CN109072161A - 平推流管式生物反应器，包含该反应器的系统及其制备病毒的方法 - Google Patents

Abstract

在第一个方面本发明涉及一种平推流管式生物反应器，其包含整体的或多部分的管状物，以适合于培养，和任选地，感染，病毒转导，或者真核细胞转染。另一方面，本发明涉及一种包括本发明所述的平推流管式生物反应器的平推流管式生物反应器系统。进一步地，本发明涉及一种利用本发明所述的平推流管式生物反应器或系统来制备病毒颗粒、载体、细胞、或其他分子包括毒素分子的方法。最后，本发明涉及一种平推流管式生物反应器在制备病毒颗粒、载体包括病毒载体、细胞包括修饰的细胞或其他分子包括毒素分子中的应用。

Description

平推流管式生物反应器，包含该反应器的系统及其制备病毒 的方法

技术领域

在第一个方面，本发明涉及一种平推流管式生物反应器，所述反应器包含一个整体的或多部分的管状物，以适合于培养，任选地，感染，病毒转导，或者真核细胞转染。在另一方面,本发明涉及一种平推流管式生物反应器系统，该系统包括本发明所述的平推流管式生物反应器。更进一步地,本发明涉及一种利用本发明所述的平推流管式生物反应器或其系统制备病毒颗粒、载体、细胞或包括毒素分子在内的其他分子的方法。最后，本发明涉及一种平推流管式生物反应器用于制备病毒颗粒、载体包括病毒载体、细胞包括修饰的细胞或其他分子包括毒素分子在内的应用。

背景技术

目前工业上以细胞培养方式生产流感疫苗的方法主要是通过搅拌槽式生物反应器(STR)进行的、以批次模式操作。在这种操作模式下，病毒生产是以两阶段工艺进行的。在第一阶段中，在容器中接种动物细胞并使之生长至高浓度，当达到了目标细胞浓度，去除残余培养基，并用适合的缓冲液系统洗涤细胞多次，例如磷酸盐缓冲液(PBS)。随后添加新的培养基，并且将细胞以限定的感染复数(MOI)的病毒感染。因为病毒的复制以破坏细胞为代价，因此连续培养是不可能的，在预定时间之后可以从生物反应器中收获含有病毒颗粒的培养液。最新技术中，批次模式操作还包括一次使用性技术，例如波式生物反应器(wavebioreactors)和填充床式生物反应器(packed bed bioreactors)，规模通常不超过1000升。

用于培养及病毒制备的另一种可能是结合连续技术与批次操作的灌注式生物反应器系统。在近来的研发研究中已经介绍了与批次生物反应器相比，这些系统用于病毒生产的效率更高。近来由Tapia和Vazquez等人发表的一篇综述(Appl.Microbiol Biotechnol2016,100:2121-2132)提供了一种适宜的系统。该文中通过讨论选择过程强化的操作和基于细胞培养的病毒疫苗生产，确认了高细胞密度和连续多级培养的生物反应器。

与利用细胞截留系统(cell retention system)帮助的批次相比，在本文所讨论的生物反应器系统中细胞生长到更高的浓度，所述细胞截留系统能够将废弃培养基去除而把细胞保留在容器中。一旦达到了目标细胞浓度，在感染之前用缓冲液(如PBS)和/或新鲜的培养基洗涤细胞。以限定的感染复数(MOI)进行感染，并且使病毒在系统中繁殖，这样以获得更高的病毒浓度。细胞截留系统的示例包括Tapia和Vazquez等人描述的交替切向流过滤系统(alternating tangential flow filtration,ATF)，以及切向流过滤系统(tangential flow filtration,TFF)、声波过滤器、中空纤维生物反应器。Tapia和Vazquez等人所提供的最新技术的详细分析，请参见上文。

另一种方法是使用串联的两个(或更多个)搅拌槽式生物反应器(STR)的连续化方法。在该系统中，在分别的容器中进行细胞生长和病毒繁殖。也就是说，双-STR串联系统中的第一个容器中，以连续的方式操作，待转染的细胞被连续繁殖，部分的所述细胞的被连续转移到第二个容器中，在第二个容器中进行病毒感染和被感染细胞的繁殖进而产生病毒。在病毒繁殖生物反应器中可以连续地收获。然而，这种类型的连续生物反应器的生产有一个主要的缺点，就是随着工艺时间(over process time)会存在不想要的抗原变异的风险，并且在病毒种群中存在干涉缺陷型质粒(defective interfering particle,DIPs)。即，DIPs会在生物反应器中累积并使病毒数量波动而导致低产率。这种效应也称为马格努斯效应(von Magnus effect)或传代效应(passage effect)。WO 89/08701中已经描述了这种双-级(two-stage)拌槽式生物反应器，其涉及用于生产病毒和病毒抗原的方法和设备。现有技术中Frensing和Heldt等人(PLoS ONE 2013 8(9):e72288)注意到了流感病毒显示了DIPs的周期性累积,伴有血凝素病毒滴度(HA滴度)大约在2.0和0.8log10(HA单位/100μL)之间振荡。

正如Tapia和Vázquez等人所指出的，使用多级搅拌槽生物反应器系统的连续过程是批量生产病毒的一个有趣的选择。然而，连续过程的产率显然受限于DNA和RNA病毒种群中的DIPs的累积，因此，DIPs的存在会显著降低产品的滴度，并因此强烈影响生产过程。尤其是，如果串联的容器数量增加，DIPs存在的影响会加剧，也就是说，可以认为双-级搅拌槽式生物反应器系统相对于多级搅拌槽生物反应器系统是优选的，因此对于强化病毒疫苗的生产过程看起来是最佳选择。然而，涉及使用三个或更多STR串联的多级STR系统在大规模疫苗生产中是不被接受的，因为操作的复杂性增加了过程失败的风险。

在此之前，Hu,Y.C.等人(Cytotechnology,1997,24,143-152)确认了一种管式连续流动生物反应器(tubular sequential-flow bioreactor)，用于利用重组杆状病毒感染昆虫细胞来生产重组蛋白。在该系统中，将昆虫细胞和杆状病毒通过管子泵入，并收集被感染细胞，用PBS洗涤，并转移到细胞培养瓶(T-flask)中用于感染动力学研究。他们的结果表明感染时间分布可以通过在管中感染来提高。然而，管子的入口中过多细胞死亡并沉积是问题所在并限制了操作。同样地，例如该系统在管内维持重组蛋白生产的能力以及长操作时间的稳定运行的问题仍然没有解决。

因此本发明的一个目的是提供一种生物反应器和生物反应器系统，能够连续的生产病毒颗粒、载体以及对这些细胞的培养产生负面影响的其他分子。

本发明的另一个目的是提供一种生产病毒颗粒、载体和其他分子特别是毒素分子的方法以克服现有技术的缺陷。

发明内容

在第一个方面,本发明涉及平推流管式生物反应器，其包含整体的或多部分的管状物，并带有至少有一个入口和至少一个出口，其中入口位于管状物的第一末端，出口位于管状物的第二末端，以适合于培养，任选的，感染，病毒转导，或者真核细胞转染，其中管长与管的直径比至少为5000:1,或至少为10000:1,特别地至少为50000:1。即本发明所述的平推流管式生物反应器能够连续生产病毒颗粒、载体和对培养细胞有负面影响的包括毒素分子在内的其他分子。

另一方面,本发明涉及包含平推流管式生物反应器的平推流管式生物反应器系统，例如本发明平推流管式生物反应器包含用于i)感染、病毒转导、或真核细胞转染或ii)允许诱导或者激活毒素分子表达的装置的模块；在生物反应器中用于保持(holding)待培养真核细胞和i)受感染的、病毒转导的和/或转染的和/或ii)被诱导或激活的毒素分子表达的模块；用于i)和/或ii)与真核细胞的混合装置的模块；和至少有一个泵用于使所述混合物以平推流的形式通过管式生物反应器。

另一方面,本发明涉及通过培养真核细胞来制备病毒颗粒、载体包括病毒载体、细胞包括修饰的细胞、或其他分子包括有毒素分子的方法，其中所述的方法包括在平推流管式生物反应器中内进行感染的培养，病毒转导，细胞的转染和/或诱导足够的时间以允许产生全病毒或者载体包括病毒载体，和分子包括毒素分子。

最后，本发明涉及一种本发明方法或本发明所述平推流管式生物反应器和/或平推流管式生物反应器系统在制备病毒颗粒、载体和其他分子，特别是对细胞培养产生负面影响的分子的应用。

附图说明

图1：现有技术系统的示意图。即，图1A左侧表示为批次生物反应器，右侧显示了细胞浓度相对时间曲线图以及感染时间虚线。在图1B中，示出了具有细胞截留系统的灌注式生物反应器以及浓度相对时间的曲线图。图1C是连续两级搅拌槽式生物反应器以及病毒繁殖生物反应器中浓度相对时间的曲线图。

图2：盘管式平推流管式生物反应器作为本发明所述的连续的平推流管式生物反应器系统中的一部分。

图3：本发明所述的生物反应器的流感病毒的HA滴度；A)管状物出口处所获得的病毒的滴度，B)病毒库的HA滴度(菱形)和生物反应器中包含未感染细胞的HA滴度(正方形)。

具体实施方式

在第一种实施方式中，本发明具体涉及平推流管式生物反应器，其包含整体的或多部分的管状物，并带有至少有一个入口和至少一个出口，其中入口位于管状物的第一末端，出口位于管状物的第二末端，以适合于培养，任选的，感染，病毒转导，或者真核细胞转染，其中管长与管的直径比至少为5000:1,或至少为10000:1，特别地至少为50000:1。

也即，本发明人认识到，通过提供长度和直径比至少为5000:1的平推流管式生物反应器，有可能使感染、病毒转导、或真核细胞转染有足够的时间以允许所希望的病毒颗粒、载体、细胞包括修饰的细胞或其他分子包括毒素分子的生产。由于管式设计，可以忽略可能发生的返混，因此，避免了连续生产带来的DIPs积累的缺陷。此外，由于子代病毒中传代次数增加而导致的不希望发生的抗原性和诱变性变异被最小化。也就是说，用于连续生产的以下所描述的新型生物反应器以及生物反应器系统避免了不希望发生的抗原变异的累积并限制了马格努斯效应。利用这种生物反应器，使提供在整个加工进程中收获实质上同一质量的病毒成为可能。

本文所使用的(术语)，术语“感染”是指致病体(disease causing agents)入侵宿主细胞。这些致病体尤其是指病毒，但还可以包括类病毒，朊病毒，细菌。

术语“转染”是指有意介导核酸进入细胞的过程。

术语“病毒转导”是指病毒介导的核酸转移。

构成生物反应器的管状物的长度与管状物的直径之比至少为5000：1，例如至少为10000：1，尤其是为50000：1。实施方式可包括比值为90000：1或更高的比例，例如125000：1，例如150000：1，例如175000：1，例如250000：1，例如300000：1或者更高。

典型地，管状物被构建成盘管式生物反应器(coiled tubular bioreactor)。在一个实施方式中，该盘管式生物反应器或普通的生物反应器通常在具有垂直位置的支架中被支撑以利用重力，其中入口位于管状物的上部，且出口位于管状物的底部。

管状物可以被构建成环形的盘管式生物反应器，和成双纽带形的盘管式(lemniscate-shaped coiled tube)结构。建议为双纽形结构，其改善了径向扩散。

进一步地，除非另有说明，本文所用的，术语“病毒”是指病毒颗粒，病毒载体和病毒样颗粒(VLPs)以及病毒蛋白。典型地，病毒是在细胞中繁殖的病毒颗粒，其存在于培养物的上清液中和/或生物反应器出口处的宿主细胞的细胞内。

术语“病毒样颗粒”是指类似病毒的颗粒，但由于它们不含任何病毒性遗传物质，因此是非感染性的。表达病毒的结构蛋白，例如包膜蛋白(envelope capsule proteins)，能够使病毒样颗粒自组装。病毒作为病毒载体也是基因治疗的焦点。

“病毒颗粒”是指具有感染性的整个病毒，除非将其失活。

术语“病毒组合物”可以指病毒颗粒或病毒样颗粒的组合物、或两种或多种不同的全病毒颗粒的混合物、或全病毒颗粒和病毒样颗粒的混合物。该组合物可能是病毒蛋白和非病毒蛋白的组合物。在一个实施方式中，所述病毒颗粒进一步用于生产疫苗或其他医学应用。这同样适用于载体，特别是病毒载体，适合于例如基因治疗或用于疫苗接种。适宜的病毒颗粒，VLPs等可以为流感病毒，黄热病病毒，或人乳头瘤病毒，或牛痘病毒或腺病毒，或杆状病毒，或肝炎病毒，或慢病毒，或脊髓灰质炎病毒，或狂犬病病毒，或轮状病毒，或风疹病毒，或这些病毒的颗粒或片段。

生产的病毒包括病毒颗粒或VLPs，尤其是，用于生产疫苗的牛痘病毒和流感病毒。

其他适宜病毒的例子包括：黄热病，登革热病毒，奇昆古尼亚病毒，脊髓灰质炎病毒，人乳头瘤病毒，腺病毒，杆状病毒，黄病毒，肝炎病毒，单纯疱疹病毒，日本脑炎病毒，慢病毒，麻疹病毒，腮腺炎病毒，脊髓灰质炎病毒，狂犬病病毒，轮状病毒，风疹病毒，西门利克森林病毒，以及，在适用情况下，与病毒样人乳头瘤病毒的VLPs和流感VLPs对应的VLPs。

如本发明所述的平推流管式生物反应器可具有沿着管式生物反应器的管状物的附加的入口和出口。所述入口和出口特别地用于供应空气和/或营养物质和/或培养基。所述的入口和出口可以与多部分管式生物反应器(multi-part tubular bioreactor)的中空纤维部分相结合。

实施例中描述了生产流感病毒的示范，在停留时间(residence times，RT)19和21小时时操作。该系统可以被改良以使停留时间降低到几小时，例如利以用于感染动力学研究(即：通过增加泵速率，或减小管长度)。此外可以通过增加停留时间来改良该系统，以便于生产比流感病毒复制慢的病毒，因此在管中需要更长的停留时间(即：通过降低泵速率，或增加管长度)。技术人员非常清楚的知道到适宜的RT有助于感染和生产病毒颗粒或表达所希望的分子。

在另一个实施方式中，如本发明所述的平推流管式生物反应器的管状物至少部分是中空纤维(hollow fiber)。管状物本身可以是硅树脂基(silicone-based)材料。其他实施方式中还包括多孔中空纤维(porous hollow fiber)或管主要由其他不同于硅树脂基材料的中空纤维的材料制成，并且中空纤维连接在管状物的某些点处以便于在这些位置交换液体和气体。此外，中空纤维可以是多孔的，以便于进行液体和气体的交换。中空纤维可以由亲水材料制成，例如以用于交换液体，或用疏水材料制成，例如以用于交换气体。

技术人员非常清楚的知道用于所希望目的的管材料。

在另一个实施方式中，平推流管式生物反应器适于一次性使用。也就是说，生物反应器被设计为单次使用，其包括例如适宜的接口，以将一次性生物反应器连接到引入不同混合物的适宜装置，如供料管线和排出管线。例如，如下所述一次性使用的生物反应器可以包括在本发明系统中。一次性使用的生物反应器特别适用于繁殖传染性病毒，例如牛痘苗病毒等。

在另一个实施方式中，本发明涉及一种平推流管式生物反应器，其进一步包括至少一个入口，以将生物反应器的入口连接到引入细胞的供料管线的入口，并且可选地，用于感染，病毒转导或转染所述细胞的装置，由此所述细胞可任选地被激活剂或诱导剂分子活化以表达所需组分。所述的平推流管式生物反应器还包括一个出口，用于将生物反应器的出口与排出管线的出口相连接。

此外，本发明提供了一种平推流管式生物反应器系统，其包括平推流管式生物反应器，特别是，本发明平推流管式生物反应器，用于i)感染，病毒转导或真核细胞转染或ii)诱导激活分子表达，尤其是，毒素分子的装置的模块；用于保持(holding)待培养真核细胞和i)感染，病毒转导或转染和/或ii)诱导或激活包括毒性分子在内的分子表达和管式反应器的模块；用于i)和/或ii)和真核细胞混合装置的模块；至少一个泵以用于将所述混合物的以平推流的形式通过管状生物反应器。

也就是说，本发明所述的系统包括除本发明平推流管式生物反应器之外的如附图2所示的附加模块。所述附加模块包括装置，如容器或允许感染、病毒转导或转染真核细胞的组分的其他类型的储库(stock)。可选择地，所述模块是用于诱导或激活包括毒素分子在内的分子的表达的装置的模块，如容器或其储库。进行感染，病毒转导或真核细胞转染的装置已为技术人员所熟知，包括上述定义的感染性病毒类病毒。可以通过本领域已知的适合的病毒载体影响病毒传导。转染是有意地介导核酸进入细胞的过程。技术人员熟知介导其进入细胞的适宜方法，如基于化学的转染或基于包括电穿孔转染在内的非化学的方法，或基于颗粒的方法，例如基因枪或纳米粒子等。

例如，用于所述装置的模块是容器或所述装置相应的其他类型的包括储库(stock)的池(reservoirs)。如果需要，这些装置可以被冷却。

此外，平推流管式生物反应器系统包括用于保持(holding)真核细胞的模块。也就是说，该模块应该是一个适宜的容器，例如生物反应器，包括能够培养真核细胞的细胞生物反应器。这些真核细胞通过供料管线输送到本发明所述的平推流管式生物反应器中。典型地，用于保持(holding)细胞的模块是以连续或半连续模式操作的允许培养真核细胞的生物反应器。例如，所述的细胞生物反应器具有至少一个控制系统，用于控制pH，氧浓度和搅拌功能。

此外，本发明所述的系统包括至少一个泵，以用于真核细胞与第二种组分的混合物以平推流的形式通过管式生物反应器，所述第二组分来自用于感染、病毒转导或转染真核细胞或诱导或激活包括毒素分子在内的分子表达的装置的模块中。

当然，可以存在其他泵。例如如图2所示，附加泵可以用于引入空气或氧气或用于将额外的组分引入系统中，例如可以通过管式生物反应器的附加入口引入。

在一个实施方式中，本发明所述的平推流管式生物反应器系统进一步包括控制模块。所述的控制模块可以被设计为控制至少细胞混合物的流动和通过平推流管式生物反应器的方式。此外，所述的控制模块可以控制管式生物反应器的温度，此外，相应的流过管式生物反应器的氧气和/或混合物的pH。典型地，所述的控制模块在系统中与适宜的传感器相连接用以确定所希望的参数。

控制用于保持(holding)真核细胞的装置中的培养基的和流过平推流管式生物反应器的培养基的氧浓度是有利的。

此外，该系统包括用于管式生物反应器的温度控制系统和用于该系统中其他的包括细胞生物反应器在内的组件的温度控制系统。例如，温度控制系统将生物反应器中的温度控制在10至40℃的范围内，例如，人体细胞控制在37℃。可选择地，可将管状物安装在培养箱内用以控制温度和空气组成。培养箱是本领域中已知的。

作为平推流管式生物反应器系统进一步的实施方式，其进一步至少包括用于引入至少一种空气，营养物质，培养基，pH调节组分，产物的诱导剂，或者引入再循环流的装置，所述再循环流从管状物下游部分进入到管状物的供料管线或者上部。

如上所述，所述的装置可包括能将组分引入相应供料管线的泵。典型地，在相应的供料管线上有阀门来引入组分。

进一步地，平推流管式生物反应器系统包括培养基储库池(medium stockreservoir)和/或至少一个另外的泵，以将培养基储存进细胞生物反应器或盘管式生物反应器。可选择地或进一步地，该系统包括用于空气，营养物质，培养基，pH调节组分等的池(reservoir)。

在另一个实施方式中，本发明所述的平推流管式生物反应器系统包括的装置，如传感器，至少能够控制含有细胞的培养基的pH和/或氧和i)用于感染，病毒转导或转染的装置或ii)诱导或激活包括毒性分子的分子的表达的装置，当其被引入平推流管式生物反应器时，可选择地，包含进一步的装置，如传感器，用于确定平推流管式生物反应器中的pH和氧浓度。

技术人员非常清楚本发明所述的系统中可用的包括传感器在内的适合的装置。

该装置包括包含质粒DNA或siRNA或蛋白质的遗传材料以及激活剂或诱导剂，例如，尤其是IPTG或用于表达分子的激活剂或诱导剂，该技术中已知的蛋白质。

在另一方面，本发明涉及在平推流管式反应器中通过培养真核细胞和感染，病毒转导，或转染和/或诱导细胞足够的时间以产生全病毒或载体包括病毒载体在内以及分子包括毒素分子在内以来制备病毒颗粒，载体包括病毒载体，细胞包括修饰的细胞和其他分子包括毒素分子在内的方法。

本发明所述的方法尤其适用于通过培养真核细胞连续生产制备病毒颗粒，载体包括病毒载体，细胞包括修饰的细胞和其他分子包括毒素分子在内的方法。

本发明方法尤其适用于制备用于疫苗等中的传染性的病毒颗粒。尤其是，该方法克服了现有技术中存在的问题，也即，在加工过程中DIPs的累积和不希望发生的抗原变异。也就是说，不希望发生的抗原变异和马格努斯效应的风险是可以避免的，因为感染是利用限定的数量的病毒株来进行的，在进行细胞感染和繁殖区域DIPs和子代病毒既没有被截留也没有累积。

实际上，理想平推流的特征为在管状物中径向扩散为优势且没有返混。因此本发明所述的系统中，细胞只能在管状物的入口处被病毒株感染，或者至少在稍后时间点由邻近的细胞释放的子代病毒感染。鉴于基本上没有返混，避免了现有技术中描述的连续培养的缺点。

同样适用于毒素分子的制备。虽然如现有技术所述，毒素分子在连续培养期间积累，本发明所述的平推流管式生物反应器中以径向扩散为优势且基本上没有返混，毒素分子仅在管式反应器的末端的稍后时间点对所有表达毒性分子的细胞显示其毒性效应。

因此，本发明所述的方法能够降低病毒和子代病毒和所产生的载体的变异风险，并避免了所预期产品的生产和及其上清液中的释放的任何负面影响。

在本发明所述方法的一个实施方式中，该方法用于产生全病毒(whole virus)，其包括在用于混合真核细胞和传染性病毒的装置中将真核细胞和传染性病毒混合，然后，通过供料管线将所述混合物引入平推流管式生物反应器中。该方法尤其适用于制备病毒颗粒或载体，尤其是病毒载体。可选择地，所述的方法是将真核细胞与诱导剂混合或者用诱导剂处理后，并随后将混合物引入平推流管式生物反应器，所述的诱导剂能够诱导或激活所述细胞中的分子包括毒素分子在内的表达。当然，所述的诱导剂或活化剂可以附加或可选择地通过所述管式生物反应器的不同侧的入口提供到管式生物反应器中的细胞。

此外，该方法可以包括控制pH值和/或氧气在开始时，可选择地，在细胞混合物通过的过程中，和在通过平推流管式生物反应器的i)用于感染，或病毒转导或转染的的装置或ii)用于诱导或激活分子包括毒素细胞的分子的表达的装置。

在一个实施方式中，平推流管式生物反应器是本发明所定义的平推流管式生物反应器，或者所述方法在本发明平推流管式生物反应器系统中进行。最后，本发明涉及平推流管式生物反应器的应用，尤其是，本发明所述的平推流管式生物反应器在制备病毒颗粒，载体包括病毒载体，细胞包括修饰的细胞，或其他分子包括毒素分子中的应用。

将通过实施例进一步说明本发明，但不限于所述的具体实施方式。

图1中展示了现有技术的生物反应器，也即，图1是批次反应器的示意图(图1A)，具有细胞截留系统的灌注式生物反应器(图1B)，和连续两级搅拌槽式生物反应器(图1C)。如该图的右侧所示的，其显示了相对于时间的细胞和病毒的浓度，以及细胞和病毒的浓度相互变化的关系。

图2展示了本发明所述的适用于产生病毒颗粒的平推流管式生物反应器。所示为盘管式生物反应器1。细胞反应器中包含连续培养的真核细胞2，并与生物反应器1通过泵1,3相连，和用于将细胞与供料管线5的病毒4混合的装置。供料管线5通过入口(未示出)与盘管式生物反应器相连接。另外，出料口(未示出)与排出管线6相连接。供料管线5可另外包含经由阀7的空气注射点。空气可通过泵2,8引入管线9。

通过管线10a，10b和装置4，病毒从病毒库被引入到含有细胞的培养基中。此外，培养基储库11被提供以通过泵1,3将新鲜培养基引入到细胞生物反应器2中。

细胞培养物通过排出管线6从本发明所述的盘管式生物反应器排出，进一步用于，例如病毒颗粒，载体等的纯化。

实施例1

材料和方法

材料和方法

一个成功的实验是利用悬浮生长的马达氏犬肾细胞(MDCK.SUS2)和流感病毒A/PR/8/34H1N1(Robert Koch Institute，RKI，Germany)进行的。该实验分如下两部分进行：第一次的停留时间为21h且在感染点(POI)的MOI为0.005，第二次的停留时间为19h，在POI处的MOI为0.016。使细胞在细胞生物反应器(CB)中生长至5×10 ⁶细胞/mL并以连续模式保持。CB的pH值保持在7.1-7.3之间的值。病毒库(VS)的pH值手动调节至7.0-7.5之间。在培养期间采集CB中样品以确保没有病毒污染。同时采集VS的样品以确定管状物入口处的病毒颗粒浓度(HA滴度)。每12小时收集产物以确定出口处的HA滴度。

结果和讨论

生物反应器运行3周，手动控制参数如pH值。在初始的5天稳定期后，在管出口处(收获)成功观察到病毒滴度，HA值在第5-10天之间达到1.6log10(HA Units/100μL)，并且接下来几天HA值约2.5(图3A)。病毒储库中的HA滴度低于检测的检测限(图3B)。因此，所测定产物的HA滴度仅对应于管式生物反应器内的病毒产物。此外，CB中没有HA滴度确认了该容器没有被病毒污染(图3B)。

基于所获得的甲型流感病毒产物的实验数据，将三种不同的生物反应器系统的收率估计并总结在表1中。在稳定操作的条件下(6-12天)假设总生产量为10L且稳定的病毒滴度为2.5log10(HA Units/100μL)，平推流管式生物反应器(连续制备病毒)时空产量与分批次培养相比提高了2.8倍。

表1.用于生产10L产物(500mL STR体积)的平推流管式反应器，两级搅拌釜式和批次生物反应器之间的病毒产率比较。

表1.比较分批次和双-级搅拌槽(STR)，和STR+平推流用于10L产物的生产的空间-时间-产率(STY)(假定STR的体积为500mL)

1 7天批次循环(细胞生长3天,病毒繁殖3天,清洗1天).

2以STR+平推流的产物流量([mL/h])作为标准来设计实验，对于双-级STR，假定其与STR+平推流相同；对于双平行批次，产物流量是假设在7天内产生1000mL计算出来的。

3平均HA滴度是通过将所有产物收集在一起后计算的值。STR+平推流系统的HA滴度是实验的第14天至第17.6天之间收集的产物所计算的平均值。对于双-级STR的数据是根据先前小规模振荡器实验中获得的实验数据估算的(数据未显示)；对于分批次实验，根据Lohr等人(Vaccine 2010 28：6256-6264)所述的在感染后72小时的估计HA滴度为获得的HA值。

4假定一个病毒颗粒结合一个细胞来进行计算的

5术语升(L)是考虑了所产的产物的体积和生物反应器系统的体积。

实施例1中说明了本发明盘管式生物反应器形式的平推流管式生物反应器的可利用性和本发明所述的系统和方法的可利用性。对技术人员来说显而易见的是不仅可以获得传染性病毒而且还可以获得载体，如基因治疗中使用的病毒载体。此外，该系统还有助于其他分子的表达和产生，包括抗体，或特别是对宿主细胞具有毒性的分子。因此，本发明方法，特别是使用本发明系统或生物反应器制备病毒颗粒，载体包括病毒载体以及其他分子包括毒素分子。如图3所示,与图1C右侧所示现有技术(弗赖辛，黑尔特等，2013)相比，HA滴度的变化不太突出,特别是,在稳态操作下，提供稳定的大约为2.5log10(HA单位/100μl)的病毒滴度是可能的，参考培养时间为13到16天。

此外，通过对排出管线的产物进行搜集结果表明随着工艺时间(over processtime)没有发生DIPs累积和任何的不期望的抗原变异。也就是说，这个系统可以成功运行数周。此外，形式上为一次性使用的生物反应器，此系统可以用于传染性材料，并允许运行不同种类型的感染性的病毒。

Claims (18)

1.一种平推流管式生物反应器包含整体的或多部分的管状物，并具有至少一个入口和至少一个出口，其中入口位于管状物的第一末端，和出口位于管状物的第二末端，以适合于培养，任选地，感染，病毒转导，或者真核细胞转染。其中管长与管的直径比至少为5000:1,或至少为10000:1,尤其地至少为50000:1。

2.如权利要求1所述的平推管式流生物反应器在沿着所述的生物反应器的管状物上具有附加的入口和出口，尤其是，用于运送空气和/或营养物质和/或培养基。

3.如权利要求1或2所述的平推流管式生物反应器，其中所述管状物为至少部分的中空纤维，和/或所述管状物为硅树脂基材料。

4.如权利要求1至3中的任何一项所述的平推流管式生物反应器适合于一次性使用。

5.如权利要求1至4中的任何一项所述的平推流管式生物反应器进一步包括至少有一个入口用于将生物反应器的入口连接至引入细胞的供料管线，和任选地，用于感染，病毒转导，或转染所述细胞的装置，和至少有一个出料口用于将生物反应器的出口和排出管线连接。

6.一种平推流管式生物反应器系统包括一个平推流管式生物反应器，尤其是，如权利要求1至5任何一项所述的平推流管式生物反应器；用于i)允许感染，病毒转导，真核细胞转染或ii)允许诱导或者激活分子包括毒素分子的表达的装置的模块；用于在管式生物反应其中保持待培养细胞和i)感染、病毒转导的和/或转染的和/或ii)被诱导或激活的分子包括毒素分子的表达的模块；用于i)和/或ii)与真核细胞的混合装置的模块；和至少有一个泵用于使所述混合物以平推流的形式通过管式生物反应器。

7.如权利要求6所述的平推流管式生物反应器系统进一步包括控制模块，用于控制通过平推流管式生物反应器的至少a)细胞混合物的流体，和i)和/或ii)的装置，任选地进一步地b)生物反应器的温度。

8.如权利要求5或6所述的平推流管式生物反应器系统进一步包括用于引导至少一种的空气、营养物质、培养基，pH调节组分，产物引导剂进入供料管线和/或管状物的装置。

9.如权利要求6至8任一项所述的平推流管式生物反应器系统，其中用于在管式生物反应器中保持待培养细胞的模块为能够用于真核细胞培养的细胞生物反应器。

10.如权利要求5至8任一项所述的平推流管式生物反应器系统，其中用于保持i)感染、病毒转导、转染的装置的所述模块是含有病毒库或核酸碱基混合物的容器。

11.如权利要求6至10任一项所述的平推流管式生物反应器系统进一步包括培养基储库池，和/或至少一个用于引导培养基进入细胞生物反应器或者盘管式生物反应器的泵。

12.如权利要求6至11任一项所述的平推流管式生物反应器系统进一步包括装置，例如传感器,能够控制至少含有细胞的培养基的pH值和/或氧气的浓度和i)用于感染,病毒转导或转染的装置或ii)允许诱导或激活分子包括毒素分子表达的装置，当引导进入平推流管式生物反应器时,任选地,进一步包括装置,如传感器,用于测定平推流管式生物反应器中的pH和/或氧气。

13.一种通过培养真核细胞来制备病毒颗粒、载体包括病毒载体、细胞包括修饰的细胞、或其他分子包括有毒素分子的方法，其包括在平推流管式生物反应器中培养感染的，病毒转导的，转染的和/或诱导的细胞以足够产生病毒颗粒或者载体包括病毒载体，和分子包括毒素分子的时间。

14.如权利要求13所述的制备全病毒的方法包括在相同的混合装置中混合真核细胞和预感染的病毒，随后，通过供料管线引导所述的混合物进入平推流管式生物反应器中。

15.如权利要求13所述的制备病毒颗粒或载体尤其是病毒载体的方法。

16.如权利要求13所述的方法，其中真核细胞中混入诱导剂或用诱导剂处理以诱导或激活所述细胞中毒素分子的表达，随后，引导所述的混合物进入平推流管式生物反应器中。

17.如权利要求13至16任一项所述的方法包括在开始时，和任选地，细胞混合物通过的过程中，和i)感染、病毒转导或转染的装置或ii)诱导或激活的分子包括毒素分子表达的装置经过平推流管式生物反应器时的pH值和/或氧气浓度。

18.如权利要求13至17任一项所述的方法，其中平推流管式生物反应器为权利要求1至5任一项所述的平推流管式生物反应器，或其中该方法在权利要求6至12任一项所述的平推流管式生物反应器系统中进行。