전자 스핀 공명에 의한 국소빈혈 마커의 감지도 본 발명에 포함된다. 대체적인 실시태양에서, 국소빈혈 마커는 항체나 수용체 분자, 면역동정(immunoassay)이나 효소학적 동정(enzymatic assay)에 의해 감지될 수 있다.
바람직한 실시태양에서, 방법은 국소빈혈의 증상을 나타내는 포유동물을 선택하는 초기 단계를 포함할 수 있다. 어떤 실시태양에서는, 국소빈혈 마커 수준이 전기 포유류의 국소빈혈과 상관되어 진다면, 방법은 항 국소빈혈 치료를 수행하는 단계를 포함할 수도 있다. 항 국소빈혈 치료는 혈청 지방산의 수준을 낮추는 수단을 포함할 수 있다. 어떤 실시태양에서는, 항 국소빈혈 치료는 리퍼퓨전(reperfusion) 치료, 항 혈전용해 치료, 맥관형성 치료 또는 절단 수술이다.
어떤 실시태양에는, 결정 단계는 전기 국소빈혈 마커의 전기 수준과 전기 마커 수준의 미리 결정된 값 사이의 비교이다. 어떤 실시태양에서는, 마커 수준의 미리 결정된 값이 비 국소빈혈 상태를 지정한다.
일 실시태양에서는, 국소빈혈 마커가 비결합 또는 수용성의 유리 지방산이다. 바람직한 실시태양에서는,비결합 또는 수용성의 유리 지방산은 지방산에 결합하는 단백질에 의해 검출된다. 바람직한 실시태양에서, 비결합 또는 수용성의 유리 지방산에 결합하는 단백질은 형광이며, 지방산의 결합 유무에 따라 다른 형광을 띤다. 어떤 실시태양에서는, 단백질은 13,000과 16,000Da 사이의 분자량을 가지는 세포내 지방산 결합 단백질(FABP) 패밀리 중 하나이다. 바람직한 실시태양에서는, FABP는 랫(rat)의 소장 FABP이다. 바람직한 실시태양에서, FABP는 위치 27에 아크릴로단(acrylodan)이 공유결합으로 표지된다. 좀 더 바람직한 실시태양에서는, 아크릴로단 라벨이 붙은 FABP는 류신(leucine) 72이 알라닌(alanine)으로 돌연변이된 것이다.
어떤 실시태양에서, 비결합 또는 수용성 유리 지방산 수준이 비 국소빈혈 군집으로부터 결정된 비결합 또는 수용성 유리 지방산 수준의 평균값보다 표준편차 2 단위이상 크면 국소빈혈을 나타낸다. 어떤 실시태양에서, 비결합 또는 수용성 유리 지방산 수준이 비 국소빈혈 군집으로부터 결정된 비결합 또는 수용성 유리 지방산 수준의 평균값보다 약 두 배 이상 크면 국소빈혈을 나타낸다. 어떤 실시태양에서, 비결합 또는 수용성 유리 지방산 수준이 약 5nM보다 크면 국소빈혈을 나타낸다.
대체할 수 있는 실시태양에서, 비결합 또는 수용성의 유리 지방산에 결합하는 단백질은 알부민(albumin)이다. 바람직한 실시태양에서, 알부민은 7-하이드록시코메린(7-hydroxycoumarin) 또는 앤트라닐로일(anthraniloyl)이 공유결합으로 표지된다.
대체할 수 있는 실시태양에서, 국소빈혈 마커는 총 유리 지방산이다. 대체할 수 있는 실시태양에서, 총 유리 지방산 수준이 비 국소빈혈 군집으로부터 결정된 총 유리 지방산 수준의 평균값보다 표준편차 2 단위이상 크면 국소빈혈을 나타낸다. 바람직하게 대체할 수 있는 실시태양에서, 총 유리 지방산 수준이 비 국소빈혈 군집으로부터 결정된 총 유리 지방산 수준의 평균값보다 약 두 배 이상 크면 국소빈혈을 나타낸다. 다른 실시태양에서, 국소빈혈 마커는 알부민에 대한 총 유리 지방산의 비율이다.
어떤 실시태양에서, 알부민에 대한 총 유리 지방산 비율이 비 국소빈혈 군집으로부터 결정된 알부민에 대한 총 유리 지방산 비율의 평균값보다 표준편차 2 단위이상 크면 국소빈혈을 나타낸다. 어떤 실시태양에서, 알부민에 대한 총 유리 지방산 비율이 비 국소빈혈 군집으로부터 결정된 알부민에 대한 총 유리 지방산 비율의 평균값보다 약 두 배 이상 크면 국소빈혈을 나타낸다.
일 실시태양에서, 상기한 바와 같이, 국소빈혈을 감지하는 단계 및 국소빈혈 마커의 수준이 전기 비 국소빈혈 상태의 마커 수준으로의 경향을 보이는 지 결정하는 단계에 의한, 국소빈혈의 치료에 대한 환자의 반응을 결정하는 방법이 기술된다. 일 실시태양에서, 치료는 혈관 형성술(angioplasty) 또는 혈전용해제 투여를 포함하지만 국한되지는 않는다.
일 실시태양에서, 리퍼퓨전 치료를 받은 이후 출혈의 높은 위험수위에 있는 환자를 확인하는 방법은 환자의 체액내 지질 요소의 수준을 측정하는 단계; 환자로부터 측정된 지질 요소의 수준과, 국소빈혈을 가지지 않는 정상 군집내 체액의 지질 요소를 측정하여 결정된 지질 요소의 역치 수준을 비교하는 단계; 역치 수준에 대한 환자로부터의 측정된 지질 요소 수준의 비율을 결정하는 단계; 및, 높은 비율은 높은 위험성을 나타내도록, 리퍼퓨전 치료후 출혈에 대한 상대적 위험과 비율을 상호연관시키는 단계를 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 지질 요소는 비결합 유리 지방산, 총 유리 지방산 및 알부민에 대한 총 유리 지방산의 비율을 포함하는 군으로부터 선택된다.
일 실시태양에서, 국소빈혈 사건이후 3년이내 사망에 대한 높은 위험수위에 있는 환자를 확인하는 방법이 기술되어 있는데, 환자의 체액내 지질 요소의 수준을 측정하는 단계; 환자로부터 측정된 지질 요소의 수준과, 국소빈혈을 가지지 않는 정상 군집내 체액의 지질 요소를 측정하여 결정된 지질 요소의 역치 수준을 비교하는 단계; 역치 수준에 대한 환자로부터의 측정된 지질 요소 수준의 비율을 결정하는 단계; 및, 높은 비율은 높은 위험성을 나타내도록, 국소빈혈 사건후 3년이내 사망에 대한 상대적 위험과 비율을 상호연관시키는 단계를 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 지질 요소는 비결합성 유리 지방산, 총 유리 지방산 및 알부민에 대한 총 유리 지방산의 비율을 포함하는 군으로부터 선택된다.
일 실시태양에서, 출혈의 높은 위험수위에 있는 환자를 확인하는 방법이 기술되어 있는데, 환자의 체액내 지질 요소의 수준을 측정하는 단계; 환자로부터 측정된 지질 요소의 수준과, 국소빈혈을 가지지 않는 정상 군집내 체액의 지질 요소를 측정하여 결정된 지질 요소의 역치 수준을 비교하는 단계; 역치 수준에 대한 환자로부터의 측정된 지질 요소 수준의 비율을 결정하는 단계; 및, 높은 비율은 높은 위험성을 나타내도록, 출혈에 대한 상대적 위험과 비율을 상호연관시키는 단계를 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 지질 요소는 비결합성 유리 자방산, 총 유리 지방산 및 알부민에 대한 총 유리 지방산의 비율을 포함하는 군으로부터 선택된다.
발명의 다른 실시태양에서, 리퍼퓨전 치료를 받은 후의 출혈에 대한 높은 위험수위에 있는 환자를 치료하는 방법이 기술되어 있는데, 상기한 방법을 이용한 리퍼퓨전 치료를 받은 후의 출혈에 대한 높은 위험수위에 있는 환자를 확인하는 단계; 및, 항 국소빈혈 치료로 전기 높은 위험수위 환자를 치료하는 단계를 포함한다. 일 실시태양에서, 항 국소빈혈 치료는 포도당-인슐린-칼륨 화합물 및 알부민 화합물로 구성된 군으로부터 선택된다.
다른 실시태양에서, 국소빈혈 사건 후 3년이내 사망에 대한 높은 위험수위에 있는 환자를 치료하는 방법이 기술되어 있는데, 상기의 방법을 이용한 국소빈혈 사건 후 3년이내 높은 사망 위험수위에 있는 환자를 확인하는 단계; 및, 항 국소빈혈 치료로 전기 높은 위험수위 환자를 치료하는 단계를 포함한다. 일 실시태양에서, 항 국소빈혈 치료는 포도당-인슐린-칼륨 화합물 및 알부민 화합물로 구성된 군으로부터 선택된다.
다른 실시태양에서, 출혈의 높은 위험수위에 있는 환자를 치료하는 단계를 포함하는 방법이 기술되어 있는데, 상기의 방법을 이용한 높은 출혈 위험수위에 있는 환자를 확인하는 단계; 및, 항 국소빈혈 치료로 전기 높은 위험수위 환자를 치료하는 단계를 포함한다. 일 실시태양에서, 항 국소빈혈 치료는 포도당-인슐린-칼륨 화합물 및 알부민 화합물로 구성된 군으로부터 선택된다.
일 실시태양에서, 급성이 아닌 환자의 장기간의 위험을 측정하는 방법이 기술되어 있는데, 환자의 체액내 지질 성분의 수준을 측정하는 단계; 환자로부터 측정된 지질 성분의 수준과, 국소빈혈을 가지지 않는 정상 군집내 체액의 지질 성분을 측정하여 결정된 지질 요소의 역치 수준을 비교하는 단계; 역치 수준에 대한 환자로부터의 측정된 지질 성분 수준의 비율을 결정하는 단계; 및, 높은 비율은 높은 위험성을 나타내도록, 상대적인 사망 위험과 비율을 상호연관시키는 단계를 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 지질 성분은 비결합성의 유리 지방산, 총 유리 지방산 및 알부민에 대한 총 유리 지방산의 비율로 구성된 군으로부터 선택된 것이다.
본 발명의 추가적인 측면, 특징, 장점은 계속되는 바람직한 실시태양의 상세한 설명에 의해 명백해질 것이다.
본 발명은, 국소빈혈 조직에서 기원하지 않지만, 혈액과 다른 체액내의 그 농도가 국소빈혈(ischemia) 상태의 결과에 따라 변화하는 분자 농도를 측정함으로 해서, 심근 및 대뇌 국소빈혈을 포함하지만 거기에만 국한되지 않는, 국소빈혈의 진단과 모니터링에 관한 것이다.
이하에서는, 본 발명의 이러한 특성과 다른 특성들을 이들에 의하여 발명의 범주가 제한되지 않는 바람직한 실시태양의 도면에 의거하여 설명한다.
도 1은 AMI를 가진 환자의 심근경색 Ⅱ(TIMI Ⅱ) 연구에서 혈전용해 중 수득한 혈액 표본에서의 비결합성 유리 지방산을 보여준다. 연구에 동원된 환자들은 증상 개시 4시간내에 응급센터에 참석하였다. 히스토그램 기호는, 처음 250명의 환자 각각의 시간 0(응급센터 입원 시간), 50분, 5시간 및 8시간 때의 ADIFAB로 측정된 혈액채취물내 [FFAu] 측정의 결과들을 보여준다.
도 2는 AMI를 가진 환자의 TIMI Ⅱ 연구의 FFAu결과들을 보여준다. 히스토그램 기호는 ADIFAB2로 측정된 다음 250명 환자들의 결과를 보여준다. 결과들은 처음 250 환자들의 도 1과 실질적으로 동일하다.
도 3은 시간 0(입원 시간)(닫힌 네모, - ■-) 및 4시간(닫힌 세모, - ▲-) 때 TIMI Ⅱ 환자의 크레아틴 키나아제(CK) 수준을 보여준다. 값은 환자집단 1 및 2에 해당하는 환자를 위한 TIMI 조사자에 의해 결정되었다. 매일 측정과 각 연구위치를 위한 정상(normal)의 상한선은 결정되었다(열린 네모, - □-).
도 4는 TIMI Ⅱ 환자의 입원때의 [FFAu]와 함께 증가하는 사망률이 보여준다. 500명의 환자집단 중 약 400명이 입원시 혈액채취를 하였다. FFAu수준은 분류되었고 각 사분위수(quartiles)의 사망자가 결정되었다. 결과들은 가장 낮은 사분위수부터 가장 높은 사분위수까지 2배 이상의 양의 상관관계를 도출한다(p<0.042). 각 사분위수의 [FFAu] 중간값은 막대로 도시되어 있다.
도 5는 입원시 [FFAu]와 TIMI Ⅱ 환자의 심각한 출혈사건사이의 상관관계를 보여준다. FFAu수준의 사분위수당 심각한 출혈을 일으킨 횟수가 표시되었다. 막대의 숫자는 nM 단위의 [FFAu] 중간값이다. 결과는 p < 0.01의 가장 낮은 사분위수부터 가장 높은 사분위수까지 위험의 3배 이상 증가를 표시한다.
설명된 실시태양이 본 발명의 바람직한 실시태양을 나타내는 반면, 발명의 범주를 벗어나지 않고 당업계에 숙련된 기술을 가진자에게 변용이 있을 것이라고 이해되어야 한다. 그러므로, 발명의 범주는 부가된 청구항에 의해 독립적으로 결정될 것이다.
본 발명은, 국소빈혈의 진단과 모니터링에 있어, 국소빈혈 조직에서 유래되지 않은 혈액 및/또는 다른 체액내의 분자 농도를 측정하는 사용법을 설명한다. 이러한 분자들을 국소빈혈 마커라 불리운다. 이러한 국소진단 마커의 농도 변화는, 비국소빈혈 상태에 상대적으로, 국소빈혈의 어떤 상태를 지시한다. 마커는 심지어 일부분이 유래되었어도, 그 부분이 표본에 나타난 마커의 작은 부분만 나타내는 한 국소빈혈 조직에서 유래되지 않았다고 간주된다, 즉 20%, 10%, 5%, 2%, 1% 또는 더 적다.
일 실시태양에서, 국소빈혈 마커는 지방산과 같은 지질요소들이다. 전체 지방산은 여기에 인용문헌으로 통합된 미국 특허 제 4,071,413호, 제 5,512,429호, 제 5,449,607호 및 제 4,369,250호 등에 개시된 당 기술분야에 잘 알려져 있는 방법에 의해서 결정될 수 있다. 이러한 방법들에 의해 수득한 전체 지방산의 수준은, 개체의 국소빈혈 상태를 감지하기 위해, 정상적인 개체로부터 수득한 수준과 비교될 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 알부민에 대한 전체 지방산의 비율이 결정되고 정상적 군집과 비교된다.
다른 실시태양에서, 비결합 유리 지방산의 수준은 하기 기술된 바와 같이 체액에서 측정된다. 비결합 유리 지방산(FFAu)은 수용액상(aqueous phase)에 용해될 수 있는 유리 지방산의 부분이다. 대부분의 체액에서 유리 지방산(FFA)은 거의 알부민과 같은 단백질에 결합하지만 중요한 소수는 비결합성이며, 수용상에 용해 가능하다. FFAu는 수용성 유리 지방산으로 간주된다.
체액은 뇌척수액, 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 타액, 임파액, 위액, 세포간액 또는 담즙을 포함한 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 검사용 표본에 사용되는 체액은 혈액에서 수득한 것이다.
일 실시태양에서, 비정상 군집에 상대적인, 체액의 비결합성 유리 지방산 수준의 표시를 제공하는 어떤 동정법도 국소빈혈 상태를 감지하는데 사용될 수 있다. 바람직하게, 역치값은 국소빈혈을 가지지 않는 정상적인 군집에서 결정된다. 일 실시태양에서, 역치값은 국소빈혈 상태를 가지지 않는 대조구 군집의 체액내 FFAu농도보다 매우 높은 체액의 FFAu농도이다. 일 실시태양에서, FFAu의 역치값은 비 국소빈혈 대조구 군집으로부터 결정된 수준의 평균값보다 표준편차 2 단위이상 큰 농도이다. 다른 실시태양에서, FFAu의 역치값은 적어도 약 5nM이다. 다른 실시태양에서, FFAu의 역치값은 비국소빈혈 대조구 군집으로부터 결정된 평균값보다 약 두 배 이상 큰 농도이다.
본 방법은 선택된 환자 군집에 적용될 때 특별히 가치가 있다. 그러므로, 일 실시태양에서, 방법은, 당뇨병 환자, 또는 외과수술환자, 또는 가계 또는 생활양식 위험요소를 가진 환자와 같은, 국소빈혈 위험에 있는 개체에서 얻은 표본에 적용된다. 다른 실시태양에서, 방법은 국소빈혈에 해당하는 증상을 나타내거나 국소빈혈을 가졌다고 의심되는 환자에 적용된다. 선택될 수 있는 특정 환자 하위군집은 심장빈혈, 뇌빈혈, 신장빈혈, 사지빈혈 또는 다른 임상학적으로 중요한 빈혈의 증상을 가지는 환자들을 포함한다. 방법은 한 특정한 국소빈혈 형태에 부합되거나 그렇지 않은 환자에 선택적으로 적용될 수 있다. 비제한적 예시는 심장빈혈이 아닌 국소빈혈 증상, 또는 뇌빈혈이 아닌 증상, 또는 주변부 또는 당뇨 연관 국소빈혈이 아닌 증상을 가진 환자의 선택일 것이다. 본 방법은, 적당한 환자 군집을 선택함으로써, 심근경색이 없는 심장 환자의 국소빈혈을 감지하는데 유사하게 사용될 수 있다. 본 발명의 어떤 방법의 일 실시태양에서도, 환자는 포유동물이고, 특정 실시태양에서 환자는 인간이다.
발명의 더 추가적인 실시태양에서, 본 발명의 방법은 치료단계를 추가로 포함한다. 그러므로, 환자는, 논의된 마커 중 하나의 증가의 표시에 의해서, 국소빈혈 상태에 대해 첫번째로 검사된다. 마커의 증가된 수준을 가지는 환자들은 이후, 리퍼퓨전 치료, 항 혈전용해 치료, 맥관형성 치료, 외과적 치료 또는 유사한 치료같은 적합한 항 국소빈혈 치료에 의해 치료된다. 예를 들어, 환자들은 국소빈혈 사건이나 증상의 10, 7, 5, 또는 3 시간내에 유리하게 검사될 수 있고, 검사후 3, 2, 또는 바람직하게 1시간내에 항 국소빈혈 치료를 받을 수 있다.
일 실시태양에서, 본 발명은, 형광 표지된 FABP에의 FFAu결합에 의한 형광의 변화를 양적으로 감지하여, 국소빈혈 상태에 연관된 체액 표본의 비결합 유리 지방산(FFAu)의 증가된 양을 측정하기 위해 형광 표지된 지방산 결합 단백질(FABP)을 사용한다. 혈청에서, 유리 지방산(FFA)은 대부분 알부민에 결합하지만 중대한 소수는 비결합성(FFAu) 및 수용액상의 수용성이다. 본 발명은, 인용문헌으로 통합된 미국 특허 제 5,470,714호에 구체적으로 기술된 방법을 이용한다. 다양한 FABP 및 형광 라벨은 혈액과 같은 체액의 FFAu의 수준을 감지하는 데 사용될 수 있다. 이것들은 반드시 국한되진 않지만, 랫 소장 FABP, 인간 지방세포 FABP(A-FABP) 및 랫 심장 FABP(H-FABP) 등을 포함한다. 하나 또는 그 이상의 아미노산이 변형된(삽입, 결실 및/또는 치환), 이러한 FABP의 위치특이적 돌연변이도 방법에 유용하고, 예를 들어, I-FABP의 위치 27, 81, 82, 84의 Cys 치환, I-FABP의 위치 72의 Ala의 치환 및 H-FABP 27 위치의 Lys 치환 등을 포함한다. 반드시 국한되진 않지만 아크릴로단(acrylodan), 댄질 아지리딘(danzyl aziridine), 4-[N-[(2-이오도아세톡시)에틸]-N-메틸아미노]-7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸 에스터(4-[N-[(2-iodoacetoxy)ethyl]-N-methylamino]-7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazole ester: IANBDE) 및 4-[N-[(2-이오도아세톡시)에틸]-N-메틸아미노]-7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸(4-[N-[(2-iodoacetoxy)ethyl]-N-methylamino]-7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazole: IANBDA) 등을 포함한 다양한 기존의 라벨을 이용하여, FABP 분자들은 형광 라벨링될 수 있다. 유리 지방산의 결합에 따라 측정 가능한 차이가 있는 이상, 어떤 라벨도 발명의 실용에 사용될 수 있다. 예를 들어, 파장, 신호세기, 또는 분극화, 또는 수명이 모니터링 될 수 있다. 사용될 수 있는 추가적인 라벨의 예시는, 반드시 국한되지는 않지만, 흡수 또는 광학적 활성 및 전자 스핀 공명에 의해 감지되는 스핀 라벨의 변화를 내는 발색단을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 형광 표지된 FABP는 아크릴로단에서 유래된 재조합 랫 소장 지방산 결합 단백질이다(ADIFAB라 일컬음). 아클리로단에 의한 유도체 형성은 종래의 구체적으로 기술된 방법에 의해 수행되고(참조: 미국 특허 제 5,470,714호 및 Richieri, G.V, et al., J. Biol. Chem.,(1992) 276:23495-23501), ADIFAB는 상업적으로 유용하다(FFA 사이언스 LLC, 샌디에이고, 캘리포니아주). FFAu의 농도는 형광 표지된 FABP에 FFAu가 결합함으로서 결정될 수 있다. 아무런 FFA도 형광 표지된 FABP에 결합하지 않을 때, 다른 형광이 나타난다. FFAu의 농도는 형광 차이에서 결정될 수 있다. 형광 표지된 FABP에 의해 방출된 파장은 라벨과 사용된 단백질에 따라 다르다. 일 실시태양에서, 라벨은 아크릴로단이고 단백질은 I-FABP이거나 위치 72에서 Ala가 Leu로 치환된 I-FABP 이다. 이러한 종류들은 각각 ADIFAB 및 ADIFAB2으로 블리운다.
요약하면, ADIFAB2는 하기와 같이 수득된다. 첫째, Ala72돌연변이와 적합한상보적 말단을 포함하는 제한절편은, 위치특이적 톨연변이에 의해 도입된 I-FABP cDNA 서열의 211 위치에 있는SalI와 291위치의PmeI를 포함하는 야생형 제한절편에 치환된다(참조: Alpers, et al., Proc. Natl. Acad. Sci, U.S.A., 1984, 81:313-317). 돌연변이된 제한 절편은 원하는 서열을 포함한, 부분적으로 상보적인 합성 올리고뉴클레오티드의 가열냉각, DNA 중합효소인 클레노우(Klenow) 절편에 의한 단일가닥 부분의 "채워넣기(filling in)" 및,SalI 및PmeI에 의해서 절단되어 적당한 말단을 만드는 과정에 의해 제작된다. I-FABP cDNA를 치환한 Ala72는 pET11 벡터에 삽입되어 BL21(DE3) 세포주에서 발현된다. 돌연변이 I-FABP는 필수적으로 Lowe, et al.에 의한 방법으로 정제되고(참조: Lowe, et al., J. Biol. Chem., 1987, 262:5931-5937), 대장균 배양후, 리터당 약 100mg의 정제된 단백질을 생산한다. 아크릴로단 유도과정은 ADIFAB를 위해 종래에 기술된 식으로 수행된다(참조: 미국 특허 제 5,470,714호). 리피덱스-5000 크로마토그래피가 유리 아크릴로단을 제거하기 위해 사용되었다.
ADIFAB2의 결합 친화력은 ADIFAB보다 약 10배 정도 큰것으로 알려져 왔다. 이러한 형광 라벨링된 FABP로부터 방출된 파장은 약 420에서 470nm이다. 형광 라벨링된 FABP에 결합한 FFA를 위한 방출 파장은 약 495에서 580nm이다. 당업계의 숙련된 기술자라면 개시된 동정법에서 다른 형광 표지된표지된쉽게 대체할 수 있을 것이라 이해될 것이다.
수용액 표본에서의 FFAu결정을 위한 동정법은, 결합한 FFA가 없을 때의 첫번째 파장으로부터, 결합이 있을 때의 두번째 파장까지 FABP 형광 이동(shift)의 강도를 측정하고, FFAu의 농도는 그후 두 형광파장 강도의 비율(R 값)로부터 결정된다(참조: 미국 특허 제 5,470,714호; Richieri, et al., J. Lipid Research, 1995, 36:229-240). 요약하면, 비율은 다음의 식을 이용해 계신된다:
ㅣ(1) 및 ㅣ(1)blank는 ADIFAB, AIFAB2 및 이 두 개를 제외한 모든 제제를 포함한 블랭크(blank) 표본을 위해 각각 파장 "1"에서 측정된 형광강도이고, ㅣ(2) 및 ㅣ(2)blank 는 해당되는 파장 "2"의 형광강도이다. ADIFAB에서, 파장 "1"은 바람직하게(절대적은 아님) 495nm와 515nm 범위이고 파장 "2"는 422nm와 442nm범위이다. 형광강도의 측정은 표준 기술을 이용해 얻을 수 있다. 당업계의 숙련된 기술자들에게 인지되었듯이, 적합한 환경에서, 상기 식의 ㅣblank 강도는 무시될 수 있다.
정상적 개체의 양보다 높이 올라간 체액 FFAu의 양적인 수준측정은 국소빈혈 상태를 진단하는데 이용될 수 있다. 일 실시태양에서, 국소빈혈 상태는 국소빈혈 상태를 가지지 않는 대조구 군집의 비결합 또는 수용성의 유리 지방산의 농도보다 매우 높은 체액 표본의 비결합 또는 수용성의 유리 지방산에 의해 지시된다. 일 실시태양에서, 국소빈혈 상태는 표준편차 2정도로 체액 표본의 정상적인 수준의 비결합 또는 수용성의 유리 지방산의 평균을 초과하는 비결합 또는 수용성의 유리 지방산의 수준에 의해 감지된다. 다른 실시태양에서, 양 5nm 보다 많은 비결합 또는 수용성의 유리 지방산이 국소빈혈 상태를 지시한다. 다른 실시태양에서, 비국소빈혈 상태 군집의 체액에서 결정된 비결합 또는 수용성의 유리 지방산의 평균보다 약 두배 큰 체액의 비결합 또는 수용성의 유리 지방산 수준이 국소빈혈 상태를 지시한다. 의미있게 높은 체액의 비결합 또는 수용성의 유리 지방산의 증가된 수준도 감지될 수 있다.
본 발명의 진단 방법은 국소빈혈 상태를 경험한 환자가, 건강한 개체와 비교하여, 혈액과 같은 체액의 FFAu같은 증가된 지질 수준을 가졌었다는 발견에 근거한다. 진단 방법이 언제라도 수행될 수 있는 반면, 바람직하게, 검사는 국소빈혈 사건의 24시간내에 수행된다. 좀 더 바람직하게, 검사는 국소빈혈 사건 10시간내에 수행된다. 가장 바람직하게, 검사는 치료가 시작될 수 있도록 국소빈혈 사건 3시간내에 수행된다. 심장 빈혈과 같은 국소빈혈 상태를 위한 많은 치료는 효과적이기 위해 빠르게(시간내로) 시행되어야 한다. 올바른 진단없는 치료는 환자를 가장 악화시킬 수 있다. 국소빈혈 상태의 신속한 진단 능력은 여기 기술된 발명의 장점이다.
요약하여, FFAu의 동정과 결정은 하기와 같이 수행된다. 혈액 표본은 완충액(20mM N-2-hydroxyethyl-piperazine-N'-2-ethane sulfonic acid(HEPES), 150mM NaCl, 5mM KCl alc 1mM Na2HPO4, pH 7.4)에서 100배 희석되어, 약 6 μM 의 혈청 알부민 농도를 생성한다. 유리 지방산이 없는 알부민에 ADIFAB 또는 ADIFAB2를 첨가한 용액은 음성 대조구이다. 각 수용체에, 두개의 혈청 분배주(aliquot)가 준비되었다: 하나는 1% 혈청의 "배경(background)"이거나 "블랭크(blank)"이고 하나는 1% 혈청에 ADIFAB 또는 ADIFAB2"의 실험적(experimental)"표본이다. 음성 대조구, 블랭크와 실험적 표본은 22℃ 또는 37℃에서 측정된다.
각 표본에서, 강도 쌍(pair)의 다중 측정은 ADIFAB를 위해 약 432nm 및 505nm, ADIFAB2를 위해 450nm 및 550nm, 그리고 R 값은 블랭크 표본 강도의 공제(subtraction)이후에 결정된다. 적어도 두 개의 분리된 측정이 각 혈청 표본에 각각 다른 날에 수행되고, FFAu농도의 표준편차가 결정된다. 측정 값사이의 차이 가능성을 결정하기 위해, 수단의 차이는 p값이 0.05보다 작으면 유효하다고 여겨지는 스튜던트의 t 경사를 통해 평가된다.
국소빈혈을 감지하는 본 방법은 국소빈혈 마커의 수준을 줄이기 위한 수단을 강구하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 여기 개시된 국소빈혈을 감지하여 국소빈혈 치료뒤의 환자의 예후(prognosis)를 결정하는 방법 및 국소빈혈 마커의 수준이 비국소빈혈 상태의 마커 수준으로 경향을 보이는가 결정하는 방법 역시 본 개시에 포함된다. 개시된 방법은 또한, 이러한 마커의 증가가 내재한 병적 상태를 반영하고/반영하거나 국소빈혈 마커가 그 자체로 해롭기 때문에, 증가된 국소빈혈 마커에 연관된 위험의 측정을 포함한다.
실시예 1: 다른 형태의 심근 국소빈혈로 응급센터에 입원한 환자의 트로포닌 I 전에 FFA u 가 증가한다.
광범위한 "자연적" 국소빈혈 상해로 고생하는 환자의 비결합성의 유리 지방산의 농도[FFAu]를 결정하기 위해, 우리는 헤네핀(Hennepin) 카운티(county) 의학센터(미네아폴리스)의 응급실에 입원한 환자의 (FFAu) 수준을 측정했다. 표본이 입원시와 몇시간 후 29명의 환자에게서 수득되었다. 이러한 환자들 각각은, 주로 ST 세그멘트 변화에 의해, 심장빈혈로 진단되었다. 이러한 환자들의 진단은 포함했다: 급성 심근경색(AMI), 울혈성(congestive) 심장이상, 불안정 협심증, 심장좌상, 심장절개, 고혈압 및 코카인에 유도된 국소빈혈. FFAu는 심장빈혈로 진단된 모든 환자에서, 정상보다 평균적으로 20배 더 높게, 상당히 증가되어 있었다(또한, 본 연구는 평균 FFAu의 수준이 3nm인 48명의 "정상의" 환자들을 포함했다).
(FFAu) 수준은 본연구(표)의 9명의 AMI 환자들을 포함한 모든 환자의 초기(응급실에 입원) 채취본에서 높아졌다. 반면에, 이 9명 중 7명의 AMI 환자들은 입원시 심장 마커 트로포닌 I의 증가를 보이지 않았다. 더욱이, 대부분의 비 AMI 환자들은 증가된 트로포닌 I 수준을 보이지 않았는데, 이것은 세포괴사 이전의 [FFAu]가 국소빈혈의 마커가 되다는 것과 일치한다.
또 다른 주목할 만한 이러한 결과의 특징은 리퍼퓨전 치료없이도, 초기 국소빈혈 사건이후 오랜 기간동안 FFAu수준이 높게 유지된다는 것이다(표). 그러므로, FFAu는 국소빈혈 사건에 빠르게 반응하지만, 기저상태로 느리게 되돌아오기 때문에, 독특하게 넓은 진단창을 제공한다.
이러한 결과들은 FFAu동정법의 잠재력을 나타낸다; 현재 심장 마커가 병을 가르키기 전에, 심각한 국소빈혈 사건은 시간에서 날까지 감지될 수 있어, 조기 치료의 가능성을 높이고 환자 결과의 중요한 개선을 가져올 수 있다.
실시예 2. 심근경색 II(TIMI-II)의 혈전용해 시도의 결과는 FFA u 측정을 이용한 AMI의 감지를 위한 높은 민감성과 특이성을 나타낸다.
급성 심근경색의 반응하는 FFAu에 관한 좀 더 자세한 정보를 얻기위해, 우리는 TIMI II 시도(TIMI 연구 집단, 뉴잉글랜드 Journal of Medicine(1989) vol. 320:618-625)의 혈액 견본을 이용했다. 이 견본들은 국립 심장 폐 혈액 연구소(National Heart Lung Blood Institute)에 의해 유지되어 왔고 국소빈혈의 FFAu수준 연구자에게 유용해졌다. 환자들은, 그들이 초기증상의 4시간 이내에 흉부 고통으로 응급실에 입원했고 ST 세그멘트 증가를 보였다면, TIMI II 시도에 등록되었다. 등록한지 10분 이내에 모든 환자들은 6시간 이상 정맥내로 100mg(치료된 3262명 환자의 90.5%) 또는 150mg(치료된 3262명 환자의 9.5%)의 t-PA 시작으로 치료되었다. 혈액 표본은 입원(t-PA 바로전)과 함께, t-PA의 50분후, 및 t-PA 치료시작 이후 5시간 및 8시간 후에 채혈되었다. 4개의 표본셋은 약 2,500명의 환자 각각 -70℃에서 보관되었다. 각각의 환자들에게, TIMI 연구자는 약 825개의 임상학적, 물리적 및 화학적 소견이 기록되었다.
처음 500명의 환자를 위한 결과는 급성 심근경색과 FFAu수준사이의 중요한 상관관계를 제공한다. [표본들은 1000 표본(250명 환자)의 각각으로 부터 채취하였다. 도 1과 도 2는 각각 실험군 1 및 2의 결과를 보여준다.](참조: Kleinfeld, et al., J. Am. Coll. Cardiol., 2002, 39:312A).
입원시 평균 FFAu(ADIFAB2) 값은, 정상값(2.8 ±0.7nM)의 14 표준편차 이상인 13nM 이었다. 이 결과는 국소빈혈 사건의 초기에 (FFAu)가 높이 증가했다는 것을 확실히 밝혀준다. 5nM의 컷오프(cutoff)를 이용하여, AMI의 감지를 위한 예견된 민감도는 입원시 FFAu를 이용하여 91%이었다(입원시 및 50분의 FFAu사용은 민감도를 >98% 까지 증가시킨다). 결과는 환자의 >98%가, 처음 두 시점을 포함할 때 정상 수준이상 >3 표준편차의 FFAu수준을 가진다는 것을 보여준다(단지 1st 시점에서 >91%).
동시에, 0시간의 CK 값은 일반적으로 정상의 상한선보다 적다. 입원시 CK 수준은 환자의 19%이하로 상승하였고 심지어 이 환자들내에서, 검사한 정상 상한선의 <50%이상의 평균으로 증가는 완만하였다. 대부분의 환자에서 입원이후 4시간까지 CK 수준은 실질적으로 증가하지 않았다.
50분 때, 평균 FFAu(22nM)는 이미 증가한 초기값보다 실질적으로 높다. 이 표본들은, t-PA 투여후 약 50분에 수득되었다(도 1 및 2). 의미있게 더 높은 FFAu수준은 리퍼퓨전 효과와 증가하는 시간에 따른 [FFAu]에서 국소빈혈 매개된 증가를반영할 수 있다. 어떤 사건이 있더라도, 5 및 8 시간에 리퍼퓨전 이후 중대한 감소가 일어나기 때문에, FFAu수준이 t-PA 처리에 의하여 이 시간경로는 갑작스럽게 바뀔 수 있어 보인다; 8시간때의 평균값은 입원시 FFAu수준보다 중대하게(p<0.05) 낮다. 헤네핀 연구의 리퍼퓨전 치료를 받지 않은 AMI 환자는 24시간 이상 증가되어 있는 [FFAu]를 밝혀주기 때문에 양위상(biphasic) 응답은 상호연관 되어있는 것처럼 보인다. 리퍼퓨전에 반응하여 FFAu이 증가한 후 5시간내에 감소할 수 있다는 이러한 발견은 FFAu수준이 리퍼퓨전 치료의 성공을 평가하는데 이용될 수 있다는 것을 나타낸다.
이 환자들의 [FFAu] 반응은 내재적이고 질병 특징에 무관한 것으로 보인다. 도 1및 도 2는 4개의 다른 표본 시간의 [FFAu] 분포의 측정이 250명의 환자들의 3개의 다른 셋의 분포를 위한 가상적으로 동일한 매개변수를 생성한다라는 것을 보여준다; 출하 1 및 2의 표본은 다른 환자들의 두 셋을 위한 것이다. 더욱이, 확인된 MI를 가진 거의 모든 환자들은 [FFAu](50분)>[FFAu](입원)을 나타내는 반면, 대략 확인된 MI가 없는 3.3%의 환자들은 [FFAu](50분) ≤[FFAu](입원)을 나타낸다.
실시예 3. 입원시 TIMI-II 시도 표본의 높은 수준의 [FFA u ]는 입원후 3년의 높은 사망률과 상호연관된다.
입원시의 [FFAu] 값은 사망률의 2배 이상 증가와 상호연관되어 있다. 입원시 채혈된 견본(500명의 환자 중 약 400명)을 위한 [FFAu] 값은 분류되고 ㅅ분위수로 구분되어 진다. 입원후 약 3년까지의 어던 이유에 의한 사망의 수는 각 사분위수에 대해 측정되었다. 사망의 주요한 원인은 심맥관(cardiovascular) 질병이었다. 결과는 p 값<0.025를 가진 최저로부터 최고 사분위수까지 사망률의 2배 이상 증가를 보여주었다(도 4). 반대로, 이 환자들의 대부분(80%) 입원시점의 심장 마커, CK는 정상이었다(도 3). 더욱이, [FFAu] 값은 입원시 나이, 성, 인종, 무게, 다른 질병, 약물상태 또는 심장수축 혈압 등과 상호연관되지 않았다. 이러한 결과들은 그들의 다른 진단 특성에 추가로, 입원시 측정된 FFAu수준은, 사망위험에 따른 환자를 계층화하는데 사용될 수 있다라는 것을 나타낸다(Kleinfeld, et al., J. Am. Coll. Cardiol., 2002, 39:312A).
실시예 4. 입원시 TIMI-II 시도 표본의 높은 수준의 [FFA u ]는 t-PA 치료후 심각한 출혈의 증가된 속도와 상호연관된다.
또한, 입원시 [FFAu]는 t-PA 치료후의 심각한 츨혈 사건의 증가된 속도를 예견한다. 심각한 출혈사건을 경험한 환자의 수는 각 사분위수에 대해 결정되었다(도 5). 결과는 최저에서 입원시(t-PA 투여의 시작전에) p<0.01의 [FFAu] 값이 분포된 최고 사분위수의 심각한 출혈사건의 속도의 3배 이상의 증가를 보여준다. 이러한 결과들에 의해 높여진 가능성 중 하나는 t-PA에 의해 매개된 출혈 속도가, FFAu수준이 낮춰지면, 감소된다는 것이다.
비록, 도 4 및 5의 결과들은 증가된 FFAu수준이 직접적 및 독립적으로, 증가된 사망률 및 출혈의 속도에 적용되는지 나타내지 않지만, 많은 시험관내 업적은 증가된 FFA가 많은 세포 기능의 잠재적인 교란자(perturber)이다하는 것을 나타낸다. 추가로, FFA의 직접적 역할에 대한 임상 증거는, 그들의 심맥관 질병에 대한 비주기성 역할 및 잠재적 역할을 지적하는 많은 연구에 의해 강하게 제기된다. 우리의 TIMI II 시도로부터의 결과는 반대되는 결론의 강한 독립 요소이다. 그러므로, [FFAu]는 이 환자 군집의 인구통계를 단순히 반영하지 않는다; 나이, 성, 인종, 또는 무게에 대해 관찰된 것과 아무런 상호연관이 없다. 더욱이, 입원시 [FFAu]와 사망률 및 출혈 사건의 상관관계는 독립적으로 보인다; 비록, 사망률은 심각한 출혈 사건을 경험한 환자들(모드 환자들의 22% 대 11%)에게 높지만, 오직 15% 의 사망이 출혈 때문이다.
실시예 4. 국소빈혈 환자들의 FFA의 혈액 수준은 국소빈혈 조직에서 유래되지 않는다.
사람의 대뇌 및 심근빈혈은 정상보다 7배 이상인 증가된 혈장 FFA 수준을 초래한다(Kleinfeld, et al., Amber. J. Cardiol., 1996, 78:1350-1354; Kurien, et al., The Lancet, 1966, 16:122-127; Oliver, et al., The Lancet, 1994, 343:155-158). FFA가 적어도 분리된 장기의 국소빈혈 세포내에 축적되는 것이 잘 알려져 있다(Bazan, et al., Biochem. Biophys Acta, 1970, 218:1-10; Van der Vusse, et al., prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids, 1997, 57:85-93). 그렇지만, 국소빈혈 조직에 의한 이러한 FFA의 생성은 국소빈혈에서 관찰된 혈장 FFA의 증가를 설명할 수 없다. 국소빈혈 조직에 의해 생성된 FFA의 양이, 전체 장기의 총 국소빈혈 상태하에도, 국소빈혈 환자에서 관찰되는 7배 이상 증가는 말할 것도 없이, 정상적인 혈장 FFA 수준에 비교하여 미미하기 때문에 이것이 뒤따른다. 예를 들어, 정상적인 상태에서, 혈장 FFA는 2분마다 소멸하는데, 그러한 속도로, 약 500μM의 정상적인 혈장 총 [FFA]는 약 0.2g의 FFA/분으로 번역된다. 국소빈혈 조직에서 생산된 FFA는 인지질에서 유도되는데(Bazan, et al., Biochem. Biophys Acta, 1970, 218:1-10; Goto, et al., Stroke, 1988, 19:728-735; Joens et al., Am. J. Pathol., 1989, 135:541-556), 일반적 세포(비지방 세포)의 중량의 1% 미만을 포함한다. 그러므로, 총 FFA는 정상적 수준보다 2에서 7배 많은 국소빈혈상태에서, 조직의 20g/분 이상은 관찰된 FFA의 수준을 유지하기 위해 사용될 수 있다. 이것은 수명과 적합하지 않고 혈장 FFA의 증가가 비국소빈혈 조직에서 유래된다는 것을 가리킨다.
총 대뇌빈혈의 특수 실시예에서, 30분 이상 랫 뇌에 축적된 총 FFA 양은 약 0.8㎛ole이다(Ikeda, et al., J. Neurochem., 1986, 47:123-132). 300g 랫의 총 혈장 FFA의 양은 5㎛ole 이상 크다(>500μM FFA의 10ml 혈장). 되돌릴수 있는 중뇌 동맥빈혈의 랫 모델에서, 총 혈장 FFA는 2배 정도 증가하고, 따라서, 5㎛ole의 FFA가 혈장에 2분마다 추가되거나 30분후에 75㎛ole가 추가된다. 그러므로, 총 국소빈혈의 30분후에 생성된 0.8㎛ole은, 혈장 수준을 국소빈혈에서 관찰된 수준으로 올리는데 필요한 FFA 의 양과 비교하여 무시할 수 있다. 뇌빈혈에서 관찰된 큰 사분위수를 생성하는 충분한 능력을 가진 가장 그럴듯한 원료는 지방 세포이다. 우리는 뇌빈혈 수 분내에, 지방세로 지방분해의 잠재적인 활성인자인 TNFα의 혈장수준의 증가가 관찰되는 것을 발견했고(Ryden, et al., J. Biol. Chem., 2002, 277:1085-1091) 이 TNFα는 혈장에서의 FFAu증가와 상관이 잘 되어 있다라는 것을 발견했다.
본 발명의 정신에서벗어나지 않게 다양한 변용이 만들어질 수 있다라는 것이 당업계 숙련된 자에게 이해될 것이다. 그러므로, 본 발명의 형태는 단지 설명을 위한 것이고 본 발명의 범주를 제한하도록 의도되지 않았다는 것이 확실히 이해되어야 한다.

Claims (61)

  1. (a) 포유동물 체액으로부터 나온 테스트용 표본에서 국소빈혈 마커(marker)의 수준을 측정하는 단계; 및,
    (b) 전기 테스트용 표본에서 측정된 전기 국소빈혈 마커의 수준이 전기 포유동물의 국소빈혈과 상관이 있는지를 결정하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 국소빈혈을 나타내는 상태의 감지방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    포유동물은 사람인 것을 특징으로 하는
    포유동물에서 국소빈혈을 나타내는 상태의 감지방법.
  3. 제 2항에 있어서,
    체액은 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 담즙, 위액, 뇌척수액, 임파액, 세포
    간액 및 소변으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는
    포유동물에서 국소빈혈을 나타내는 상태의 감지방법.
  4. 제 3항에 있어서,
    체액은 혈액인 것을 특징으로 하는
    포유동물에서 국소빈혈을 나타내는 상태의 감지방법.
  5. 제 3항에 있어서,
    국소빈혈 마커는 지질인 것을 특징으로 하는
    포유동물에서 국소빈혈을 나타내는 상태의 감지방법.
  6. 제 5항에 있어서,
    지질은 지방산인 것을 특징으로 하는
    포유동물에서 국소빈혈을 나타내는 상태의 감지방법.
  7. 제 5항에 있어서,
    지질은 스핑고리피드(sphingolipid), 리소리피드(lysolipid),
    당지질(glycolipid), 스테로이드(steroid) 및
    아이코사노이드(eicosanoid)로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는
    포유동물에서 국소빈혈을 나타내는 상태의 감지방법.
  8. 제 5항에 있어서,
    지질은 스핑고신(sphingosine), 세라미드(ceramide), 스핑고신-1-포스
    페이트(sphingosine-1-phosphate),
    스핑고실포스포릴콜린(sphingosylphosphorylcholine) 및 디하이드로스
    핑고신(dihydrosphingosine)등으로 구성된 군으로부터 선택된 것을
    특징으로 하는
    포유동물에서 국소빈혈을 나타내는 상태의 감지방법.
  9. 제 1항에 있어서,
    심장은 국소빈혈 상태에 있는 것을 특징으로 하는
    포유동물에서 국소빈혈을 나타내는 상태의 감지방법.
  10. 제 1항에 있어서,
    뇌는 국소빈혈 상태에 있는 것을 특징으로 하는
    포유동물에서 국소빈혈을 나타내는 상태의 감지방법.
  11. 제 1항에 있어서,
    신장은 국소빈혈 상태에 있는 것을 특징으로 하는
    포유동물에서 국소빈혈을 나타내는 상태의 감지방법.
  12. 제 1항에 있어서,
    사지(limb)는 국소빈혈 상태에 있는 것을 특징으로 하는
    포유동물에서 국소빈혈을 나타내는 상태의 감지방법.
  13. 제 1항에 있어서,
    측정된 국소빈혈 마커는 수용성 완충액에 가용인 것을 특징으로 하는
    포유동물에서 국소빈혈을 나타내는 상태의 감지방법.
  14. 제 1항에 있어서,
    측정된 국소빈혈 마커는 수용완충액에 불용성인 것을 특징으로 하는
    포유동물에서 국소빈혈을 나타내는 상태의 감지방법.
  15. 제 1항에 있어서,
    국소빈혈 마커는 UV/VIS, 적외선, 극초단파, 라디오파, 흡수 또는
    방출 분광기(spectroscope)등에 의해 감지되는 것을 특징으로 하는
    포유동물에서 국소빈혈을 나타내는 상태의 감지방법.
  16. 제 1항에 있어서,
    국소빈혈 마커는 크로마토그래피 절차에 의해 감지되는 것을 특징으로
    하는
    포유동물에서 국소빈혈을 나타내는 상태의 감지방법.
  17. 제 16항에 있어서,
    크로마토그래피 절차는 HPLC, 저압(low pressure) 크로마토그래피, 중
    압(medium pressure) 크로마토그래피 및 기체 크로마토그래피등으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는
    포유동물에서 국소빈혈을 나타내는 상태의 감지방법.
  18. 제 1항에 있어서,
    국소빈혈 마커는 스핀 라벨(spin label)을 이용한 전자 스핀
    공명(electron spin resonance)에 의해 감지되는 것을 특징으로 하는
    포유동물에서 국소빈혈을 나타내는 상태의 감지방법.
  19. 제 1항에 있어서,
    국소빈혈 마커는 항체 또는 수용체 분자, 면역분석(immunoassay) 또는
    효소분석(enzymatic assay)에 의해 감지되는 것을 특징으로 하는
    포유동물에서 국소빈혈을 나타내는 상태의 감지방법.
  20. 제 1항에 있어서,
    국소빈혈의 증상을 나타내는 포유동물을 선택하는 첫 번째 단계를 추가로 포함하는
    포유동물에서 국소빈혈을 나타내는 상태의 감지방법.
  21. 제 1항에 있어서,
    만약 국소빈혈 마커의 수준이 전기 포유동물의 국소빈혈과 상관이 있다면, 항 국소빈혈 치료를 수행하는 단계를 추가로 포함하는
    포유동물에서 국소빈혈을 나타내는 상태의 감지방법.
  22. 제 21항에 있어서,
    항 국소빈혈 치료는 혈장 지방산의 수준을 내리는 수단을 포함하는 것
    을 특징으로 하는
    포유동물에서 국소빈혈을 나타내는 상태의 감지방법.
  23. 제 21항에 있어서,
    항 국소빈혈 치료는 리퍼퓨전(reperfusion) 치료,
    항혈전용해(antithrombolytic) 치료, 맥관생성(angiogenic) 치료 또는 수술인 것을 특징으로 하는
    포유동물에서 국소빈혈을 나타내는 상태의 감지방법.
  24. 제 1항에 있어서,
    전기 결정단계는 전기 국소빈혈 마커의 전기 측정된 수준과 전기 마커
    수준의 미리 결정된 값 사이의 비교인 것을 특징으로 하는
    포유동물에서 국소빈혈을 나타내는 상태의 감지방법.
  25. 제 24항에 있어서,
    전기 마커 수준의 미리 결정된 값은 비 국소빈혈 상태를 나타내는 것을 특징으로 하는
    포유동물에서 국소빈혈을 나타내는 상태의 감지방법.
  26. 제 25항에 있어서,
    국소빈혈 마커는 비결합 또는 수용성의 유리(free) 지방산인 것을
    특징으로 하는
    포유동물에서 국소빈혈을 나타내는 상태의 감지방법.
  27. 제 26항에 있어서,
    비결합 또는지방산에 결합하는 단백질에 의해 감지되는 것을
    특징으로 하는
    포유동물에서 국소빈혈을 나타내는 상태의 감지방법.
  28. 제 27항에 있어서,
    비결합 또는 수용성의 유리 지방산에 결합하는 전기 단백질은
    형광성이고 지방산의 결합 유무에 따라 구별되는 형광을 내는 것을
    특징으로 하는
    포유동물에서 국소빈혈을 나타내는 상태의 감지방법.
  29. 제 28항에 있어서,
    단백질은 13,000과 16,000 Da 사이의 분자량을 가지는 세포내 지방산 결합 단백질(FABP) 패밀리 중 하나인 것을 특징으로 하는
    포유동물에서 국소빈혈을 나타내는 상태의 감지방법.
  30. 제 29항에 있어서,
    FABP는 랫(rat)의 소장 FABP인 것을 특징으로 하는
    포유동물에서 국소빈혈을 나타내는 상태의 감지방법.
  31. 제 30항에 있어서,
    FABP는 위치 27에 아크릴로단(acrylodan)이 공유결합되어 표지된 것을 특징으로 하는
    포유동물에서 국소빈혈을 나타내는 상태의 감지방법.
  32. 제 31항에 있어서,
    아크릴로단으로 표지된 FABP는 류신(leucine) 72이 알라닌(alanine)으로 돌연변이된 것을 특징으로 하는
    포유동물에서 국소빈혈을 나타내는 상태의 감지방법.
  33. 제 26항에 있어서,
    비결합성 또는 수용성 유리 지방산 수준이 비 국소빈혈 군집으로부터 결정된 비결합성 또는 수용성 유리 지방산 수준의 평균값보다 표준편차 2 단위이상 크면 국소빈혈 증상을 나타내는 것을 특징으로 하는
    포유동물에서 국소빈혈을 나타내는 상태의 감지방법.
  34. 제 26항에 있어서,
    비결합성 또는 수용성 유리 지방산 수준이 비 국소빈혈 군집으로부터
    결정된 비결합성 또는 수용성 유리 지방산 수준의 평균값보다 약 두배 이상 크면 국소빈혈 증상을 나타내는 것을 특징으로 하는
    포유동물에서 국소빈혈을 나타내는 상태의 감지방법.
  35. 제 26항에 있어서,
    비결합성 또는 수용성 유리 지방산 수준이 약 5nM보다 크면 국소빈혈 증상을 나타내는 것을 특징으로 하는
    포유동물에서 국소빈혈을 나타내는 상태의 감지방법.
  36. 제 27항에 있어서,
    단백질은 알부민(albumin)인 것을 특징으로 하는
    포유동물에서 국소빈혈을 나타내는 상태의 감지방법.
  37. 제 36항에 있어서,
    알부민은 7-하이드록시코메린(7-hydroxycoumarin) 또는앤트라닐로일(anthraniloyl)이 공유결합적으로 표지된 것을 특징으로 하는
    포유동물에서 국소빈혈을 나타내는 상태의 감지방법.
  38. 제 25항에 있어서,
    국소빈혈 마커는 총총지방산인 것을 특징으로 하는
    포유동물에서 국소빈혈을 나타내는 상태의 감지방법.
  39. 제 38항에 있어서,
    총 유리 지방산 수준이 비 국소빈혈 군집으로부터 결정된 총 유리
    지방산 수준의 평균값보다 표준편차 2 단위이상 크면 국소빈혈 증상을
    나타내는 것을 특징으로 하는
    포유동물에서 국소빈혈을 나타내는 상태의 감지방법.
  40. 제 38항에 있어서,
    총 유리 지방산 수준이 비 국소빈혈 군집으로부터 결정된 총 유리
    지방산 수준의 평균값보다 약 두 배 이상 크면 국소빈혈 증상을나타내는 것을 특징으로 하는
    포유동물에서 국소빈혈을 나타내는 상태의 감지방법.
  41. 제 25항에 있어서,
    국소빈혈 마커는 총 유리 지방산 대 알부민의 비율인 것을 특징으로
    하는
    포유동물에서 국소빈혈을 나타내는 상태의 감지방법.
  42. 제 41항에 있어서,
    총 유리 지방산 대 알부민의 비율이 비 국소빈혈 군집으로부터 결정된
    총 유리 지방산 대 알부민 비율의 평균값보다 표준편차 2 단위이상
    크면 국소빈혈 증상을 나타내는 것을 특징으로 하는
    포유동물에서 국소빈혈을 나타내는 상태의 감지방법.
  43. 제 41항에 있어서,
    총 유리 지방산 대 알부민 비율이 비 국소빈혈 군집으로부터 결정된
    전체 유리 지방산 대 알부민 비율의 평균값보다 약 두배 이상 크면
    국소빈혈 증상을 나타내는 것을 특징으로 하는
    포유동물에서 국소빈혈을 나타내는 상태의 감지방법.
  44. 청구항 26에서와 같이 국소빈혈을 감지하는 단계; 및,
    국소빈혈 마커의 수준이 전기 비 국소빈혈 상태의 마커 수준을 향하여 움직이는지 결정하는 단계에 의한, 국소빈혈의 치료에 대한 환자의 반응 결정방법.
  45. 제 44항에 있어서,
    전기 치료는 리퍼퓨전(reperfusion) 치료인 것을 특징으로 하는
    국소빈혈의 치료에 대한 환자 반응의 결정방법.
  46. 제 45항에 있어서,
    전기 리퍼퓨전 치료는 혈관 형성술(angioplasty)을 포함하는 것을 특징으로 하는
    국소빈혈의 치료에 대한 환자 반응의 결정방법.
  47. 제 45항에 있어서,
    전기 리퍼퓨전 치료는 혈전용해제 투여를 포함하는 것을 특징으로 하는
    국소빈혈의 치료에 대한 환자 반응의 결정방법.
  48. 환자의 체액내 지질 성분의 수준을 측정하는 단계;
    환자로부터 측정된 지질 성분의 수준과, 국소빈혈 증상을 나타내지 않는 정상 군집내 체액의 지질 성분을 측정하여 결정된 지질 성분의 역치 수준을 비교하는 단계;
    환자로부터의 측정된 지질 성분 수준 대 역치 수준의 비율을 결정하는 단계; 및,
    높은 비율은 높은 위험성을 나타내도록, 리퍼퓨전 치료후 출혈에 대한 상대적 위험과 전기 비율을 상관시키는 단계를 포함하는, 리퍼퓨전 치료를 받은 이후 출혈 위험수위가 높은 환자의 확인방법.
  49. 환자의 체액내 지질 성분의 수준을 측정하는 단계;
    환자로부터 측정된 지질 성분의 수준과, 국소빈혈 증상을 나타내지 않는 정상 군집내 체액의 지질 성분을 측정하여 결정된 지질 성분의 역치 수준을 비교하는 단계;
    환자로부터의 측정된 지질 성분 수준 대 역치 수준의 비율을 결정하는 단계; 및,
    높은 비율은 높은 위험성을 나타내도록, 국소빈혈 발생후 3년이내 사망에 대한 상대적 위험과 비율을 상관시키는 단계를 포함하는, 국소빈혈 발생 이후 3년이내에 사망할 가능성이 높은 환자의 확인방법.
  50. 환자의 체액내 지질 성분의 수준을 측정하는 단계;
    환자로부터 측정된 지질 성분의 수준과, 국소빈혈 증상을 나타내지 않는 정상 군집내 체액의 지질 성분을 측정하여 결정된 지질 성분의 역치 수준을 비교하는 단계;
    역치 수준에 대한 환자로부터의 측정된 지질 성분 수준의 비율을 결정하는 단계; 및,
    높은 비율은 높은 위험성을 나타내도록, 출혈에 대한 상대적 위험과 비율을 상관시키는 단계를 포함하는, 출혈이 발생할 위험이 높은 환자의 확인방법.
  51. 제 48항에 있어서,
    지질 성분은 비결합 유리 지방산, 총 유리 지방산 및 총 유리 지방산
    대 알부민의 비율로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는
    리퍼퓨전 치료를 받은 이후 출혈의 위험수위가 높은 환자의 확인방법.
  52. 제 49항에 있어서,
    지질 성분은 비결합 유리 지방산, 총 유리 지방산 및 총 유리 지방산
    대 알부민의 비율로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는
    리퍼퓨전 치료를 받은 이후 출혈 위험수위가 높은 환자의 확인방법.
  53. 제 50항에 있어서,
    지질 성분은 비결합 유리 지방산, 총 유리 지방산 및 총 유리 지방산
    대 알부민의 비율로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는
    리퍼퓨전 치료를 받은 이후 출혈 위험수위가 높은 환자의 확인방법.
  54. 청구항 48의 방법을 이용한 리퍼퓨전 치료를 받은 후 출혈 위험성이 높은 환자를 확인하는 단계; 및,
    항 국소빈혈 치료로 전기 출혈 위험성이 높은 환자를 치료하는 단계를 포함하는, 리퍼퓨전 치료를 받은 후의 출혈 위험수위가 높은 환자의 치료방법.
  55. 청구항 49의 방법을 이용한 국소빈혈 발생 후 3년이내 사망 위험성이 높은 환자를 확인하는 단계; 및,
    항 국소빈혈 치료로 전기 사망 위험성이 높은 환자를 치료하는 단계를 포함하는, 국소빈혈 사건 후 사망 위험수위가 높은 환자의 치료방법.
  56. 청구항 50의 방법을 이용하여 출혈 위험성이 높은 환자를 확인하는 단계; 및,
    항 국소빈혈 치료로 전기 출혈 위험성이 높은 환자를 치료하는 단계를 포함하는, 출혈 위험수위가 높은 환자를 치료하는 단계를 포함하는 방법.
  57. 제 54항에 있어서,
    항 국소빈혈 치료는 글루코오스-인슐린-칼륨 조성물 및 알부민 조성물로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는
    리퍼퓨전 치료를 받은 후의 출혈 위험수위가 높은 환자의 치료방법.
  58. 제 55항에 있어서,
    항 국소빈혈 치료는 글루코오스-인슐린-칼륨 조성물 및 알부민 조성물로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는
    국소빈혈 사건 후 사망 위험수위가 높은 환자의 치료방법.
  59. 제 56항에 있어서,
    항 국소빈혈 치료는 글루코오스-인슐린-칼륨 조성물 및 알부민 조성물로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는
    출혈 위험수위가 높은 환자를 치료하는 단계를 포함하는 방법.
  60. 환자의 체액내 지질 성분의 수준을 측정하는 단계;
    환자로부터 측정된 지질 성분의 수준과, 국소빈혈 증상을 나타내지 않는 정상 군집내 체액의 지질 성분을 측정하여 결정된 지질 성분의 역치 수준을 비교하는 단계;
    역치 수준에 대한 환자로부터의 측정된 지질 성분 수준의 비율을 결정하는 단계; 및,
    높은 비율은 높은 위험성을 나타내도록, 상대적인 사망 위험과 비율을 상관시키는 단계를 포함하는, 급성이 아닌 환자의 장기간 위험 측정방법.
  61. 제 60항에 있어서,
    지질 성분은 비결합 유리 지방산, 총 유리 지방산 및 총 유리 지방산
    대 알부민의 비율로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는
    급성이 아닌 환자의 장기간 위험 측정방법.
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