CN109153860A - 具有间隔连接体基团的超高亮二聚体或聚合物染料 - Google Patents

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Abstract

本文公开可用作荧光染料或着色染料的化合物。该化合物具有下述结构(I)：或其立体异构体、互变异构体或盐，其中R1，R2，R3，R4，R5，L1，L2，L3，L4，M，m和n如本文所定义。也提供与所述化合物制备和使用有关的方法。

Description

具有间隔连接体基团的超高亮二聚体或聚合物染料
背景知识
技术领域
本发明一般涉及具有刚性间隔基团的二聚体和聚合物荧光染料或着色染料，和制备它们的方法和它们在各种分析方法中的用途。
有关技术的描述
荧光和/或着色染料已知特别适于希望高度敏感的检测试剂的应用。能够在样品中优先标记特定成分或组分的染料使得研究者可以确定所述特定成分或组分的存在、量和/或位置。此外，能够监测特定体系在不同环境中的空间和时间分布。
荧光和比色方法在化学和生物学中是极度广泛的。这些方法提供关于生物分子存在，结构，距离，取向，复合和/或位置的有用信息。此外，时间分辨方法越来越多地用于动态学和动力学的测量中。作为结果，已开发出用于荧光或颜色标记生物分子比如核酸和蛋白质的许多策略。由于生物分子的分析一般在含水环境中进行，关注的焦点一直是开发和使用水可溶的染料。
高度荧光的或着色的染料是希望的，原因是使用这种染料提高信噪比且提供其它有关益处。相应地，已尝试增加来自已知荧光和/或着色部分的信号。例如，已制备包含两个或更多个荧光和/或着色部分的二聚体和聚合物化合物，预期这种化合物会引起更高亮的染料。然而，作为分子内荧光猝灭的结果，已知的二聚体和聚合物染料并未实现所希望的亮度提高。
从而，本领域需要具有增加的摩尔亮度的水可溶染料。理想地，所述染料和生物标记应是强着色的或荧光的并且应以各种颜色和荧光波长可获得。本发明实现该需要和提供其它有关优势。
发明概要
简言之，本发明的实施方式一般涉及用作水可溶的荧光和/或着色染料和/或探针的化合物，其使得分析物分子比如生物分子的视觉检测成为可能，以及用于它们的制备的试剂。也描述用染料来视觉检测分析物分子的方法。
本公开染料的实施方式包括通过连接体("L4")共价连接的两个或更多个荧光和/或着色部分。与二聚体和/或聚合物染料的先前报告相比，本发明染料比相应单体染料化合物显著更亮。不期望受理论所限，据信连接体部分提供荧光和/或着色部分之间充足的空间分离从而降低和/或消除分子内荧光猝灭。
本发明水可溶的荧光染料或着色染料的实施方式是强着色的和/或荧光的并且能够通过视觉检查或其它手段容易地观察。在某些实施方式中，可以观察化合物而不用事先光照或化学或酶活化。通过适当选择染料，如本文描述，可以获得各种颜色的视觉可检测的分析物分子。
在一种实施方式中，提供具有下述结构(I)的化合物：
或其立体异构体、互变异构体或盐，其中R1，R2，R3，R4，R5，L1，L2，L3，L4，M，m和n如本文所定义。结构(I)化合物用于许多应用，包括在各种分析方法中用作荧光染料和/或着色染料。
在又一实施方式中，提供将样品染色的方法，所述方法包括向所述样品加入结构(I)化合物，其量足以在以适当波长光照所述样品的情况下产生光学响应。
在其它实施方式中，本公开提供视觉检测分析物分子的方法，包括：
(a)提供化合物(I)；和
(b)通过其可视特性检测化合物。
其它公开的方法包括视觉检测生物分子的方法，所述方法包括：
(a)将结构(I)化合物与一种或多种生物分子混合；和
(b)通过其可视特性检测化合物。
其它实施方式提供视觉检测分析物的方法，所述方法包括：
(a)提供本文公开的化合物，其中R2或R3包含连接体，所述连接体包含与具有对分析物的特异性的靶向部分的共价键；
(b)混合化合物和分析物，由此使靶向部分和分析物结合；和
(c)通过其可视特性检测化合物。
其它实施方式涉及组合物，包含结构(I)化合物和一种或多种分析物分子比如生物分子。也提供所述组合物在分析方法中检测一种或多种生物分子的用途。
在某些其它不同的实施方式中，提供结构(II)化合物：
或其立体异构体、盐或互变异构体，其中R1，R2，R3，R4，R5，L1a，L2，L3，L4，G，m和n如本文所定义。结构(II)化合物用于许多应用，包括用作制备结构(I)荧光染料和/或着色染料的中间体。
在其它实施方式中，提供标记分析物分子的方法，所述方法包括：
(a)将结构(II)化合物，其中R2或R3是Q或包含与Q的共价键的连接体，与分析物分子混合；
(b)形成化合物和分析物分子的缀合物；和
(c)将所述缀合物与式M-L1b-G′化合物反应，由此通过G和G′的反应形成至少一个共价键，其中R2，R3，Q，G和M-L1b-G′如本文所定义。
在某些不同的实施方式中，提供标记分析物分子的又一方法，所述方法包括：
(a)将结构(II)化合物，其中R2或R3是Q或包含与Q的共价键的连接体，与式M-L1b-G′化合物混合，由此通过G和G′的反应形成至少一个共价键；和
(b)将步骤(A)产物与分析物分子反应，由此形成步骤(A)产物和分析物分子的缀合物，其中R2，R3，Q，G和M-L1b-G′如本文所定义。
在更多不同的实施方式中，提供制备结构(I)化合物的方法，所述方法包括将结构(II)化合物与式M-L1b-G′化合物混合，由此通过G和G′的反应形成至少一个共价键，其中G和M-L1b-G′如本文所定义。
更多的实施方式涉及包含Y个荧光部分M的荧光化合物，其中所述荧光化合物具有在预定波长紫外光激发下的峰值荧光发射，其是单个M部分在相同波长紫外光激发下的峰值荧光发射的Y倍的至少85％，和其中Y是2或更大的整数。
本发明的这些和其它方面在参照下文详述之后更佳明显。
附图说明
在附图中，相同的标记数字鉴定相似的要素。要素在图中的尺寸和相对位置不一定按比例画出和这些要素中的某些被人为地扩大和定位以改善图的可辨认性。此外，画出的要素具体形状并不期望传递有关该特定要素的真实形状的任何信息，而是仅仅为了便于在图中识别而选用。
图1提供包含三甘醇间隔物的代表性化合物和比较化合物于5μm和pH 9的紫外吸光度谱图。
图2是包含六乙二醇间隔物的代表性化合物和比较化合物于5μm和pH 9的UV吸光度数据。
图3是包含三甘醇间隔物的代表性化合物和比较化合物于50nM和pH 9的荧光发射谱图。
图4代表包含六乙二醇间隔物的代表性化合物和比较化合物于50nM和pH 9的荧光发射谱图。
图5是包含4个六乙二醇间隔物和2或3个荧光素部分的代表性化合物相比具有单个荧光素部分的比较化合物于5μm的UV吸光度数据。
图6是这样的图：包含4个六乙二醇间隔物和2或3个荧光素部分的代表性化合物相对具有单个荧光素部分的比较化合物于5μm的荧光发射数据。
图7显示比较具有各种m值的示例性化合物的荧光发射响应。
图8提供数据比较"HEG"化合物，其中m是1、2或3，相对化合物A的荧光发射。
图9提供化合物I-32，化合物I-46和化合物B的紫外吸光度数据。
图10显示三聚体化化合物I-42的反应的PAGE分析结果。
图11提供数据比较七种化合物在死亡和坏死细胞群体中的荧光信号。
图12显示I-51的抗体缀合物vs化合物G的抗体缀合物的荧光强度。
图13显示I-51缀合物和化合物G参比抗体的比较。
图14显示UCHT1-I-51，UCHT1-BB515和UCHT1-FITC的比较。
图15显示CD3与MEF标准曲线相比的表达水平。
图16显示UCHT1-I-16级分与FITC的比较。
图17显示UCHT1-I-16级分与I-56缀合物的比较。
图18显示UCHT1-I-51-状类似物UCHT1 I-16与UCHT1 I-56(10x)和UCHT1 I-53(6x)的比较。
图19提供数据比较UCHT1 I-51-状类似物UCHT1 I-16与UCHT1 I-56(10x)和UCHT1I-53(6x)。
图20显示对测试UCHT1 I-16和UCHT1 I-49缀合物时产生的数据进行的回归分析的结果，展示缀合之间的等价性。
图21A显示用回归分析确定的I-16和I-45的相关性。图21B显示滴定曲线重叠图并与参比比较。图21C显示实例定性数据，显示背景FL和细胞形态，比较化合物D和I-45。
图22按直方图显示亲和力曲线，其中在FL1-A通道检测化合物发射。
图23A显示UCHT1-I-21B、UCHT1-I-16和参比UCHT1-FITC的脱靶、非特异性结合的荧光强度的比较，而图23B代表支持数据。
图24代表对数据进行的回归分析的结果，以检查相关性和相对亲和力。
图25显示UCHT1-I-21B，UCHT1-I-51和UCHT1-FITC的信噪比数据。
图26A和26B提供数据，在用PBMC的血浆干扰研究中比较UCHT1化合物G和UCHT1 I-51。图26A显示加入0％甘氨酸产生的数据，和图26B显示加入2.5％甘氨酸产生的数据。
发明详述
在下文描述中，描述某些特定细节以提供对本发明各种实施方式的透彻理解。然而，本领域技术人员将理解本发明可以不用这些细节来实施。
除非上下文另有需要，在整个说明书和权利要求中，措辞"包含"及其变型比如"含有"和"包括"解释为开放内含意义，也即"包括，但不限于"。
在本说明书通篇提及"一种实施方式"或"一个实施方式"意指的是，在实施方式中描述的特定性质、结构或特征包括在至少一个本发明实施方式中。从而，短语"在一种实施方式中"或"在一个实施方式中"在本说明书通篇各种位置出现不一定全部是指同一个的实施方式。另外，特定的性质、结构或特征可以在一个或多个实施方式中以任何适宜方式组合。
"氨基"是指-NH2基团。
"羧基"是指-CO2H基团。
"氰基"是指-CN基团。
"甲酰基"是指-C(＝O)H基团。
"羟基"或"羟基"是指-OH基团。
"亚氨基"是指＝NH基团。
"硝基"是指-NO2基团。
"氧代"是指＝O取代基。
"氢硫基"是指-SH基团。
"硫代"是指＝S基团。
"烷基"是指仅由碳和氢原子组成的直链或支化的烃链基团，不含不饱和度，具有一至十二个碳原子(C1-C12烷基)、一至八个碳原子(C1-C8烷基)或一至六个碳原子(C1-C6烷基)，并且其通过单键连接至分子其余部分，例如甲基、乙基、正丙基、1-甲基乙基(异丙基)、正丁基、正戊基、1,1-二甲基乙基(叔丁基)、3-甲基己基、2-甲基己基等。除非特别在说明书中另有说明，烷基是任选经取代的。
"亚烷基"或"亚烷基链"是指将分子其余部分连接至残基的直链或支化的二价烃链，仅由碳和氢组成，不含不饱和度，并且具有一至十二个碳原子，例如亚甲基、亚乙基、亚丙基、正-亚丁基、亚乙烯基、亚丙烯基、正-亚丁烯基、亚丙炔基、正-亚丁炔基等。亚烷基链通过单键连接至分子其余部分并且通过单键连接至残基。亚烷基链与分子其余部分的连接点和与残基的连接点能够通过链中的一个碳或任何两个碳。除非说明书中特别另有说明，亚烷基是任选经取代的。
"亚烯基"或"亚烯基链"是指将分子其余部分连接至残基的直链或支化的二价烃链，仅由碳和氢组成，含有至少一个碳-碳双键和具有二至十二个碳原子，例如亚乙烯基、亚丙烯基、正-亚丁烯基等。亚烯基链通过单键连接至分子其余部分和通过双键或单键连接至残基。亚烯基链与分子其余部分的连接点和与残基的连接点能够通过链中的一个碳或任何两个碳。除非说明书中特别另有说明，亚烯基是任选经取代的。
"亚炔基"或"亚炔基链"是指将分子其余部分连接至残基的直链或支化的二价烃链，仅由碳和氢组成，含有至少一个碳-碳三键和具有二至十二个碳原子，例如亚乙烯基，亚丙烯基，正-亚丁烯基等。亚炔基链通过单键连接至分子其余部分和通过双键或单键连接至残基。亚炔基链与分子其余部分的连接点和与残基的连接点能够通过链中的一个碳或任何两个碳。除非说明书中特别另有说明，亚炔基是任选经取代的。
"烷基醚"是指如前文所定义的任何烷基，其中至少一个碳-碳键用碳-氧键替换。碳-氧键可以在末端(如烷氧基)或碳氧键可以在内部(也即C-O-C)。烷基醚包括至少一个碳氧键，但是可以包括多于一个。例如，聚乙二醇(PEG)包括烷基醚的含义当中。除非说明书中特别另有说明，烷基醚基团是任选经取代的。例如，在某些实施方式中烷基醚用醇或-OP(＝Ra)(Rb)Rc取代，其中Ra，Rb和Rc各自如对结构(I)化合物的定义。
"烷氧基"是指式-ORa基团，其中Ra是如前文所定义的含有一至十二个碳原子的烷基。除非说明书中特别另有说明，烷氧基是任选经取代的。
"烷氧基烷基醚"是指式-ORaRb基团，其中Ra是如前文所定义的含有一至十二个碳原子的亚烷基，而Rb是如本文所定义的烷基醚基团。除非说明书中特别另有说明，烷氧基烷基醚基团是任选经取代的，例如用醇或-OP(＝Ra)(Rb)Rc取代，其中Ra，Rb和Rc各自如对结构(I)化合物的定义。
"杂烷基"是指如前文所定义的烷基，在烷基中或在烷基末端包含至少一个杂原子(例如N、O、P或S)。在某些实施方式中，杂原子在烷基内(也即包含至少一个碳-[杂原子]x-碳键的杂烷基，其中x是1，2或3)。在其它实施方式中，杂原子在烷基末端和从而将烷基与分子其余部分相连(例如M1-H-A)，其中M1是分子的一部分，H是杂原子而A是烷基)。除非说明书中特别另有说明，杂烷基是任选经取代的。示范性杂烷基包括氧化乙烯(例如聚氧化乙烯)，任选包括磷-氧键，比如磷酸二酯键。
"杂烷氧基"是指式-ORa基团，其中Ra是如前文所定义的含有一至十二个碳原子的杂烷基。除非说明书中特别另有说明，杂烷氧基是任选经取代的。
"杂亚烷基"是指如前文所定义的亚烷基，在亚烷基链内或在亚烷基链末端包含至少一个杂原子(例如，N、O、P或S)。在某些实施方式中，杂原子在亚烷基链内(也即杂亚烷基包含至少一个碳-[杂原子]-碳键，其中x是1，2或3)。在其它实施方式中，杂原子在亚烷基末端和从而将亚烷基与分子其余部分连接(例如M1-H-A-M2，其中M1和M2是分子的一部分，H是杂原子而A是亚烷基)。除非说明书中特别另有说明，杂亚烷基是任选经取代的。示范性杂亚烷基包括氧化乙烯(例如聚氧化乙烯)和说明如下的"C"联接基团：
"C连接体"
上述C-连接体的多聚体包括在杂亚烷基连接体的各种实施方式中。
"杂亚烯基"是如前文所定义的杂亚烷基，包含至少一个碳-碳双键。除非说明书中特别另有说明，杂亚烯基是任选经取代的。
"杂亚炔基"是包含至少一个碳-碳三键的杂亚烷基。除非说明书中特别另有说明，杂亚炔基是任选经取代的。
在提及"杂原子连接体"时"杂原子"是指由一个或多个杂原子组成的连接体基团。示范性杂原子连接体包括单个原子选自O、N、P和S，和多个杂原子例如具有式-P(O-)(＝O)O-或-OP(O-)(＝O)O-的连接体及其多聚体和组合。
"磷酸盐/酯"是指-OP(＝O)(Ra)Rb基团，其中Ra是OH，O-或ORc；而Rb是OH，O-，ORc，硫代磷酸盐/酯基团或其它磷酸盐/酯基团，其中Rc是平衡离子(例如Na+等)。
"磷酸基烷基"是指-OP(＝O)(Ra)Rb基团，其中Ra是OH，O-或ORc；而Rb是-O烷基，其中Rc是平衡离子(例如Na+等)。除非说明书中特别另有说明，磷酸基烷基是任选经取代的。例如，在某些实施方式中，磷酸基烷基中的-O烷基部分任选用一个或多个下述取代：羟基，氨基，氢硫基，磷酸盐/酯，硫代磷酸盐/酯，磷酸基烷基，硫代磷酸基烷基，磷酸基烷基醚，硫代磷酸基烷基醚或-OP(＝Ra)(Rb)Rc，其中Ra，Rb和Rc各自如对结构(I)化合物的定义。
"磷酸基烷基醚"是指-OP(＝O)(Ra)Rb基团，其中Ra是OH，O-或ORc；而Rb是-O烷基醚，其中Rc是平衡离子(例如Na+等)。除非说明书中特别另有说明，磷酸基烷基醚基团是任选经取代的。例如，在某些实施方式中，磷酸基烷基醚基团中的-O烷基醚部分任选用一个或多个下述取代：羟基，氨基，氢硫基，磷酸盐/酯，硫代磷酸盐/酯，磷酸基烷基，硫代磷酸基烷基，磷酸基烷基醚，硫代磷酸基烷基醚或-OP(＝Ra)(Rb)Rc，其中Ra，Rb和Rc各自如对结构(I)化合物的定义。
"硫代磷酸盐/酯"是指-OP(＝Ra)(Rb)Rc基团，其中Ra是O或S，Rb是OH，O-，S-，ORd或SRd；而Rc是OH，SH，O-，S-，ORd，SRd，磷酸盐/酯基团或其它硫代磷酸盐/酯基团，其中Rd是平衡离子(例如Na+等)且条件是：i)Ra是S；ii)Rb是S-或SRd；iii)Rc是SH，S-或SRd；或iv)i)，ii)和/或iii)的组合。
"硫代磷酸基烷基"是指-OP(＝Ra)(Rb)Rc基团，其中Ra是O或S，Rb是OH，O-，S-，ORd或SRd；而Rc是-O烷基，其中Rd是平衡离子(例如Na+等)且条件是：i)Ra是S；ii)Rb是S-或SRd；或iii)Ra是S而Rb是S-或SRd。除非说明书中特别另有说明，硫代磷酸基烷基是任选经取代的。例如，在某些实施方式中，硫代磷酸基烷基中的-O烷基部分任选用一个或多个下述取代：羟基，氨基，氢硫基，磷酸盐/酯，硫代磷酸盐/酯，磷酸基烷基，硫代磷酸基烷基，磷酸基烷基醚，硫代磷酸基烷基醚或-OP(＝Ra)(Rb)Rc，其中Ra，Rb和Rc各自如对结构(I)化合物的定义。
"硫代磷酸基烷基醚"是指-OP(＝Ra)(Rb)Rc基团，其中Ra是O或S，Rb是OH，O-，S-，ORd或SRd；而Rc是-O烷基醚，其中Rd是平衡离子(例如Na+等)且条件是：i)Ra是S；ii)Rb是S-或SRd；或iii)Ra是S而Rb是S-或SRd。除非说明书中特别另有说明，硫代磷酸基烷基醚基团是任选经取代的。例如，在某些实施方式中，硫代磷酸基烷基中的-O烷基醚部分任选用一个或多个下述取代：羟基，氨基，氢硫基，磷酸盐/酯，硫代磷酸盐/酯，磷酸基烷基，硫代磷酸基烷基，磷酸基烷基醚，硫代磷酸基烷基醚或-OP(＝Ra)(Rb)Rc，其中Ra，Rb和Rc各自如对结构(I)化合物的定义。
"碳环"是指稳定的3-至18-元芳族或非芳族环，其包含3至18个碳原子。除非说明书中特别另有说明，碳环可以是单环、双环、三环或四环的环系，其可以包括稠合的或桥连的环系，和可以是部分或完全饱和的。非芳族碳环基残基包括环烷基，而芳族碳环基残基包括芳基。除非说明书中特别另有说明，碳环基团是任选经取代的。
"环烷基"是指稳定的非芳族单环或多环碳环，其可以包括稠合的或桥连的环系，具有三至十五个碳原子，优选具有三至十个碳原子，并且其是饱和的或不饱和的和通过单键连接至分子其余部分。单环环烷基包括例如环丙基，环丁基，环戊基，环己基，环庚基和环辛基。多环环烷基包括例如金刚烷基，降莰烷基，十氢萘基，7,7-二甲基-二环-[2.2.1]庚烷基等。除非说明书中特别另有说明，环烷基是任选经取代的。
"芳基"是指环系包含至少一个碳环芳族环。在某些实施方式中，芳基包含6至18个碳原子。芳基环可以是单环、双环、三环或四环的环系，其可以包括稠合的或桥连的环系。芳基包括但不限于衍生自下述的芳基：醋蒽，苊，醋菲烯，蒽，薁，苯，荧蒽，芴，不对称引达省，对称引达省，茚满，茚，萘，非那烯，菲，七曜烯，芘和三亚苯。除非说明书中特别另有说明，芳基是任选经取代的。
"杂环"是指稳定的3-至18-元芳族或非芳族环，包含一至十二个碳原子和一至六个选自氮、氧和硫的杂原子。除非说明书中特别另有说明，杂环可以是单环、双环、三环或四环的环系，其可以包括稠合的或桥连的环系；和杂环中的氮、碳或硫原子可以任选被氧化；氮原子可以任选被季铵化；和杂环可以是部分或完全饱和的。芳族杂环的实例是在下文中列于杂芳基的定义中(也即杂芳基是杂环的子集)。非芳族杂环的实例包括但不限于二氧杂环戊烷基，噻吩基[1,3]二噻烷基，十氢异喹啉基，咪唑啉基，咪唑烷基，异噻唑烷基，异噁唑烷基，吗啉基，八氢吲哚基，八氢异吲哚基，2-氧代哌嗪基，2-氧代哌啶基，2-氧代吡咯烷基，噁唑烷基，哌啶基，哌嗪基，4-哌啶酮基，吡咯烷基，吡唑烷基，吡唑并嘧啶基，奎宁环基，噻唑烷基，四氢呋喃基，三噁烷基，三硫杂环己烷基，三嗪烷基，四氢吡喃基，硫吗啉基，硫杂吗啉基，1-氧代-硫吗啉基和1,1-二氧代-硫吗啉基。除非说明书中特别另有说明，杂环基团是任选经取代的。
"杂芳基"是指5-至14-元环系统包含一至十三个碳原子，一至六个选自氮、氧和硫的杂原子，和至少一个芳族环。出于本发明的某些实施方式的意图，杂芳基残基可以是单环、双环、三环或四环的环系，其可以包括稠合的或桥连的环系；和杂芳基残基中的氮、碳或硫原子可以任选被氧化；氮原子可以任选被季铵化。实例包括但不限于氮杂基，吖啶基，苯并咪唑基，苯并噻唑基，苯并吲哚基，苯并二氧杂环戊二烯基，苯并呋喃基，苯并噁唑基，苯并噻唑基，苯并噻二唑基，苯并[b][1,4]二氧杂基，1,4-苯并二噁烷基，苯并萘并呋喃基，苯并噁唑基，苯并二氧杂环戊二烯基，苯并二氧杂环己二烯基，苯并吡喃基，苯并吡喃酮基，苯并呋喃基，苯并呋喃酮基，苯并噻吩基(苯并噻吩基)，苯并三唑基，苯并[4,6]咪唑并[1,2-a]吡啶基，苯并噁唑啉酮基，苯并咪唑亚硫酰基，咔唑基，噌啉基，二苯并呋喃基，二苯并噻吩基，呋喃基，呋喃酮基，异噻唑基，咪唑基，吲唑基，吲哚基，吲唑基，异吲哚基，吲哚啉基，异吲哚啉基，异喹啉基，吲嗪基，异噁唑基，萘啶基，噁二唑基，2-氧代氮杂基，噁唑基，氧化乙烯基，1-氧化吡啶基，1-氧化嘧啶基，1-氧化吡嗪基，1-氧化哒嗪基，1-苯基-1H-吡咯基，吩嗪基，吩噻嗪基，吩噁嗪基，酞嗪基，蝶啶基，蝶啶酮基，嘌呤基，吡咯基，吡唑基，吡啶基，吡啶酮基，吡嗪基，嘧啶基，嘧啶酮基，哒嗪基，吡咯基，吡啶并[2,3-d]嘧啶酮基，喹唑啉基，喹唑啉酮基，喹喔啉基，喹喔啉酮基，喹啉基，异喹啉基，四氢喹啉基，噻唑基，噻二唑基，噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-酮基，噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-酮基，三唑基，四唑基，三嗪基，和噻吩基(也即噻吩基)。除非说明书中特别另有说明，杂芳基是任选经取代的。
"稠合的"是指包含至少两个环的环系，其中所述两个环共享至少一个共同的环原子、例如两个共享的环原子。在稠环是杂环基环或杂芳基环的情况下，共享的环原子可以是碳或氮。稠环包括双环，三环，四环等。
术语"取代"在本文中所用意指任何上述基团(例如烷基，亚烷基，亚烯基，亚炔基，杂亚烷基，杂亚烯基，杂亚炔基，烷氧基，烷基醚，烷氧基烷基醚，杂烷基，杂烷氧基，磷酸基烷基，磷酸基烷基醚，硫代磷酸基烷基，硫代磷酸基烷基醚，碳环，环烷基，芳基，杂环和/或杂芳基)，其中至少一个氢原子(例如1、2、3个或全部氢原子)用连接至非氢原子的键替换，所述非氢原子是比如但不限于：卤素原子比如F，Cl，Br和I；基团比如羟基，烷氧基和酯基团中的氧原子；基团比如硫醇基团，硫代烷基，砜基团，磺酰基和亚砜基团中的硫原子；基团比如胺，酰胺，烷基胺，二烷基胺，芳基胺，烷基芳基胺，二芳基胺，N-氧化物，酰亚胺和烯胺中的氮原子；基团比如三烷基甲硅烷基，二烷基芳基甲硅烷基，烷基二芳基甲硅烷基和三芳基甲硅烷基中的硅原子；和各种其它基团中的其它杂原子。"取代"也意指任何上述基团，其中一个或多个氢原子用连接至杂原子的更高等级的键(例如双键或三键)替换，所述杂原子是比如氧代，羰基，羧基和酯基团中的氧；和基团比如亚胺，肟，腙和腈中的氮。例如，"取代"包括任何上述基团，其中一个或多个氢原子用-NRgRh，-NRgC(＝O)Rh，-NRgC(＝O)NRgRh，-NRgC(＝O)ORh，-NRgSO2Rh，-OC(＝O)NRgRh，-ORg，-SRg，-SORg，-SO2Rg，-OSO2Rg，-SO2ORg，＝NSO2Rg，和-SO2NRgRh替换。"取代"也意指任何上述基团，其中一个或多个氢原子用-C(＝O)Rg，-C(＝O)ORg，-C(＝O)NRgRh，-CH2SO2Rg，-CH2SO2NRgRh替换。在前文中，Rg和Rh是相同或不同的和独立地是氢，烷基，烷氧基，烷基氨基，硫代烷基，芳基，芳烷基，环烷基，环烷基烷基，卤代烷基，杂环基，N-杂环基，杂环基烷基，杂芳基，N-杂芳基和/或杂芳基烷基。"取代"还意指任何上述基团，其中一个或多个氢原子用连接至下述的键替换：氨基，氰基，羟基，亚氨基，硝基，氧代，硫代，卤代，烷基，烷氧基，烷基氨基，硫代烷基，芳基，芳烷基，环烷基，环烷基烷基，卤代烷基，杂环基，N-杂环基，杂环基烷基，杂芳基，N-杂芳基和/或杂芳基烷基。在某些实施方式中，可选取代基是-OP(＝Ra)(Rb)Rc，其中Ra，Rb和Rc各自如对结构(I)化合物的定义。此外，前述取代基各自还可以任选用一个或多个上述取代基取代。
"共轭"是指一个p-轨道与又一个p-轨道跨间隔的σ键重叠。共轭可以发生在环状或无环化合物中。"共轭度"是指至少一个p-轨道与又一个p-轨道跨间隔的σ键重叠。例如，1,3-丁二烯具有一个共轭度，而苯和其它芳族化合物一般具有多个共轭度。荧光和着色化合物一般包含至少一个共轭度。
"荧光"是指分子能够吸收特定频率的光和发出不同频率的光。荧光是本领域普通技术人员熟知的。
"着色"是指分子吸收着色光谱范围内的光(也即红、黄、蓝色等)。
"连接体"是指至少一个原子比如碳、氧、氮、硫、磷及其组合的连续链，其将分子的一部分与同一分子的又一部分连接或者与不同分子、部分或固体载体(例如微粒)连接。连接体可以经由共价键或其它手段比如离子键或氢键相互作用连接分子。
术语"生物分子"是指任何各种生物学物质，包括核酸，碳水化合物，氨基酸，多肽，糖蛋白，激素类，适体及其混合物。更特别地，该术语期望包括但不限于RNA，DNA，寡核苷酸，修饰的或衍生化的核苷酸，酶，受体，朊病毒，受体配体(包括激素类)，抗体，抗原和毒素，以及细菌，病毒，血液细胞和组织细胞。本发明的视觉可检测的生物分子(例如具有与其连接的生物分子的结构(I)化合物)制备如下：将生物分子与化合物接触，所述化合物具有反应性基团使得生物分子可以经由生物分子上任何可获得的原子或官能团比如氨基、羟基、羧基或氢硫基连接至化合物，如本文进一步描述。
"反应性基团"是能够与第二反应性基团(例如"互补反应性基团")反应形成一个或多个共价键的部分，例如通过取代、氧化、还原、加成或环加成反应。示范性反应性基团提供于表1并且包括例如亲核物质，亲电试剂，双烯，亲双烯体，醛，肟，腙，炔，胺，叠氮化物，酰基叠氮化物，酰卤，腈，硝酮，氢硫基，二硫化物，磺酰卤，异硫氰酸酯，亚氨酸酯，活化的酯，酮，α,β-不饱和羰基，烯烃，马来酰亚胺，α-卤代酰亚胺，环氧化物，氮丙啶，四嗪，四唑，膦，生物素，硫杂环丙烷等。
术语"可视的"和"视觉可检测的"在本文中用于指通过视觉检查可以观察的物质，而不用预先光照或者化学或酶活化。所述视觉可检测的物质吸收和发出约300至约900nm光谱范围的光。优选，所述物质是强着色的，优选具有至少约40,000，更优选至少约50,000，还更优选至少约60,000，又还更优选至少约70,000，和最优选至少约80,000M-1cm-1的摩尔消光系数。本发明化合物可以检测如下：肉眼观察，或者借助基于光学的检测装置包括但不限于吸收分光光度计、透射光学显微镜、数字照相机和扫描仪。视觉可检测的物质并不局限于发出和/或吸收可见光谱光的那些。发出和/或吸收紫外(UV)区域的光(约10nm至约400nm)、红外(IR)区域的光(约700nm至约1mm)的物质，和发出和/或吸收其它区域的电磁光谱的物质也包括在"视觉可检测的"物质的范围内。
出于本发明实施方式的意图，术语"光稳定的可视染料"是指化学部分，其如上文所定义是视觉可检测的，并且在暴露于光的情况下不显著变化或分解。优选，光稳定的可视染料在暴露于光至少1小时之后不展示显著漂白或分解。更优选，可视染料在暴露于光至少12小时、还更优选至少24小时、又还更优选至少1周和最优选至少1个月之后是稳定的。适用于本发明化合物和方法的光稳定的可视染料的非限制性实例包括偶氮染料，硫靛蓝染料，喹吖啶酮色素，二噁嗪，酞菁，紫环酮(perinone)，二酮基吡咯并吡咯，喹酞酮，和truarycarbonium。
如本文所用，术语"苝衍生物"期望包括视觉可检测的任何取代的苝。然而，该术语并不期望包括苝本身。术语"蒽衍生物"，"萘衍生物"和"芘衍生物"类似地使用。在某些优选实施方式中，衍生物(例如苝、芘、蒽或萘衍生物)是苝、蒽、萘或芘的酰亚胺、双酰亚胺或肼酰亚胺衍生物。
本发明各种实施方式的视觉可检测的分子可用于各式各样的分析应用比如生物化学和生物医药应用，其中需要确定特定分析物(例如生物分子)的存在、位置或量。因此，在又一方面本发明提供视觉检测生物分子的方法，包括：(a)提供具有视觉可检测的生物分子的生物学系统，包含连接至生物分子的结构(I)化合物；和(b)通过其可视特性检测所述生物分子。出于本发明意图，短语"通过其可视特性检测所述生物分子"意指，在不用光照或化学或酶活化的情况下，用肉眼或者借助基于光学的检测装置包括但不限于吸收分光光度计、透射光学显微镜、数字照相机和扫描仪来观察生物分子。密度计可以用来定量存在的视觉可检测的生物分子的量。例如，生物分子在两个样品中的相对量能够通过测量相对光密度来测量。如果已知染料分子/生物分子的化学计量，且已知染料分子的消光系数，那么还能够从光密度的测量确定生物分子的绝对浓度。如本文所用，术语"生物学系统"用于指除了视觉可检测的生物分子之外还包含一种或多种生物分子的任何溶液或混合物。所述生物学系统的非限制性实例包括细胞，细胞提取物，组织样品，电泳凝胶，测试混合物，和杂交反应混合物。
"固体载体"是指本领域对于分子固相载体已知的任何固体基底，例如"微粒"是指用于连接至本发明化合物的任何各种小颗粒，包括但不限于玻璃珠、磁珠、聚合物珠、非聚合物珠等。在某些实施方式中，微粒包含聚苯乙烯珠。
"固体载体残基"是指在分子从固体载体裂解后保持连接至分子的官能团。固体载体残基是在本领域已知的和能够基于固体载体结构和将分子与其连接的基团容易地衍生。
"靶向部分"是选择性结合或连接特定靶标比如分析物分子的部分。"选择性"结合或连接意指靶向部分相对其它靶标优先与希望靶标连接或结合。在某些实施方式中，本文公开的化合物包括出于将化合物与有关分析物(也即靶向部分的靶标)选择性结合或连接的意图连接靶向部分，从而允许分析物的检测。示范性靶向部分包括但不限于抗体，抗原，核酸序列，酶，蛋白质，细胞表面受体拮抗剂等。在某些实施方式中，靶向部分是部分比如抗体，其选择性结合或连接细胞上或细胞内的靶标特征，例如细胞膜或其它细胞结构上的靶标特征，从而允许有关细胞的检测。选择性结合或连接希望分析物的小分子也预期在某些实施方式中用作靶向部分。本领域技术人员将理解在各种实施方式中有用的其它分析物和相应靶向部分。
"碱基配对部分"是指能够与互补杂环部分经由氢键(例如Watson-Crick碱基配对)杂交的杂环部分。碱基配对部分包括天然和非天然碱基。碱基配对部分的非限制性实例是RNA和DNA碱基比如腺苷，鸟苷，胸苷，胞嘧啶和尿苷及其类似物。
本文公开的发明的实施方式也意在涵盖同位素标记的全部结构(I)或(II)化合物，其中一个或多个原子用具有不同的原子质量或质量数的原子替换。能够掺入公开化合物的同位素的实例包括氢，碳，氮，氧，磷，氟，氯和碘的同位素，分别比如2H，3H，11C，13C，14C，13N，15N，15O，17O，18O，31P，32P，35S，18F，36Cl，123I和125I。
同位素标记的结构(I)或(II)化合物能够一般地通过本领域技术人员已知的常规技术或通过与下文和下述实例描述的那些类似的过程用适当同位素标记的试剂代替原先使用的非标记试剂来制备。
"稳定化合物"和"稳定结构"意指化合物，其是足够稳健的从而经历从反应混合物分离为有用程度的纯度，和配制为有效的治疗剂还存在。
"任选的"或"任选地"意指随后描述的事件或环境可以或可以不发生，并且该描述包括其中所述事件或环境发生的情况和其并不发生的情况。例如，"任选经取代的烷基"意指烷基可以或可以不被取代并且该描述包括取代的烷基和不具有取代的烷基。
"盐"包括酸和碱加成盐。
"酸加成盐"是指与无机酸形成的那些盐，所述无机酸是比如但不限于盐酸，氢溴酸，硫酸，硝酸，磷酸等，和与有机酸形成的那些盐，所述有机酸是比如但不限于乙酸，2,2-二氯乙酸，己二酸，藻酸，抗坏血酸，天冬氨酸，苯磺酸，苯甲酸，4-乙酰氨基苯甲酸，樟脑酸，樟脑-10-磺酸，癸酸，己酸，辛酸，碳酸，肉桂酸，柠檬酸，环拉酸，十二烷基硫酸，乙烷-1,2-二磺酸，乙磺酸，2-羟基乙磺酸，甲酸，富马酸，粘酸，龙胆酸，葡庚糖酸，葡萄糖酸，葡萄糖醛酸，谷氨酸，戊二酸，2-氧代-戊二酸，甘油磷酸，羟基乙酸，马尿酸，异丁酸，乳酸，乳糖酸，月桂酸，马来酸，苹果酸，丙二酸，扁桃酸，甲磺酸，粘酸，萘-1,5-二磺酸，萘-2-磺酸，1-羟基-2-萘甲酸，烟酸，油酸，乳清酸，草酸，棕榈酸，双羟萘酸，丙酸，焦谷氨酸，丙酮酸，水杨酸，4-对氨水杨酸，癸二酸，硬脂酸，丁二酸，酒石酸，硫氰酸，对-甲苯磺酸，三氟乙酸，十一烯酸等。
"碱加成盐"是指将无机碱或有机碱加至游离酸制备的那些盐。衍生自无机碱的盐包括但不限于钠，钾，锂，铵，钙，镁，铁，锌，铜，锰，铝盐等。衍生自有机碱的盐包括但不限于下述的盐：伯、仲和叔胺，取代的胺包括天然取代的胺，环状胺和碱性离子交换树脂，比如氨，异丙胺，三甲胺，二乙胺，三乙胺，三丙胺，二乙醇胺，乙醇胺，地阿诺，2-二甲基氨基乙醇，2-二乙基氨基乙醇，二环己基胺，赖氨酸，精氨酸，组氨酸，咖啡因，普鲁卡因，海巴明(hydrabamine)，胆碱，内铵盐，苯乙苄胺，N,N'-二苄基乙二胺，乙二胺，氨基葡萄糖，甲基葡萄糖胺，可可碱，三乙醇胺，氨丁三醇，嘌呤类，哌嗪，哌啶，N-乙基哌啶，多元胺树脂等。特别优选的有机碱是异丙胺，二乙胺，乙醇胺，三甲胺，二环己基胺，胆碱和咖啡因。
结晶可以产生本文描述的化合物的溶剂化物。本发明的实施方式包括所描述化合物的全部溶剂化物。如本文所用，术语"溶剂化物"是指聚集体，其包含一个或多个本发明化合物分子与一个或多个溶剂分子。溶剂可以是水，在该情况下溶剂化物可以是水合物。另选地，溶剂可以是有机溶剂。从而，本发明化合物可以作为水合物存在，包括一水合物，二水合物，半水合物，倍半水合物，三水合物，四水合物等，以及相应的溶剂化形式。本发明化合物可以是真正的溶剂化物，而在另外的情况下本发明化合物可以仅保留外来水或其它溶剂或者是水和一些外来溶剂的混合物。
本发明化合物(例如结构I或II化合物)或它们的盐、互变异构体或溶剂化物的实施方式可以含有一个或多个不对称中心和可以从而产生对映体、非对映体和其它立体异构形式，其在绝对立体化学方面可以定义为(R)-或(S)-或者对于氨基酸的(D)-或(L)-。本发明的实施方式意在包括全部所述可能异构体，以及它们的外消旋和光学纯形式。光学活性的(+)和(-)、(R)-和(S)-或(D)-和(L)-异构体可以用手性合成子或手性试剂制备，或用常规技术例如色谱法和分步结晶拆分。用来制备/分离单独对映体的常规技术包括从适宜的光学纯前体手性合成或者用例如手性高压液体色谱法(HPLC)拆分外消旋体(或盐或衍生物的外消旋体)。在本文描述的化合物含有烯式双键或其它几何不对称中心的情况下，并且除非另有指定，期望的是化合物包括E和Z几何异构体。类似地，也期望包括全部互变异构体形式。
"立体异构体"是指由通过相同键键合的相同原子构成的化合物，但是具有不可互换的不同三维结构。本发明预期各种立体异构体及其混合物和包括"对映体"，其是指两个立体异构体，其分子是彼此不可重叠的镜像。
"互变异构体"是指质子从分子的一个原子转移到相同分子的又一个原子。本发明包括任何所述化合物的互变异构体。化合物的各种互变异构体形式可通过本领域普通技术人员容易地衍生。
本文使用的化学命名方案和结构图解是I.U.P.A.C.命名系统的修饰形式，采用ACD/Name版本9.07软件程序和/或ChemDraw Ultra版本11.0软件命名程序(CambridgeSoft)。也使用本领域普通技术人员熟悉的通用名。
如上文所述，在本发明的一种实施方式中，提供在各种分析方法中用作荧光染料和/或着色染料的化合物。在其它实施方式中，提供用作制备用作荧光染料和/或着色染料的化合物的合成中间体的化合物。一般来说，本发明的实施方式涉及荧光部分和/或着色部分的二聚体和更高级的聚合物。荧光和/或着色部分通过连接部分连接。不受理论限制，据信连接体有助于保持荧光部分和/或着色部分之间充足的空间距离，从而减少或消除分子内猝灭，从而获得具有高摩尔"亮度"(例如高荧光发射)的染料化合物。
相应地，在某些实施方式中化合物具有下述结构(A)：
其中L是连接体，其足以保持一个或多个(例如各)M基团之间的空间分离，从而减少或消除分子内猝灭，和R1、R2、R3、L1、L2、L3和n如对结构(I)定义。在结构(A)的某些实施方式中，L是包含一个或多个乙二醇或聚乙二醇部分的连接体。
在其它实施方式中，提供具有下述结构(I)的化合物：
或其立体异构体、盐或互变异构体，其中：
M的各具体值独立地是包含两个或更多个碳-碳双键和至少一个共轭度的部分；
L1的各具体值独立地是：i)任选的亚烷基，亚烯基，亚炔基，杂亚烷基，杂亚烯基，杂亚炔基或杂原子连接体；或ii)连接体，其包含通过两个互补反应性基团的反应能够形成的官能团；
L2和L3的各具体值独立地是任选的亚烷基，亚烯基，亚炔基，杂亚烷基，杂亚烯基，杂亚炔基或杂原子连接体；
L4的各具体值独立地是长度大于三个原子的杂亚烷基，杂亚烯基或杂亚炔基连接体，其中杂亚烷基、杂亚烯基和杂亚炔基连接体中的杂原子选自O、N和S；
R1的各具体值独立地是H，烷基或烷氧基；
R2和R3各自独立地是H，OH，SH，烷基，烷氧基，烷基醚，杂烷基，-OP(＝Ra)(Rb)Rc，Q或L'；
R4的各具体值独立地是OH，SH，O-，S-，ORd或SRd；
R5的各具体值独立地是氧代，硫代或不存在；
Ra是O或S；
Rb是OH，SH，O-，S-，ORd或SRd；
Rc是OH，SH，O-，S-，ORd，OL'，SRd，烷基，烷氧基，杂烷基，杂烷氧基，烷基醚，烷氧基烷基醚，磷酸盐/酯，硫代磷酸盐/酯，磷酸基烷基，硫代磷酸基烷基，磷酸基烷基醚或硫代磷酸基烷基醚；
Rd是平衡离子；
Q的各具体值独立地是包含反应性基团或其经保护的类似物的部分，能够与分析物分子、靶向部分、固体载体或互补反应性基团Q′形成共价键；
L'的各具体值独立地是包含与Q的共价键的连接体，包含与靶向部分的共价键的连接体，包含与分析物分子的共价键的连接体，包含与固体载体的共价键的连接体，包含与固体载体残基的共价键的连接体，包含与核苷的共价键的连接体或包含与又一结构(I)化合物的共价键的连接体；
m的各具体值独立地是0或更大的整数，条件是m的至少一个具体值是1或更大的整数；和
n是1或更大的整数。
在结构(I)化合物的不同实施方式中：
M的各具体值独立地是包含两个或更多个碳-碳双键和至少一个共轭度的部分；
L1的各具体值独立地是：i)任选的亚烷基，亚烯基，亚炔基，杂亚烷基，杂亚烯基，杂亚炔基或杂原子连接体；或ii)连接体，其包含通过两个互补反应性基团的反应能够形成的官能团；
L2和L3的各具体值独立地是任选的亚烷基，亚烯基，亚炔基，杂亚烷基，杂亚烯基，杂亚炔基或杂原子连接体；
L4的各具体值独立地是长度大于三个原子的杂亚烷基，杂亚烯基或杂亚炔基连接体，其中杂亚烷基、杂亚烯基和杂亚炔基连接体中的杂原子选自O、N和S；
R1的各具体值独立地是H，烷基或烷氧基；
R2和R3各自独立地是H，OH，SH，烷基，烷氧基，烷基醚，-OP(＝Ra)(Rb)Rc，Q，包含与Q的共价键的连接体，包含与分析物分子的共价键的连接体，包含与固体载体的共价键的连接体或包含与又一结构(I)化合物的共价键的连接体，其中：Ra是O或S；Rb是OH，SH，O-，S-，ORd或SRd；Rc是OH，SH，O-，S-，ORd，SRd，烷基，烷氧基，烷基醚，烷氧基烷基醚，磷酸盐/酯，硫代磷酸盐/酯，磷酸基烷基，硫代磷酸基烷基，磷酸基烷基醚或硫代磷酸基烷基醚；和Rd是平衡离子；
R4的各具体值独立地是OH，SH，O-，S-，ORd或SRd；
R5的各具体值独立地是氧代，硫代或不存在；
Q的各具体值独立地是包含反应性基团的部分，所述反应性基团能够与分析物分子、固体载体或互补反应性基团Q′形成共价键；
m的各具体值独立地是0或更大的整数，条件是m的至少一个具体值是1或更大的整数；和
n是1或更大的整数。
结构(I)化合物中的各种连接体和取代基(例如M，Q，R1，R2，R3，Rc L1，L2，L3和L4)任选用一个或多个取代基取代。例如，在某些实施方式中选择可选取代基来优化结构(I)化合物的水溶解度或其它特性。在某些实施方式中，在结构(I)化合物中的各烷基、烷氧基、烷基醚、烷氧基烷基醚、磷酸基烷基、硫代磷酸基烷基、磷酸基烷基醚和硫代磷酸基烷基醚任选用一个或多个取代基取代，所述取代基选自羟基，烷氧基，烷基醚，烷氧基烷基醚，氢硫基，氨基，烷基氨基，羧基，磷酸盐/酯，硫代磷酸盐/酯，磷酸基烷基，硫代磷酸基烷基，磷酸基烷基醚和硫代磷酸基烷基醚。在某些实施方式中，可选取代基是-OP(＝Ra)(Rb)Rc，其中Ra，Rb和Rc如对结构(I)化合物的定义。
在某些实施方式中，L1的各具体值独立地是任选的亚烷基，亚烯基，亚炔基，杂亚烷基，杂亚烯基，杂亚炔基或杂原子连接体。在其它实施方式中，L1的各具体值独立地是连接体，其包含通过两个互补反应性基团的反应能够形成的官能团，例如Q基团。
在某些实施方式中，L4的各具体值独立地是杂亚烷基连接体。在其它更特定的实施方式中，L4的各具体值独立地是氧化烯烃连接体。例如，在某些实施方式中L4是聚氧化乙烯，和化合物具有下述结构(IA)：
其中z是2至100的整数。在(IA)的某些实施方式中，z是2-30，例如约20至25，或约23的整数。在某些实施方式中，z是2至10的整数，例如3至6。在某些实施方式中，z是3。在某些实施方式中，z是4。在某些实施方式中，z是5。在某些实施方式中，z是6。
任选的连接体L1能够用作M部分与化合物其余部分的连接点。例如，在某些实施方式中制备结构(I)化合物的合成前体，和用任何数量的本领域已知的温和方法例如称为"点击化学"的方法将M部分连接至合成前体。出于该意图，快速和基本上不可逆的任何反应能够用来将M连接至合成前体以形成结构(I)化合物。示范性反应包括叠氮化物和炔形成三唑的铜催化反应(Huisgen 1，3-偶极环加成)，二烯和亲双烯体的反应(Diels-Alder)，张力促进的炔-硝酮环加成，张力烯烃与叠氮化物、四嗪或四唑的反应，烯烃和叠氮化物[3+2]环加成，烯烃和四嗪逆需求Diels-Alder，烯烃和四唑光反应以及各种取代反应，比如离去基团被亲电原子上的亲核进攻取代。示范性取代反应包括胺与下述的反应：活化的酯；N-羟基琥珀酰亚胺酯；异氰酸酯；异硫氰酸酯等。在某些实施方式中，形成L1的反应可以在含水环境中进行。
相应地，在某些实施方式中L1的各具体值是连接体，其包含通过两个互补反应性基团的反应能够形成的官能团，例如是前述"点击"反应之一的产物的官能团。在各种实施方式中，对于L1的至少一个具体值，所述官能团能够通过醛、肟、腙、炔、胺、叠氮化物、酰基叠氮化物、酰卤、腈、硝酮、氢硫基、二硫化物、磺酰卤、异硫氰酸酯、亚氨酸酯、活化的酯(例如N-羟基琥珀酰亚胺酯)、酮、α、β-不饱和羰基、烯烃、马来酰亚胺、α-卤代酰亚胺、环氧化物、氮丙啶、四嗪、四唑、膦、生物素或硫杂环丙烷官能团与互补反应性基团的反应形成。例如，胺与N-羟基琥珀酰亚胺酯或异硫氰酸酯的反应。
在其它实施方式中，对于L1的至少一个具体值，所述官能团能够通过炔和叠氮化物的反应形成。在其它实施方式中，对于L1的至少一个具体值，所述官能团能够通过胺(例如伯胺)和N-羟基琥珀酰亚胺酯或异硫氰酸酯的反应形成。
在更多实施方式中，对于L1的至少一个具体值，官能团包含烯烃，酯，酰胺，硫代酯，二硫化物，碳环，杂环或杂芳基。在更多实施方式中，对于L1的至少一个具体值，官能团包含烯烃，酯，酰胺，硫代酯，硫脲，二硫化物，碳环，杂环或杂芳基。在其它实施方式中，官能团包含酰胺或硫脲。在某些更特定的实施方式中，对于L1的至少一个具体值，L1是包含三唑基官能团的连接体。而在其它实施方式中，对于L1的至少一个具体值，L1是包含酰胺或硫脲官能团的连接体。
在其它实施方式中，对于L1的至少一个具体值，L1-M具有下述结构：
其中L1a和L1b各自独立地是任选的连接体。
在不同的实施方式中，对于L1的至少一个具体值，L1-M具有下述结构：
其中L1a和L1b各自独立地是任选的连接体。
在前述的各种实施方式中，L1a或L1b或两者不存在。在其它实施方式中，L1a或L1b或两者存在。
在某些实施方式中，L1a和L1b当存在时各自独立地是亚烷基或杂亚烷基。例如，在某些实施方式中L1a和L1b当存在时独立地具有下述结构之一：
在结构(I)的其它不同实施方式中，L1的各具体值独立地是任选的亚烷基或杂亚烷基连接体。在某些实施方式中，L1具有下述结构之一：
在更多实施方式中，L2和L3的各具体值独立地是C1-C6亚烷基，C2-C6亚烯基或C2-C6亚炔基。例如，在某些实施方式中化合物具有下述结构(IB)：
其中：
x1，x2，x3和x4的各具体值独立地是0至6的整数；和
z是2至100，例如3至6的整数。
在结构(IB)化合物的某些实施方式中，x1，x2，x3或x4的至少一个具体值是1。在其它实施方式中，x1，x2，x3和x4的各具体值各自是1。在其它实施方式中，x1和x3的各具体值各自是0。在某些实施方式中，x2和x4的各具体值各自是1。在其它实施方式中，x1和x3的各具体值各自是0，而x2和x4的各具体值各自是1。
在结构(IB)化合物的某些更特定的实施方式中，L1的各具体值独立地包含三唑基官能团。在结构(IB)化合物的某些其它特定的实施方式中，L1的各具体值独立地包含酰胺或硫脲官能团。在结构(IB)化合物的其它实施方式中，L1的各具体值独立地包含任选的亚烷基或杂亚烷基连接体。
在任何结构(I)化合物的其它实施方式中，R4的各具体值独立地是OH，O-或ORd。应理解"ORd"和"SRd"期望指与阳离子结合的O-和S-。例如，磷酸基团的二钠盐可以表示为：
其中Rd是钠(Na+)。
在任何结构(I)化合物的其它实施方式中，R5的各具体值是氧代。
在任何前述化合物的某些不同的实施方式中，R1是H。
在其它各种实施方式中，R2和R3各自独立地是OH或-OP(＝Ra)(Rb)Rc。在某些不同的实施方式中，R2或R3是OH或-OP(＝Ra)(Rb)Rc，而R2或R3中另一个是Q或包含与Q的共价键的连接体。
在任何前述结构(I)化合物的还更多不同的实施方式中，R2和R3各自独立地是-OP(＝Ra)(Rb)Rc。在这些实施方式的某些中，Rc是OL'。
在其它实施方式中，R2和R3各自独立地是-OP(＝Ra)(Rb)OL'，而L'是亚烷基或与下述的杂亚烷基连接体：Q，靶向部分，分析物(例如分析物分子)，固体载体，固体载体残基，核苷或又一结构(I)化合物。
连接体L'能够是适于将Q，靶向部分，分析物(例如分析物分子)，固体载体，固体载体残基，核苷或又一结构(I)化合物连接至结构(I)化合物的任何连接体。有利地，某些实施方式包括使用L'部分，其经选择以增加或优化化合物的水溶解度。在某些实施方式中，L'是杂亚烷基部分。在其它某些实施方式中，L'包含氧化烯烃或磷酸二酯部分，或其组合。
在某些实施方式中，L'具有下述结构：
其中：
m”和n”独立地是1至10的整数；
Re是H，电子对或平衡离子；
L”是Re或与下述的直连键或连接体：Q，靶向部分，分析物(例如分析物分子)，固体载体，固体载体残基，核苷或又一结构(I)化合物。
在某些实施方式中，m”是4至10的整数，例如4、6或10。在其它实施方式中n”是3至6的整数，例如3、4、5或6。
在某些其它实施方式中，L”是亚烷基或杂亚烷基部分。在其它某些实施方式中，L”包含氧化烯烃，磷酸二酯部分，氢硫基，二硫化物或马来酰亚胺部分或其组合。
在某些前述实施方式中，靶向部分是抗体或细胞表面受体拮抗剂。
在任何前述结构(I)化合物的其它更特定的实施方式中，R2或R3具有下述结构之一：
结构(I)化合物的某些实施方式能够根据固相合成方法制备，类似于制备寡核苷酸领域已知的那些。相应地，在某些实施方式中，L'是与固体载体，固体载体残基或核苷的连接体。包含活化的脱氧胸苷(dT)基团的固体载体是可容易获得的，和在某些实施方式中能够用作制备结构(I)化合物的原料。相应地，在某些实施方式中R2或R3具有下述结构：
本领域技术人员将理解上文描述的dT基团仅出于便于合成和经济效率包括，并非是必须的。能够使用其它固体载体和会引起L'上存在不同的核苷或固体载体残基，或能够在合成之后除去或修饰核苷或固体载体残基。
在其它实施方式中，Q的各具体值独立地是包含反应性基团的部分，所述反应性基团能够与分析物分子或固体载体形成共价键。在其它实施方式中，Q的各具体值独立地是包含反应性基团的部分，所述反应性基团能够与互补反应性基团形成Q′共价键。例如，在某些实施方式中，Q′存在于又一结构(I)化合物上(例如R2或R3位)，和Q和Q′包含互补反应性基团从而结构(I)化合物和又一结构(I)化合物的反应引起共价结合的结构(I)化合物的二聚体。多聚体结构(I)化合物还能够以类似方式制备和包括在本发明实施方式范围内。
Q基团的类型和Q基团与结构(I)化合物其余部分的连接性是不受限制的，条件是Q包含具有适当反应性的部分以形成希望的键。
在某些实施方式中，Q是在含水条件下不易水解的部分，但具有充足反应性以与分析物分子或固体载体上的相应基团成键(例如胺，叠氮化物或炔)。
结构(I)化合物的某些实施方式包含一般用于生物缀合领域的Q基团。例如在某些实施方式中，Q包含亲核反应性基团，亲电反应性基团或环加成反应性基团。在某些更特定的实施方式中，Q包含氢硫基，二硫化物，活化的酯，异硫氰酸酯，叠氮化物，炔，烯烃，二烯，亲双烯体，酰卤，磺酰卤，膦，α-卤代酰胺，生物素，氨基或马来酰亚胺官能团。在某些实施方式中，活化的酯是N-琥珀酰亚胺酯，亚氨酸酯或聚氟苯基酯。在其它实施方式中，炔是烷基叠氮化物或酰基叠氮化物。
Q基团能够以保护形式方便地提供以增加贮藏稳定性或其它希望特性，然后在适当时间除去保护基团以与例如靶向部分或分析物缀合。相应地，Q基团包括"保护形式"的反应性基团，包括上文和下表1描述的任何反应性基团。Q的"保护形式"是指在预定反应条件下相对Q具有更低反应性的部分，但是其能够在各种条件下转化为Q，其优选不降解或与结构(I)化合物的其它部分反应。本领域技术人员能够基于特定Q和希望终端应用和贮藏条件而衍生Q的适当保护形式。例如，在Q是SH的情况下，Q的保护形式包括二硫化物，其能够用一般已知技术和试剂还原以展示SH部分。
示范性Q部分提供于下表I。
表1.示范性Q部分
应注意在Q是SH的某些实施方式中，所述SH部分将倾向于与又一氢硫基(例如在又一结构(I)化合物上)形成二硫化物键。相应地，某些实施方式包括结构(I)化合物，其呈二硫化物二聚体形式，所述二硫化物键衍生自SH Q基团。
在某些实施方式范围中也包括结构(I)化合物，其中R2和R3之一或两者包含与又一结构(I)化合物的连接体。例如，其中R2和R3之一或两者是-OP(＝Ra)(Rb)Rc，和Rc是OL'，和L'是包含与又一结构(I)化合物的共价键的连接体。所述化合物能够制备如下：制备第一结构(I)化合物，其具有例如约10个"M"部分(也即n＝9)和具有适当的"Q"以与第二结构(I)化合物上的互补Q'基团反应。以该方式，能够制备具有任何数量例如100或更多个"M"部分的结构(I)化合物，而不需要依次偶联各单体。所述结构(I)化合物的示范性实施方式具有下述结构(I')
其中：
R1，R2，R3，R4，R5，L1，L2，L3，L4，M，m和n的各具体值独立地如对结构(I)化合物的定义；
L”是连接体，其包含Q部分与相应Q'部分反应形成的官能团；和
α是大于1，例如1至100，或1至10的整数。
结构(I')的示范性化合物提供于实施例5。其它结构(I')化合物可由本领域普通技术人员衍生，例如二聚体化或聚合本文提供的结构(I)化合物。
在其它实施方式中，Q部分被方便地掩蔽(例如保护)为二硫化物部分，其能够随后还原，提供活化的Q部分以结合至希望的分析物分子或靶向部分。例如，Q部分可以掩蔽为具有下述结构的二硫化物：
其中R是任选经取代的烷基。例如，在某些实施方式中，Q提供为具有下述结构的二硫化物部分：
其中n是1至10的整数，例如6。
在某些其它实施方式中，R2或R3之一是OH或-OP(＝Ra)(Rb)Rc，而R2或R3中另一个是包含与分析物分子的共价键的连接体或包含与固体载体的共价键的连接体。例如，在某些实施方式中分析物分子是核酸，氨基酸或其聚合物。在其它实施方式中，分析物分子是酶，受体，受体配体，抗体，糖蛋白，适体或朊病毒。在还不同的实施方式中，固体载体是聚合物珠或非聚合物珠。
m值是能够基于希望的荧光和/或颜色强度选择的又一个变量。在某些实施方式中，m的各具体值独立地是1至10的整数。在其它实施方式中，m的各具体值独立地是1至5的整数，例如1，2，3，4或5。
在其它实施方式中，m的各具体值独立地是大于2的整数，而z是3至10的整数，例如在某些实施方式中m的各具体值独立地是大于2的整数，比如3，4，5或6，而z是3至6的整数。
荧光强度还能够通过选择不同的n值调节。在某些实施方式中，n是1至100的整数。在其它实施方式中，n是1至10的整数。在某些实施方式中n是1。在某些实施方式中n是2。在某些实施方式中n是3。在某些实施方式中n是4。在某些实施方式中n是5。在某些实施方式中n是6。在某些实施方式中n是7。在某些实施方式中n是8。在某些实施方式中n是9。在某些实施方式中n是10。
M基于希望的光学特性，例如基于希望的颜色和/或荧光发射波长来选择。在某些实施方式中，M的各具体值是相同的；然而，需要强调指出的是M的各具体值并不需要是相同的M，而某些实施方式包括化合物，其中M的各具体值是不相同的。例如，在某些实施方式中各M是不相同的并且选择不同的M部分以具有用于荧光共振能量转移(FRET)方法中的吸收和/或发射。例如，在所述实施方式中选择不同的M部分从而吸收一个波长的辐射通过FRET机理导致发射不同波长的辐射。示范性M部分能够由本领域普通技术人员基于希望的终端用途适当选择。用于FRET方法的示范性M部分包括荧光素和5-TAMRA(5-羧基四甲基罗丹明，琥珀酰亚胺基酯)染料。
M可以从M上的任何位置(也即原子)连接至分子其余部分。本领域技术人员将认识到将M连接至分子其余部分的手段。示范性方法包括本文描述的"点击"反应。
在某些实施方式中，M是荧光或着色部分。可以使用任何荧光的和/或着色的部分，例如可以使用本领域已知的那些和在比色、UV和/或荧光测试中一般使用的那些。在本发明各种实施方式中有用的M部分的实例包括但不限于：呫吨衍生物(例如荧光素，罗丹明，Oregon绿，曙红或Texas红)；菁蓝衍生物(例如菁蓝，靛青，氧杂羰花青，硫杂羰花青或部花青)；方酸(squaraine)衍生物和环取代的方酸，包括Seta、SeTau和方形染料；萘衍生物(例如丹磺酰和prodan衍生物)；香豆素衍生物；噁二唑衍生物(例如吡啶基噁唑，硝基苯并噁二唑或苯并噁二唑)；蒽衍生物(例如蒽醌，包括DRAQ5、DRAQ7和CyTRAK橙)；芘衍生物比如级联蓝；噁嗪衍生物(例如Nile红，Nile蓝，甲酚基紫，噁嗪170)；吖啶衍生物(例如原黄素，吖啶橙，吖啶黄)；芳基次甲基衍生物：金胺，晶紫，孔雀绿；和四吡咯衍生物(例如卟吩，酞菁或胆红素)。其它示范性M部分包括：菁类染料，黄原酸盐/酯染料(例如Hex，Vic，Nedd，Joe或Tet)；Yakima黄；Redmond红；tamra；texas红和alexa 染料。
在任何前述的其它实施方式中，M包含三个或更多个芳基或杂芳基环或其组合，例如四个或更多个芳基或杂芳基环或其组合，或甚至五个或更多个芳基或杂芳基环或其组合。在某些实施方式中，M包含六个芳基或杂芳基环或其组合。在其它实施方式中，各环是稠合的。例如在某些实施方式中，M包含三个或更多个稠环，四个或更多个稠环，五个或更多个稠环，或甚至六个或更多个稠环。
在某些实施方式中，M是环状。例如，在某些实施方式中M是碳环。在其它实施方式中，M是杂环。在前述的其它实施方式中，M的各具体值独立地包含芳基部分。在这些实施方式的某些中，芳基部分是多环的。在其它更特定的实例中，芳基部分是稠合多环芳基部分，例如其可以包含至少3个、至少4个或甚至大于4个芳基环。
在任何前述结构(I)、(IA)、(IB)或(I')化合物的其它实施方式中，M的各具体值独立地包含至少一个杂原子。例如，在某些实施方式中，杂原子是氮，氧或硫。
在任何前述的更多实施方式中，M的各具体值独立地包含至少一个取代基。例如，在某些实施方式中所述取代基是氟，氯，溴，碘，氨基，烷基氨基，芳基氨基，羟基，氢硫基，烷氧基，芳氧基，苯基，芳基，甲基，乙基，丙基，丁基，异丙基，叔丁基，羧基，磺酸盐/酯基团，酰胺，或甲酰基。
在前述的某些甚至更特定的实施方式中，M的各具体值独立地是二甲基氨基茋，喹吖啶酮，氟苯基-二甲基-BODIPY，his-氟苯基-BODIPY，吖啶，骈三萘(terrylene)，联六苯，卟啉，苯并芘，(氟苯基-二甲基-二氟硼杂-二氮杂-引达省)苯基，(二-氟苯基-二氟硼杂-二氮杂-引达省)苯基，四联苯，联-苯并噻唑，三联-苯并噻唑，联萘，联蒽，方酸(squaraine)，方酸鎓(squarylium)，9,10-乙炔基蒽或三联-萘部分。在其它实施方式中，M的各具体值独立地是对-三联苯，苝，偶氮苯，吩嗪，菲咯啉，吖啶，噻吨，红荧烯，蒄，菁蓝，苝酰亚胺，或苝酰胺或其衍生物。在还更多实施方式中，M的各具体值独立地是香豆素染料，试卤灵染料，二吡咯甲烯硼二氟化物染料，钌联吡啶染料，能量转移染料，噻唑橙染料，聚甲炔染料或N-芳基-1,8-邻萘二甲酰亚胺染料。
在任何前述的还更多实施方式中，M的各具体值是相同的。在其它实施方式中，各M是不同的。在还更多实施方式中，一个或多个M是相同的而一个或多个M是不同的。
在某些实施方式中，M是芘，苝，苝一酰亚胺或6-FAM或其衍生物。在某些其它实施方式中，M具有下述结构之一：
尽管包含羧酸基团的M部分在上文以阴离子形式(CO2 -)描述，本领域技术人员将理解其将取决于pH变化，而质子化形式(CO2H)包括在各种实施方式中。
在某些特定实施方式中，化合物是选自表2的化合物。表2的化合物根据实施例描述的程序制备和由质谱确认其身份。
表2.结构I的示范性化合物
*TBD＝待确定
如表2和本申请通篇所用，R2，R3，m，n和L′具有为结构(I)化合物提供的定义，除非另有指定，而F，F′和F″分别是指具有下述结构的荧光素部分：
"dT"是指下述结构：
某些实施方式包括任何前述化合物，包括表2中提供的特定化合物，其缀合至靶向部分比如抗体。
本公开一般地提供化合物，其具有相对早先已知的化合物增加的荧光发射。相应地，某些实施方式涉及包含Y个荧光部分M的荧光化合物，其中所述荧光化合物具有在预定波长紫外光激发下的峰值荧光发射，其是单个M部分在相同波长紫外光激发下的峰值荧光发射的Y倍的至少85％，和其中Y是2或更大的整数。荧光化合物包括在用光比如紫外光激发的情况下发出荧光信号的化合物。
在某些实施方式中，荧光化合物具有峰值荧光发射，其是单个M部分的峰值荧光发射的Y倍的至少90％，95％*Y倍，97％*Y倍或99％*Y倍。
在某些实施方式中，Y是2至100，例如2-10的整数。
在某些实施方式中，所述Y个M部分独立地具有下述结构之一：
其中指出与荧光化合物的连接点。
在其它实施方式中，单个M部分独立地具有下述结构之一：
在更特定的实施方式中，荧光化合物包含Y个M部分，所述部分独立地具有下述结构之一：
其中指出与荧光化合物的连接点，和单个M部分具有下述结构：
在其它实施方式中，峰值荧光发射位于范围约500至约550nm的波长。
在还更多实施方式中，荧光化合物包含至少一个氧化乙烯部分。
还提供组合物，包含权利要求中任一项的荧光化合物和分析物。
目前公开的化合物是"可调的"，意味着通过合适选择任何前述化合物的变量，本领域技术人员能够获得具有希望和/或预先确定的摩尔荧光(摩尔亮度)的化合物。化合物的可调性允许使用者容易地获得具有希望荧光和/或颜色的化合物，用于特定测试或用于鉴定有关的特定分析物。尽管全部变量都可以对化合物的摩尔荧光具有效果，合适选择M、L4、m和n据信在化合物的摩尔荧光中发挥重要作用。相应地，在一种实施方式中提供获得具有希望摩尔荧光的化合物的方法，所述方法包括选择具有已知荧光的M部分，制备包含M部分的结构(I)化合物，和为L4、m和n选择适当变量以获得所希望的摩尔荧光。
摩尔荧光在某些实施方式中能够表示为相对母体荧光团(例如单体)荧光发射的增加或降低倍数。在某些实施方式中，本发明化合物的摩尔荧光是相对母体荧光团1.1x，1.5x，2x，3x，4x，5x，6x，7x，8x，9x 10x或甚至更高。各种实施方式包括通过适当选择L4、m和n制备具有相对母体荧光团希望的荧光倍数增加的化合物。
为了便于举例说明，包含磷部分(例如磷酸盐/酯等)的各种化合物描述为阴离子状态(例如-OPO(OH)O-，-OPO3 2-)。本领域技术人员将容易地理解电荷取决于pH而未带电的(例如质子化，或盐比如钠或其它阳离子)形式也包括在本发明实施方式的范围内。
包含任何前述化合物和一种或多种分析物分子(例如生物分子)的组合物提供于各种其它实施方式中。在某些实施方式中，也提供所述组合物在分析方法中用于检测一种或多种分析物分子的应用。
在其它实施方式中，化合物可用于各种分析方法。例如，在某些实施方式中本公开提供染色样品的方法，所述方法包括向所述样品加入结构(I)化合物，例如其中R2或R3之一是包含连接至分析物分子(例如生物分子)或微粒的共价键的连接体，而R2或R3中另一个是H，OH，烷基，烷氧基，烷基醚或-OP(＝Ra)(Rb)Rc，其量足以在以适当波长光照所述样品的情况下产生光学响应。
在前述方法的某些实施方式中，R2是连接体，包含与分析物分子比如生物分子的共价连接。例如，核酸，氨基酸或其聚合物(例如多核苷酸或多肽)。在还更多实施方式中，生物分子是酶，受体，受体配体，抗体，糖蛋白，适体或朊病毒。
在前述方法的其它实施方式中，R2是连接体，包含与固体载体比如微粒的共价连接。例如，在某些实施方式中微粒是聚合物珠或非聚合物珠。
在甚至更多实施方式中，所述光学响应是荧光响应。
在其它实施方式中，所述样品包含细胞，和某些实施方式还包括通过流式细胞术观察所述细胞。
在还更多实施方式中，方法还包括将所述荧光响应区别于具有检测上不同的光学特性的第二荧光团的荧光相应。
在其它实施方式中，本公开提供视觉检测分析物分子比如生物分子的方法，包括：
(a)提供结构(I)化合物，例如其中R2或R3之一包含与分析物分子的共价键的连接体，而R2或R3中另一个是H，OH，烷基，烷氧基，烷基醚或-OP(＝Ra)(Rb)Rc；和
(b)通过其可视特性检测化合物。
在某些实施方式中分析物分子是核酸，氨基酸或其聚合物(例如多核苷酸或多肽)。在还更多实施方式中，分析物分子是酶，受体，受体配体，抗体，糖蛋白，适体或朊病毒。
在其它实施方式中，提供视觉检测分析物分子比如生物分子的方法，所述方法包括：
(a)将任何前述化合物与一种或多种分析物分子混合；和
(b)通过其可视特性检测化合物。
在其它实施方式中提供视觉检测分析物分子的方法，所述方法包括：
(a)将权利要求1的化合物，其中R2或R3是Q或包含与Q的共价键的连接体，与分析物分子混合；
(b)形成化合物和分析物分子的缀合物；和
(c)通过其可视特性检测所述缀合物。
其它示范性方法包括检测分析物的方法，所述方法包括：
(a)提供结构(I)化合物，其中R2或R3包含连接体，所述连接体包含与靶向部分的共价键，所述靶向部分具有对分析物的特异性；
(b)混合化合物和分析物，由此使靶向部分和分析物结合；和
(c)检测化合物，例如通过其可视特性或荧光特性进行。
在前述方法的某些实施方式中，分析物是颗粒比如细胞，和所述方法包括流式细胞术的应用。例如，可以向化合物提供靶向部分比如抗体，以选择性结合希望的细胞，从而使得细胞可以通过任何数量的技术比如可视检测或荧光检测来检测。适当的抗体能够由本领域普通技术人员取决于所希望的终端应用选择。用于某些实施方式中的示范性抗体包括UCHT1和MOPC-21。
本发明化合物的实施方式从而用于任何数量的方法，包括但不限于：细胞计数；细胞分选；生物标记检测；定量细胞凋亡；确定细胞存活率；鉴定细胞表面抗原；确定总DNA和/或RNA含量；鉴定特定核酸序列(例如作为核酸探针)；和诊断疾病比如血癌。
除了上述方法之外，结构(I)化合物的实施方式还用于各种学科和方法，包括但不限于：在内窥镜术过程中成像以鉴定癌性组织和其它组织；单细胞和/或单分子分析方法，例如几乎不用或不用扩增地检测多核苷酸；癌症成像，例如在结构(I)化合物中包括靶向部分比如抗体或糖或优先结合癌细胞的其它部分；在手术操作中成像；结合组蛋白以鉴定各种疾病；药物递送，例如在结构(I)化合物中用M部分替换活性药物部分；和/或在牙科工作和其它程序中的造影剂，例如结构(I)化合物优先结合各种菌丛和/或有机体。
应理解如上文描述的结构(I)化合物的任何实施方式，和如上文对结构(I)化合物中R1、R2、R3、R4、R5、L'、L1、L2、L3、L4、M、m和/或n变量描述的任何特定选择，可以独立地与结构(I)化合物的其它实施方式和/或变量组合以形成上文并未具体描述的本发明实施方式。此外，如果在具体实施方式和/或权利要求中对任何特定R1、R2、R3、R4、R5、L'、L1、L2、L3、L4、M、m和/或n变量列出了特选列表，应理解各单独选项可以从具体实施方式和/或权利要求删除，并且剩余的特选列表视为属于本发明范围以内。
应理解在本说明书中，所描述式的取代基和/或变量的组合是可以允许的，只要这种贡献获得稳定化合物。
本领域技术人员还应认识到，在本文描述的过程中中间体化合物的官能团可以需要被适宜保护基团保护。所述官能团包括羟基，氨基，巯基和羧酸。羟基的适宜保护基团包括三烷基甲硅烷基或二芳基烷基甲硅烷基(例如叔丁基二甲基甲硅烷基，叔丁基二苯基甲硅烷基或三甲基甲硅烷基)，四氢吡喃基，苄基等。氨基，脒基和胍基的适宜保护基团包括叔丁氧基羰基，苄氧基羰基等。巯基的适宜保护基团包括-C(O)-R"(其中R"是烷基，芳基或芳基烷基)，对-甲氧基苄基，三苯甲基等。羧酸的适宜保护基团包括烷基，芳基或芳基烷基酯。保护基团可以按照标准技术加入或除去，其是本领域技术人员已知的和如本文描述的。保护基团的使用详细描述于Green,T.W.and P.G.M.Wutz,Protective Groups in OrganicSynthesis(1999),3rd Ed.,Wiley。本领域技术人员会理解保护基团还可以是聚合物树脂比如Wang树脂，Rink树脂或2-氯三苯甲基-氯化物树脂。
另外，以游离碱或酸形式存在的全部本发明化合物能够通过用适当无机或有机碱或酸借助本领域技术人员已知的方法处理转化为它们的盐。本发明化合物的盐能够通过标准技术转化为它们的游离碱或酸形式。
下述反应方案说明制备本发明化合物的示范性方法。应理解本领域技术人员可以能够通过相似方法或通过组合本领域技术人员已知的其它方法来制备这些化合物。还应理解本领域技术人员能够通过用适当的初始组分并视需要修饰合成参数以与如下描述相似的方式制备并未具体说明如下的其它结构(I)化合物。通常，初始组分可以得自来源比如Sigma Aldrich，Lancaster Synthesis，Inc.，Maybridge，Matrix Scientific，TCI，和Fluorochem USA等或者根据本领域技术人员已知的来源合成(参见例如Advanced OrganicChemistry:Reactions,Mechanisms,and Structure,5th edition(Wiley,December2000))或如本发明的描述制备。
反应方案I
反应方案I说明制备用于制备结构(I)化合物的中间体的示范性方法，其中R1、L2、L3和M如前文所定义，R2和R3如前文所定义或是其保护变型而L是任选的连接体。参照反应方案1，结构a化合物能够购买或通过本领域普通技术人员熟知的方法制备。a与M-X(其中x是卤素比如溴)在本领域已知的Suzuki偶联条件下的反应引起结构b化合物。结构b化合物能够用于制备结构(I)化合物，描述如下。
反应方案II
反应方案II说明制备用于制备结构(I)化合物的中间体的备择方法。参照反应方案II，其中R1、L1、L2、L3、G和M如前文所定义，而R2和R3如前文所定义或是其保护变型，能够购买或通过熟知技术制备的结构c化合物与M-G'反应产生结构d化合物。在此，G和G'代表具有互补反应性的官能团(也即反应形成共价键的官能团)。G’可以侧挂至M或是M结构骨架的一部分。G和G'可以是任何数量的本文描述的官能团比如分别是炔和叠氮化物，胺和活化的酯，或者胺和异硫氰酸酯等。
结构(I)化合物可以通过在熟知的自动化DNA合成条件下与具有下述结构(e)的亚磷酰胺化合物反应而制备自结构b或d之一：
其中A如本文定义和各L独立地是任选的连接体。
DNA合成方法是本领域熟知的。简言之，两个醇基团例如上述中间体b或d的R2和R3分别被二甲氧基三苯甲基(DMT)基团和2-氰基乙基-N,N-二异丙基氨基亚磷酰胺基团官能化。亚磷酰胺基团一般在活化剂比如四唑存在下偶联至醇基团，随后用碘氧化磷原子。二甲氧基三苯甲基能够用酸(例如氯乙酸)除去以暴露游离醇，其能够与亚磷酰胺基团反应。2-氰基乙基能够在低聚化之后用氨水处理除去。
制备用于低聚化方法中的亚磷酰胺也是本领域熟知的。例如，伯醇(例如R3)能够通过与DMT-Cl反应保护为DMT基团。仲醇(例如R2)则通过与适当试剂比如2-氰基乙基N,N-二异丙基氯亚磷酰胺反应官能化为亚磷酰胺。制备亚磷酰胺和它们低聚化的方法是本领域熟知的并且更加详细地描述于实施例中。
结构(I)化合物制备如下：根据上文描述的熟知亚磷酰胺化学使中间体b或d和e低聚化。通过将亚磷酰胺偶联重复希望次数将希望数量的m和n重复单元并入分子。应认识到描述如下的结构(II)化合物能够通过类似方法制备。
在各种其它实施方式中，提供用于制备结构(I)化合物的化合物。化合物能够如上文描述以单体、二聚体和/或低聚形式制备，然后M部分经由任何数量的合成方法(例如上文描述的"点击"反应)共价连接至化合物以形成结构(I)化合物。相应地，在各种实施方式中提供具有下述结构(II)的化合物：
或其立体异构体、盐或互变异构体，其中：
G的各具体值独立地是包含反应性基团或其经保护的类似物的部分，能够与互补反应性基团形成共价键；
L1a，L2和L3的各具体值独立地是任选的亚烷基，亚烯基，亚炔基，杂亚烷基，杂亚烯基，杂亚炔基或杂原子连接体；
L4的各具体值独立地是长度大于三个原子的杂亚烷基，杂亚烯基或杂亚炔基连接体，其中杂亚烷基、杂亚烯基和杂亚炔基连接体中的杂原子选自O、N和S；
R1的各具体值独立地是H，烷基或烷氧基；
R2和R3各自独立地是H，OH，SH，烷基，烷氧基，烷基醚，杂烷基，-OP(＝Ra)(Rb)Rc，Q或L'；
R4的各具体值独立地是OH，SH，O-，S-，ORd或SRd；
R5的各具体值独立地是氧代，硫代或不存在；
Ra是O或S；
Rb是OH，SH，O-，S-，ORd或SRd；
Rc是OH，SH，O-，S-，ORd，OL'，SRd，烷基，烷氧基，烷基醚，烷氧基烷基醚，磷酸盐/酯，硫代磷酸盐/酯，磷酸基烷基，硫代磷酸基烷基，磷酸基烷基醚或硫代磷酸基烷基醚；
Rd是平衡离子；
Q的各具体值独立地是包含反应性基团或其经保护的类似物的部分，能够与分析物分子、靶向部分、固体载体或互补反应性基团Q′形成共价键；
L'的各具体值独立地是包含与Q的共价键的连接体，包含与靶向部分的共价键的连接体，包含与分析物分子的共价键的连接体，包含与固体载体的共价键的连接体，包含与固体载体残基的共价键的连接体，包含与核苷的共价键的连接体或包含与又一结构(II)化合物的共价键的连接体；
m的各具体值独立地是0或更大的整数，条件是m的至少一个具体值是1或更大的整数；和
n是1或更大的整数。
在结构(II)的其它实施方式中：
G的各具体值独立地是包含反应性基团的部分，所述反应性基团能够与互补反应性基团形成共价键；
L1a，L2和L3的各具体值独立地是任选的亚烷基，亚烯基，亚炔基，杂亚烷基，杂亚烯基，杂亚炔基或杂原子连接体；
L4的各具体值独立地是长度大于三个原子的杂亚烷基、杂亚烯基或杂亚炔基连接体，其中杂亚烷基、杂亚烯基和杂亚炔基连接体中的杂原子选自O、N和S；
R1的各具体值独立地是H，烷基或烷氧基；
R2和R3各自独立地是H，OH，SH，烷基，烷氧基，烷基醚，-OP(＝Ra)(Rb)Rc，Q，包含与Q的共价键的连接体，包含与分析物分子的共价键的连接体，包含与固体载体的共价键的连接体或包含与其它结构(II)化合物的共价键的连接体，其中：Ra是O或S；Rb是OH，SH，O-，S-，ORd或SRd；Rc是OH，SH，O-，S-，ORd，SRd，烷基，烷氧基，烷基醚，烷氧基烷基醚，磷酸盐/酯，硫代磷酸盐/酯，磷酸基烷基，硫代磷酸基烷基，磷酸基烷基醚或硫代磷酸基烷基醚；和Rd是平衡离子；
R4的各具体值独立地是OH，SH，O-，S-，ORd或SRd；
R5的各具体值独立地是氧代，硫代或不存在；
Q的各具体值独立地是包含反应性基团的部分，所述反应性基团能够与分析物分子、固体载体或互补反应性基团Q′形成共价键；
m的各具体值独立地是0或更大的整数，条件是m的至少一个具体值是1或更大的整数；和
n是1或更大的整数。
结构(II)化合物中的G部分能够选自包含基团的任何部分，所述基团具有适当的反应性基团以与M部分上的互补基团形成共价键。在示范性实施方式中，G部分能够选自本文描述的任何Q部分，包括表1中提供的那些特定实例。在某些实施方式中，G的各具体值独立地包含适于反应的部分，所述反应包括：叠氮化物和炔形成三唑的铜催化反应(Huisgen1,3-偶极环加成)，二烯和亲双烯体的反应(Diels-Alder)，张力促进的炔-硝酮环加成，张力烯烃与叠氮化物、四嗪或四唑的反应，烯烃和叠氮化物[3+2]环加成，烯烃和四嗪的逆需求Diels-Alder反应，烯烃和四唑光反应和各种取代反应，比如离去基团被亲电原子上的亲核进攻取代。
在某些实施方式中，G的各具体值独立地是包含下述的部分：醛，肟，腙，炔，胺，叠氮化物，酰基叠氮化物，酰卤，腈，硝酮，氢硫基，二硫化物，磺酰卤，异硫氰酸酯，亚氨酸酯，活化的酯，酮，α,β-不饱和羰基，烯烃，马来酰亚胺，α-卤代酰亚胺，环氧化物，氮丙啶，四嗪，四唑，膦，生物素或硫杂环丙烷官能团。
在其它实施方式中，G的各具体值独立地包含炔或叠氮化物基团。在其它实施方式中，G的各具体值独立地包含氨基，异硫氰酸酯或活化的酯基团。在不同的实施方式中，G的各具体值独立地包含反应性基团，其在与互补反应性基团反应的情况下能够形成包含烯烃，酯，酰胺，硫代酯，二硫化物，碳环，杂环或杂芳基的官能团。例如，在某些实施方式中杂芳基是三唑基。
在结构(II)化合物的各种其它实施方式中，L2和L3的各具体值独立地是C1-C6亚烷基，C2-C6亚烯基或C2-C6亚炔基。
在其它实施方式中，化合物具有下述结构(IIA)：
其中：
x1，x2，x3和x4的各具体值独立地是0至6的整数。
在结构(II)的其它实施方式中，各L1a是不存在。在其它实施方式中，各L1a是存在，例如L1a的各具体值独立地是杂亚烷基。在某些实施方式中，L1a具有下述结构：
在化合物(II)的其它任何前述实施方式中，G的各具体值独立地是
在结构(IIA)化合物的各种实施方式中，x1，x2，x3或x4的至少一个具体值是1。在其它实施方式中，x1，x2，x3和x4的各具体值各自是1。在其它实施方式中，x1和x3的各具体值各自是0。在某些实施方式中，x2和x4的各具体值各自是1。在其它实施方式中，x1和x3的各具体值各自是0，而x2和x4的各具体值各自是1。
在结构(II)或(IIA)化合物的某些其它实施方式中，L4的各具体值独立地是杂亚烷基连接体。在其它更特定的实施方式中，L4的各具体值独立地是氧化烯烃连接体。例如，在某些实施方式中L4是聚氧化乙烯，和化合物具有下述结构(IB)：
其中z是2至100的整数，例如3至6的整数。
在其它实施方式中，R4的各具体值独立地是OH，O-或ORd，而在不同的实施方式中R5的各具体值是氧代。
在任何前述结构(II)或(IIa)化合物的某些不同的实施方式中，R1是H。
在结构(II)化合物的其它各种实施方式中，R2和R3各自独立地是OH或-OP(＝Ra)(Rb)Rc。在某些不同的实施方式中，R2或R3是OH或-OP(＝Ra)(Rb)Rc，而R2或R3中另一个是Q或包含与Q的共价键的连接体。
在任何前述结构(II)化合物的更多不同实施方式中，R2和R3各自独立地是-OP(＝Ra)(Rb)Rc。在这些实施方式的某些中，Rc是OL'。
在结构(II)的其它实施方式中，R2和R3各自独立地是-OP(＝Ra)(Rb)OL'，而L'是与下述的杂亚烷基连接体：Q，靶向部分，分析物(例如分析物分子)，固体载体，固体载体残基，核苷或其它结构(II)化合物。
连接体L'能够是适于将Q、靶向部分、分析物(例如分析物分子)、固体载体、固体载体残基、核苷或其它结构(II)化合物与结构(II)化合物连接的任何连接体。有利地，某些实施方式包括使用所选的L'部分来增加或优化化合物的水溶解度。在某些实施方式中，L'包含氧化烯烃或磷酸二酯部分，或其组合。
在某些实施方式中，L'具有下述结构：
其中：
m”和n”独立地是1至10的整数；
Re是H，电子对或平衡离子；
L”是Re或与下述的直连键或连接体：Q，靶向部分，分析物(例如分析物分子)，固体载体，固体载体残基，核苷或其它结构(II)化合物。
在某些前述实施方式中，靶向部分是抗体或细胞表面受体拮抗剂。
在任何前述结构(II)化合物的其它更特定的实施方式中，R2或R3具有下述结构之一：
结构(II)化合物的某些实施方式能够根据固相合成方法制备，类似于本领域制备寡核苷酸已知的那些。相应地，在某些实施方式中，L'是与固体载体、固体载体残基或核苷的连接体。包含活化的脱氧胸苷(dT)基团的固体载体可容易地获得，和在某些实施方式中能够用作制备结构(II)化合物的原料。相应地，在某些实施方式中R2或R3具有下述结构：
在结构(II)化合物的其它实施方式中，Q的各具体值独立地是包含反应性基团的部分，所述反应性基团能够与分析物分子或固体载体形成共价键。在其它实施方式中，Q的各具体值独立地是包含反应性基团的部分，所述反应性基团能够与互补反应性基团Q′形成共价键。例如，在某些实施方式中，Q′存在于又一结构(II)化合物上(例如R2或R3位置)，而Q和Q′包含互补反应性基团从而结构(II)化合物和所述又一结构(II)化合物的反应获得结构(II)化合物的共价结合的二聚体。多聚体结构(II)化合物还能够以类似方式制备并包括在本发明实施方式范围内。
Q基团的类型和Q基团与结构(II)化合物其余部分的连接性并不受限，条件是Q包含具有适当反应性以形成希望的键的部分。
在结构(II)化合物的某些实施方式中，Q是在含水条件下不易水解的部分，但具有充足反应性与分析物分子或固体载体上的相应基团(例如胺，叠氮化物或炔)成键。
结构(II)化合物的某些实施方式包含在生物缀合领域一般使用的Q基团。例如在某些实施方式中，Q包含亲核反应性基团，亲电反应性基团或环加成反应性基团。在某些更特定的实施方式中，Q包含氢硫基，二硫化物，活化的酯，异硫氰酸酯，叠氮化物，炔，烯烃，二烯，亲双烯体，酰卤，磺酰卤，膦，α-卤代酰胺，生物素，氨基或马来酰亚胺官能团。在某些实施方式中，活化的酯是N-琥珀酰亚胺酯，亚氨酸酯或聚氟苯基酯。在其它实施方式中，炔是烷基叠氮化物或酰基叠氮化物。
结构(II)化合物的示范性Q部分提供于上文表I。
正如结构(I)化合物，在结构(II)化合物的某些实施方式中，其中Q是SH，所述SH部分将倾向于与又一结构(II)化合物上的又一氢硫基形成二硫化物键。相应地，某些实施方式包括结构(II)化合物，其呈二硫化物二聚体形式，所述二硫化物键衍生自SH Q基团。
在结构(II)化合物的某些其它实施方式中，R2或R3之一是OH或-OP(＝Ra)(Rb)Rc，而R2或R3中另一个是包含与分析物分子的共价键的连接体，包含与靶向部分的共价键的连接体或包含与固体载体的共价键的连接体。例如，在某些实施方式中分析物分子是核酸，氨基酸或其聚合物。在其它实施方式中，分析物分子是酶，受体，受体配体，抗体，糖蛋白，适体或朊病毒。在某些实施方式中，靶向部分是抗体或细胞表面受体拮抗剂。在不同的实施方式中，固体载体是聚合物珠或非聚合物珠。
在结构(II)化合物的其它实施方式中，m的各具体值独立地是1至10的整数。例如，在某些实施方式中m的各具体值独立地是1至5的整数，比如1，2，3，4或5。在某些实施方式中，m是1。在某些实施方式中，m是2。在某些实施方式中，m是3。在某些实施方式中，m是4。在某些实施方式中，m是5。
在结构(II)化合物的不同实施方式中，n是1至100的整数。例如，在某些实施方式中n是1至10的整数。在某些实施方式中，n是1。在某些实施方式中，n是2。在某些实施方式中，n是3。在某些实施方式中，n是4。在某些实施方式中，n是5。在某些实施方式中，n是6。在某些实施方式中，n是7。在某些实施方式中，n是8。在某些实施方式中，n是9。在某些实施方式中，n是10。
在其它不同的实施方式中，结构(II)化合物选自表3。
表3.示范性结构(II)化合物
在各种实施方式中，表3化合物中的G是炔基，比如乙炔基。在其它实施方式中，表3化合物中的G是叠氮化物。在其它实施方式中，表3化合物中的G是氨基(NH2)。在其它实施方式中，表3化合物中的G是异硫氰酸酯。在其它实施方式中，表3化合物中的G是活化的酯，比如N-羟基琥珀酰亚胺的酯。
结构(II)化合物能够用于各种方法中，例如在实施方式中提供标记分析物比如分析物分子或靶向部分的方法，所述方法包括：
(a)将任何描述的结构(II)化合物，其中R2或R3是Q或包含与Q的共价键的连接体，与分析物分子混合；
(b)形成化合物和分析物或靶向部分的缀合物；和
(c)将所述缀合物与式M-L1b-G′化合物反应，由此通过至少一个G和至少一个G′的反应形成至少一个共价键，
其中：
M是包含两个或更多个碳-碳双键和至少一个共轭度的部分；
L1b是任选的亚烷基，杂亚烷基或杂原子连接体；和
G′是与G互补的反应性基团。
不同的实施方式是标记分析物比如分析物分子或靶向部分的方法，所述方法包括：
(a)将本文公开的任何结构(II)化合物，其中R2或R3是Q或包含与Q的共价键的连接体，与式M-L1b-G′化合物混合，由此通过G和G′的反应形成至少一个共价键；和
(b)将步骤(A)产物与分析物或靶向部分反应，由此形成步骤(A)产物和分析物分子的缀合物，
其中：
M是包含两个或更多个碳-碳双键和至少一个共轭度的部分；
L1b是任选的亚烷基，杂亚烷基或杂原子连接体；和
G′是与G互补的反应性基团。
此外，如上文所述结构(II)化合物用于制备结构(I)化合物。相应地，在一种实施方式中提供制备结构(I)化合物的方法，所述方法包括将结构(II)化合物与式M-L1b-G′化合物混合，由此通过G和G′的反应形成至少一个共价键，其中：
M是包含两个或更多个碳-碳双键和至少一个共轭度的部分；
L1b是任选的亚烷基，杂亚烷基或杂原子连接体；和
G′是与G互补的反应性基团。
提供下述实施例的目的是举例说明而并非限制。
实施例
一般方法
质谱分析在Waters/Micromass Quattro micro MS/MS系统(MS单模式)进行，用MassLynx 4.1采集软件。用于染料LC/MS的流动相是100mM 1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇(HFIP)，8.6mM三乙胺(TEA)，pH 8。亚磷酰胺和前体分子也用Waters Acquity UHPLC系统分析，具有2.1mm x 50mm Acquity BEH-C18柱，保持在45℃，采用乙腈/水流动相梯度。单体中间体的分子量在Waters/Micromass Quattro micro MS/MS系统(MS单模式)上用鎓阳离子输注增强离子化获得。激发和发射特征实验在Cary Eclipse谱图光度计上记录。
全部反应在炉干的玻璃仪器中在氮气氛下进行，除非另有说明。可商购的DNA合成试剂购自Glen Research(Sterling，VA)。无水的吡啶，甲苯，二氯甲烷，二异丙基乙基胺，三乙胺，乙酸，吡啶和THF购自Aldrich。全部其它化学品购自Aldrich或TCI并原样用作不加额外纯化。
实施例1
用乙二醇间隔物合成染料
具有氧化乙烯连接体的化合物制备如下：
低聚荧光核苷类似物(oligofluoroside)结构(也即结构(I)化合物)在AppliedBiosystems 394DNA/RNA合成器上以1μmol规模合成和具有3’-磷酸基团或3’-S2-(CH2)6-OH基团或本文描述的任何其它基团。合成在CPG珠或在聚苯乙烯固体载体上用标准亚磷酰胺化学直接进行。低聚荧光核苷类似物以3’至5’方向用标准固相DNA方法合成，和用标准β-氰基乙基亚磷酰胺化学偶联。将荧光核苷类似物亚磷酰胺和间隔物(例如六乙氧基-二醇亚磷酰胺，三乙基氧基-二醇亚磷酰胺，聚乙二醇亚磷酰胺)和连接体(例如，5’-氨基-调节剂亚磷酰胺和硫醇-调节剂S2亚磷酰胺)溶于乙腈制得0.1M溶液，和用下述合成循环依次添加：1)在二氯甲烷中用二氯乙酸除去5’-二甲氧基三苯甲基保护基团，2)在乙腈中将下一个亚磷酰胺与活化剂偶联，3)用碘/吡啶/水氧化P(III)以形成稳定的P(v)，和4)用乙酸酐/1-甲基咪唑/乙腈封端任何未反应的5’-羟基。重复合成循环直至组装好完整长度低聚荧光核苷类似物结构。在链组装末尾，在二氯甲烷中用二氯乙酸除去一甲氧基三苯甲基(MMT)基团或二甲氧基三苯甲基(DMT)基团。
在受控孔隙玻璃(CPG)载体上在标记的离心管中以0.2umol规模提供化合物。加入400μL 20-30％NH4OH和温和混合。将开口管置于55℃持续～5分钟或直至过量气体被释放，然后紧密封闭和温育2hrs(+/-15分钟。)。将管从加热块移除和使其达到室温，随后于13,400RPM离心30秒以固定上清液和固体。仔细除去上清液，置于标记的管中，然后加入150μL乙腈以洗涤载体。在洗涤液加入管中之后，将其置入40℃的CentriVap设备直至干燥。
产品通过ESI-MS(参见表2)，UV-吸光度，和荧光光谱表征。
实施例2
化合物的光谱测试
干燥的化合物在150μL 0.1M Na2CO3缓冲剂中重构以制得～1mM储备液。浓缩储备液在0.1x PBS中稀释50x和在NanoDrop UV光谱仪上分析以后的吸光读数。吸光读数与消光系数(75,000M-1cm-1，各FAM单元)和Beer定律一起使用以确定储备液真实浓度。
从计算的储备浓度，在0.1M Na2CO3(pH 9)中制备～4mL的5μM溶液和在1x 1cm石英池中于Cary 60UV光谱仪上分析，用300nm至700nm的光谱范围，以测量相对基团的总吸光度。从这些5μM溶液进行50nM或25nM(也在0.1M Na2CO3中，pH 9)的第二稀释，用于CaryEclipse荧光计上的光谱分析。激发设于494nm而从499至700nm收集发射谱图。
图1和图2提供代表性结构(I)化合物和比较化合物("化合物A")的紫外吸光度。如图1和2所示，包含两个荧光素部分的代表性结构(I)化合物的UV消光系数是化合物A的大约两倍。
化合物A
代表性结构(I)化合物的荧光发射谱图也加以确定并与化合物A的发射光谱相比。如图3和4的数据展示，代表性结构(I)化合物的荧光发射高于化合物A，和发射随着三甘醇或六乙二醇单元的数量增加而增加。虽然不期望受理论所限，据信该出乎意料的荧光发射增加涉及内部猝灭的减少，其与L4提供的空间距离有关。
测试化合物I-10和I-11以确定M部分的数量对化合物紫外吸光度和荧光发射的效果。图5提供数据，于5μm将化合物I-10和I-11的紫外吸光度与具有单个M部分的比较化合物("化合物B")相比。在5uM，含有1个FAM单元的化合物B以0.43AU吸收，而化合物I-10(3个FAM单元)以1.17AU吸收和化合物I-11(5个FAM单元)以2.00AU吸收。
化合物B
化合物I-10，I-11和B于25nM的荧光发射谱图示于图6。不同于猝灭(隔开更紧密的FAM单元会如此)，化合物I-10和I-11显示与化合物B的值相比分别增加2.5x和4.3x的发射响应。
实施例3
比较荧光发射响应
制备化合物"HEG,""TEG,""C2,""C3,""C4"和"C6"，其中R2和R3如对化合物I-3的定义和m从1至9变化，和确定它们的荧光发射谱图。结果示于图7。数据显示，根据本发明实施方式的化合物(也即HEG和TEG)在较少重复的间隔物部分(也即较低m值)的情况下相对其它染料化合物具有增加的荧光发射。
图8提供数据比较"HEG"化合物相对化合物A的荧光发射，其中m是1、2或3(50nM，pH＝9)。数据显示，在m大于2的情况下，HEG相对化合物A荧光发射增加。
实施例4
制备代表性化合物
制备化合物I-29、I-32和代表性类似物并测试以确定是否L4是长连接体(～1,000道尔顿PEG)的化合物与具有较短L4连接体但是多次重复(也即m大于1)的化合物具有相似的特性。图9提供化合物I-60、化合物I-46和化合物B的紫外吸光度数据。数据显示具有长L4连接体的化合物与具有多次重复的较短连接体的那些化合物具有类似的紫外吸光度，并且两种化合物都具有相对对照化合物B增加的吸光度。
实施例5
制备99聚体染料
用如本文描述的标准固相寡核苷酸技术制备具有33个荧光素部分的化合物I-42。I-42(在下述方案中用"A"代表)如下文说明和描述三聚体化，以形成99聚体染料。
在200μL聚丙烯管中置入磷酸钠缓冲剂(3.5μL，100mM，pH＝6.5)和I-42双-二硫化物的溶液(5.5μL，0.18mM，在水中)。向其加入溶液三(2-羧乙基)膦(TCEP，1.0μL，10mM，在水中)。将管封端，涡流搅拌和在室温下温育2h。混合物通过微Zeba Spin脱盐柱(Pierce，Cat#89877)脱盐。脱盐的溶液用磷酸钠缓冲剂(2.0μL，500mM，pH＝7.2)和双马来酰亚胺基乙烷的DMSO溶液(BMOE，1.0μL，0.25mM)处理和在室温下温育过夜。反应混合物用水稀释(100μL)和用PAGE分析(图10，Invitrogen EC6875，10％TBE-尿素凝胶，180V恒定，最高MW种类拆分完成即停止电泳，通过UV光照(365nm)可视化)。
具有任何希望数量染料部分的其它低聚物染料以类似的方式制备。
实施例6
一般流式细胞术方法
除非另有指出，下述一般程序用于全部下文实施例。
全血的裂解：
缓冲氯化铵方法。为了染色活细胞，将乙二胺四乙酸盐(EDTA)抗凝的普通人类血液用氯化铵溶液(ACK)批量裂解，15mL血液对35mL在室温下(RT)裂解15分钟。细胞用50％Hank's平衡盐溶液(HBSS)和50％1％胎牛血清(FBS)1x Dulbecco's磷酸缓冲盐水(DPBS)(含0.02％叠氮化钠)洗涤两次。然后将细胞在供体血浆中再悬浮为100μL/试验/0.1-1x10e6。在聚丙烯96孔HTS板中，将血浆细胞加入预稀释的100μL的Vf抗体，1％牛血清白蛋白(BSA)和含0.02％叠氮化钠的1x DPBS。在RT温育45分钟之后，将细胞用50％HBSS和50％-1％FBS 1x DPBS(含0.02％叠氮化钠)洗涤两次。
裂解/固定方法。血液用1.0mL RBC裂解溶液(氯化铵)裂解，100-15mL血液对35mL在RT裂解15分钟。细胞然后用50％HBSS和50％-1％FBS 1x DPBS(含0.02％叠氮化钠)洗涤两次。然后将细胞在供体血浆中再悬浮为100μL/试验/1x10e6。将预稀释的抗体加入100μL1％BSA和1x DPBS(含0.02％叠氮化钠)。将100μL细胞加入96孔聚丙烯HTS板(共200μL试验规模)。在RT温育45分钟之后，将细胞用50％HBSS和50％1％FBS 1x DPBS(含0.02％叠氮化钠)洗涤两次。
制备抗体缀合物：
抗体缀合物制备如下：将包含具有下述结构的Q部分的结构(I)化合物：
与希望抗体反应。从而化合物和抗体通过抗体上的S与Q部分的反应缀合形成下述连接结构：
抗体缀合物通过抗体名称和随后的化合物编号指明。例如，UCHT1-I-45指出化合物I-45和UCHT1抗体形成的缀合物。如果所引化合物编号不包括上述表2的Q部分，应理解安置了Q部分且所述缀合物制备自具有Q部分的所得化合物。
缀合物的稀释：
使抗体达到RT。将抗体缀合物在细胞染色缓冲剂(1X DPBS，1％BSA，0.02％叠氮化钠)中稀释至0.1-540nM(8.0微克或更少每试验)范围的浓度。在某些实施例中，各样品的系列稀释开始于在细胞染色缓冲剂中的269nM抗体，和保持抗体稀释液避光直至使用。在其它实验中，稀释开始于4.0μg抗体/试验规模，试验规模的范围是100-200μL。滴定以两倍或四倍稀释进行以产生结合曲线。在某些情况下，8.0或2.0μg/试验规模用于稀释系列的第一孔中。
采用缀合物的流式细胞术：
在物理表征之后，测试缀合物的活性和功能(抗体结合亲和力和染料亮度)并与参比抗体染色相比。然后如下确定分辨率质量：使用流细胞计数器检查亮度，并与自体荧光阴性对照和其它非特异性结合比较。在测试I-45时并未包括对小鼠IgG1,k同种型对照MOPC-21缀合物的广泛研究，原因是MOPC-21非特异性结合已在早先测试中于测试UCHT1-化合物C和UCHT1-I-45期间表征。I-45缀合物在Jurkat T细胞、Ramos B细胞、和人血白细胞异质群体或外周血液单核细胞(PBMC)上测试，并且使用聚苯乙烯山羊-抗-小鼠Ig包覆的珠。全血筛选对于测试UCHT1I-45及其类似物是最常规的。由于新结构形成而进行桥连研究。在测试缀合物(UCHT1-I-56，I-48，I-49，I-16，和I-21B)时使用额外的流式细胞术方法，并且与Sony Biotechnology的抗体缀合物参比(UCHT1-FITC)和绝大多数研究中预先表征的关键桥连参比(例如UCHT1-I-45，UCHT1-I-49)比较。
化合物C
进行游离染料流式细胞术：
在分子和物理表征之后，也测试染料对细胞的潜在亲和力，与参比染料染色相比。因为染料具有也充当细胞探针并结合至细胞物质的能力，染料能够在高浓度(>100nM-至-10,000nM)对血液进行一般筛选以确定特定特征。然后通过评价在稀释时的亮度和线性来品评期望或出乎意料的脱靶结合，与自体荧光阴性对照和其它染料对照比较，使用流细胞计数器。化合物D(化合物C游离染料，但是非官能化的)的研究是染料亮脱靶结合的阳性对照并且已在缀合物形式中预先表征。在细胞用裂解和固定溶液处理的情况下，和在血液陈化的情况下，或在应用于PBMC单核细胞群体的情况下在人血白细胞异质群体上测试I-45染料。为了染料批次比较而进行评价亲和力(化合物D，I-45，I-49和I-16)的桥连研究，并且在表征化合物D时包括很早先研究的染料。
化合物D
流式细胞术工作流程：
培养细胞和观察代谢性应激的视觉征兆以用于染料筛选或脱靶结合(数据未显示)，或者将新鲜健康细胞用于缀合物筛选。周期地计数细胞以检查细胞密度(1x 10e5和1x10e6活细胞/mL)。(优选在板或管中)稀释抗体缀合物，随后在染色缓冲剂(DPBS，0.1％BSA，0.02％叠氮化钠)中收获细胞。使用存活率范围80-85％的细胞。细胞通过离心洗涤两次和用缓冲剂洗涤细胞除去pH指示剂，和用包含于FBS中的Ig和其它蛋白质阻断细胞。在染色缓冲剂中将细胞密度调节至试验规模。铺板细胞，1次试验/孔，或将染料(预稀释的)施用至板中的细胞。然后，细胞在23℃温育45分钟。细胞通过离心洗涤两次和用洗涤缓冲剂洗涤细胞，然后抽吸板。将细胞再悬浮于采集缓冲剂中。通过流式细胞术采集5000个完好细胞。
染料荧光通过488nM蓝色激光线借助流式细胞术检测，其中峰值发射(521nM)用525/50带通滤波器检测。通过流式细胞术采集至少1500个完好的细胞，采集目标是3000-5000个完好细胞，并且分析以鉴定细胞制备液中的活细胞。
数据分析方法：
描述性统计.EC-800软件允许使用者收集各样品采集的许多统计学数据。在通过流式细胞术查询的情况下和在检查噪音的情况下，用FL1-A通道中的平均值或中位数荧光强度(MFI)来度量抗体-染料试剂的亮度。评价其它统计数据以确定染料特征和试剂的总品质，包括中位数信噪比和绝对荧光(中位数或几何平均值)。
直方图.流式细胞术事件通过向前散射vs侧面散射(细胞体积vs细胞颗粒性)的规模来门控。那些细胞然后通过于515nm荧光发射的平均荧光强度(MFI)来门控。收集的数据展示为双参数直方图，用y-轴事件数vs x-轴log等级代表的荧光强度作图。数据可以概括为相对荧光强度的直方图或亲和力曲线。
结合曲线.选择MFI是原因是其是在通过FCM查询的情况下度量抗体-染料试剂亮度的最佳参数，其能够表示为几何平均值、中位数或平均值，并且代表绝对荧光度量。为了比较，在噪音能够被高度表征的情况下，信噪比报告为MFI，S/N。在实施例7、8和14中，显示UCHT1-化合物C缀合物的MFI vs浓度以展示试剂的结合曲线。
二变量、双参数直方图。在某些情况下，FCM事件并不进行门控以便检查定性输出，和数据表达为细胞颗粒性(SSC)vs染料荧光。该方法允许总体评价全血中回收的全部群体。
实施例7
用热应激JURKAT T细胞的坏死和凋亡群体评价染料的非特异性和脱靶结合
根据American Type Culture Collection(ATCC)提供的指南培养Jurkat细胞，收获活细胞，热应激，洗涤2-3x，和用缀合物抗体染色。通过将细胞应用于预稀释的染料和预稀释的缀合抗体进行染色，温育，洗涤，然后通过流式细胞术采集。评价死亡和坏死细胞群体(～10％的采集细胞)的荧光信号。结果示于图11。如图11所示，观察到与10x I-47、5x化合物E、5x I-44、3x化合物F和3x I-43相比荧光在10x化合物D游离染料中更高。
实施例8
评价缀合物的荧光强度：UCHT1-化合物G VS.UCHT1-I-51
根据ATCC提供的指南培养活Jurkat细胞并收获，然后在设置为23℃的控温离心机中在～225RCF恢复6分钟。除去上清液。然后将细胞在细胞悬浮液缓冲剂(不含钙和镁的1xDPBS，1.0％FBS，0.02％叠氮化钠，pH 7.2)中洗涤两次。在第二次洗涤之后，离心细胞，除去上清液，和将细胞(～5x105活细胞/样品)再悬浮为试验规模(最终体积100μL)。细胞用抗体染料缀合物溶液在RT温育45分钟。在温育之后，洗涤样品两次然后悬浮于采集缓冲剂中。
采集数据并在SONY EC-800FCM上评价，并且将nM抗体蛋白质vs相对荧光的几何平均值作图，如图12所示。可以发现，MOPC-21-化合物G具有非特异性结合，但是两种缀合物都比FITC参比更光亮4-5x。该实施例也显示MOPC21-I-51显示与UCHT1-化合物G缀合物相比降低的非特异性结合(于这些染料的标记(DOL)水平)。
实施例9
在异质细胞样品和外周全血细胞中评价CD3表达(特异性和分辨率)
从普通供体抽取全血进入EDTA稳定化的样品管用于运输和短期贮藏。血液用ACK裂解，15mL血液对35mL在RT裂解15分钟。细胞用50％Hanks平衡盐溶液(HBSS)和50％-1％FBS 1x DPBS(含0.02％叠氮化钠)洗涤两次。细胞在供体血浆中再悬浮为100μL/试验/1x10e6。抗体在100μL 1％BSA和1x DPBS(含0.02％叠氮化钠)中预稀释，并加至聚丙烯96孔HTS板中的100μL细胞(共200μL试验规模)。细胞在RT温育45分钟，用50％HBSS和50％-1％FBS 1x DPBS(含0.02％叠氮化钠)洗涤两次，和再悬浮于1％FBS 1x DPBS(含0.02％叠氮化钠)。
图13显示I-51缀合物和化合物G参比抗体的比较。在图13中，细胞形态(SSC-Lin)在双参数直方图中显示，其中染料发射在FL1-A通道中检测。这显示化合物G缀合物在细胞(主要是中性白细胞和单核细胞)异质群体上的非特异性结合(NSB)，而I-51缀合物则不显示NSB。UCHT1-化合物G在裂解全血中的NSB有效地减少可获得的与CD3结合的抗体。
图14显示UCHT1-I-51，UCHT1BB515和UCHT1-FITC的比较。UCHT1-I-51比UCHT1-FITC更亮6x。
实施例10
与等价荧光染料分子(MEF)标准曲线相比的CD3表达水平。
利用裂解全血，高抗原密度CD3表达通过荧光强度结果可视化并与6-峰(或8-峰)珠荧光输出(Sony Biotech，Cat.No.AE700520)比较以估计MEF值。用作参比的UCHT1-FITC、UCHT1-化合物G和UCHT1-I-51、以及用作额外参比缀合物的UCHT1-BB515在相同实验中用标准物加以比较。6峰珠由6种不同荧光强度的3.8微米珠混合物组成和用来检验设备的线性和敏感性并且在给定方案中平行操作的情况下用来估计MEF。
图15显示与MEF标准曲线相比的CD3表达水平。可以发现I-51比参比更亮大约6x，而化合物G亮约2x。显示的浓度范围是133nM和更低。应注意，作为比较，图13显示UCHT1-化合物G在裂解全血中的非特异性结合有效地减少可获得的与CD3结合的抗体。
实施例11
UCHT1 I-16级分与FITC和I-56缀合物的比较
将珠预处理(涡流搅拌和超声)且洗涤，和在初步实验中确定的与2x C稀释校准的珠计数用以优化采集和靶向线性饱和曲线。将珠与抗体缀合物温育，洗涤，然后通过流式细胞术采集。将1x DPBS中的BSA溶液0.1％用于珠稀释，洗涤和采集。抗体在96孔聚丙烯板中于1％BSA染色缓冲剂中预稀释，在第一孔中开始于4.0μg/200μL体积，然后在各后续孔中系列稀释100μL，进行至少8次稀释(2倍)。然后加入彻底涡流搅拌的珠(于2x C)，和在各孔中将100μL珠加至100μL抗体。在RT温育珠20分钟，洗涤，和通过流式细胞术采集。
结果示于图16。UCHT1-I-16在DOL～3.0逼近理论最大值。如图17所示，进行相似实验来强调在UCTH1-I-16和更长链系的桥连参比UCHT1-I-56之间注意到的亲和力曲线差异。
实施例12
UCHT1 I-51-状类似物UCHT1 I-16，与UCHT1 I-56(10X)和UCHT1 I-53(6X)比较
外周WBC用裂解缓冲剂(缓冲的ACK)在25℃缓慢振摇处理20分钟，然后离心和除去裂解缓冲剂。细胞用HBSS(pH 7.2)洗涤一次，然后用含有0.5％FBS和0.02％叠氮化钠的1xHBSS(pH 7.2)洗涤，和再悬浮于染色缓冲剂(1xDPBS，1％BSA，0.02％叠氮化钠，Ph 7.2)。细胞然后应用于预稀释的缀合抗体和在23-25℃避光温育40分钟。
图18显示UCHT1-I-51-状类似物UCHT1-I-16与UCHT1-I-56(10x)和UCHT1-I-53(6x)的比较。
实施例13
UCHT1 I-51-状类似物UCHT1 I-16，与UCHT1 I-56(10X)和UCHT1 I-53(6X)比较
通过流式细胞术评价抗体的特异性结合和荧光分辨率。根据ATCC提供的指南培养Jurkat细胞和收获活细胞。在细胞应用于预稀释的缀合抗体时进行染色，温育20-40分钟，洗涤，然后通过流式细胞术采集。将UCHT1-I-51-状类似物UCHT1-I-16与UCHT1-I-56(10x)和UCHT1-I-53(6x)比较。结果示于图19。
实施例14
通过回归分析比较UCHT1缀合物分辨率
细胞从外周全血分离，和在冷冻缓冲剂中冷冻。细胞解冻，静置，用自体血浆处理以阻断FcR和模拟全血环境，洗涤2至3次，然后用缀合物染色，其很类似用全血的情况。将珠预校准以优化采集和靶向抗体染色中的饱和。珠用抗体缀合物温育，洗涤，然后通过流式细胞术采集。
对测试UCHT1-I-16和UCHT1-I-49时产生的数据进行回归分析以展示缀合之间的等价性。结果示于图20。
实施例15
粗染料在全血中的I-49和I-16亲和力测试
在等价性试验中于过量染料存在下，用染色、裂解、固定和洗涤全血方法筛选染料以评价三个群体即单核细胞、粒细胞和淋巴细胞中的背景。全血中存在的粒细胞被选为分析的主要靶标。尽管也研究淋巴细胞和单核细胞，数据并未示于回归图。
在不存在抗体缀合物的情况下过量(第一滴定开始于10,000nM)使用粗染料以便强调但也定性两个几乎等同结构之间的非特异性结合差异。外周WBC用裂解缓冲剂(缓冲的ACK)在25℃缓慢振摇处理20分钟，离心，和除去裂解缓冲剂。将红细胞裂解和固定溶液施用至染料和细胞，细胞然后用HBSS(pH 7.2)洗涤一次，然后用含0.5％FBS和0.02％叠氮化钠(pH 7.2)的1x HBSS洗涤，然后再悬浮于染色缓冲剂(1x DPBS，1％BSA，0.02％叠氮化钠，pH7.2)。
将相对MFI数据与浓度匹配并通过回归分析比较以展示在粗I-45和I-16之间的一致水平和/或相似性。在该试验中发现I-45和I-16具有几乎相当水平的背景。用来自染料筛选的相同数据，I-45类似物(I-49和I-16)在检查全部滴定曲线和对照的情况下相互重叠。落入参比对照MFIs之间的I-45类似物是化合物D(10x)，和具有更长亚烷基间隔基团的两个类似物化合物D(类似物i和ii)。I-49具有比I-16稍高的背景而I-16背景很类似I-45。10x荧光团结构在非特异性结合中比6x更暗，展示骨架调节的有效性，其容纳额外荧光团同时降低10x分子的非特异性结合特性。结果示于图21A-21C。图21A显示I-16和I-45之间的相关性；图21B显示滴定曲线重叠图并与参比相比；而图21C显示实施例定性数据，显示背景FL和细胞形态，将化合物D和I-45比较。
实施例16
在已固定和储存72小时的血液细胞中比较UCHT1-I-21B和UCHT1-I-16
将全血从普通供体抽取进入EDTA稳定化的样品管用于运输和短期贮藏。血液用裂解试剂处理，在用抗体染色之前或在其之后进行。细胞用ACK裂解，15mL血液对35mL在RT裂解15分钟，然后用50％HBSS和50％1％FBS 1x DPBS(含0.02％叠氮化钠)洗涤两次。细胞在供体血浆中再悬浮为100μL/试验/1x10e6。将在100μL 1％BSA和1x DPBS(含0.02％叠氮化钠)中预稀释的抗体加至100μL细胞，然后将其加至96孔HTS聚丙烯板(共200μL试验规模)。在RT温育细胞45分钟之后，细胞用50％HBSS+50％1％FBS 1x DPBS(含0.02％叠氮化钠)洗涤两次。然后将细胞再悬浮于1％FBS 1x DPBS(含0.02％叠氮化钠)。再一次洗涤细胞，在2％低聚甲醛中以200μL/孔固定，用1x DPBS洗涤一次，在2-8℃储存72小时，再一次用1xDPBS洗涤，然后用0.1％BSA/1x DPBS采集。
将缀合物的分辨率与参比UCHT1-FITC并且与DOL理论亮度3.0比较。在该方法中DOL是3.0的情况下新结构UCHT1-I-21B最佳地符合理论，并且比UCHT1-FITC更亮七倍。如图22所示，亲和力曲线显示为直方图，其中化合物发射在FL1-A通道中检测。
非特异性结合的评价通过粒细胞荧光测量来完成。图23显示UCHT1-I-21B、UCHT1-I-16和参比UCHT1-FITC的脱靶、非特异性结合荧光强度的比较。UCHT1-I-21B的全部级分和重复都显示比试验中包括的其它结构和FITC参比更低的背景。对数据应用回归分析以检查相关性和相对亲和力，如图24所述，并且确定UCHT1-I-21B与UCHT1-I-16并不具有线性关系。
实施例17
UCHT1 I-21B，用JURKAT细胞模型和简单两点滴定
类似实施例16，以2.0和0.125微克/抗体试验的简单两点滴定进行UCHT1 I-21B的试验。根据ATCC提供的指南培养Jurkat细胞，收获活细胞或热应激细胞，洗涤2-3x，然后用缀合物抗体染色。在细胞施用至预稀释的缀合抗体的情况下进行染色，温育，洗涤，然后通过流式细胞术采集。
如图25所示，UCHT1-I-21B展示在低浓度与UCHT1-I-51相比更高的亲和力，正如所期望。真实信噪比在0.125微克/试验的亚饱和C超过理论值并且比UCHT1-I-51表现更佳。
实施例18
在血浆干扰研究中用PBMC比较UCHT1化合物G和UCHT1 I-51
从外周全血预先分离PBMC和自体血浆，然后在冷冻培养基中冷冻。细胞解冻，短时间静置，洗涤2或3次，然后如从全血新鲜分离那样用缀合物抗体染色，使用自体血浆或在抗体染色期间存在的HBSS。
在存在活化和失活的供体血浆以及添加2.5％甘氨酸的情况下UCHT1-化合物G与单核细胞相互作用形成荧光事件。图26A显示加入0％甘氨酸导致的数据，和图26B显示加入2.5％甘氨酸导致的数据。两性离子氨基酸甘氨酸在免疫测定发挥酰胺代替亲和力的作用，与天然聚胺结合或被天然聚胺阻断，从而夸大或阻断其它试剂在活细胞染色系统中的效果。重新引入PBMC的血浆(1)用以正常水平存在的补体血小板活化，或者(2)通过加热、过滤和离心除去绝大多数血小板而失活(血浆补体和其它因子)。失活的血浆更多地充当阻断剂，而活化的血浆则期望具有高干扰。
研究模拟在血液运动、血浆存在、残余、被稀释或被洗除的情况下，全血中可能的一系列效果。化合物C和I-45正如所期望地显示明显行为差异，支持对I-45的结构修饰导致的背景结合减少和活性明显改善。一般来说，观察到UCHT1-I-51与化合物G相比背景受限，而甘氨酸当存在时稍微增强I-51的背景染色和抑制UCHT1-化合物G的背景，特别是在失活血浆和纯对照当中如此。总的来说，UCHT1-化合物G具有更高的单核细胞背景。
实施例19
制备亚磷酰胺和化合物
示范性化合物用标准固相寡核苷酸合成方案制备和含荧光素的亚磷酰胺具有下述结构：
其购自ChemGenes(Cat.#CLP-9780)。
示范性连接体(L4)通过与具有下述结构的亚磷酰胺偶联而包括在化合物中：
其也是可商购的。
其它示范性化合物用亚磷酰胺制备，所述亚磷酰胺根据下述方案制备：
最终脱保护产生希望的F”部分。其它可商购的亚磷酰胺试剂按需要使用以便安置化合物的各个部分。具有下述结构的Q部分：
通过下述反应安置：
与游离氢硫基反应。其它Q部分以类似方式根据本领域普通技术人员的知识来安置。
代表性的实施方式包括但不限于下述：
实施方式1.具有下述结构(I)的化合物：
或其立体异构体、盐或互变异构体，其中：
M的各具体值独立地是包含两个或更多个碳-碳双键和至少一个共轭度的部分；
L1的各具体值独立地是：i)任选的亚烷基，亚烯基，亚炔基，杂亚烷基，杂亚烯基，杂亚炔基或杂原子连接体；或ii)连接体，其包含通过两个互补反应性基团的反应能够形成的官能团；
L2和L3的各具体值独立地是任选的亚烷基，亚烯基，亚炔基，杂亚烷基，杂亚烯基，杂亚炔基或杂原子连接体；
L4的各具体值独立地是长度大于三个原子的杂亚烷基、杂亚烯基或杂亚炔基连接体，其中杂亚烷基、杂亚烯基和杂亚炔基连接体中的杂原子选自O、N和S；
R1的各具体值独立地是H，烷基或烷氧基；
R2和R3各自独立地是H，OH，SH，烷基，烷氧基，烷基醚，杂烷基，-OP(＝Ra)(Rb)Rc，Q，或其经保护的形式，或L'；
R4的各具体值独立地是OH，SH，O-，S-，ORd或SRd；
R5的各具体值独立地是氧代，硫代或不存在；
Ra是O或S；
Rb是OH，SH，O-，S-，ORd或SRd；
Rc是OH，SH，O-，S-，ORd，OL'，SRd，烷基，烷氧基，杂烷基，杂烷氧基，烷基醚，烷氧基烷基醚，磷酸盐/酯，硫代磷酸盐/酯，磷酸基烷基，硫代磷酸基烷基，磷酸基烷基醚或硫代磷酸基烷基醚；
Rd是平衡离子；
Q的各具体值独立地是包含反应性基团或其经保护的形式的部分，所述反应性基团能够与分析物分子、靶向部分、固体载体或互补反应性基团Q′形成共价键；
L'的各具体值独立地是包含与Q的共价键的连接体，包含与靶向部分的共价键的连接体，包含与分析物分子的共价键的连接体，包含与固体载体的共价键的连接体，包含与固体载体残基的共价键的连接体，包含与核苷的共价键的连接体或包含与又一结构(I)化合物的共价键的连接体；
m的各具体值独立地是0或更大的整数，条件是m的至少一个具体值是1或更大的整数；和
n是1或更大的整数。
实施方式2.实施方式1的化合物，其中L4的各具体值独立地是杂亚烷基连接体。
实施方式3.实施方式2的化合物，其中L4的各具体值独立地是氧化烯烃连接体。
实施方式4.实施方式1的化合物，L4是聚氧化乙烯，和所述化合物具有下述结构(IA)：
其中z是2至100的整数。
实施方式5.实施方式4的化合物，其中z是3至6的整数。
实施方式6.实施方式1-5中任一种的化合物，其中L1的各具体值是连接体，其包含通过两个互补反应性基团的反应能够形成的官能团。
实施方式7.实施方式6的化合物，其中对于L1的至少一个具体值，所述官能团能够通过醛、肟、腙、炔、胺、叠氮化物、酰基叠氮化物、酰卤、腈、硝酮、氢硫基、二硫化物、磺酰卤、异硫氰酸酯、亚氨酸酯、活化的酯、酮、α,β-不饱和羰基、烯烃、马来酰亚胺、α-卤代酰亚胺、环氧化物、氮丙啶、四嗪、四唑、膦、生物素或硫杂环丙烷官能团与互补反应性基团的反应形成。
实施方式8.实施方式6的化合物，其中对于L1的至少一个具体值，所述官能团能够通过炔和叠氮化物的反应形成。
实施方式9.实施方式6的化合物，其中对于L1的至少一个具体值，官能团包含烯烃，酯，酰胺，硫代酯，硫脲，二硫化物，碳环，杂环或杂芳基。
实施方式10.实施方式6的化合物，其中对于L1的至少一个具体值，L1是包含三唑基官能团的连接体。
实施方式11.实施方式6的化合物，其中对于L1的至少一个具体值，L1-M具有下述结构：
其中L1a和L1b各自独立地是任选的连接体。
实施方式12.实施方式6的化合物，其中对于L1的至少一个具体值，L1-M具有下述结构：
其中L1a和L1b各自独立地是任选的连接体。
实施方式13.实施方式11-12中任一种的化合物，其中L1a或L1b或两者是不存在。
实施方式14.实施方式11-12中任一种的化合物，其中L1a或L1b或两者是存在。
实施方式15.实施方式14的化合物，其中L1a和L1b当存在时各自独立地是亚烷基或杂亚烷基。
实施方式16.实施方式14的化合物，其中L1a和L1b，当存在时，独立地具有下述结构之一：
实施方式17.实施方式1-5中任一种的化合物，其中L1的各具体值独立地是任选的亚烷基或杂亚烷基连接体。
实施方式18.实施方式1-17中任一种的化合物，其中L2和L3的各具体值独立地是C1-C6亚烷基，C2-C6亚烯基或C2-C6亚炔基。
实施方式19.实施方式1-18中任一种的化合物，其中所述化合物具有下述结构(IB)：
其中：
x1，x2，x3和x4的各具体值独立地是0至6的整数；和
z是2至100的整数。
实施方式20.实施方式19的化合物，其中x1，x2，x3或x4的至少一个具体值是1。
实施方式21.实施方式19或20的化合物，其中x1，x2，x3和x4的各具体值各自是1。
实施方式22.实施方式19-21中任一种的化合物，其中L1的各具体值独立地包含三唑基官能团。
实施方式23.实施方式19-21中任一种的化合物，其中L1的各具体值独立地是任选的亚烷基或杂亚烷基连接体。
实施方式24.实施方式1-23中任一种的化合物，其中R4的各具体值独立地是OH，O-或ORd。
实施方式25.实施方式1-24中任一种的化合物，其中R5的各具体值是氧代。
实施方式26.实施方式1-25中任一种的化合物，其中R1的各具体值是H。
实施方式27.实施方式1-26中任一种的化合物，其中R2和R3各自独立地是OH或-OP(＝Ra)(Rb)Rc。
实施方式28.实施方式1-26中任一种的化合物，其中R2或R3之一是OH或-OP(＝Ra)(Rb)Rc，而R2或R3中另一个是Q或包含与Q的共价键的连接体。
实施方式29.实施方式1-26中任一种的化合物，其中R2和R3各自独立地是-OP(＝Ra)(Rb)Rc。
实施方式30.实施方式29的化合物，其中Rc是OL'。
实施方式31.实施方式30的化合物，其中L'是与下述的杂亚烷基连接体：Q，靶向部分，分析物分子，固体载体，固体载体残基，核苷或又一结构(I)化合物。
实施方式32.实施方式31的化合物，其中L'包含氧化烯烃或磷酸二酯部分，或其组合。
实施方式33.实施方式32的化合物，其中L'具有下述结构：
其中：
m”和n”独立地是1至10的整数；
Re是H，电子对或平衡离子；
L”是Re或与下述的直连键或连接体：Q，靶向部分，分析物分子，固体载体，固体载体残基，核苷或又一结构(I)化合物。
实施方式34.实施方式29-33的化合物，其中靶向部分是抗体或细胞表面受体拮抗剂。
实施方式35.实施方式29-34中任一种的化合物，其中R2或R3具有下述结构之一：
实施方式36.实施方式29-35中任一种的化合物，其中R2或R3具有下述结构：
实施方式37.实施方式1-26或28-33中任一种的化合物，其中Q包含亲核反应性基团，亲电反应性基团或环加成反应性基团。
实施方式38.实施方式37的化合物，其中Q包含氢硫基，二硫化物，活化的酯，异硫氰酸酯，叠氮化物，炔，烯烃，二烯，亲双烯体，酰卤，磺酰卤，膦，α-卤代酰胺，生物素，氨基或马来酰亚胺官能团。
实施方式39.实施方式38的化合物，其中活化的酯是N-琥珀酰亚胺酯，亚氨酸酯或聚氟苯基酯。
实施方式40.实施方式38的化合物，其中叠氮化物是烷基叠氮化物或酰基叠氮化物。
实施方式41.实施方式1-33中任一种的化合物，其中Q是选自表1的部分。
实施方式42.实施方式1-26中任一种的化合物，其中R2或R3之一是OH或-OP(＝Ra)(Rb)Rc，而R2或R3中另一个是包含与分析物分子的共价键的连接体，包含与靶向部分的共价键的连接体或包含与固体载体的共价键的连接体。
实施方式43.实施方式42的化合物，其中分析物分子是核酸，氨基酸或其聚合物。
实施方式44.实施方式42的化合物，其中分析物分子是酶，受体，受体配体，抗体，糖蛋白，适体或朊病毒。
实施方式45.实施方式42的化合物，其中靶向部分是抗体或细胞表面受体拮抗剂。
实施方式46.实施方式42的化合物，其中固体载体是聚合物珠或非聚合物珠。
实施方式47.实施方式1-46中任一种的化合物，其中m的各具体值独立地是1至10的整数。
实施方式48.实施方式1-46中任一种的化合物，其中m的各具体值独立地是1至5的整数。
实施方式49.实施方式1-48中任一种的化合物，其中n是1至100的整数。
实施方式50.实施方式1-48中任一种的化合物，其中n是1至10的整数。
实施方式51.实施方式1-50中任一种的化合物，其中M的各具体值独立地是包含四个或更多个芳基或杂芳基环或其组合的部分。
实施方式52.实施方式1-51中任一种的化合物，其中M的各具体值独立地是荧光的或着色的。
实施方式53.实施方式52的化合物，其中M是荧光的。
实施方式54.实施方式1-53中任一种的化合物，其中M的各具体值独立地包含稠合多环芳基部分，所述部分包含至少四个稠环。
实施方式55.实施方式1-54中任一种的化合物，其中M的各具体值独立地是二甲基氨基茋，喹吖啶酮，氟苯基-二甲基-BODIPY，his-氟苯基-BODIPY，吖啶，骈三萘(terrylene)，联六苯，卟啉，苯并芘，(氟苯基-二甲基-二氟硼杂-二氮杂-引达省)苯基，(二-氟苯基-二氟硼杂-二氮杂-引达省)苯基，四联苯，联-苯并噻唑，三联-苯并噻唑，联萘，联蒽，方酸(squaraine)，方酸鎓(squarylium)，9,10-乙炔基蒽或三联-萘部分。
实施方式56.实施方式1-54中任一种的化合物，其中M的各具体值独立地是对-三联苯，苝，偶氮苯，吩嗪，菲咯啉，吖啶，噻吨，红荧烯，蒄，菁蓝，苝酰亚胺，或苝酰胺或其衍生物。
实施方式57.实施方式1-54中任一种的化合物，其中M的各具体值独立地是香豆素染料，试卤灵染料，二吡咯甲烯硼二氟化物染料，钌联吡啶染料，能量转移染料，噻唑橙染料，聚甲炔染料或N-芳基-1,8-邻萘二甲酰亚胺染料。
实施方式58.实施方式1-54中任一种的化合物，其中M的各具体值独立地是芘，苝，苝一酰亚胺或6-FAM或其衍生物。
实施方式59.实施方式1-54中任一种的化合物，其中M的各具体值独立地具有下述结构之一：
实施方式60.选自表2的化合物。
实施方式61.将样品染色的方法，包括向所述样品加入实施方式1-60中任一种的化合物，其量足以在以适当波长光照所述样品的情况下产生光学响应。
实施方式62.实施方式61的方法，其中所述光学响应是荧光响应。
实施方式63.实施方式61-62中任一种的方法，其中所述样品包含细胞。
实施方式64.实施方式63的方法，还包括通过流式细胞术观察所述细胞。
实施方式65.实施方式62的方法，还包括将所述荧光响应区别于具有检测上不同的光学特性的第二荧光团的荧光响应。
实施方式66.视觉检测分析物分子的方法，所述方法包括：
(a)提供实施方式1的化合物，其中R2或R3是包含与分析物分子的共价键的连接体；和
(b)通过其可视特性检测化合物。
实施方式67.视觉检测分析物分子的方法，所述方法包括：
(a)将实施方式1的化合物，其中R2或R3是Q或包含与Q的共价键的连接体，与分析物分子混合；
(b)形成化合物和分析物分子的缀合物；和
(c)通过其可视特性检测所述缀合物。
实施方式68.视觉检测分析物的方法，所述方法包括：
(a)提供实施方式1-36中任一种的化合物，其中R2或R3包含连接体，所述连接体包含与靶向部分的共价键，所述靶向部分具有对分析物的特异性；
(b)混合化合物和分析物，由此使靶向部分和分析物结合；和
(c)通过其可视特性检测化合物。
实施方式69.包含实施方式1-60中任一种的化合物和一种或多种分析物分子的组合物。
实施方式70.实施方式69的组合物在分析方法中用于检测一种或多种分析物分子的用途。
实施方式71.具有下述结构(II)的化合物：
或其立体异构体、盐或互变异构体，其中：
G的各具体值独立地是包含反应性基团或其经保护的类似物的部分，所述反应性基团能够与互补反应性基团形成共价键；
L1a，L2和L3的各具体值独立地是任选的亚烷基，亚烯基，亚炔基，杂亚烷基，杂亚烯基，杂亚炔基或杂原子连接体；
L4的各具体值独立地是长度大于三个原子的杂亚烷基、杂亚烯基或杂亚炔基连接体，其中杂亚烷基、杂亚烯基和杂亚炔基连接体中的杂原子选自O、N和S；
R1的各具体值独立地是H，烷基或烷氧基；
R2和R3各自独立地是H，OH，SH，烷基，烷氧基，烷基醚，杂烷基，-OP(＝Ra)(Rb)Rc，Q或L'；
R4的各具体值独立地是OH，SH，O-，S-，ORd或SRd；
R5的各具体值独立地是氧代，硫代或不存在；
Ra是O或S；
Rb是OH，SH，O-，S-，ORd或SRd；
Rc是OH，SH，O-，S-，ORd，OL'，SRd，烷基，烷氧基，烷基醚，烷氧基烷基醚，磷酸盐/酯，硫代磷酸盐/酯，磷酸基烷基，硫代磷酸基烷基，磷酸基烷基醚或硫代磷酸基烷基醚；
Rd是平衡离子；
Q的各具体值独立地是包含反应性基团或其经保护的类似物的部分，所述反应性基团能够与分析物分子、靶向部分、固体载体或互补反应性基团Q′形成共价键；
L'的各具体值独立地是包含与Q的共价键的连接体，包含与靶向部分的共价键的连接体，包含与分析物分子的共价键的连接体，包含与固体载体的共价键的连接体，包含与固体载体残基的共价键的连接体，包含与核苷的共价键的连接体或包含与又一结构(II)化合物的共价键的连接体；
m的各具体值独立地是0或更大的整数，条件是m的至少一个具体值是1或更大的整数；和
n是1或更大的整数。
实施方式72.实施方式71的化合物，其中G的各具体值独立地包含醛，肟，腙，炔，胺，叠氮化物，酰基叠氮化物，酰卤，腈，硝酮，氢硫基，二硫化物，磺酰卤，异硫氰酸酯，亚氨酸酯，活化的酯，酮，α,β-不饱和羰基，烯烃，马来酰亚胺，α-卤代酰亚胺，环氧化物，氮丙啶，四嗪，四唑，膦，生物素或硫杂环丙烷官能团。
实施方式73.实施方式71的化合物，其中G的各具体值独立地包含炔或叠氮化物基团。
实施方式74.实施方式71的化合物，其中G的各具体值独立地包含反应性基团，其在与互补反应性基团反应的情况下能够形成包含烯烃，酯，酰胺，硫代酯，二硫化物，碳环，杂环或杂芳基的官能团。
实施方式75.实施方式74的化合物，其中杂芳基是三唑基。
实施方式76.实施方式71-75中任一种的化合物，其中L2和L3的各具体值独立地是C1-C6亚烷基，C2-C6亚烯基或C2-C6亚炔基。
实施方式77.实施方式71的化合物，其中所述化合物具有下述结构(IIA)：
其中：
x1，x2，x3和x4的各具体值独立地是0至6的整数。
实施方式78.实施方式71-77中任一种的化合物，其中各L1a是不存在。
实施方式79.实施方式71-77中任一种的化合物，其中各L1a是存在。
实施方式80.实施方式79的化合物，其中L1a的各具体值独立地是杂亚烷基。
实施方式81.实施方式80的化合物，其中L1a具有下述结构：
实施方式82.实施方式81的化合物，其中G的各具体值独立地是
实施方式83.实施方式77-82中任一种的化合物，其中x1，x2，x3或x4的至少一个具体值是1。
实施方式84.实施方式77-83中任一种的化合物，其中x1，x2，x3和x4的各具体值各自是1。
实施方式85.实施方式71-84中任一种的化合物，其中L4如实施方式2-5中任一种中所定义。
实施方式86.实施方式71-85中任一种的化合物，其中R4的各具体值独立地是OH，O-或ORd。
实施方式87.实施方式71-86中任一种的化合物，其中R5的各具体值是氧代。
实施方式88.实施方式71-87中任一种的化合物，其中R1是H。
实施方式89.实施方式71-88中任一种的化合物，其中R2和R3各自独立地是OH或-OP(＝Ra)(Rb)Rc。
实施方式90.实施方式71-88中任一种的化合物，其中R2或R3之一是OH或-OP(＝Ra)(Rb)Rc，而R2或R3中另一个是Q或包含与Q的共价键的连接体。
实施方式91.实施方式71-88中任一种的化合物，其中R2和R3各自独立地是-OP(＝Ra)(Rb)Rc。
实施方式92.实施方式91的化合物，其中Rc是OL'。
实施方式93.实施方式92的化合物，其中L'是与下述的杂亚烷基连接体：Q，靶向部分，分析物分子，固体载体，固体载体残基，核苷或又一结构(I)化合物。
实施方式94.实施方式93的化合物，其中L'包含氧化烯烃或磷酸二酯部分，或其组合。
实施方式95.实施方式94的化合物，其中L'具有下述结构：
其中：
m”和n”独立地是1至10的整数；
Re是H，电子对或平衡离子；
L”是Re或与下述的直连键或连接体：Q，靶向部分，分析物分子，固体载体，固体载体残基，核苷或又一结构(I)化合物。
实施方式96.实施方式91-95的化合物，其中靶向部分是抗体或细胞表面受体拮抗剂。
实施方式97.实施方式91-96中任一种的化合物，其中R2或R3具有下述结构之一：
实施方式98.实施方式91-97中任一种的化合物，其中R2或R3具有下述结构：
实施方式99.实施方式71-98中任一种的化合物，其中Q包含亲核反应性基团，亲电反应性基团或环加成反应性基团。
实施方式100.实施方式99的化合物，其中Q包含氢硫基，二硫化物，活化的酯，异硫氰酸酯，叠氮化物，炔，烯烃，二烯，亲双烯体，酰卤，磺酰卤，膦，α-卤代酰胺，生物素，氨基或马来酰亚胺官能团。
实施方式101.实施方式100的化合物，其中活化的酯是N-琥珀酰亚胺酯，亚氨酸酯或聚氟苯基酯。
实施方式102.实施方式100的化合物，其中炔是烷基叠氮化物或酰基叠氮化物。
实施方式103.实施方式71-98中任一种的化合物，其中Q是选自表1的部分。
实施方式104.实施方式61-88中任一种的化合物，其中R2或R3之一是OH或-OP(＝Ra)(Rb)Rc，而R2或R3中另一个是包含与分析物分子的共价键的连接体，包含与靶向部分的共价键的连接体或包含与固体载体的共价键的连接体。
实施方式105.实施方式104的化合物，其中分析物分子是核酸，氨基酸或其聚合物。
实施方式106.实施方式104的化合物，其中分析物分子是酶，受体，受体配体，抗体，糖蛋白，适体或朊病毒。
实施方式107.实施方式104的化合物，其中靶向部分是抗体或细胞表面受体拮抗剂。
实施方式108.实施方式104的化合物，其中固体载体是聚合物珠或非聚合物珠。
实施方式109.实施方式71-108中任一种的化合物，其中m的各具体值独立地是1至10的整数。
实施方式110.实施方式71-108中任一种的化合物，其中m的各具体值独立地是1至5的整数。
实施方式111.实施方式71-110中任一种的化合物，其中n是1至100的整数。
实施方式112.实施方式71-110中任一种的化合物，其中n是1至10的整数。
实施方式113.选自表3的化合物。
实施方式114.标记分析物分子或靶向部分的方法，所述方法包括：
(a)将实施方式71的化合物，其中R2或R3是Q或包含与Q的共价键的连接体，与分析物分子或靶向部分混合；
(b)形成化合物和分析物分子或靶向部分的缀合物；和
(c)将所述缀合物与式M-L1b-G′化合物反应，由此通过至少一个G和至少一个G′的反应形成至少一个共价键，
其中：
M是包含两个或更多个碳-碳双键和至少一个共轭度的部分；
L1b是任选的亚烷基，杂亚烷基或杂原子连接体；和
G′是与G互补的反应性基团。
实施方式115.标记分析物分子或靶向部分的方法，所述方法包括：
(a)将实施方式71的化合物，其中R2或R3是Q或包含与Q的共价键的连接体，与式M-L1b-G′化合物混合，由此通过G和G′的反应形成至少一个共价键；和
(b)将步骤(A)产物与分析物分子或靶向部分反应，由此形成步骤(A)产物和分析物分子或靶向部分的缀合物，
其中：
M是包含两个或更多个碳-碳双键和至少一个共轭度的部分；
L1b是任选的亚烷基，杂亚烷基或杂原子连接体；和
G′是与G互补的反应性基团。
实施方式116.制备实施方式1的化合物的方法，所述方法包括将实施方式71的化合物与式M-L1b-G′化合物混合，由此通过G和G′的反应形成至少一个共价键，其中：
M是包含两个或更多个碳-碳双键和至少一个共轭度的部分；
L1b是任选的亚烷基，杂亚烷基或杂原子连接体；和
G′是与G互补的反应性基团。
实施方式117.包含Y个荧光部分M的荧光化合物，其中荧光化合物具有在预定波长紫外光激发下的峰值荧光发射，其是单个M部分在相同波长紫外光激发下的峰值荧光发射的Y倍的至少85％，和其中Y是2或更大的整数。
实施方式118.实施方式117的荧光化合物，具有峰值荧光发射，其是单个M部分的峰值荧光发射的Y倍的至少90％。
实施方式119.实施方式117的荧光化合物，具有峰值荧光发射，其是单个M部分的峰值荧光发射的Y倍的至少95％。
实施方式120.实施方式117的荧光化合物，具有峰值荧光发射，其是单个M部分的峰值荧光发射的Y倍的至少97％。
实施方式121.实施方式117的荧光化合物，具有峰值荧光发射，其是单个M部分的峰值荧光发射的Y倍的至少99％。
实施方式122.实施方式117-121中任一种的荧光化合物，其中Y是2至100的整数。
实施方式123.实施方式117-121中任一种的荧光化合物，其中Y是2至10的整数。
实施方式124.实施方式117-123中任一种的荧光化合物，其中Y个M部分独立地具有下述结构之一：
其中指出与荧光化合物的连接点。
实施方式125.实施方式117-124中任一种的荧光化合物，其中单个M部分独立地具有下述结构之一：
实施方式126.实施方式117-123中任一种的荧光化合物，其中所述荧光化合物包含Y个独立地具有下述结构之一的M部分：
其中指出与荧光化合物的连接点，和单个M部分具有下述结构：
实施方式127.实施方式117-126中任一种的荧光化合物，其中峰值荧光发射的波长范围是约500至约550nm。
实施方式128.实施方式117-127中任一种的荧光化合物，其中荧光化合物包含至少一个氧化乙烯部分。
实施方式129.包含实施方式117-128中任一种的荧光化合物和分析物的组合物。
本说明书提及的全部U.S.专利、U.S.专利申请公开、U.S.专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利公开通过援引全部并入本文，其程度不与本发明的描述冲突。
从前文应认识到，尽管本发明的具体实施方式已在本文中出于举例目的描述，可以进行各种修饰而不偏离本发明的主旨和范围。相应地，本发明除了受所附权利要求限制以外并不受限。

Claims (129)

1.具有下述结构(I)的化合物：
或其立体异构体、盐或互变异构体，其中：
M的各具体值独立地是包含两个或更多个碳-碳双键和至少一个共轭度的部分；
L1的各具体值独立地是：i)任选的亚烷基，亚烯基，亚炔基，杂亚烷基，杂亚烯基，杂亚炔基或杂原子连接体；或ii)连接体，其包含通过两个互补反应性基团的反应能够形成的官能团；
L2和L3的各具体值独立地是任选的亚烷基，亚烯基，亚炔基，杂亚烷基，杂亚烯基，杂亚炔基或杂原子连接体；
L4的各具体值独立地是长度大于三个原子的杂亚烷基、杂亚烯基或杂亚炔基连接体，其中杂亚烷基、杂亚烯基和杂亚炔基连接体中的杂原子选自O、N和S；
R1的各具体值独立地是H，烷基或烷氧基；
R2和R3各自独立地是H，OH，SH，烷基，烷氧基，烷基醚，杂烷基，-OP(＝Ra)(Rb)Rc，Q，或其经保护的形式，或L'；
R4的各具体值独立地是OH，SH，O-，S-，ORd或SRd；
R5的各具体值独立地是氧代，硫代或不存在；
Ra是O或S；
Rb是OH，SH，O-，S-，ORd或SRd；
Rc是OH，SH，O-，S-，ORd，OL'，SRd，烷基，烷氧基，杂烷基，杂烷氧基，烷基醚，烷氧基烷基醚，磷酸盐/酯，硫代磷酸盐/酯，磷酸基烷基，硫代磷酸基烷基，磷酸基烷基醚或硫代磷酸基烷基醚；
Rd是平衡离子；
Q的各具体值独立地是包含反应性基团或其经保护的形式的部分，所述部分能够与分析物分子、靶向部分、固体载体或互补反应性基团Q′形成共价键；
L'的各具体值独立地是包含与Q的共价键的连接体，包含与靶向部分的共价键的连接体，包含与分析物分子的共价键的连接体，包含与固体载体的共价键的连接体，包含与固体载体残基的共价键的连接体，包含与核苷的共价键的连接体或包含与又一结构(I)化合物的共价键的连接体；
m的各具体值独立地是0或更大的整数，条件是m的至少一个具体值是1或更大的整数；和
n是1或更大的整数。
2.权利要求1的化合物，其中L4的各具体值独立地是杂亚烷基连接体。
3.权利要求2的化合物，其中L4的各具体值独立地是氧化烯烃连接体。
4.权利要求1的化合物，L4是聚氧化乙烯，和所述化合物具有下述结构(IA)：
其中z是2至100的整数。
5.权利要求4的化合物，其中z是3至6的整数。
6.权利要求1的化合物，其中L1的各具体值是包含通过两个互补反应性基团的反应能够形成的官能团的连接体。
7.权利要求6的化合物，其中对于L1的至少一个具体值，所述官能团能够通过醛、肟、腙、炔、胺、叠氮化物、酰基叠氮化物、酰卤、腈、硝酮、氢硫基、二硫化物、磺酰卤、异硫氰酸酯、亚氨酸酯、活化的酯、酮、α,β-不饱和羰基、烯烃、马来酰亚胺、α-卤代酰亚胺、环氧化物、氮丙啶、四嗪、四唑、膦、生物素或硫杂环丙烷官能团与互补反应性基团的反应形成。
8.权利要求6的化合物，其中对于L1的至少一个具体值，所述官能团能够通过炔和叠氮化物的反应形成。
9.权利要求6的化合物，其中对于L1的至少一个具体值，所述官能团包含烯烃，酯，酰胺，硫代酯，硫脲，二硫化物，碳环，杂环或杂芳基团。
10.权利要求6的化合物，其中对于L1的至少一个具体值，L1是包含三唑基官能团的连接体。
11.权利要求6的化合物，其中对于L1的至少一个具体值，L1-M具有下述结构：
其中L1a和L1b各自独立地是任选的连接体。
12.权利要求6的化合物，其中对于L1的至少一个具体值，L1-M具有下述结构：
其中L1a和L1b各自独立地是任选的连接体。
13.权利要求11的化合物，其中L1a或L1b或两者不存在。
14.权利要求11的化合物，其中L1a或L1b或两者存在。
15.权利要求14的化合物，其中L1a和L1b当存在时各自独立地是亚烷基或杂亚烷基。
16.权利要求14的化合物，其中L1a和L1b当存在时独立地具有下述结构之一：
17.权利要求1的化合物，其中L1的各具体值独立地是任选的亚烷基或杂亚烷基连接体。
18.权利要求1的化合物，其中L2和L3的各具体值独立地是C1-C6亚烷基，C2-C6亚烯基或C2-C6亚炔基。
19.权利要求1的化合物，其中所述化合物具有下述结构(IB)：
其中：
x1，x2，x3和x4的各具体值独立地是0至6的整数；和
z是2至100的整数。
20.权利要求19的化合物，其中x1，x2，x3或x4的至少一个具体值是1。
21.权利要求19的化合物，其中x1，x2，x3和x4的各具体值各自是1。
22.权利要求19的化合物，其中L1的各具体值独立地包含三唑基官能团。
23.权利要求19的化合物，其中L1的各具体值独立地是任选的亚烷基或杂亚烷基连接体。
24.权利要求1的化合物，其中R4的各具体值独立地是OH，O-或ORd。
25.权利要求1的化合物，其中R5的各具体值是氧代。
26.权利要求1的化合物，其中R1的各具体值是H。
27.权利要求1的化合物，其中R2和R3各自独立地是OH或-OP(＝Ra)(Rb)Rc。
28.权利要求1的化合物，其中R2或R3之一是OH或-OP(＝Ra)(Rb)Rc，而R2或R3中的另一个是Q或包含与Q的共价键的连接体。
29.权利要求1的化合物，其中R2和R3各自独立地是-OP(＝Ra)(Rb)Rc。
30.权利要求29的化合物，其中Rc是OL'。
31.权利要求30的化合物，其中L'是与下述的杂亚烷基连接体：Q，靶向部分，分析物分子，固体载体，固体载体残基，核苷或又一结构(I)化合物。
32.权利要求31的化合物，其中L'包含氧化烯烃或磷酸二酯部分，或其组合。
33.权利要求32的化合物，其中L'具有下述结构：
其中：
m”和n”独立地是1至10的整数；
Re是H，电子对或平衡离子；
L”是Re或与下述的直连键或连接体：Q，靶向部分，分析物分子，固体载体，固体载体残基，核苷或又一结构(I)化合物。
34.权利要求31的化合物，其中所述靶向部分是抗体或细胞表面受体拮抗剂。
35.权利要求29的化合物，其中R2或R3具有下述结构之一：
36.权利要求29的化合物，其中R2或R3具有下述结构：
37.权利要求1的化合物，其中Q包含亲核反应性基团，亲电反应性基团或环加成反应性基团。
38.权利要求37的化合物，其中Q包含氢硫基，二硫化物，活化的酯，异硫氰酸酯，叠氮化物，炔，烯烃，二烯，亲双烯体，酰卤，磺酰卤，膦，α-卤代酰胺，生物素，氨基或马来酰亚胺官能团。
39.权利要求38的化合物，其中所述活化的酯是N-琥珀酰亚胺酯，亚氨酸酯或聚氟苯基酯。
40.权利要求38的化合物，其中所述叠氮化物是烷基叠氮化物或酰基叠氮化物。
41.权利要求1的化合物，其中Q是选自表1的部分。
42.权利要求1的化合物，其中R2或R3之一是OH或-OP(＝Ra)(Rb)Rc，而R2或R3中另一个是包含与分析物分子的共价键的连接体，包含与靶向部分的共价键的连接体或包含与固体载体的共价键的连接体。
43.权利要求42的化合物，其中所述分析物分子是核酸，氨基酸或其聚合物。
44.权利要求42的化合物，其中所述分析物分子是酶，受体，受体配体，抗体，糖蛋白，适体或朊病毒。
45.权利要求42的化合物，其中所述靶向部分是抗体或细胞表面受体拮抗剂。
46.权利要求42的化合物，其中所述固体载体是聚合物珠或非聚合物珠。
47.权利要求1的化合物，其中m的各具体值独立地是1至10的整数。
48.权利要求1的化合物，其中m的各具体值独立地是1至5的整数。
49.权利要求1的化合物，其中n是1至100的整数。
50.权利要求1的化合物，其中n是1至10的整数。
51.权利要求1的化合物，其中M的各具体值独立地是包含四个或更多个芳基或杂芳基环或其组合的部分。
52.权利要求1的化合物，其中M的各具体值独立地是荧光的或着色的。
53.权利要求52的化合物，其中M是荧光的。
54.权利要求1的化合物，其中M的各具体值独立地包含稠合多环芳基部分，其包含至少四个稠合环。
55.权利要求1的化合物，其中M的各具体值独立地是二甲基氨基茋，喹吖啶酮，氟苯基-二甲基-BODIPY，his-氟苯基-BODIPY，吖啶，骈三萘(terrylene)，联六苯，卟啉，苯并芘，(氟苯基-二甲基-二氟硼杂-二氮杂-引达省)苯基，(二-氟苯基-二氟硼杂-二氮杂-引达省)苯基，四联苯，联-苯并噻唑，三联-苯并噻唑，联萘，联蒽，方酸(squaraine)，方酸鎓(squarylium)，9,10-乙炔基蒽或三联-萘部分。
56.权利要求1的化合物，其中M的各具体值独立地是对-三联苯，苝，偶氮苯，吩嗪，菲咯啉，吖啶，噻吨，红荧烯，蒄，菁蓝，苝酰亚胺，或苝酰胺或其衍生物。
57.权利要求1的化合物，其中M的各具体值独立地是香豆素染料，试卤灵染料，二吡咯甲烯硼二氟化物染料，钌联吡啶染料，能量转移染料，噻唑橙染料，聚甲炔染料或N-芳基-1,8-邻萘二甲酰亚胺染料。
58.权利要求1的化合物，其中M的各具体值独立地是芘，苝，苝一酰亚胺或6-FAM或其衍生物。
59.权利要求1的化合物，其中M的各具体值独立地具有下述结构之一：
60.选自表2的化合物。
61.将样品染色的方法，包括向所述样品加入权利要求1的化合物，其量足以在以适当波长光照所述样品的情况下产生光学响应。
62.权利要求61的方法，其中所述光学响应是荧光响应。
63.权利要求61的方法，其中所述样品包含细胞。
64.权利要求63的方法，还包括通过流式细胞术观察所述细胞。
65.权利要求62的方法，还包括将所述荧光响应与具有检测上不同的光学特性的第二荧光团相区别。
66.视觉检测分析物分子的方法，所述方法包括：
(a)提供权利要求1的化合物，其中R2或R3是包含与分析物分子的共价键的连接体；和
(b)通过其可视特性检测所述化合物。
67.视觉检测分析物分子的方法，所述方法包括：
(a)将权利要求1的化合物，其中R2或R3是Q或包含与Q的共价键的连接体，与分析物分子混合；
(b)形成化合物和分析物分子的缀合物；和
(c)通过其可视特性检测所述缀合物。
68.视觉检测分析物的方法，所述方法包括：
(a)提供权利要求1的化合物，其中R2或R3包含连接体，所述连接体包含与靶向部分的共价键，所述靶向部分具有对分析物的特异性；
(b)混合化合物和分析物，由此将靶向部分和分析物结合；和
(c)通过其可视特性检测化合物。
69.一种组合物，包含权利要求1的化合物和一种或多种分析物分子。
70.权利要求69的组合物在用于检测一种或多种分析物分子的分析方法中的用途。
71.具有下述结构(II)的化合物：
或其立体异构体、盐或互变异构体，其中：
G的各具体值独立地是包含反应性基团或其经保护的类似物的部分，所述部分能够与互补反应性基团形成共价键；
L1a，L2和L3的各具体值独立地是任选的亚烷基，亚烯基，亚炔基，杂亚烷基，杂亚烯基，杂亚炔基或杂原子连接体；
L4的各具体值独立地是长度大于三个原子的杂亚烷基，杂亚烯基或杂亚炔基连接体，其中杂亚烷基、杂亚烯基和杂亚炔基连接体中的杂原子选自O、N和S；
R1的各具体值独立地是H，烷基或烷氧基；
R2和R3各自独立地是H，OH，SH，烷基，烷氧基，烷基醚，杂烷基，-OP(＝Ra)(Rb)Rc，Q或L'；
R4的各具体值独立地是OH，SH，O-，S-，ORd或SRd；
R5的各具体值独立地是氧代，硫代或不存在；
Ra是O或S；
Rb是OH，SH，O-，S-，ORd或SRd；
Rc是OH，SH，O-，S-，ORd，OL'，SRd，烷基，烷氧基，烷基醚，烷氧基烷基醚，磷酸盐/酯，硫代磷酸盐/酯，磷酸基烷基，硫代磷酸基烷基，磷酸基烷基醚或硫代磷酸基烷基醚；
Rd是平衡离子；
Q的各具体值独立地是包含反应性基团或其经保护的类似物的部分，所述部分能够与分析物分子、靶向部分、固体载体或互补反应性基团Q′形成共价键；
L'的各具体值独立地是包含与Q的共价键的连接体，包含与靶向部分的共价键的连接体，包含与分析物分子的共价键的连接体，包含与固体载体的共价键的连接体，包含与固体载体残基的共价键的连接体，包含与核苷的共价键的连接体或包含与又一结构(II)化合物的共价键的连接体；
m的各具体值独立地是0或更大的整数，条件是m的至少一个具体值是1或更大的整数；和
n是1或更大的整数。
72.权利要求71的化合物，其中G的各具体值独立地包含醛，肟，腙，炔，胺，叠氮化物，酰基叠氮化物，酰卤，腈，硝酮，氢硫基，二硫化物，磺酰卤，异硫氰酸酯，亚氨酸酯，活化的酯，酮，α,β-不饱和羰基，烯烃，马来酰亚胺，α-卤代酰亚胺，环氧化物，氮丙啶，四嗪，四唑，膦，生物素或硫杂环丙烷官能团。
73.权利要求71的化合物，其中G的各具体值独立地包含炔或叠氮化物基团。
74.权利要求71的化合物，其中G的各具体值独立地包含反应性基团，其能够与互补反应性基团反应形成包含烯烃、酯、酰胺、硫代酯、二硫化物、碳环、杂环或杂芳基的官能团。
75.权利要求74的化合物，其中所述杂芳基是三唑基。
76.权利要求71的化合物，其中L2和L3的各具体值独立地是C1-C6亚烷基，C2-C6亚烯基或C2-C6亚炔基。
77.权利要求71的化合物，其中所述化合物具有下述结构(IIA)：
其中：
x1，x2，x3和x4的各具体值独立地是0至6的整数。
78.权利要求71的化合物，其中各L1a不存在。
79.权利要求71的化合物，其中各L1a存在。
80.权利要求79的化合物，其中L1a的各具体值独立地是杂亚烷基。
81.权利要求80的化合物，其中L1a具有下述结构：
82.权利要求81的化合物，其中G的各具体值独立地是
83.权利要求77的化合物，其中x1，x2，x3或x4的至少一个具体值是1。
84.权利要求77的化合物，其中x1，x2，x3和x4的各具体值各自是1。
85.权利要求71的化合物，其中L4如权利要求2-5中任一项所定义。
86.权利要求71的化合物，其中R4的各具体值独立地是OH，O-或ORd。
87.权利要求71的化合物，其中R5的各具体值是氧代。
88.权利要求71的化合物，其中R1是H。
89.权利要求71的化合物，其中R2和R3各自独立地是OH或-OP(＝Ra)(Rb)Rc。
90.权利要求71的化合物，其中R2或R3之一是OH或-OP(＝Ra)(Rb)Rc，而R2或R3中另一个是Q或包含与Q的共价键的连接体。
91.权利要求71的化合物，其中R2和R3各自独立地是-OP(＝Ra)(Rb)Rc。
92.权利要求91的化合物，其中Rc是OL'。
93.权利要求92的化合物，其中L'是与下述的杂亚烷基连接体：Q，靶向部分，分析物分子，固体载体，固体载体残基，核苷或又一结构(I)化合物。
94.权利要求93的化合物，其中L'包含氧化烯烃或磷酸二酯部分，或其组合。
95.权利要求94的化合物，其中L'具有下述结构：
其中：
m”和n”独立地是1至10的整数；
Re是H，电子对或平衡离子；
L”是Re或与下述的直连键或连接体：Q，靶向部分，分析物分子，固体载体，固体载体残基，核苷或又一结构(I)化合物。
96.权利要求91的化合物，其中所述靶向部分是抗体或细胞表面受体拮抗剂。
97.权利要求91的化合物，其中R2或R3具有下述结构之一：
98.权利要求91的化合物，其中R2或R3具有下述结构：
99.权利要求71的化合物，其中Q包含亲核反应性基团，亲电反应性基团或环加成反应性基团。
100.权利要求99的化合物，其中Q包含氢硫基，二硫化物，活化的酯，异硫氰酸酯，叠氮化物，炔，烯烃，二烯，亲双烯体，酰卤，磺酰卤，膦，α-卤代酰胺，生物素，氨基或马来酰亚胺官能团。
101.权利要求100的化合物，其中所述活化的酯是N-琥珀酰亚胺酯，亚氨酸酯或聚氟苯基酯。
102.权利要求100的化合物，其中所述炔是烷基叠氮化物或酰基叠氮化物。
103.权利要求71的化合物，其中Q是选自表1的部分。
104.权利要求71的化合物，其中R2或R3之一是OH或-OP(＝Ra)(Rb)Rc，而R2或R3中另一个是包含与分析物分子的共价键的连接体，包含与靶向部分的共价键的连接体或包含与固体载体的共价键的连接体。
105.权利要求104的化合物，其中所述分析物分子是核酸，氨基酸或其聚合物。
106.权利要求104的化合物，其中所述分析物分子是酶，受体，受体配体，抗体，糖蛋白，适体或朊病毒。
107.权利要求104的化合物，其中所述靶向部分是抗体或细胞表面受体拮抗剂。
108.权利要求104的化合物，其中所述固体载体是聚合物珠或非聚合物珠。
109.权利要求71的化合物，其中m的各具体值独立地是1至10的整数。
110.权利要求71的化合物，其中m的各具体值独立地是1至5的整数。
111.权利要求71的化合物，其中n是1至100的整数。
112.权利要求71的化合物，其中n是1至10的整数。
113.选自表3的化合物。
114.标记分析物分子或靶向部分的方法，所述方法包括：
(a)将权利要求71的化合物，其中R2或R3是Q或包含与Q的共价键的连接体，与分析物分子或靶向部分混合；
(b)形成化合物和分析物分子或靶向部分的缀合物；和
(c)将所述缀合物与式M-L1b-G′化合物反应，由此通过至少一个G和至少一个G′的反应形成至少一个共价键，
其中：
M是包含两个或更多个碳-碳双键和至少一个共轭度的部分；
L1b是任选的亚烷基，杂亚烷基或杂原子连接体；和
G′是与G互补的反应性基团。
115.标记分析物分子或靶向部分的方法，所述方法包括：
(a)将权利要求71的化合物，其中R2或R3是Q或包含与Q的共价键的连接体，与式M-L1b-G′化合物混合，由此通过G和G′的反应形成至少一个共价键；和
(b)将步骤(A)产物与分析物分子或靶向部分反应，由此形成步骤(A)产物和分析物分子或靶向部分的缀合物，
其中：
M是包含两个或更多个碳-碳双键和至少一个共轭度的部分；
L1b是任选的亚烷基，杂亚烷基或杂原子连接体；和
G′是与G互补的反应性基团。
116.制备权利要求1的化合物的方法，所述方法包括将权利要求71的化合物与式M-L1b-G′化合物混合，由此通过G和G′的反应形成至少一个共价键，其中：
M是包含两个或更多个碳-碳双键和至少一个共轭度的部分；
L1b是任选的亚烷基，杂亚烷基或杂原子连接体；和
G′是与G互补的反应性基团。
117.包含Y个荧光部分M的荧光化合物，其中所述荧光化合物具有在预定波长紫外光激发下的峰值荧光发射，其是单个M部分在相同波长紫外光激发下的峰值荧光发射的Y倍的至少85％，和其中Y是2或更大的整数。
118.权利要求117的荧光化合物，具有峰值荧光发射，其是单个M部分的峰值荧光发射的Y倍的至少90％。
119.权利要求117的荧光化合物，具有峰值荧光发射，其是单个M部分的峰值荧光发射的Y倍的至少95％。
120.权利要求117的荧光化合物，具有峰值荧光发射，其是单个M部分的峰值荧光发射的Y倍的至少97％。
121.权利要求117的荧光化合物，具有峰值荧光发射，其是单个M部分的峰值荧光发射的Y倍的至少99％。
122.权利要求117的荧光化合物，其中Y是2至100的整数。
123.权利要求117的荧光化合物，其中Y是2至10的整数。
124.权利要求117的荧光化合物，其中Y个M部分独立地具有下述结构之一：
其中指出与荧光化合物的连接点。
125.权利要求117的荧光化合物，其中单个M部分独立地具有下述结构之一：
126.权利要求117的荧光化合物，其中所述荧光化合物包含Y个独立具有下述结构之一的M部分：
其中指出与荧光化合物的连接点，和单个M部分具有下述结构：
127.权利要求117的荧光化合物，其中所述峰值荧光发射位于范围约500至约550nm的波长。
128.权利要求117的荧光化合物，其中所述荧光化合物包含至少一个氧化乙烯部分。
129.一种组合物，包含权利要求117的荧光化合物和分析物。
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