CN114107221A - 用于产生制备疫苗的病毒的方法 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及产生例如用于制备疫苗的肠病毒A的方法，其包括在固定床生物反应器中培养细胞。本文还提供了一种通过本文所公开的生产方法产生的肠病毒A以及与其相关的组合物、免疫原性组合物和疫苗。

Description

用于产生制备疫苗的病毒的方法
本申请是申请日为2016年2月12日、申请号为201680015584.7、发明名称为“用于产生制备疫苗的病毒的方法”的发明专利申请的分案申请。
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年2月13日提交的美国临时申请号62/116,361的权益，所述临时申请以引用方式整体并入本文。
序列表以ASCII文本文件提交
关于ASCII文本文件的以下提交文件的内容以引用方式整体并入本文：序列表的计算机可读形式(CRF)(文件名：606772001140SEQLIST.txt，记录的日期：2016年2月12日，大小：28KB。
技术领域
本公开涉及用于产生制备疫苗的病毒(例如肠病毒A病毒)的方法。
背景技术
手足口病(HFMD)由人类肠病毒A(HEV-A)组的若干成员所引起。它通常是影响大部分儿童的自限制性感染并且其特征在于手、足和口腔上的溃疡和囊泡。然而，更多严重形式的疾病可伴随神经病状，诸如脑膜炎、脑炎、脊髓灰质炎样瘫痪以及脑干脑炎而出现，从而导致肺水肿和死亡(Huang,CC等人,(1999)N Engl J Med 341:936–942；Chang,LY等人,(1998)Lancet 352:367–368；以及Ooi,MH等人,(2009)BMC Infect Dis 9:3)。自20世纪90年代中期，由人类肠病毒71(EV71)引起的HFMD感染已导致大量发病率和死亡率，尤其是在亚太地区(Solomon,T等人,(2010)Lancet Infect Dis 10(11):778–90；以及McMinn,PC(2002)FEMS Microbiol Rev 26:91–107)。中国、越南和新加坡在2012年一月至五月报道的活动性与2011年相同时间段相比有所增加。手足口病爆发破坏教育和经济活动，这是由于学校和育儿中心为努力控制疾病传播而关闭。
人类肠病毒A属于无包膜正义RNA病毒的小核糖核酸病毒科，其也包括脊髓灰质炎病毒和鼻病毒。引起HFMD的HEV-A组的成员包括肠病毒71(EV71)和柯萨奇病毒(Coxsackievirus)，包括血清型A1、A4、A6、A10和A16(Pallansch和Roos,(2007)Knipe DM,Howley PM,Griffin DE,编者.Fields Virology.Philadelphia,PA LippincottWilliams&Wilkins.第839–894页；以及Kobayashi M等人,Jpn J Infect Dis 2013；66:260-1)。由于EV71感染导致的HFMD爆发具有引起严重神经疾病的最大倾向。食蟹猴的实验性感染显示在几十年来分离的菌株全部为嗜神经组织的，并且显示比脊髓灰质炎病毒更广泛的组织嗜性(Nagata,N等人,(2002)J Med Virol 67:207–216)。
EV71具有四种衣壳蛋白(VP1–VP4)和七种非结构蛋白。除了预防病毒RNA之外，衣壳蛋白识别宿主细胞表面上的受体并且促成病毒的抗原特征(Pallansch和Roos,(2007)Knipe DM,Howley PM,Griffin DE,编者.Fields Virology.Philadelphia,PA LippincottWilliams&Wilkins.第839–894页)。EV71的已知人类细胞表面受体是清道夫受体B2(SCARB2)和P-选择素糖蛋白配体1(PSGL-1)(Yamayoshi,S等人,(2009)Nat Med 15:798–801；以及Nishimura,Y等人,(2009)Nat Med 15:794–797)。
尽管由血清中和作用分型肠病毒的经典方法将EV71定义为单一血清型(Oberste,MS等人(1999)J Clin Microbiol 37:1288–1293)，但是目前分子分型方法指示若干种基因群至少自20世纪90年代后就已在亚太地区循环(Lee,MS等人,(2012)PLoS Negl Trop Dis6:e1737)。EV71分离株先前基于单独的VP1核苷酸序列分类成基因群A、B和C以及亚基因群(Brown,BA等人,(1999)J Virol 73:9969–9975)；VP1基因的核苷酸序列一致性在基因群内>92％，而基因群之间的核苷酸序列一致性为78％-83％(Solomon,T等人,(2010)LancetInfect Dis 10(11):778–90)。然而，全基因组测序导致对B4下的亚基因群B5的重新分类和基因群D的添加；作者表明3D聚合酶序列连同VP1更好地表示全基因组(Chan,YF等人,(2009)Infect Genet Evol 10(3):404–12)。也发生基因群之间以及与其他人类肠病毒A血清型的重组(Yoke-Fun和AbuBakar(2006)BMC Microbiol 6:74)。
目前，没有针对EV71的特定抗病毒疗法或疫苗可用。静脉内免疫球蛋白已用于严重HFMD病例中，其中一些治疗益处由结果来显示但还未得到临床试验证明(Ooi,MH等人,(2009)BMC Infect Dis 9:3；以及Wang,SM等人,(1999)Clin Infect Dis 29:184–190)。在EV71爆发期间的预防和控制措施局限于监视、关闭教育和育儿设施以及隔离患者。
对于潜在疫苗的生产，病毒疫苗通常通过贴壁依赖型细胞系(例如VERO细胞)产生。在工业规模下，这些细胞以静态模式在生物反应器中的悬浮液中的多板系统(例如CellFactories、Cell Cube等)上、滚瓶上或微载体(多孔或非多孔)上培养。多板系统为大体积的并且需要大量的处理操作，而微载体培养需要许多操作(载体的消毒和水合等)和从预培养到最终过程的具有复杂操作(即珠至珠转移)的的许多步骤。
像许多其他肠道病毒一样，肠病毒A(例如EV71病毒)已适于生长在细胞系上(例如Vero细胞)，这些细胞系在完全细胞裂解的情况下产生CPE，从而将病毒释放到细胞培养流体中。肠病毒A(例如EV71病毒)病毒培养物由于每个细胞的较低病毒产生量子而比其他病毒有更大挑战性，从而在每次培养运行中产生低产率。由于细胞裂解非常迅速，大量病毒颗粒的产生是需要常规系统的多个大细胞培养设备的巨大任务，这些大细胞培养设备像数以百计的滚瓶或细胞工厂或若干升大规模微载体培养罐，因此需要延长预培养步骤以及复杂的多个操作。目前的监管环境需要避免可重复使用的培养方法以及充斥着污染风险的无菌操作和转移的多个步骤。然而，大部分目前可用的单次使用反应器未能良好适于培养固定在微载体上的动物细胞。
发明内容
因此，需要发展用于肠病毒A生产的方法，例如允许以工业规模生产病毒的方法。如本文所公开的，本公开的方法尤其使用固定床培养系统来使得能够以更大成本效率且使用流水线化加工进行增强的病毒生产。有利的是，可使用这些方法例如来大规模或工业规模生产肠病毒A，所述肠病毒A可用于制造疫苗和/或免疫原性组合物。
因此，本公开的某些方面提供用于产生肠病毒A病毒的方法，其包括(a)在含有巨载体的固定床中培养粘着性细胞，其中所述细胞在第一细胞培养基中培养；(b)在肠病毒A病毒感染细胞的条件下用肠病毒A病毒接种细胞；(c)在固定床中在第二细胞培养基中在感染细胞产生肠病毒A病毒的条件下培养感染细胞；以及(d)收获由所述细胞产生的肠病毒A病毒。在可与任何以上实施方案组合的一些实施方案中，细胞为哺乳动物细胞。在可与任何以上实施方案组合的一些实施方案中，细胞为Vero细胞。在可与任何以上实施方案组合的一些实施方案中，Vero细胞系选自WHO Vero 10-87、ATCC CCL-81、Vero 76(ATCC登录号CRL-1587)以及Vero C1008(ATCC登录号CRL-1586)。在可与任何以上实施方案组合的一些实施方案中，肠病毒A病毒选自EV71、CA6和CA16。在可与任何以上实施方案组合的一些实施方案中，肠病毒A病毒含有至少一种非人类细胞适应性突变。在可与任何以上实施方案组合的一些实施方案中，肠病毒A病毒为EV71，并且所述至少一种非人类细胞适应性突变包括VP1多肽突变。在可与任何以上实施方案组合的一些实施方案中，肠病毒A病毒为CA6，并且所述至少一种非人类细胞适应性突变包括选自以下各项的突变：VP1多肽突变、VP2多肽突变、VP3多肽突变以及5’非翻译区(UTR)突变。在可与任何以上实施方案组合的一些实施方案中，肠病毒A病毒为CA16，并且所述至少一种非人类细胞适应性突变包括选自以下各项的突变：2A多肽突变、VP1多肽突变、VP2多肽突变以及5’非翻译区(UTR)突变。在可与任何以上实施方案组合的一些实施方案中，在含有巨载体的固定床中培养粘着性细胞的步骤中培养约4,000个细胞/cm2-约16,000个细胞/cm2，其中所述细胞在第一细胞培养基中培养。在可与任何以上实施方案组合的一些实施方案中，在含有巨载体的固定床中培养粘着性细胞的步骤中培养约5,000个细胞/cm2，其中所述细胞在第一细胞培养基中培养。在可与任何以上实施方案组合的一些实施方案中，在肠病毒A病毒感染细胞的条件下用肠病毒A病毒接种细胞的步骤中接种约100,000个细胞/cm2-约800,000个细胞/cm2。在可与任何以上实施方案组合的一些实施方案中，在肠病毒A病毒感染细胞的条件下用肠病毒A病毒接种细胞的步骤中接种约200,000个细胞/cm2-约350,000个细胞/cm2。在可与任何以上实施方案组合的一些实施方案中，第一细胞培养基含有血清。在可与任何以上实施方案组合的一些实施方案中，第一细胞培养基含有小于10％的胎牛血清，并且所述细胞不适于无血清培养基。在可与任何以上实施方案组合的一些实施方案中，第一细胞培养基含有5％胎牛血清。在可与任何以上实施方案组合的一些实施方案中，第一细胞培养基和第二细胞培养基是不同的。在可与任何以上实施方案组合的一些实施方案中，所述方法还包括在含有巨载体的固定床中培养粘着性细胞的步骤(其中所述细胞在第一细胞培养基中培养)与在肠病毒A病毒感染细胞的条件下用肠病毒A病毒接种细胞的步骤之间去除第一细胞培养基并用第二培养基冲洗细胞。在可与任何以上实施方案组合的一些实施方案中，第二细胞培养基为无血清培养基。在可与任何以上实施方案组合的一些实施方案中，所述细胞用肠病毒A病毒以约0.025与约0.0009之间的MOI接种。在可与任何以上实施方案组合的一些实施方案中，所述细胞用肠病毒A病毒以约0.001的MOI接种。在可与任何以上实施方案组合的一些实施方案中，细胞在以下步骤期间进行培养：在含有巨载体的固定床中培养粘着性细胞，其中所述细胞在第一细胞培养基中培养；在肠病毒A病毒感染细胞的条件下用肠病毒A病毒接种细胞；以及在固定床中在第二细胞培养基中在感染细胞产生肠病毒A病毒的条件下培养感染细胞，体积/表面比率为约0.3mL/cm2。在可与任何以上实施方案组合的一些实施方案中，在以下步骤期间在第一细胞培养基中的乳酸盐浓度不超过约25mM：在含有巨载体的固定床中培养粘着性细胞的步骤，其中所述细胞在第一细胞培养基中培养；和/或在肠病毒A病毒感染细胞的条件下用肠病毒A病毒接种细胞。在可与任何以上实施方案组合的一些实施方案中，在以下步骤期间在第二细胞培养基中的乳酸盐浓度不超过约25mM：在固定床中在第二细胞培养基中在感染细胞产生肠病毒A病毒的条件下培养感染细胞。在可与任何以上实施方案组合的一些实施方案中，在以下步骤期间在第一细胞培养基中的氧密度(DO)维持在约50％之上：在含有巨载体的固定床中培养粘着性细胞的步骤，其中所述细胞在第一细胞培养基中培养；和/或在肠病毒A病毒感染细胞的条件下用肠病毒A病毒接种细胞。在可与任何以上实施方案组合的一些实施方案中，在以下步骤期间在第二细胞培养基中的氧密度(DO)维持在约50％之上：在固定床中在第二细胞培养基中在感染细胞产生肠病毒A病毒的条件下培养感染细胞。在可与任何以上实施方案组合的一些实施方案中，固定床具有约2cm的床高度。在可与任何以上实施方案组合的一些实施方案中，固定床具有约10cm的床高度。在可与任何以上实施方案组合的一些实施方案中，巨载体为微纤维基质。在可与任何以上实施方案组合的一些实施方案中，巨载体具有约60％与99％之间的孔隙率。在可与任何以上实施方案组合的一些实施方案中，孔隙率在约80％与约90％之间。在可与任何以上实施方案组合的一些实施方案中，巨载体具有细胞易接近的约150cm2/cm3与约1000cm2/cm3之间的面积。在可与任何以上实施方案组合的一些实施方案中，在收获由细胞产生的肠病毒病毒的步骤中收获至少5.0×107TCID50/mL的肠病毒A病毒。在可与任何以上实施方案组合的一些实施方案中，所述方法还包括用β丙内脂(BPL)、福尔马林或二乙烯亚胺(BEI)中的一种或多种灭活肠病毒A。在可与任何以上实施方案组合的一些实施方案中，肠病毒A病毒为减毒病毒。
本公开的其他方面涉及一种由任何以上实施方案的方法产生的肠病毒A病毒。在可与任何以上实施方案组合的一些实施方案中，所述病毒含有一种或多种抗原。在可与任何以上实施方案组合的一些实施方案中，所述病毒已用β-丙内脂(BPL)、福尔马林或二乙烯亚胺(BEI)中的一种或多种灭活。
本公开的其他方面涉及一种含有由任何以上实施方案的方法产生的肠病毒A病毒的组合物。本公开的其他方面涉及一种含有由任何以上实施方案的方法产生的肠病毒A病毒的免疫原性组合物。本公开的其他方面涉及一种含有由任何以上实施方案的方法产生的肠病毒A病毒的疫苗。
附图说明
专利或申请文件含有至少一幅彩色附图。本专利或专利申请公开具有彩色附图的副本将会根据要求且在支付必要的费用后由专利局提供。
图1示出NANO中的实验细胞培养设置。对于再循环，使用安装有EasyLoad头的MasterFlex泵(未示出)代替此图片中示出的灌注模块。
图2A至图2C示出NANO载体的图片。在不同时间对载体取样并用结晶紫染色。图2A示出空白载体。图2B示出在第3天的载体。图2C示出在第6天的载体。
图3示出iCELLis NANO的监测结果。所测量参数为细胞数目、葡萄糖和乳酸盐浓度、溶解氧(DO)、pH以及温度。在第3天和第6天进行培养基替换。
图4示出iCELLis NANO和对照Cell-Stack中的细胞密度的比较。对于iCELLisNANO，使用核计数方法计数细胞，而对于Cell-Stack，在胰蛋白酶处理之后使用台盼蓝方法计数细胞。
图5示出使用0.52E6个细胞/cm2的细胞密度进行EV71 iCELLis NANO培养的实验计划。
图6示出使用0.52E6个细胞/cm2的细胞密度进行对照EV71 Cell-Stack培养的实验计划。
图7示出使用0.52E6个细胞/cm2的细胞密度进行EV71 iCELLis NANO培养的监测结果。所测量参数为细胞数目、葡萄糖和乳酸盐浓度、溶解氧(DO)、pH以及温度。在第3天进行培养基替换并且在第6天进行感染。
图8示出使用0.52E6个细胞/cm2的细胞密度进行对照EV71 Cell-Stack培养的监测结果。所测量参数为：葡萄糖和乳酸盐浓度。在第4天进行感染。
图9示出使用0.52E6个细胞/cm2的细胞密度进行的EV71 cell-stack培养细胞病变效应(CPE)。
图10示出使用0.25E6个细胞/cm2的细胞密度进行EV71 iCELLis NANO培养和对照cell-stack培养的实验计划。
图11示出使用0.25E6个细胞/cm2的细胞密度进行EV71 iCELLis NANO培养的监测结果。所测量参数为细胞数目、葡萄糖和乳酸盐浓度、溶解氧(DO)、pH以及温度。在第4天进行感染。
图12示出使用0.25E6个细胞/cm2的细胞密度进行对照EV71 Cell-Stack培养的监测结果。所测量参数为葡萄糖和乳酸盐浓度。在第4天进行感染。
图13示出用于Polio S2生产的基准Cytodex过程的实验计划。
图14示出使用0.52E6个细胞/cm2的细胞密度进行Polio S2 iCELLis NANO培养的实验计划。
图15示出使用0.52E6个细胞/cm2的细胞密度进行对照Polio S2 Cell-Stack培养的实验计划。
图16示出使用0.52E6个细胞/cm2的细胞密度进行Polio S2 iCELLis NANO培养的监测结果。所测量参数为：细胞数目、葡萄糖和乳酸盐浓度。在第3天进行培养基替换并且在第6天进行感染。
图17示出使用0.52E6个细胞/cm2的细胞密度进行对照Polio S2 Cell-Stack培养的监测结果。所测量参数为：葡萄糖和乳酸盐浓度。在第4天进行感染。
图18示出使用0.52E6个细胞/cm2的细胞密度进行的Polio S2 cell-stack培养细胞病变效应(CPE)。
图19示出使用0.25E6个细胞/cm2的细胞密度进行Polio S2 iCELLis NANO和对照cell-stack培养的实验计划。
图20示出使用0.25E6个细胞/cm2的细胞密度进行Polio S2 iCELLis NANO培养的监测结果。所测量参数为细胞数目、葡萄糖和乳酸盐浓度、氧密度(DO)、pH以及温度。在第4天进行感染。
图21示出使用0.25E6个细胞/cm2的细胞密度进行对照Polio S2 Cell-Stack培养的监测结果。所测量参数为：葡萄糖和乳酸盐浓度。在第4天进行感染。
图22示出使用0.25E6个细胞/cm2的细胞密度进行的Polio S2 cell-stack培养细胞病变效应(CPE)。
图23A示出根据感染时的细胞密度的比(每个细胞)最大EV71生产率。图23B示出根据感染时的细胞密度的总(每收获体积)最大EV71生产率。图23C示出每个细胞的病毒释放动力学。图23D示出每收获体积的病毒释放动力学。
图24示出对EV71接种时的减小的细胞密度的评价。接种两种iCELLis NANO，一种以15,000个细胞/cm2(上图)接种，另一种以低3倍的细胞密度(5,000个细胞/cm2；下图)接种。在整个培养中监测葡萄糖(红色曲线)和乳酸盐(蓝色曲线)。
图25示出体积/表面比率和FBS浓度对T-烧瓶中的最终细胞密度的影响。
图26示出在iCELLis NANO中的EV71优化的过程的示意图。
图27示出对于所有iCELLis NANO实验中针对EV71获得的最大病毒生产率的概述。
图28示出在iCELLis500/100中的EV71过程的示意图。
图29示出EV71 iCELLis500/100运行的实验设置。
图30A至30C示出iCELLis500/100中的EV71细胞培养参数。图30A示出细胞密度。图30B示出溶解氧(设定值为50％)。图30C示出葡萄糖和乳酸盐浓度。图30D至30F示出对照iCELLis NANO中的EV71细胞培养参数。图30D示出细胞密度。图30E示出溶解氧(设定值为50％)。图30F示出葡萄糖和乳酸盐浓度。
图31A示出在iCELLis500/100中在感染之后EV71病毒的动力学释放。根据TCID50方法定量病毒。图31B示出在iCELLis500/100中在感染之后HCP的动力学释放。使用Octet和Signus抗Vero-HCP抗体定量HCP。图31C示出在iCELLis500/100中在感染之后DNA的动力学释放。使用pico-green方法定量DNA。
图32示出概述EV71 iCELLis500/100运行的产率的示意图。
图33示出使用无血清(SFM,OptiPro)或10％FBS(M199)培养基在T-烧瓶中进行EV71感染的示意图。
图34示出EV71过程发展策略的示意图。
图35示出在iCELLis500/500中的EV71工厂规模过程的示意图。
具体实施方式
一般技术
本文所述或引用的技术和程序通常是熟知的并且一般由本领域技术人员使用常规方法加以采用，例如像在以下文献中所述的广泛利用的方法：Sambrook等人,MolecularCloning:A Laboratory Manual第3版(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人编辑,(2003))；系列Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.):PCR 2:APractical Approach(M.J.MacPherson,B.D.Hames和G.R.Taylor编辑(1995)),Harlow和Lane编辑(1988)Antibodies,A Laboratory Manual,and Animal Cell Culture(R.I.Freshney编辑(1987))；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编辑,1984)；Methodsin Molecular Biology,Humana Press；Cell Biology:A Laboratory Notebook(J.E.Cellis编辑,1998)Academic Press；Animal Cell Culture(R.I.Freshney)编辑,1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather和P.E.Roberts,1998)Plenum Press；Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures(A.Doyle、J.B.Griffiths和D.G.Newell编辑,1993-8)J.Wiley and Sons；Handbook ofExperimental Immunology(D.M.Weir和C.C.Blackwell编辑)；Gene Transfer Vectorsfor Mammalian Cells(J.M.Miller和M.P.Calos编辑,1987)；PCR:The Polymerase ChainReaction,(Mullis等人编辑,1994)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan等人编辑,1991)；Short Protocols in Molecular Biology(Wiley and Sons,1999)；Immunobiology(C.A.Janeway和P.Travers,1997)；Antibodies(P.Finch,1997)；Antibodies:A Practical Approach(D.Catty.编辑,IRL Press,1988-1989)；MonoclonalAntibodies:A Practical Approach(P.Shepherd和C.Dean编辑,Oxford UniversityPress,2000)；Using Antibodies:A Laboratory Manual(E.Harlow和D.Lane(Cold SpringHarbor Laboratory Press,1999)；The Antibodies(M.Zanetti和J.D.Capra编辑,HarwoodAcademic Publishers,1995)；以及Cancer:Principles and Practice of Oncology(V.T.DeVita等人编辑,J.B.Lippincott Company,1993)。
细胞培养
本公开的某些方面涉及用于产生肠病毒A病毒(术语“肠病毒A”可在本文中互换使用)的方法。产生肠病毒A可用于例如疫苗和/或免疫原性组合物，包括但不限于纯化病毒、灭活病毒、减毒病毒、重组病毒或用于亚基疫苗的纯化的和/或重组的病毒蛋白。在一些实施方案中，本公开的用于产生肠病毒A病毒的方法包括在含有基质的床中培养细胞，其中所述细胞在第一细胞培养基中培养；在肠病毒A病毒感染细胞的条件下用肠病毒A病毒接种细胞；在固定床中在第二细胞培养基中在感染细胞产生肠病毒A病毒的条件下培养感染细胞；以及收获由所述细胞产生的肠病毒A病毒。
在一些实施方案中，本公开的细胞为哺乳动物细胞(例如哺乳动物细胞系)。适用于生长至少一种本公开的病毒的细胞系优选地具有哺乳动物来源，并且包括但不限于：Vero细胞(来自猴肾)、马、牛(例如MDBK细胞)、羊、狗(例如来自狗肾的MDCK细胞、ATCCCCL34 MDCK(NBL2)或MDCK 33016，保藏号DSM ACC 2219，如WO97/37001所述的)、猫以及啮齿动物(例如仓鼠细胞，诸如BHK21-F、HKCC细胞或中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞))，并且可获自各个发展阶段，包括例如成年、新生儿、胎儿以及胚胎。在某些实施方案中，细胞为永生化的(例如PERC.6细胞，如WO01/38362和WO02/40665所述的，并且以ECACC保藏号96022940保藏)。在优选的实施方案中，利用哺乳动物细胞，并且其可选自和/或来源于以下非限制性细胞类型中的一种或多种：成纤维细胞(例如皮肤、肺)、内皮细胞(例如主动脉的、冠状动脉的、肺的、血管的、皮肤微脉管的、脐带的)、肝细胞、角化细胞、免疫细胞(例如T细胞、B细胞、巨噬细胞、NK、树突状细胞)、乳腺细胞(例如上皮的)、平滑肌细胞(例如血管的、主动脉的、冠状动脉的、动脉的、子宫的、支气管的、子宫颈的、视网膜周皮细胞)、黑素细胞、神经细胞(例如星形胶质细胞)、前列腺细胞(例如上皮的、平滑肌)、肾细胞(例如上皮的、肾小球系膜的、近端小管)、骨骼肌细胞(例如软骨细胞、破骨细胞、成骨细胞)、肌细胞(例如成肌细胞、骨骼肌、平滑肌、支气管)、肝细胞、成视网膜细胞以及基质细胞。WO97/37000和WO97/37001描述能够在悬浮液和无血清培养基中生长并且可用于产生和复制病毒的动物细胞和细胞系的产生。
在一些实施方案中，所述细胞为Vero细胞。适合的Vero细胞系的实例包括但不限于WHO Vero 10-87、ATCC CCL-81、Vero 76(ATCC登录号CRL-1587)或Vero C1008(ATCC登录号CRL-1586)。
在一些实施方案中，所述细胞为粘着性细胞。如本文所用，粘着性细胞可以是指在培养期间粘着或锚定至基底的任何细胞。
用于以上细胞类型的培养条件是已知的并且描述于各种出版物中，或者可选地培养基、补充剂和条件可商购得到，例如像如Cambrex Bioproducts(East Rutherford,N.J.)的目录和附加文献中所述的。
已知无血清培养基包括Iscove培养基、Ultra-CHO培养基(BioWhittaker)或EX-CELL(JRH Bioscience)。普通含血清培养基包括伊格尔(Eagle)基础培养基(BME)或最低必需培养基(MEM)(Eagle,Science,130,432(1959))或杜尔贝科氏改良伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle Medium)(DMEM或EDM)，它们通常使用高达10％胎牛血清或类似添加剂。任选地，可使用最低必需培养基(MEM)(Eagle,Science,130,432(1959))或尔贝科氏改良伊格尔培养基(DMEM或EDM)而没有任何含血清补充剂。无蛋白质培养基像PF-CHO(JHR Bioscience)、化学成分确知培养基像ProCHO 4CDM(BioWhittaker)或SMIF 7(Gibco/BRL Life Technologies)以及促分裂肽像Primactone、Pepticase或HyPep.TM.(全部来自Quest国际)或乳白蛋白水解产物(Gibco和其他制造商)也是现有技术中充分已知的。基于植物水解产物的培养基添加剂具有特殊优点，即可以排除病毒、支原体或未知感染剂的污染。
本公开的方法的某些方面涉及培养细胞的密度。在一些实施方案中，在第一培养基中培养的细胞的密度或绝对数目可以是接种细胞培养基即在病毒接种之前的细胞密度或绝对数目。如本文所述并且不希望受到理论的约束，认为以较低密度培养细胞可有利于减少病毒接种时的细胞密度、延长细胞生长阶段、和/或减少以下因素，所述因素包括但不限于接种体的大小、劳动时间、预培养步骤中的足迹、培养箱的数目和/或污染风险。
在一些实施方案中，培养约4,000个细胞/cm2-约16,000个细胞/cm2。在一些实施方案中，培养约4,000个细胞/cm2；约5,000个细胞/cm2；约6,000个细胞/cm2；约7,000个细胞/cm2；约8,000个细胞/cm2；约9,000个细胞/cm2；约10,000个细胞/cm2；约11,000个细胞/cm2；约12,000个细胞/cm2；约13,000个细胞/cm2；约14,000个细胞/cm2；约15,000个细胞/cm2；或约16,000个细胞/cm2，包括它们之间的任何值。在一些实施方案中，接种之前的细胞密度小于约任何以下密度(以细胞/cm2计)：16,000；15,500；15,000；14,500；14,000；13,500；13,000；12,500；12,000；11,500；11,000；10,500；9,000；8,500；8,000；7,500；7,000；6,500；6,000；5,500；5,000；或4,500。在一些实施方案中，接种之前的细胞密度大于约任何以下密度(以细胞/cm2计)：4,000；4,500；5,000；5,500；6,000；6,500；7,000；7,500；8,000；8,500；9,000；9,500；10,000；10,500；11,000；11,500；12,000；12,500；13,000；13,500；14,000；14,500；15,000；或15,500。即，接种之前的细胞密度可以是具有上限16,000；15,500；15,000；14,500；14,000；13,500；13,000；12,500；12,000；11,500；11,000；10,500；9,000；8,500；8,000；7,500；7,000；6,500；6,000；5,500；5,000；或4,500以及独立选择的下限4,000；4,500；5,000；5,500；6,000；6,500；7,000；7,500；8,000；8,500；9,000；9,500；10,000；10,500；11,000；11,500；12,000；12,500；13,000；13,500；14,000；14,500；15,000；或15,500的任何密度范围；其中所述下限小于所述上限。在某些实施方案中，培养约5,000个细胞/cm2。
在一些实施方案中，本公开的细胞在肠病毒A病毒感染细胞的条件下用本公开的肠病毒A病毒接种。肠病毒A感染细胞的条件为本领域已知的并且可取决于细胞的类型、肠病毒A的类型、培养基、温度、细胞密度、病毒密度(例如MOI)、细胞生长率、细胞传代数目等等。下文提供肠病毒感染细胞的条件的示例性描述。
本公开的方法的某些方面涉及病毒接种时的细胞密度。如本文所述并且不希望受到理论约束，认为感染时的细胞密度可影响病毒产生(例如病毒生产率)。病毒接种时的最佳细胞密度可使得比(每个细胞)生产率、体积(每mL收获物)生产率和/或稳定性增加以及培养基消耗和/或收获物中的污染减少。
在一些实施方案中，用肠病毒A接种约100,000个细胞/cm2-约800,000个细胞/cm2。在一些实施方案中，用肠病毒A接种约200,000个细胞/cm2-约350,000个细胞/cm2。在一些实施方案中，接种时的细胞密度小于约任何以下密度(以细胞/cm2计)：800,000；750,000；700,000；650,000；600,000；550,000；500,000；450,000；400,000；350,000；300,000；250,000；200,000；或150,000。在一些实施方案中，接种时的细胞密度大于约任何以下密度(以细胞/cm2计)：100,000；150,000；200,000；250,000；300,000；350,000；400,000；450,000；500,000；550,000；600,000；650,000；700,000；或750,000。即，接种时的细胞密度可以是具有上限800,000；750,000；700,000；650,000；600,000；550,000；500,000；450,000；400,000；350,000；300,000；250,000；200,000；或150,000以及独立选择的下限100,000；150,000；200,000；250,000；300,000；350,000；400,000；450,000；500,000；550,000；600,000；650,000；700,000；或750,000的任何密度范围；其中所述下限小于所述上限。
本公开的方法的某些方面涉及用于接种本公开的细胞培养物的肠病毒的MOI。MOI在本文中的使用与本领域中可接受的含义一致，即病毒剂(例如肠病毒A病毒)与病毒靶标(例如本公开的细胞)的已知或预测的比率。在本领域中已知MOI影响培养物中被至少一种病毒感染的细胞的百分比。虽然较高MOI可增加病毒生产率，但是在一定范围的MOI感染率下可以饱和，并且在达到阈值或预期感染率后减小MOI可降低对应的病毒种子库的体积和成本。
在一些实施方案中，所述细胞用肠病毒A病毒以约0.025与约0.0009之间的MOI接种。在一些实施方案中，MOI小于约任何以下MOI：0.025、0.022、0.020、0.018、0.015、0.012、0.010、0.008、0.005、0.002或0.0010。在一些实施方案中，MOI大于约任何以下MOI：0.0009、0.0010、0.002、0.005、0.008、0.010、0.012、0.015、0.018、0.020或0.022。即，MOI可以是具有上限0.025、0.022、0.020、0.018、0.015、0.012、0.010、0.008、0.005、0.002或0.0010以及独立选择的下限0.0009、0.0010、0.002、0.005、0.008、0.010、0.012、0.015、0.018、0.020或0.022的任何MOI范围；其中所述下限小于所述上限。在某些实施方案中，所述细胞用肠病毒A病毒以约0.001的MOI接种。
在感染时，本公开的感染细胞可以在第二细胞培养基中培养(例如在本公开的固定床中)。如本文所述培养的细胞可以在病毒接种之前在第一培养基中培养并且在病毒接种时和/或之后在第二培养基中培养。例如，在一些实施方案中，本公开的细胞可以在第一细胞培养基中培养，然后可去除第一细胞培养基，所述细胞可任选地冲洗(例如用水性缓冲溶液诸如PBS冲洗)，并且可将第二培养基添加到细胞中。在一些实施方案中，第二培养基可含有用于接种细胞的肠病毒A病毒。在一些实施方案中，第一培养基和第二培养基为相同培养基(例如具有相同组成，在一些实施方案中不必是相同的物理培养基)。在其他实施方案中，第一培养基和第二培养基是不同的(例如具有不同组成)。
在一些实施方案中，第一细胞培养基含有血清(例如胎牛血清)。可以使用任何类型的适用于生长培养的细胞的血清。本领域中血清的实例包括但不限于胎牛血清、小牛血清、马血清、山羊血清、兔血清、大鼠血清、小鼠血清以及人类血清。在一些实施方案中，第一细胞培养基含有小于10％血清(例如胎牛血清)，并且所述细胞不适于无血清培养基。在某些实施方案中，第一细胞培养基含有5％血清(例如胎牛血清)。
在一些实施方案中，第二细胞培养基是无血清培养基。在一些实施方案中，第二细胞培养基是无蛋白培养基。培养基(例如本公开的培养基)在本公开的背景下称为无血清培养基，其中没有来自人类或动物来源的血清的添加剂。无蛋白应理解为意指其中发生细胞复制的培养物，其排除蛋白质、生长因子、其他蛋白质添加剂和非血清蛋白质，但是可任选地包括对于病毒生长可能需要的蛋白质诸如胰蛋白酶或其他蛋白酶。在此类培养物中生长的细胞自身天然地含有蛋白质。
病毒接种体和病毒培养物优选地不含单纯疱疹病毒、呼吸道合胞体病毒、副流感病毒3、SARS冠状病毒、腺病毒、鼻病毒、呼肠孤病毒、多瘤病毒、双RNA病毒、圆环病毒和/或细小病毒(即将针对这些病毒测试并且给出针对这些病毒的污染的阴性结果)[WO2006/027698]。
细胞培养和细胞培养基的其他参数也可以影响病毒产生。在一些实施方案中，本公开的细胞可以在所需体积/表面比率下在本公开的第一培养基和/或第二培养基中培养。不希望受到理论约束，培养细胞时的体积/表面比率可影响各种参数，诸如细胞生产率、细胞大小、生长率和/或对培养基中的营养素和其他组分的接近性。在某些实施方案中，细胞(例如在病毒接种之前、期间和/或之后)在约0.3mL/cm2的体积/表面比率下培养。
在一些条件下，本公开的细胞可在培养期间产生乳酸盐。本领域已知的是培养物中的细胞可由于糖分解或厌氧型代谢而产生乳酸盐。不希望受到理论约束，认为细胞培养基中的过量乳酸盐可消极地影响细胞生长、代谢和/或病毒生产率，例如通过降低培养基的pH。另外，培养的细胞产生过量乳酸盐可指示对于病毒产生和/或生长不期望的细胞代谢状态。在一些实施方案中，第一细胞培养基和/或第二细胞培养基中的乳酸盐浓度不超过约25mM。用于测量细胞培养基中的乳酸盐浓度的方法为本领域已知的并且包括但不限于使用乳比重计、乳酸盐酶测定(例如通过使用乳酸盐脱氢酶和比色或荧光检测试剂)、微量透析取样设备等等。
在一些实施方案中，本公开的感染细胞可以在第二细胞培养基中在感染细胞产生肠病毒A病毒的条件下培养(例如在本公开的固定床中)。感染细胞产生肠病毒A的条件为本领域已知的并且可取决于细胞的类型、肠病毒A的类型、培养基、温度、细胞密度、病毒密度(例如MOI)、细胞生长率、细胞传代数目等等。下文提供肠病毒感染细胞的条件的示例性描述。
本文所述的方法的其他方面涉及细胞培养基中的氧密度(DO)。维持细胞培养基中适合的氧水平可通过提供氧用于细胞呼吸来促进细胞生长和/或病毒生产率。另外，细胞培养物中细胞进行的氧利用可反映其健康、生长和/或代谢的状态。在一些实施方案中，第一细胞培养基和/或第二细胞培养基中的氧密度维持在约50％之上。用于维持和/或测量细胞培养基中的DO的方法为本领域中已知的并且可包括但不限于自动氧注射、使细胞培养基暴露于氧(优选地同时使污染风险最小化)、使用氧控制器、使用氧传感器等等。
本领域已知的各种方法可以用于测量由本公开的方法产生的感染病毒的滴度。此类方法包括但不限于终点稀释测定(例如测定TCID50值)、蛋白质测定、定量透射电子显微镜法(TEM)、噬斑测定、焦点形成测定(FFA)等等。在一些实施方案中，病毒滴度以TCID50/mL测量。在一些实施方案中，收获至少5.0×107TCID50/mL的肠病毒A病毒。
用于细胞培养的设备
本公开的某些方面涉及用于在固定床中培养细胞的方法。示例性细胞培养设备参见US8597939、US8137959、US PG Pub 2008/0248552和WO2014093444并且可商购获得(例如来自
Figure BDA0003343729380000141
Life Sciences,Port Washington,NY的
Figure BDA0003343729380000142
生物反应器，诸如Nano和500/100生物反应器)。
在一些实施方案中，所述细胞在固定床生物反应器中培养。固定床生物反应器包括呈固定填充材料形式的载体，所述载体形成用于促进细胞粘附和生长的固定床或填充床。固定床的填充材料的布置影响局部流体、热量和质量传递，并且通常非常密集以使给定空间内的细胞培养最大化。在一个实施方案中，反应器包括与由填充材料(诸如纤维、珠粒、球粒或类似材料)组成的填充床或固定床形成内部的壁，以用于促进细胞粘附和生长。所述材料位于反应器内部内的隔室中，所述隔室可包括中空的垂直延伸管的上部分。第二隔室设置在反应器内部内，以用于将流体来回运输到至少部分形成固定床的隔室的材料。通常，填充材料应被布置来使用于细胞生长的表面积最大化，其中1,000平方米被认为是有利的表面积量(这例如可使用医用级聚酯微纤维作为填充材料来实现)。在一个实施方案中，均匀分布的培养基循环通过建立磁力驱动叶轮来实现，从而确保低剪切应力和高细胞活力。细胞培养基从底部到顶部流动穿过固定床。在顶部，培养基以薄膜形式从外壁上下落，其中它吸收O2，以维持生物反应器中的高KLa.。此瀑布式样充氧作用连同轻微搅拌和生物质固化使得生物反应器能够实现并维持高细胞密度。在一些实施方案中，固定床具有约2cm的床高。在其他实施方案中，固定床具有约10cm的床高。
在一些实施方案中，固定床含有巨载体(例如基质)。在一些实施方案中，所述巨载体为纤维基质。在一些实施方案中，所述巨载体为碳纤维基质。巨载体可选自织造或非织造微纤维、聚酯微纤维(例如医用级聚酯微纤维)多孔碳和壳聚糖基质。微纤维可任选地由PET或任何其他聚合物或生物聚合物制成。在一些实施方案中，巨载体包括珠粒。聚合物可被处理来与细胞培养物相容，如果此类处理必需的话。
适合巨载体、基质或“携带材料”为与细胞生长相容的矿物载体，诸如硅酸盐、磷酸钙、有机化合物诸如多孔碳、天然产物诸如壳聚糖、聚合物或生物聚合物。基质可具有带有规则或不规则结构的珠粒形式，或者可包含与细胞生长相容的聚合物或任何其他材料的织造或非织造微纤维。填充物也可以具有孔和/或通道的单件形式提供。器皿中的填充物可具有各种形式和尺寸。在一些实施方案中，基质为固体或多孔球、薄片、多边形的微粒材料。通常，使用充分量的基质来避免基质颗粒在使用时在器皿中移动，因为这会损害细胞并且可能对气体和/或培养基的循环具有影响。可选地，基质由配合到内部器皿中或配合到器皿隔室中的元件组成，并且具有适合的孔隙率和表面。其实例为通过Cinvention(德国)制造的碳基质(Carboscale)。在一些实施方案中，纤维基质具有细胞易接近的约150cm2/cm3与约1000cm2/cm3之间的面积。
在一些实施方案中，巨载体(例如纤维基质)具有约60％与99％之间的孔隙率。在一些实施方案中，巨载体(例如纤维基质)具有约80％与约90％之间的孔隙率。任选地，填充可具有50％至98％的范围内的孔隙率P。术语孔隙率P为给定材料体积内存在的空气的体积，并且表示为给定材料体积的百分比。孔隙率可通过测量每体积多孔材料的重量Wx并使用以下公式来测量：
P＝100-(1-Wx W比)
其中W比为材料的比重。多孔材料可以是一个固体单元的多孔材料，或者可以是多个单独单元，诸如晶粒、碎片、珠粒、纤维或纤维聚结物。
在一些实施方案中，固定床为单次使用或一次性固定床。例如，可商购获得的生物反应器诸如
Figure BDA0003343729380000151
Nano和500/100生物反应器Bioreactors(
Figure BDA0003343729380000152
Life Sciences,Port Washington,NY)可包括具有可移除、一次性或单次使用的固定床的生物反应器系统，所述固定床提供压实生物反应器体积的大生长表面积。与使用微载体的标准搅拌罐生物反应器相比，此类系统避免若干个精妙且耗时的程序，包括人工操作、微载体的消毒和水合以及从预培养到最终过程的珠粒至珠粒转移。如本文所用，此类生物反应器可使得能够实现在大规模(例如500平方米)培养面积当量和高达1500至2000L的收获流体体积下的过程，其有利于工业规模生产病毒(例如用于制备疫苗)。如本文所列举的，此类设备可能够实现另外的优点，诸如低细胞接种体；在短预培养时段达到最佳感染细胞密度；和/或对培养生长阶段期间的MOI、培养基和血清浓度最优化。此类设备可被配置来允许将细胞快速灌注于培养物中，例如使得90％或更多的细胞经历相同的培养基环境。此外，并且不希望受到理论约束，单次使用或一次性固定床可允许流水线化下游处理以使生产率最大化并且减少处理区的足迹，甚至在使比例放大相对于若干大规模常规培养容器的情况下也是如此。这样，可使用最少步骤和成本实现有利的生产率和纯度。
在一个实施方案中，用于细胞培养的器皿具有内部空间，其可以是环形的但也可以采用其他形式。所述空间含有填充物。当器皿用于细胞培养时，填充物应与细胞生长相容。在环形配置中，内部空间具有由以下各项限定的环形体积：外管状壁，其具有第一外端和第二外端以及在纵向方向上延伸的纵向壁。外管状壁在纵向方向上限定了环形体积的外边界；第一闭合件和第二闭合件，其分别在外管状壁的第一外端和第二外端处对环状体积进行限界和封闭；内伸长壁，其具有朝向外管状壁的第一外端定向的第一外端和朝向外管状壁的第二外端定向的第二外端。内伸长壁定位在外管状壁内。内伸长壁在纵向方向中延伸并且限定了环形体积的内边界，所述内边界由所述外边界包围。内伸长壁的第二外端与第二闭合件相重合。作为实例，外管状壁通过圆柱形外管状元件提供。内伸长壁可通过实心内圆柱形元件诸如圆柱形杆提供。外管状元件为圆柱形管状元件，并且具有平行于纵向方向的中心轴线。内圆柱形元件和外管状元件可以同轴安装。
在一些实施方案中，内圆柱形元件的第一外端可包括联接元件以将内圆柱形元件联接至驱动机构，并且所述联接元件也通过与内圆柱形元件和外管状元件固定的闭合件将外管状元件联接至驱动机构，所述驱动机构例如是生物反应器的马达。第二闭合件设置有连接器，所述连接器适于将器皿联接至培养基源或气体源，以向内部空间提供培养基和/或气体和/或从所述内部空间中抽取培养基和/或气体。可为第一闭合件或第二闭合件提供这种连接器或可选地另外的连接器。
在一些实施方案中，当移动器皿中，填充物(具体地为多孔材料)可相对于器皿处于固定的相对位置，或者可在器皿内并相对于器皿移动，或者可视情况在器皿隔室内移动。器皿围绕其轴线，任选地以每分钟0.1转与25转之间的旋转速度旋转。
在一些实施方案中，内部空间部分填充有培养基，诸如细胞培养用培养基。作为实例，液体水平至少接触内伸长壁，或者内伸长壁部分浸入在培养基中。位于液体水平下方的填充物部分被培养用培养基诸如细胞培养用培养基浸湿。位于液体水平上方的填充物与内部空间中存在的气体或空气接触。当器皿在一个方向上围绕轴线旋转，例如顺时针旋转时，培养用培养基诸如细胞培养用培养基反向旋转，即在相对于填充物逆时针方向中。培养用培养基诸如细胞培养用培养基以活塞流的形式穿过整个填充物。在器皿例如顺时针旋转时，培养用培养基诸如细胞培养用培养基迫使活塞流前沿处的气体或空气逆时针移位。在培养基的后沿处，形成任选受限低压，使得气体或空气被朝向所述尾缘抽吸。如此，培养基和气体或空气穿过整个填充物。
在一些实施方案中，替代性器皿的内伸长壁可通过圆柱形管状元件来提供。外管状壁通过外管状元件提供。内伸长壁通过伸长圆柱形管状元件提供。外管状元件和伸长圆柱形管状元件固定至两个可移除的闭合件。第一闭合件设置有联接元件，其用于将器皿联接至驱动装置以使器皿沿纵向方向上的轴线旋转。第一闭合件还包括用于将内部空间连接至导管诸如柔性管的连接器。
在一些实施方案中，外管状元件可以是玻璃管，其具有例如110mm的长度L和例如135mm的内径Do。内伸长元件可以是具有例如88.9mm的外径Di的聚偏二氟乙烯(PVDF)管。内伸长元件的外端(因此内伸长壁的外端)与闭合件相重合。闭合件可以是不锈钢或PVDF环形盘，其可使用硅树脂连接至内部元件和外部元件。可设置有连接器的第一闭合件具有外径Dee为例如约35mm的联接元件。内部空间至少部分填充有填充物。
在一些实施方案中，器皿还包括2个流体可渗透分隔件，其将内部空间分隔为2个隔室。流体可渗透分隔件在平行于管轴方向的纵向方向上从内伸长壁延伸到外管状壁并且从第一闭合件延伸到第二闭合件。一个隔室设置有填充物。一个隔室未设置有填充物。流体可渗透分隔件可设置有孔隙，诸如通过使用多孔材料来提供多孔分隔件，或者设置有孔，从而在任何情况下均允许液体即培养用培养基和气体通过。然而，分隔件具有小到足以防止填充物从分隔件一侧穿到另一侧的孔隙或孔。
在一些实施方案中，外管状壁通过外管状元件提供，所述外管状元件沿垂直于纵向方向的平面的径向(racial)截面，所述截面具有圆的形状。内延伸壁通过内延伸元件提供，所述内延伸元件具有沿垂直于纵向方向的平面的径向截面，所述横截面具有截圆或圆弓形的形状。在一个实施方案中，圆弓形具有圆弧区段和弦。例如，圆弓形的高度具有200mm(Dec)、400mm(Do)、240mm(Di)和125mm(L)的尺寸。分隔件在此实施方案中与圆弓形的弦共面。两个闭合件中的第二闭合件设置有两个连接器。第一连接器设置于外管状壁附近。第二连接器设置于内伸长壁附近。当器皿仅部分填充有培养用培养基(其具有液体表面)时，则器皿可旋转至如下位置，液体并不接触内伸长壁的，而是与内伸长壁保持给定距离。当器皿处于此位置时，第一连接器可用于从隔室移除或向隔室提供培养基，所述隔室未填充有填充物。可通过连接器将气体移除或将气体提供在培养基液体表面上方。通过顺时针或逆时针旋转器皿，例如以多至360°或甚至更大角度旋转，培养基将穿过两个分隔件之一，更具体地穿过将逐渐浸入在培养基中的分隔件。随着填充物将由于旋转而逐渐穿过培养基，培养基将缓慢地流过填充物。由于器皿旋转，培养基将以活塞流的方式穿过并流过整个填充物。将在整个环状体积中发生培养基与填充物之间的均匀接触。一旦一部分填充物穿过培养基，所述培养基将从填充物逐渐渗出并且因此器皿中的气体可再次接触填充物，从而允许细胞均匀生长在整个填充物中。
在器皿的一个替代实施方案中，内部空间的环形体积通过多个环形区段(在此具体情况下为四个环形区)提供。每个区段通过外管状壁区段提供一部分外管状壁。每个区段通过内伸长壁区段提供一部分内伸长壁。每个区段具有两个径向延伸区段壁。这些区段壁为液体和气体不可渗透的。每个区段壁设置有允许相邻区段彼此联接的安装装置。第一区段闭合件和第二区段闭合件分别在外管状壁的第一外端和第二外端处对环状区段的体积进行限定和封闭。区段闭合件一起分别形成器皿的环形体积的第一闭合件和第二闭合件。
在一些实施方案中，每个区段可进一步设置有两个流体可渗透分隔件，所述两个流体可渗透分隔件将每个环状区段的内部空间分为三个隔室。流体可渗透分隔件，例如多孔分隔件在平行于管状轴线方向的纵向方向上从内伸长壁延伸到外管状壁并且从第一闭合件延伸到第二闭合件。一个隔室设置有填充物。两个隔室未设置有填充物。对于每个环形区段，第一连接器设置于外管状壁附近。第二连接器设置于内伸长壁附近。当器皿围绕轴线旋转时，每个区段可充当器皿的独立器皿区段。在每个区段中填充物提供有培养基，所述培养基根据区段的径向位置而存在于此区段中。
通过安装这些区段(在此实施方案中为四个区段)，获得了具有外管状壁和伸长壁的器皿，其环形体积通过两个闭合件在外管状壁的两个外端处封闭。因为区段的联接通过安装和联接两个径向延伸的区段壁来提供，两个连续区段壁的组合形成液体和气体不可渗透分隔件，其在平行于管轴线方向的纵向方向上从内伸长壁延伸至外管状壁并且从第一闭合件延伸到第二闭合件。此实施方案具有以下优点：每个区段可提供有用于不同细胞培养的不同培养基。而且，在这些区段之一中的反应填充物的功能不正确的情况下，仅替换一个区段。器皿(或本文所公开的任何其他器皿)的旋转可由旋转器提供。在一个实例中，此旋转器可包括使外管状壁的外表面与至少两个支撑轮接触，所述支撑轮中的至少一个被驱动。
在一个替代性实施方案中，器皿的每个区段具有两个径向延伸区段壁。这些区段壁为液体和气体可渗透的。每个区段壁包括许多个孔，这些孔中的每个在邻隔室的第二区段壁中存在对应的孔。第一区段壁的孔可设置有向外延伸的边缘，其延伸穿过第二区段壁的对应孔。任选地，在相邻区段壁中的孔周围设置密封件，以防止培养基在接触壁之间渗漏。在替代性实施方案中，在器皿之间安置有柔性管而不是密封件。
在利用器皿的生物反应器的一个实施方案中，至少一个器皿以可旋转方式安装在容器中，所述容器可具有任何适合的径向截面，例如像圆形或多边形诸如矩形(任选地正方形)。容器部分地填充有培养用培养基，因此液体水平任选地不升高至高于生物反应器的轴线，而是至少接触内伸长壁。器皿围绕此轴线旋转，所述轴线与器皿的纵向轴线相同。器皿的纵向轴线是平行于外管状壁的纵向方向的轴线。任选地外管状壁设置有孔，或者由多孔的例如液体和气体可渗透材料制成。当此流体可渗透外管状壁在部分填充有培养基的容器中旋转，以使得仅外管状壁的一部分浸入在培养基中时，填充物可提供有通过外管状壁流入到环形体积中的培养基。当器皿在容器中旋转时，部分培养基可连同填充物一起受到拖曳。
在一些实施方案中，至少一个器皿包括磁力元件。生物反应器还包括与器皿的磁力元件协作的磁力元件。两个磁力元件被定位来使得生物反应器的磁力元件围绕旋转轴线的旋转将诱导器皿的磁力元件旋转，因此将使整个器皿旋转。相邻器皿可安装在共用轴上，它们围绕所述共用轴旋转。相邻器皿可在固定位置中彼此联接，因此器皿的旋转也诱导器皿旋转。
在一些实施方案中，器皿具有液体和气体不可渗透外管状壁，其具有用于通过任选柔性管将器皿连接至气体或培养基储存器的连接器。器皿可通过驱动系统旋转以用于提供生物反应器。器皿安装在可旋转轴上，其可围绕与器皿轴线重合的旋转轴线旋转。轴被设定外形并配合在内伸长元件的内空隙内的独特旋转位置中。这样，通过控制轴的旋转位置，明确地限定了器皿绕轴线的位置。驱动系统还可包括精确控制轴旋转的电动机(诸如线性马达)或任何其他适合的装置。防止器皿在轴上沿纵向方向移位的夹紧螺钉或任何其他装置可将固定器皿在轴上沿纵向方向的位置。应理解任选地超过一个器皿可安装在共同轴上。内伸长元件的内部空隙和轴的外周的形状被选择来使得所述轴和器皿可以受限的方式或甚至以独特的方式安装。
在器皿的一个实施方案中，内伸长元件在内伸长元件的内壁中具有纵向凹槽。轴上的边缘配合到此凹槽中。器皿以明确的方式固定在轴上。边缘可在凹槽中可滑动地移动。在器皿的一个替代性实施方案中，内伸长元件具有在所述内伸长元件的内壁中的两个纵向凹槽。轴上两个互相垂直凸脊配合到这些凹槽中。器皿以两种方式配合在轴上，第一位置围绕轴线相对于第二位置旋转180°。这些凸脊可在凹槽中可滑动地移动。在器皿的另一个实施方案中，内伸长元件具有四个纵向凹槽，在由隔室提供的内伸长元件的每个内壁中都存在一个。轴具有基本上十字形的截面，其包括轴上四个互相垂直的凸脊。每个凸脊配合到一个隔室的凹槽中。器皿以四种方式固定在轴上。这些凸脊可在凹槽中可滑动地移动。
在生物反应器器皿的另一个实施方案中，内部空间的体积通过多个区段(在此具体情况下为四个四分之一部分)提供。每个区段通过外管状壁部提供外管状壁的一部分。每个弓形通过内伸长壁部提供内伸长壁的一部分。每个弓形具有两个径向延伸弓形壁。作为实例，弓形具有两个径向延伸弓形壁。培养用培养基还可填充内伸长壁的内部空隙。通过孔，培养用培养基可流入或流出所述区段，并任选地流到相邻区段。器皿包括形成纵向壁的主体和呈帽的形式的末端。所述帽可为可移除的，并且在连接位置中形成用于在主体内包含任何流体的流体密封，。每个帽可包括形成用于接收培养基的入口或出口的开口，但是入口和出口各自也可设置在同一帽中或在主体的纵向壁中。提供至少一个或一对流体可渗透结构诸如穿孔隔板，从而形成用于包含任何填充物的隔室。每个隔板中的穿孔可在形状和尺寸上被设定，以控制流体在隔室中的流动和驻留时间，并且这些隔板可以是相同或不同的。可以下述方式提供填充物：使得它完全占据器皿的隔室的方式提供，并且因此沿圆周接触主体壁的内表面以及流体可渗透结构。
在一些实施方案中，器皿可与旋转设备相关联。所述设备可包括一对辊，其用于接收、支撑器皿并使器皿围绕主体纵向轴线旋转。器皿可设置有大体圆柱形主体，其适于接合辊并通过所述辊旋转以帮助分布穿过隔室中存在的任何填充物的任何流体(例如培养基或任何冲洗剂或回收剂)。管状连接器也可设置成与入口和出口相关联，以用于将流体递送至隔室。这可在器皿固定的同时或在它旋转的同时来进行。在后一种情况下，连接器可以按允许相对旋转的方式连接，例如通过使用卡扣接合产生的旋转接头或通过使用轴承而相对旋转。密封件诸如O-形环可用于帮助防止任何渗漏并且帮助维持细胞培养所需要的无菌条件。器皿的一个优点为布置的简单性。例如，器皿不包括传感器、探头、混合物或类似装置，在希望它包括此类结构的情况下，它可以包括这些结构，并且可通过将器皿与储罐以闭环回路连接来实现。储罐可包括用于测量循环流体的一个或多个特征的任何数目的传感器或类似装置，并且可包括单次使用容器(诸如柔性袋)以避免对清洁和消毒的需要。还可提供泵诸如蠕动泵以用于使流体循环通过回路。
在此实施方案中，器皿可根据任何以上细节而构造(因此形成滚瓶)，并且包括入口和出口。每个入口和出口可连接至导管，在不过度地约束(biding)或扭转该导管的情况下，该导管允许器皿以不干扰流体传输的方式旋转，并且因此可在器皿旋转的同时允许流体连续流入和流出器皿。确切地说，导管可包括具有开口端的盘管，以用于分别连接至入口或出口，并且可在相反端处于任何流体储罐相关联。适合的泵送布置也可被提供来使流体移动通过导管和器皿。
在一个实施方案中，器皿可使用适合旋转器(诸如辊)在第一方向上(诸如顺时针)旋转，进行一次或多次完整旋转。在不约束导管的情况下，可能的旋转次数可发生改变，但设想的是2-3次旋转可能是最小旋转次数。器皿然后可在第二相反方向上旋转，进行一次或多次完整旋转。更确切地说，旋转可以是在第一方向上使盘管回到其原来位置的旋转次数，加上在第二位置上的对应旋转次数，只要盘管不约束或以其他方式干扰流体传输。旋转和反向旋转可连续或间断地发生，并且对于经由导管对流体进行的递送和回收同样如此。还应理解在器皿包括传感器的事件中，它也可连接至用于感测的任何能量源。在此情况下，也可以盘绕或缠绕任何传输线诸如电缆，以在无扭转或约束的情况下适应以上文所预期的方式进行的相对旋转。同样，希望将任何传感器或类似装置置于任何再循环回路中，因为这降低了器皿的成本。
在滚瓶形式的器皿的另一个实施方案中，入口和出口可设置于共用壁中。所述入口也可与定位在固定床内的流体可渗透内部圆柱体内的管相关联，这有助于确保所引入的流体(气体、液体或两者)并不简单地通过入口立即流出。气体可通过将注射器诸如转子流量计放置于再循环回路中而引入到液体中。所述放置可恰好在入口的上游。这种气体引入方式与液体流动的结合有利地有助于减少发泡的发生率并提高传质速率，因为气体保留在由液体隔开的气穴中。与出口相关联的传输线回到储罐，这可通过所示的过滤器对所述储罐通气，以避免与器皿直接连接的通气孔。
在一些实施方案中，其他元件可添加至器皿和生物反应器。作为实例，内伸长壁可以是伸长管状的，任选地为圆柱形壁。内管壁的内空隙可用于容纳一个或多个传感器，诸如温度传感器、位置传感器(例如用于限定器皿相对于旋转轴线的取向)、光学传感器(例如用于生成关于培养用培养基诸如细胞培养用培养基的颜色的数据)、pH传感器、氧传感器(诸如溶解氧(DO)-传感器)、CO2～传感器、氨传感器或细胞生物质传感器(例如浊度密度计)。此类传感器可另外地或任选地位于闭合件之中或之上。器皿还可适应灌注、新鲜营养培养基的连续添加和抽出等体积的已用培养基，从而允许实现尽可能近似地接近体内情形的细胞培养条件。灌注细胞培养物与利如酶葡萄糖生物传感器的组合允许连续监控细胞培养物的葡萄糖消耗。还应理解可以为外部和任选地内壁提供加热元件诸如加热毯，以用于加热或维持器皿内培养基和填充物的温度。
在一个替代实施方案中，生物反应器包括细胞培养容器，其包括基本上垂直和圆柱形的培养容器，但是也可以设想其他形式，例如任何棱柱形状，优选地为规则形状。培养容器包括彼此连通的至少四个区。从容器中心至外部，容器包括第一区、第三区、第二区和第四区。
在一些实施方案中，培养容器包括在其底部中的培养基循环装置。在此优选实施方案中，培养基循环设备由围绕真实或虚拟的中心旋转轴线旋转的磁力设备，例如磁力棒，其第一端容纳在顶部接合装置中并且其第二端容纳在底部接合装置中。磁力棒由在培养容器外部且在此未示出的旋转磁力驱动马达驱动。循环装置包括至少一个培养基入口。培养基入口包括至少一个第一端，该端是培养基流动的转向挡板。磁力棒充当离心泵，即培养基通过通过所述棒产生的培养基移动而被吸入相对中心区中并且培养基相对于中心点向外推进。培养基转向挡板将培养基引导在所述棒的相对中心区中，以使得培养基被吸入其中并且然后向外推进。有利的是，入口处于相同平面(星形构型)中并且入口的数目将是使得其位置表现出对称性的数目。更具体地说，如果考虑三个入口，则对其有利的是它们各自以约120°角度彼此分开；如果入口数目等于4，则入口将以基本上等同于90°的角度彼此分开；如果入口数目等于10，则入口将以大约等于36°的分离角度设置。培养基循环装置还包括至少一个培养基出口。培养基出口有利地位于培养基通过磁力棒的离心作用而被推进的位点处。有利的是，出口的数目将是使得其位置将表现出对称性的数目。更具体地说，如果考虑三个出口，则对其有利的是它们各自以约120°角度彼此分开；如果出口数目等于四，则出口将以基本上等同于90°的角度彼此分开；如果出口数目等于10，则出口将以约36°的分离角度设置。优选地，出口并不位于与入口相同的水平平面中。培养容器的底部包括与所述至少一个出口相邻的至少一个培养基导向装置，其引导培养基朝向培养容器顶部推进。
在一些实施方案中，培养容器的第一区是基本上中心区并且是培养基转移区。第一区包括基底部分并且在具体实施方案中任选地也是圆柱形部分。基底部分的直径小于培养容器的直径。基底部分与培养基循环装置的所述至少一个培养基出口处于培养基连通。基底部分在第一区的顶部部分中缩小至具有小于基底部分的直径的圆柱形部分。顶部圆柱形部分包括外壁并且与所述第一培养基转移区的基底部分处于直接的培养基连通。第三区是培养基转移区，在第一培养基转移区的外部。第三区还包括基本上基底部分(呈套筒形式)并且在具体实施方案中任选地也是基本上圆柱形顶部部分。
在一些实施方案中，第三培养基转移区的基本上圆柱形部分基本上与第一培养基转移区的基本上圆柱形部分同心并且这两个部件是处于培养基连通的。培养基连通借助于通过孔口或管、通过经由溢流而产生的溢出(如图所示)或用于实现此连通的任何其他可能的手段来实现。第二区是细胞培养区，其具有或不具有载体或微载体。第二区也呈套筒形式，在其中心处为第一培养基转移区和第三培养基转移区。第二区包括底部壁和顶部壁，每个壁设置有孔口，从而允许转移基本上不含细胞的培养基。第二培养区通过底部壁中的孔口与第三培养基转移区的相对基底部分处于培养基连通，从而允许培养基穿过。第四区为培养基转移区，其在第二培养区外部但在培养容器内部。第四区与第二培养区处于培养连通。第四区也经由所述至少一个入口与培养基循环装置处于培养基连通。培养基连通借助于通过孔口或管、通过溢出或通过用于实现此连通的任何其他可能的手段来实现。
在一些实施方案中，培养设备包括基本上圆柱形培养容器，但是也可以设想其他实施方案，如先前所提及的，例如基本上菱柱形容器，优选地为规则的。明显，也可以是具有各种培养基和培养转移区的情况。它们也可以是菱柱形，优选地为规则的，可能是任何的形状组合。在此情况下，术语套筒必须设想为截面类似于所设想菱柱的截面的包裹物。当操作培养基循环装置时，培养基通过所述至少一个出口(当存在多个出口时，通过各个出口)离开所述装置，并通过导向装置转向，所述培养基终止于第一培养基转移区的基本上基底部分。第一培养基转移区的结构和泵的输出要求将培养基朝向第一培养基转移区的基本上圆柱形部分引导。当培养基到达基本上圆柱形部分的壁的顶部时，它经由溢流溢出到第三培养基转移区中。
本领域技术人员清楚的是，在此具体实施方案中，出于效率和流速的原因，第一培养基转移区的基本上圆柱形部分的壁的高度小于第三培养基转移区的壁，但将容易理解的是第一培养基转移区的基本上圆柱形部分的壁也可高于第三培养基转移区的基本上圆柱形部分的壁。培养基因此经历由泵所施加的流速和重力，它被从第三培养基转移区向下引导、从基本上圆柱形部分向下流动，并且到达第三培养基转移区的基本上基底部分。接着，培养基通过连通容器效应以及通过泵所施加的流速向上流动，并且到达第二培养区的顶部。培养基经由第二培养区的底部壁中的用于基本上不含细胞的培养基通过的孔口从第三培养基转移区到达第二培养区。如已经提及的，培养基通过孔口根据培养类型设定大小。如果培养是不使用载体的培养，则包括孔口的壁将是多孔膜，其中孔径小于细胞直径。如果培养是在微载体上或载体上，则孔口的大小将小于微载体或载体的大小。当培养基流动边缘到达第二培养区的壁的顶部时，它溢出到第四培养基转移区中。自然，如果存在孔口或管，则必须理解当培养基流动边缘到达孔口或管时，它流入到第四区中。
在一个实施方案中，第四培养基转移区包括斜壁，当培养基从第二区进入第四区时，所述培养基在所述斜壁上流动。斜壁优选地包括亲水性膜，以便改进膜在所述斜壁上的形成。膜必须优选地为层状物，以便尽可能防止泡沫的形成。为了使膜稳定，还可以将添加剂添加到培养基中以便改变水的流变特性，具体地为培养基的流变特性，所述添加剂诸如由以下组成的组中包括的添加剂：表面活化剂、普朗尼克F68、甘油、季铵以及用于改变培养基流变特性的任何其他添加剂。亲水性膜例如将是由聚氧乙烯组成的膜。膜在斜壁上的形成是一个重要的步骤，因为它允许在“薄膜”上充氧。实际上，气体体积相对于此第四培养基转移区中培养基的量较大并且提高了交换。另外，膜在斜壁上的形成增加了气体-液体接触表面积。
在一些实施方案中，培养容器优选地包括盖，至少一个气体入口孔口和至少一个气体出口孔口穿过所述盖。气体入口孔口优选地定位使得与第四培养基转移区直接连通。在一些变形中，可优选的是气体入口孔口存在于培养容器的垂直壁上或存在于培养容器的底部，即气体通过贯穿培养容器的与盖相对的壁的孔口穿过，并且此孔口由管提供以终止于液体水平上方。
在此实施方案中，盖通过固定装置固定到第二培养区的顶部壁。在变形中，盖可制成第二培养区的顶部壁的整体部分，此部分当培养容器的盖升高时打开。以这种方式，容易在使用或不使用载体的情况下获取细胞样品以评价细胞密度、细胞结构以及反映培养物健康状态的细胞的其他物理特征。实际上，将两者相连接使得可以仅通过升高培养容器的盖来打开培养隔室。在悬浮培养的情况下，可有利的是将多孔膜连接至设置有第二培养区的孔口的顶部壁，此组件可改进盖/或膜组件的刚度以便取样。
在一些实施方案中，磁力棒具有螺旋形状。具有基本上中心旋转轴线的磁力设备的设计将基本上取决于培养物的体积。实际上，对于小培养而言，所述设备被设定为能够使用简单棒诸如磁力芯片来使培养基循环。对于大体积，所述设备设想磁力转子，其也由外部马达驱动，例如像允许高培养基循环速率的养鱼缸中所使用的转子。
细胞培养设备的一些实施方案可以设想使用气泡产生设备，根据所产生气泡的大小更通常地称为“分布器”或“微型分布器”。有利的是，当将使用气泡时，气泡产生设备例如管的冲孔端将浸入在第四培养基转移区底部处或第一培养基转移区中的培养基中。当选择这种类型的充氧时，常常还可能在薄膜上继续充氧，这使得可以减少气体流动并形成更少的气泡并且因此减少泡沫的形成。在此情况下，还采取在培养容器的盖中或在培养容器的垂直壁上具有两个气体入口的措施。另外，还可以设想气泡产生设备仅作为SOS程序存在，并且仅在需要时使用。
在一些实施方案中，培养设备还包括一系列培养参数传感器，例如溶解氧分压pO2、酸度pH、温度、浊度、光密度、葡萄糖、CO2、乳酸盐、铵以及通常用于监测细胞培养的任何其他参数。这些传感器优选地为不需要培养容器内部与其外部之间相连的光学传感器。这些传感器的优选位置为临界位置，因为使这些传感器位于培养容器壁附近以便于它们与培养基接触是有利的，且优选地处于策略性位置中，如在培养基穿过细胞之前或紧接之后培养基穿过的区中。
在一些实施方案中，出于先前提及的所有简单性和经济的原因，细胞培养设备包括一次性生物反应器。因此，这是要减少培养容器的内部与外部之间的连接的原因。另外，生物反应器包括特别可靠的生物反应器，其中污染的风险由于是一次性的而特别低。
设备的一个实施方案还设想模块化设计，其包括用于以较大体积培养的一系列模块。例如，在使用这种类型的模块化设计的情况下，例如通过使用非常有限数目的标准模块设想约500毫升至100升的培养体积。在一些实施方案中，所述设备提供一系列模块，所述模块可放置于包括培养循环设备和盖的标准培养容器内、在第一培养基转移区周围“滑动”。在一个具体变形中，所述设备包括安装系统，其包括各种标准模块。这些标准模块例如是放置于组件底部处的循环装置模块、一个或多个培养模块和盖模块。尽管可以设想固定这些模块的其他装置，但是这些模块将彼此夹紧，例如通过从液体和气体角度而言完全不可渗透的快速连接器。
因此，根据培养类型和所需体积，使用者将能够从储备中取出包含培养基循环装置的底部模块，他也将必须根据所需培养体积从中取出需要的数目的培养模块并且然后取出与盖相对应的头部模块。接着，所有这些模块以无菌方式包装，他只需要将它们拆开并将一个“夹持”在另一个上面即可。所述叠加可形成“一次性生物反应器”或者可放置于适当容器中。
在一些实施方案中，包括循环装置的底部模块可固定至培养容器底部，也可滑动到培养容器中，以便能够安置它并且使用另一个模块进行另一次培养并且因此防止交叉污染。这些循环装置包括围绕中心旋转轴线旋转的磁力设备，其第一端容纳在顶部接合装置中并且其第二端容纳在底部接合装置中。循环装置包括至少一个培养基入口。培养基循环装置还包括至少一个培养基出口。培养容器的底部模块包括与所述至少一个出口相邻的至少一个培养基导向装置，其引导培养基朝向培养容器顶部推进。
在一些实施方案中，培养容器包括一个叠加在另一个上的一系列培养模块。还可设想的是它们简单地彼此相邻，即并排放置。在一些实施方案中，所述模块可通过快速连接器或夹子彼此夹持。另外，可能有利的是每个模块包括与每个培养模块的第四区连通的气体或气体混合物入口。容器也可包括用于过量气体或气体混合物的出口作为其部分。例如，气体入口孔口可存在于培养容器的底部，即气体通过贯穿培养容器的与盖相对的壁穿过，并且此孔口由管提供以便终止于模块的液体水平上方。因此，气体混合物到达此模块的第四培养基转移区。放置于所述模块上方的模块还可包括使得培养模块的第四区中存在的气体混合物能够与所述模块的第四区连通的管。此管因此有利地穿过模块的底部壁。
在某些实施方案中，对于长持续时间培养，可有利的是用新鲜培养基替换部分培养基或者进行营养物的添加。因此，底部模块然后可包括营养物入口。还有利的是，培养容器可在培养基循环装置处包括培养基出口，以便防止溢出。以类似方式，培养容器包括头部模块，其包括盖，所述盖有利地通过固定装置连接至设置有培养基通过孔口的顶部壁，以便简化在位于上方的模块中的样品取样。另外，有利的是，培养参数传感器也可设置于每个培养模块中。还可以在仅一个或若干个培养模块的所有区处或底部模块中提供传感器。
在一些实施方案或底部模块中，培养基经由所述至少一个出口(当存在若干个出口时，经由各个出口)从培养基循环装置推进，并且通过导向装置转向。培养基终止于在第一培养基转移区的基本上基底部分。此实施方案的基本上基底部分是所有培养模块所共有的区，并且在所示的实施方案中，位于底部模块中。无论培养模块是叠加还是并置的，这都是有效的。第一培养基转移区的结构和泵的输出需要将培养基引导朝向第一模块的第一培养基转移区的基本上圆柱形部分、朝向第二模块的第一培养基转移区的基本上圆柱形部分。在此实施方案中，模块组装形成包括基本上圆柱形部分的大第一培养基转移区。当培养基到达第二培养模块的基本上圆柱形部分的壁的顶部时，所述培养基溢出到第二培养模块的第三培养基转移区中。
在一些实施方案中，培养基因此经历由泵所施加的流速和重力，它被引导朝向第二培养模块的第三培养基转移区底部、从第二培养模块的基本上圆柱形部分向下流动，并且到达第二培养模块的第三培养基转移区的基本上基底部分。接着，培养基通过连通容器效应以及通过泵所施加的流速向上流动，并且到达第二培养模块的第二培养区的顶部。培养基经由第二培养模块的底部壁的用于基本上不含细胞的培养基通过的孔口从第二培养模块的第三培养基转移区到达第二培养模块的第二区。当培养基流动边缘到达第二培养模块的第二培养区的外部壁的顶部时，所述培养基溢出到第二培养模块的第四培养基转移区中。自然，如果孔口或管存在于培养区的此外部壁中时，需要理解的是当培养基流动边缘到达孔口或管时所述培养基流入到第二培养模块的第四区。在所述设备的特别优选的实施方案中，第二培养模块的第四培养基转移区包括斜壁，当培养基从第二培养模块的第二区进入第二培养模块的第四区时所述培养基在所述斜壁上流动。斜壁优选地包括亲水性膜，以便改进膜在所述斜壁上的形成。膜必须优选地为层状物，以便尽可能防止泡沫的形成。为了使膜稳定，还可以将添加剂添加到培养基中，以便改变水的流变特性，如之前所提及的。接着，第二培养模块的第四培养基转移区中存在的培养基通过管或经第二培养模块的第四培养基转移区的壁的顶部溢出到第一培养模块的第三培养基转移区中。
在一些实施方案中，培养基经历由泵所施加的流速和重力，它被从第一培养模块的第三培养基转移区向下引导、从第一培养模块的基本上圆柱形部分向下流动，并且到达第一培养模块的第三培养基转移区的基本上基底部分。接着，培养基通过连通容器效应以及通过由泵所施加的流速向上流动，并且到达第一培养模块的第二培养区的顶部。培养基经由第一培养模块的底部壁中用于基本上不含细胞的培养基通过的孔口从第一培养模块的第三培养基转移区到达第一培养模块的第二区。当培养基流动边缘到达第一培养模块的第二培养区的壁的顶点时，所述培养基溢出到第一培养模块的第四培养基转移区中。明显，如果孔口或管存在于此壁中时，必须理解的是当培养基流动边缘到达孔口或管时所述培养基流入到第一培养模块的第四培养基转移区。第一培养模块的第四培养基转移区还可包括斜壁，当培养基从第一培养模块的第二培养区进入第一培养模块的第四培养转移区时所述培养基在所述斜壁上流动。斜壁可能设置有如上亲水性膜。接着，培养基通过入口(管)回到底部模块和培养基循环装置，即第一培养模块的第四培养基转移区中存在的培养基通过管或经第一培养模块的第四培养基转移区的壁的顶部溢入管道中，所述管道终止于由构成培养基循环装置的所述离心泵形成的虹吸管的基本上中心区。
在此实施方案的一个变形中，叠加的模块构成培养容器。在此变形中，可存在例如三种类型的模块，即底部模块、包括四个区的模块、以及头部模块mx。底部模块或基底模块包括培养基循环装置和组装装置；所述组装装置被设计成接合如上所解释的四个区模块的第一组装装置，并且构成容器的底部。头部模块被设计为接合四个区模块的第二组装装置。由底部模块接合的四个区模块可以与由头部模块接合的模块相同或者由底部模块接合的四个区模块可以是一系列四区模块中的第一个并且由头部模块接合的模块因此是所述系列的四区模块中的第二四区模块。
在一些实施方案中，所有模块包括固定装置，从而使得可以获可与另一个培养模块以及与底部模块或头部模块组装的单一培养模块。这些固定装置例如是设置有圆形密封件的同心圆、细胞培养领域中已熟知的快速连接器、螺距和锯齿或用于组装这些模块的任何其他设备。
在此实施方案中，底部模块的基底部分与基本上管形孔口接合，在此情况下所述孔口是允许引入气体或气体混合物的孔口。气体入口孔口连接管，所述管终止于培养基水平上方，使得气体或气体混合物到达培养设备的至少第四培养基转移区。第四培养基转移区的所有环境气氛通过类似管连接，以使得气体混合物可到达顶部。这在具有在高度上可叠加的模块的设备中特别有利，所述高度可以非常高，从而可通过反应器底部供给气体。在一个变形中，基底部分包括用于将气体物质引入到磁力设备所位于的区中的气体或气体混合物进料管。以这种方式，通过磁力设备旋转来搅拌进入气体并且通过移动培养基来改进氧溶解。过量气体也被搅拌并且再以小气泡形式向上移动。另外，提供用于从外部接近这些孔口的凹槽，这使得可以将这些孔口连接至气体、气体混合物、新鲜培养基等的供给。模块的顶部部分mob是被设计为凭借固定装置抓握并凭借底部模块的底部部分上的环形密封件密封的元件。
在一些实施方案中，所述设备还包括营养物进料件，其可在穿过盖的管或穿过设备的一个壁的管中。同样，加热装置也可以存在于设备或模块各个四区模块的第一区或第四区中。可能，所述设备还可包括若干培养基循环设备，例如若干离心泵。所述设备使得培养基在穿过第二区的底部部分中的孔口后能够均质流动并且因此在进一步穿过此第二区期间也能够均质流动。这与，其中第一区与第二区直接接触而引起整个第二区中的非均质流动的装置形成对比。此类非均质流动导致细胞培养区内存在供应有不足的氧和营养素的低供应区或死区，并且其中细胞生长和/或代谢远非最佳。
设备和方法的具体实施方案涉及设备及其用途，其中第三区是在所述第二区内部并且在所述第一区外部的区。所述培养基从第一区的基底部分经由第一区的顶部圆柱形部分朝上流动、经由第三转移区的圆柱形顶部部分进一步朝下流动到第三区的基底部分，从而在进入第二区的底部部分后生成所需的均质流动。圆柱形部分的存在进一步允许容易接近培养基，以在进入第二区之前测定其特性。圆柱形元件的存在还防止在设备内建立高压。圆柱形部分的存在另外允许制造包括不同模块的设备。
其他实施方案涉及被修改来使得能绕过穿过圆柱形部分的液体流的设备。在设备的这些替代性实施方案中，第三区完全位于第二区下方并且完全位于第一区上方。在设备的一个实施方案中，所述设备的与第一区和第二区的圆柱形部分相对应的部分通过例如塑料、玻璃或金属的实心元件替换。
在另一个实施方案中，第一区和第二区由分别对应于基底部分且缺乏圆柱形部分的扁平形体积组成。在此改变下，培养基可同样经由溢流从第一区溢出到第三区。由搅拌设备形成的培养基流动能够通过第一区与第三区之间的隔离壁来使其均质并且在进入第二区后产生均质流动。
在具体实施方案中，第一区与第三区之间的隔离壁由水平部分以及垂直部分组成，其中在溢流的情况下此垂直部分具有的高度为第三区的高度的约多至5％、多至10％、多至20％或甚至多至50％。在其他具体实施方案中，第一区与第三区之间的隔离壁不存在垂直部分。
在具体实施方案中，实心元件设置有适于并入例如探头的通道，以测量培养基在第三区中的条件(pH、氧、温度)。在其他具体实施方案中，实心元件设置有包括安全压力阀的通道，所述安全压力阀当在第一区和第三区中建立过度压力时打开。在设备的一个替代性实施方案中，第一区和第三区、第二区各自的圆柱形部分不存在。先前由元件占据的体积现在变成第二区的部分，使得设备的使用更有效，这是由于适用于细胞生长体积得以扩大。
在不均质流动分布到第三区中的情况下为了防止培养基从第一区直接流入到第二区中，第二区的底部壁中的孔口在位于第一区与第三区之间的壁中的开口上方的那些区域处闭合。通过在开口上方提供闭合区域来修改设备使得培养基从第一培养基转移区溢出到第三培养基转移区中，之后培养基作为均质流进入第二区中。
在具体实施方案中，将多个开口和对应的闭合区域分别提供到第一区与第二区之间的隔离壁中和第三区与第二区之间的壁中。通常，此类多个开口和对应的闭合区域对称地分布。
在设备的一个替代性实施方案中，培养基的均质流动通过在第三区内提供流再分布元件来实现。此元件可具有适用于适当再分布来自第一区的培养基的任何形状，以在进入第二区之前在第三区中获得均质液体流动。在一个具体实施方案中，元件具有一系列径向延伸杆的形式，其具有圆形、菱形或椭圆形截面，位于对应的径向应用的开口上方。
病毒
本公开的某些方面涉及产生肠病毒A。人类手足口病(HFMD)由许多人类肠病毒A(HEV-A)组的若干成员所引起。人类肠病毒A属于无包膜正义RNA病毒的小核糖核酸病毒科，其也包括脊髓灰质炎病毒和鼻病毒。HEV-A组中可引起HFMD的成员包括肠病毒71(EV71)和柯萨奇病毒。因此，适合肠病毒A的实例包括但不限于肠病毒71(EV71)，柯萨奇病毒A毒株，包括血清型A1、A2、A4、A5、A6、A8、A9、A10、或A16，或柯萨奇病毒B毒株，包括血清B3或B5或其任何组合。如本文所用，术语“CA6”与“CVA6”和“柯萨奇病毒A6”互换使用。如本文所用，术语“CA16”与“CVA16”和“柯萨奇病毒A16”互换使用。在一些实施方案中，至少一种病毒可以是选自以下各项的一种或多种、两种或更多种、或三种病毒：EV71、CA6和CA16。在一些实施方案中，至少一种病毒可以是EV71和CA6。在一些实施方案中，至少一种病毒可以是EV71和CA16。在一些实施方案中，至少一种病毒可以是CA6和CA16。在一些实施方案中，至少一种病毒可以是EV71。
因此，在一些实施方案中，本公开的肠病毒A可用于本文所公开的疫苗和/或免疫原性组合物中的任何一种中。例如，本公开的肠病毒A可用于提供一种或多种抗原，所述抗原可用于在有需要的受试者中治疗或预防手足口病和/或在有需要的受试者中诱导针对手足口病的免疫应答，诸如保护性免疫应答。
本公开的抗原可来源于本公开的肠病毒A(例如通过本文所述的方法产生和/或纯化的肠病毒A)。本公开的抗原可以是能够引发免疫应答的任何物质。适合抗原的实例包括但不限于全病毒、减毒病毒、灭活病毒、蛋白质、多肽(包括活性蛋白质和蛋白质内个别多肽表位)、糖多肽、脂多肽、肽、多糖、多糖缀合物、多糖和其他分子的肽模拟物和非肽模拟物、小分子、脂质、糖脂类以及碳水化合物。
本公开的肠病毒A可包含至少一种非人类细胞适应性突变。适应性突变可通过使病毒适应于在特定细胞系中生长来生成。例如，细胞可被病毒感染并传代，使得病毒进行复制并且使其核酸发生突变。核酸突变可以是点突变、插入突变或缺失突变。核酸突变可导致病毒蛋白质内的氨基酸变化，所述变化有利于病毒在非人类细胞中生长。适应性突变可有利于病毒的表型变化，包括改变的噬斑大小、生长动力学、温度敏感性、耐药性、病毒性以及细胞培养物中的病毒产率。这些适应性突变可通过增加病毒在细胞系中培养的速度和产率而可用于疫苗生产中。另外，适应性突变可通过改变免疫原性表位的结构来增强病毒抗原的免疫原性。
因此，在某些实施方案中，本公开的肠病毒A可包含至少一种非人类细胞适应性突变。在某些实施方案中，适应性突变是病毒抗原的针对非人类细胞的突变。在一些实施方案中，非人类细胞可以是哺乳动物细胞。非人类哺乳动物细胞的实例包括但不限于上文所述的那些细胞，诸如Vero细胞(来自猴肾)、MDBK细胞、MDCK细胞、ATCC CCL34 MDCK(NBL2)细胞、MDCK 33016(保藏号DSM ACC 2219，如WO97/37001所述的)细胞、BHK21-F细胞、HKCC细胞或中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)。在一些实施方案中，非人类细胞可以是猴细胞。在一些实施方案中，猴细胞来自Vero细胞系。适合的Vero细胞系的实例包括但不限于WHO Vero 10-87、ATCC CCL-81、Vero 76(ATCC登录号CRL-1587)或Vero C1008(ATCC登录号CRL-1586)。
肠病毒A诸如EV71、CA6和CA16具有线性、正义、单链RNA基因组。这些病毒基因组中的每一种编码结构性多肽和非结构性多肽。由这些病毒中的每一种编码的结构性多肽包括但不限于VP1、VP2、VP3和VP4，它们一起可构成病毒衣壳。由这些病毒中的每一种编码的非结构性多肽包括但不限于2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D，其涉及例如病毒复制和病毒性。
因此，在某些实施方案中，本公开的肠病毒A可在一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或更多种、八种或更多种、九种或更多种、十种或更多种病毒抗原中含有至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少10种、至少11种、至少12种、至少13种、至少14种、至少15种、至少16种、至少17种、至少18种、至少19种、至少20种或更多种非人类细胞适应性突变，所述病毒抗原包括但不限于VP1、VP2、VP3、2A、2B、2C、3A、3B、3C以及3D。在一些实施方案中，本公开的肠病毒A包括灭活全病毒，其可在病毒的5’或3’非翻译区(UTR)内含有至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少10种或更多种非人类细胞适应性突变。
在一些实施方案中，至少一种非人类细胞适应性突变是在EV71的VP1多肽内。在其他实施方案中，至少一种非人类细胞适应性突变是在CA6的VP1多肽内。在其他实施方案中，至少一种非人类细胞适应性突变是在CA6的VP2多肽内。在其他实施方案中，至少一种非人类细胞适应性突变是在CA6的VP3多肽内。在其他实施方案中，至少一种非人类细胞适应性突变是在CA16的2A多肽内。在其他实施方案中，至少一种非人类细胞适应性突变是在CA16的VP2多肽内。在其他实施方案中，至少一种非人类细胞适应性突变是在CA16的VP1多肽内。在一些实施方案中，本公开的抗原可在本公开的肠病毒A的5’非翻译区(UTR)内含有至少一种非人类细胞适应性突变，所述抗原包括但不限于EV71、CA6和CA16。
在一些实施方案中，至少一种非人类细胞适应性突变是在EV71的VP1多肽内。来自示例性EV71毒株的VP1多肽的氨基酸序列列出如下：
GDRVADVIESSIGDSVSRALTQALPAPTGQNTQVSSHRLDTGEVPALQAAEIGASSNTSDESMIETRCVLNSHSTAETTLDSFFSRAGLVGEIDLPLEGTTNPNGYANWDIDITGYAQMRRKVELFTYMRFDAEFTFVACTPTGEVVPQLLQYMFVPPGAPKPESRESLAWQTATNPSVFVKLTDPPAQVSVPFMSPASAYQWFYDGYPTFGEHKQEKDLEYGACPNNMMGTFSVRTVGSSKSKYPLVVRIYMRMKHVRAWIPRPMRNQNYLFKANPNYAGNSIKPTGTSRNAITTL(SEQ ID NO:1)。
在一些实施方案中，至少一种非人类细胞适应性突变在EV71的VP1多肽内的一个或多个氨基酸位置处发生。在一些实施方案中，当使用成对比对算法将EV71的VP1多肽与SEQ ID NO:1比对时，突变可在选自SEQ ID NO:1的7、14、145和282的一个或多个、两个或更多个、三个或更多个或四个氨基酸位置处或在与SEQ ID NO:1的位置7、14、145或282相对应的位置处发生。在一些实施方案中，当使用成对比对算法与SEQ ID NO:1比对时，突变在SEQID NO:1的位置7处或在与SEQ ID NO:1的位置7相对应的位置处发生。在一些实施方案中，当使用成对比对算法将EV71的VP1多肽与SEQ ID NO:1比对时，突变在SEQ ID NO:1的位置7处或在SEQ ID NO:1的位置7、14、145或282中的两个或更多个、三个或更多个或所有四个处或在与SEQ ID NO:1的位置7、14、145或282相对应的位置处发生。在一些实施方案中，在位置7处的突变是缬氨酸至甲硫氨酸取代。在一些实施方案中，在位置14处的突变是天冬氨酸至天冬酰胺取代。在一些实施方案中，在位置145处的突变是谷氨酸至谷氨酰胺取代。在一些实施方案中，在位置282处的突变是天冬酰胺至天冬氨酸取代。
在一些实施方案中，至少一种非人类细胞适应性突变是在CA6的VP1多肽内。来自示例性CA6毒株的VP1多肽的氨基酸序列列出如下：
NDPISNAIENAVSTLADTTISRVTAANTAASSHSLGTGRVPALQAAETGASSNASDENLIETRCVMNRNGVNEASVEHFYSRAGLVGVVEVKDSGTSQDGYTVWPIDVMGFVQQRRKLELSTYMRFDAEFTFVSNLNDSTTPGMLLQYMYVPPGAPKPDGRKSYQWQTATNPSIFAKLSDPPPQVSVPFMSPASAYQWFYDGYPTFGEHKQATNLQYGQCPNNMMGHFAIRTVSESTTGKNVHVRVYMRIKHVRAWVPRPFRSQAYMVKNYPTYSQTISNTAADRASITTTDYEGGVPANPQRTF(SEQ ID NO:2)。
在一些实施方案中，至少一种非人类细胞适应性突变在CA6的VP1多肽内的一个或多个氨基酸位置处发生。在一些实施方案中，当使用成对比对算法将CA6的VP1多肽与SEQID NO:2比对时，突变可在选自SEQ ID NO:2的46、90、96和268的一个或多个、两个或更多个、三个或更多个或四个氨基酸位置处或在与SEQ ID NO:2的位置46、90、96和268相对应的位置处发生。在一些实施方案中，当使用成对比对算法将CA6的VP1多肽与SEQ ID NO:2比对时，突变在SEQ ID NO:2的位置46、90、96和268中的一个或多个、两个或更多个、三个或更多个或所有四个处或在与SEQ ID NO:2的位置46、90、96和268相对应的位置处发生。在一些实施方案中，在位置46处的突变是丙氨酸至缬氨酸取代。在一些实施方案中，在位置90处的突变是谷氨酸至赖氨酸取代。在一些实施方案中，在位置96处的突变是苏氨酸至丙氨酸取代。在一些实施方案中，在位置268处的突变是缬氨酸至异亮氨酸取代。
在一些实施方案中，至少一种非人类细胞适应性突变是在CA6的VP2多肽内。来自示例性CA6毒株的VP2多肽的氨基酸序列列出如下：
SPSVEACGYSDRVAQLTVGNSTITTQEAANIVLSYGEWPGYCPSTDATAVDKPTRPDVSVNRFYTLSTKSWKTESTGWYWKFPDVLNDTGVFGQNAQFHYLYRSGFCMHVQCNASKFHQGALLVVVIPEFVVAASSPAMKPNGQGLYPDFAHTNPGKEGQVFRDPYVLDAGIPLSQALVFPHQWINLRTNNCATIIMPYVNALPFDSALNHSNFGLAVIPISPLKYCNGATTEVPITLTIAPLNSEFSGLRQAIKQ(SEQ ID NO:3)。
在一些实施方案中，当使用成对比对算法将CA6的VP2多肽与SEQ ID NO:3比对时，突变可在SEQ ID NO:3的氨基酸位置144处或在与SEQ ID NO:3的位置144相对应的位置处发生。在一些实施方案中，在位置144处的突变是谷氨酰胺至赖氨酸取代。
在一些实施方案中，至少一种非人类细胞适应性突变是在CA6的VP3多肽内。来自示例性CA6毒株的VP3多肽的氨基酸序列列出如下：
GLPTELKPGTNQFLTTDDGTSPPILPGFEPTPLIHIPGEFTSLLDLCRIETILEVNNTTGTTGVNRLLIPVRAQNNVDQLCASFQVDPGRNGPWQSTMVGQICRYYTQWSGSLKVTFMFTGSFMATGKMLIAYTPPGSAQPTTREAAMLGTHIVWDFGLQSSVTLVIPWISNTHFRAVKTGGVYDYYATGIVTIWYQTNFVVPPDTPSEANIIALGAAQENFTLKLCKDTDEIRQTAEYQ(SEQ ID NO:4)。
在一些实施方案中，至少一种非人类细胞适应性突变在CA6的VP3多肽内的一个或多个氨基酸位置处发生。在一些实施方案中，当使用成对比对算法将CA6的VP3多肽与SEQID NO:4比对时，突变可在SEQ ID NO:4的氨基酸位置102处或在与SEQ ID NO:4的位置102相对应的位置处发生。在一些实施方案中，在位置102处的突变是异亮氨酸至缬氨酸取代。
在一些实施方案中，至少一种非人类细胞适应性突变是在CA6的5’UTR内。来自示例性CA6毒株的5’UTR的核酸序列列出如下：
TTAAAACAGCTAGTGGGTTGCACCCACTCACAGGGCCCACTGGGCGCTAGCACACTGATTTCCCGGAATCCTTGTGCGCCTGTTTTATATCCCCTCCCCCATGCGCAACTTAGAAGCAATCTACACCTTCGATCAATAGCAGGCGTGGCGCGCCAGCCATGTCTAGATCAAGCACTTCTGTTTCCCCGGACTGAGTATCAATAAACTGCTCACGCGGTTGAAGGAGAAAATGTTCGTTACCCGGCTAACTACTTCGAGAAACCTAGTAGCACCATGAAAATTGCAGAGCGTTtCGcTCAGCGcTtCCCCcGCGtAGATCAGGCTGATGAGTCACTGCATTCCTCACGGGCGACCGTGGCAGTGGCTGCGTTGGCGGCCTGCCCATGGGGTAACCCATGGGACGCTCTAATATGGACATGGTGTGAAGAGTCTATTGAGCTAGTTAGTAGTCCTCCGGCCCCTGAATGCGGCTAATCCTAACTGCGGAGCACATACCCCCAAACCAGGGGGCGGTGTGTCGTAACGGGCAACTCTGCAGCGGAACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTTCCTTTTATTCTTATATTGGCTGCTTATGGTGACAATTGAAAGATTGTTACCATATAGCTATTGGATTGGCCATCCGGTGAATAACAGAGCCTTGATATACCTTTTTGTAGGGTTTATACCACTTACTCTTCGCGTTGTTGAGACTCTAAAGTACATTCTAATCTTGAACACTAGAAA(SEQ IDNO:8)。
在一些实施方案中，至少一种非人类细胞适应性突变在CA6的5’UTR内的一个或多个核酸位置处发生。在一些实施方案中，当使用成对比对算法将CA6的5’UTR与SEQ ID NO:8比对时，突变可在选自SEQ ID NO:8的1、13、14、15、16、21、23、34和40的一个或多个、两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、或九个核酸位置处或者在与SEQ ID NO:8的位置1、13、14、15、16、21、23、34和40相对应的位置处发生。在一些实施方案中，当使用成对比对算法将CA6的5’UTR与SEQ IDNO:8比对时，突变在SEQ ID NO:8的位置1、13、14、15、16、21、23、34和40中的一个或多个、两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、或所有九个处或者在与SEQ ID NO:8的位置1、13、14、15、16、21、23、34和40相对应的位置处发生。在一些实施方案中，在位置1处的突变是胸腺嘧啶至鸟嘌呤取代。在一些实施方案中，在位置13处的突变是鸟嘌呤至腺嘌呤取代。在一些实施方案中，在位置14处的突变是胸腺嘧啶至鸟嘌呤取代。在一些实施方案中，在位置15处的突变是鸟嘌呤至胞嘧啶取代。在一些实施方案中，在位置16处的突变是鸟嘌呤至腺嘌呤取代。在一些实施方案中，在位置21处的突变是胞嘧啶至胸腺嘧啶取代。在一些实施方案中，在位置23处的突变是胞嘧啶至胸腺嘧啶取代。在一些实施方案中，在位置34处的突变是鸟嘌呤至胸腺嘧啶取代。在一些实施方案中，在位置40处的突变是胞嘧啶至鸟嘌呤取代。
在一些实施方案中，至少一种非人类细胞适应性突变是在CA16的2A多肽内。来自示例性CA16毒株的2A多肽的氨基酸序列列出如下：
GKFGQQSGAIYVGNYRVVNRHLATHNDWANLVWEDSSRDLLVSSTTAQGCDTIARCDCQTGIYYCSSKRKHYPVSFTKPSLIFVEASEYYPARYQSHLMLAVGHSEPGDCGGILRCQHGVVGIVSTGGNGLVGFADVRDLLWLDEEAMEQ(SEQ ID NO:5)。
在一些实施方案中，至少一种非人类细胞适应性突变在CA16的2A多肽内的一个或多个氨基酸位置处发生。在一些实施方案中，当使用成对比对算法将CA16的2A多肽与SEQID NO:5比对时，突变可在SEQ ID NO:5的氨基酸位置2处或在与SEQ ID NO:5的位置2相对应的位置处发生。在一些实施方案中，在位置2处的突变是赖氨酸至谷氨酸取代。
在一些实施方案中，至少一种非人类细胞适应性突变是在CA16的VP2多肽内。来自示例性CA16毒株的VP2多肽的氨基酸序列列出如下：
SPSAEACGYSDRVAQLTIGNSTITTQEAANIVIAYGEWPEYCPDTDATAVDKPTRPDVSVNRFFTLDTKSWAKDSKGWYWKFPDVLTEVGVFGQNAQFHYLYRSGFCVHVQCNASKFHQGALLVAVLPEYVLGTIAGGTGNENSHPPYATTQPGQVGAVLMHPYVLDAGIPLSQLTVCPHQWINLRTNNCATIIVPYMNTVPFDSALNHCNFGLLVIPVVPLDFNAGATSEIPITVTIAPMCAEFAGLRQAVKQ(SEQ ID NO:6)。
在一些实施方案中，至少一种非人类细胞适应性突变在CA16的VP2多肽内的一个或多个氨基酸位置处发生。在一些实施方案中，当使用成对比对算法将CA16的VP2多肽与SEQ ID NO:6比对时，突变可在SEQ ID NO:6的氨基酸位置161处或在与SEQ ID NO:6的位置161相对应的位置处发生。在一些实施方案中，在位置161处的突变是甲硫氨酸至苏氨酸取代。
在一些实施方案中，至少一种非人类细胞适应性突变是在CA16的VP1多肽内。来自示例性CA16毒株的VP1多肽的氨基酸序列列出如下：
GDPIADMIDQTVNNQVNRSLTALQVLPTAANTEASSHRLGTGVVPALQAAETGASSNASDKNLIETRCVLNHHSTQETAIGNFFSRAGLVSIITMPTTDTQNTDGYVNWDIDLMGYAQLRRKCELFTYMRFDAEFTFVVAKPNGVLVPQLLQYMYVPPGAPKPTSRDSFAWQTATNPSVFVKMTDPPAQVSVPFMSPASAYQWFYDGYPTFGEHLQANDLDYGQCPNNMMGTFSIRTVGTEKSPHSITLRVYMRIKHVRAWIPRPLRNQPYLFKTNPNYKGNDIKCTSTSRDKITTL(SEQ ID NO:7)。
在一些实施方案中，至少一种非人类细胞适应性突变在CA16的VP1多肽内的一个或多个氨基酸位置处发生。在一些实施方案中，当使用成对比对算法将CA16的VP1多肽与SEQ ID NO:7比对时，突变可在选自SEQ ID NO:7的99和145的一个或多个、或两个氨基酸位置处或在与SEQ ID NO:7的位置99或145相对应的位置处发生。在一些实施方案中，在位置99处的突变是天冬氨酸至甘氨酸取代。在一些实施方案中，在位置145处的突变是缬氨酸至谷氨酸取代。
在一些实施方案中，至少一种非人类细胞适应性突变是在CA16的5’UTR内。来自示例性CA16毒株的5’UTR的核酸序列列出如下：
AGCCTGTGGGTTGTTCCCACCCACAGGGCCCAGTGGGCGCTAGCACACTGATTCTGCGGGATCTTTGTGCGCCTGTTTTATAACCCCTTCCCTAAGCAGCAACTTAGAAGTTTCACACAATCACGACCAGTAGTGGGCGTGGCGCGCCAGTCACGTCTTGGTCAAGCACTTCTGTTCCCCCGGACTGAGTATCAATAGACTGCTCACGCGGTTGAAGGAGAAAACGTTCGTTATCCGGCTAACTACTTCGAGAAACCTAGtAGCACCGTGAAAGTTGCGGAGtGTttCGCTCAGCACTTCCCCCGTGTAGATCAGGTCGATGAGTCACTGTAAACCCCACGGGCGACCGTGACAGTGGCTGCGTTGGCGGCCTGCCCATGGGGTAACCCATGGGACGCTCTAATACAGACATGGTGTGAAGAGTCTATTGAGCTAGTTAGTAGTCCTCCGGCCCCTGAATGCGGCTAATCCTAACTGCGGAGCACGCACCCTCAACCCAGGGGGCGGCGTGTCGTAATGGGTAACTCTGCAGCGGAACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTTCCTTTTATTCCTTATTGGCTGCTTATGGTGACAATTGAAAAGTTGTTACCATATAGCTATTGGATTGGCCATCCGGTGTCTAACAGAGCTATTGTTTACCTATTTATTGGATACGTCCCTCTTAATCTCAAGGCCATTCAAACTCTTGATTATATATTGCTCCTTAACTGTAAGAAA(SEQ ID NO:9)。
在一些实施方案中，至少一种非人类细胞适应性突变在CA16的5’UTR内的一个或多个核酸位置处发生。在一些实施方案中，当使用成对比对算法将CA16的5’UTR与SEQ IDNO:9比对时，突变可在选自SEQ ID NO:9的6和33的一个或多个或两个核酸位置处或在与SEQ ID NO:9的位置6或33相对应的位置处发生。在一些实施方案中，当使用成对比对算法将CA16的5’UTR与SEQ ID NO:9比对时，突变在SEQ ID NO:9的位置6和33处或在与与SEQ IDNO:9的位置6或33相对应的位置处发生。在一些实施方案中，在位置6处的突变是鸟嘌呤至腺嘌呤取代。在一些实施方案中，在位置33处的突变是鸟嘌呤至胞嘧啶取代。
在本公开的以上实施方案中，示例性成对比对算法是Needleman-Wunsch全局比对算法，其使用缺省参数(例如其中空位开放罚分＝10.0，并且空位延伸罚分＝0.5，使用EBLOSUM62评分矩阵)。此算法方便地以EMBOSS程序包中的needle工具实施。
在一些实施方案中，肠病毒A可用于本公开的疫苗和/或免疫原性组合物中的任何一种中。例如，本公开的肠病毒A可用于在有需要的受试者中治疗或预防手足口病和/或在有需要的受试者中诱导针对手足口病的免疫应答，诸如保护性免疫应答。
抗原的产生
用于疫苗和/或免疫原性组合物的本公开抗原可以通过本领域已知的任何适合方法产生和/或纯化或以其他方式分离，所述抗原包括但不限于纯化病毒、灭活病毒、减毒病毒、重组病毒或用于亚单位疫苗的纯化和/或重组病毒蛋白，其治疗或预防手足口病和/或诱导针对手足口病的免疫反应，诸如保护性免疫反应。本公开的抗原可包括但不限于全病毒、减毒病毒、灭活病毒、蛋白质、多肽(包括活性蛋白质和蛋白质内的个别多肽表位)、糖多肽、脂多肽、肽、多糖、多糖缀合物、多糖和其他分子的肽模拟物和非肽模拟物、小分子、脂质、糖脂、以及由引起手足口病的至少一种病毒产生、衍生、纯化和/或以其他方式分离的碳水化合物。例如，适合抗原可包括但不限于结构性多肽诸如VP1、VP2、VP3和VP4以及非结构性多肽诸如来自病毒诸如EV71、CA6和CA16的2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D。
本公开的抗原可以化学方式或酶促方式合成、重组产生、从天然来源分离、或其组合。在某些实施方案中，本公开的抗原由本公开的引起手足口病的至少一种病毒诸如EV71、CA6和CA16产生、纯化、分离和/或衍生。本公开的抗原可以是纯化的、部分纯化的或粗提取物。在一些实施方案中，本公开的抗原是如题为“疫苗和免疫原性组合物的产生”的以上部分中所述地产生的病毒，诸如灭活病毒。
在某些实施方案中，本公开的一种或多种抗原可通过培养非人类细胞产生。适用于产生一种或多种本公开的抗原的细胞系优选地具有哺乳动物来源，并且包括但不限于：VERO细胞(来自猴肾)、马、牛(例如MDBK细胞)、羊、狗(例如来自狗肾的MDCK细胞、ATCCCCL34 MDCK(NBL2)或MDCK33016，保藏号DSM ACC 2219，如WO97/37001所述的)、猫以及啮齿动物(例如仓鼠细胞，诸如BHK21-F、HKCC细胞或中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞))，并且可获自各个发展阶段，包括例如成年、新生儿、胎儿以及胚胎。在某些实施方案中，细胞为永生化的(例如PERC.6细胞，如WO01/38362和WO02/40665所述的，并且以ECACC保藏号96022940保藏)。在优选的实施方案中，利用哺乳动物细胞，并且其可选自和/或来源于以下非限制性细胞类型中的一种或多种：成纤维细胞(例如皮肤、肺)、内皮细胞(例如主动脉的、冠状动脉的、肺的、血管的、皮肤微脉管的、脐带的)、肝细胞、角化细胞、免疫细胞(例如T细胞、B细胞、巨噬细胞、NK、树突状细胞)、乳腺细胞(例如上皮的)、平滑肌细胞(例如血管的、主动脉的、冠状动脉的、动脉的、子宫的、支气管的、子宫颈的、视网膜周皮细胞)、黑素细胞、神经细胞(例如星形胶质细胞)、前列腺细胞(例如上皮的、平滑肌)、肾细胞(例如上皮的、肾小球系膜的、近端小管)、骨骼肌细胞(例如软骨细胞、破骨细胞、成骨细胞)、肌细胞(例如成肌细胞、骨骼肌、平滑肌、支气管)、肝细胞、成视网膜细胞以及基质细胞。WO97/37000和WO97/37001描述能够在悬浮液和无血清培养基中生长并且可用于产生病毒抗原的动物细胞和细胞系的产生。在某些实施方案中，非人类细胞在无血清培养基中培养。
多肽抗原可使用本领域已知的标准蛋白质纯化方法从天然来源中分离，所述方法包括但不限于液相色谱法(例如高效液相色谱法、快速蛋白质液相色谱法等)、尺寸排阻色谱法、凝胶电泳(包括一维凝胶电泳、二维凝胶电泳)、亲和色谱法或其他纯化技术。在许多实施方案中，抗原是纯化抗原，例如约50％至约75％纯的、约75％至约85％纯的、约85％至约90％纯的、约90％至约95％纯的、约95％至约98％纯的、约98％至约99％纯的或大于99％纯的。
可以采用固相肽合成技术，其中此类技术是为本领域技术人员已知的。参见Jones,The Chemical Synthesis of Peptides(Clarendon Press,Oxford)(1994)。通常，在此类方法中，肽通过将活化单体单元依序添加到固相结合的逐渐生长肽链来产生。
公知的重组DNA技术可用于产生多肽，其中例如包含编码多肽的核苷酸序列的表达构建体被引入到适当宿主细胞(例如作为单细胞实体在体外细胞培养物中生长的真核宿主细胞，例如酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞等)或原核细胞(例如在体外细胞培养物中生长)中，从而生成遗传修饰的宿主细胞；在适当培养条件下，蛋白质由遗传修饰的宿主细胞产生。
除了灭杀病毒和减毒病毒免疫原性组合物之外，可使用对动物呈现手足口病病毒抗原组分的亚单元免疫原性组合物或其他类型的免疫原性组合物。抗原组分可以是蛋白质、糖蛋白、脂质缀合蛋白质或糖蛋白、修饰的脂质部分或其他病毒组分，所述抗原组分当注入人类中时刺激人类的免疫应答，以使得人类产生针对手足口病的保护性免疫。对于亚单元免疫原性组合物，病毒可以在哺乳动物细胞上培养，如以上所述。细胞培养物可均质化并且免疫原性组合物可通过使细胞培养物均浆物通过适当柱或穿过适当孔径过滤器或经由细胞培养物均浆物的离心来分离。
如果抗原组分是蛋白质，那么可分离编码所述蛋白质的核酸并生成含有所述分离核酸的免疫原性组合物。编码抗原组分的核酸可置于真核启动子的信号序列下游的质粒上。该质粒可含有一种或多种可选择标记并且可转染到减毒原核生物体中，诸如沙门氏菌属、志贺氏菌属或其他适合细菌。细菌然后可施用于人类，以使得人类可生成针对抗原组分的保护性免疫应答。可选地，编码抗原组分的核酸可置于原核启动子下游，具有一种或多种可选择标记，并且转染到减毒原核生物体诸如沙门氏菌属、志贺氏菌属或其他适合细菌中。细菌然后可施用于需要针对感兴趣抗原的免疫应答的真核受试者。参见，例如授予Hone等人的美国专利号6,500,419。
对于亚单元免疫原性组合物，编码手足口病病毒的蛋白质抗原组分的核酸可克隆到质粒中，诸如国际专利申请公布号WO 00/32047(Galen)和国际专利申请公布号WO 02/083890(Galen)中所述的那些质粒。然后质粒可转染到细菌中并且细菌可产生所需抗原蛋白质。可通过两份专利申请中所述的多种方法分离和纯化所需抗原蛋白质。
病毒灭活
在一些实施方案中，通过本公开的方法产生和/或纯化的肠病毒A病毒是灭活的。灭活或杀灭病毒以破坏其感染哺乳动物细胞的能力的方法是为本领域已知的。此类方法包括化学方式和物理方式。用于灭活病毒的适合方式包括但不限于使用有效量的选自以下各项的一种或多种试剂进行处理：洗涤剂、福尔马林(在本文中也称为“甲醛”)、β-丙内酯(BPL)、二乙胺(BEI)、乙酰基乙烯亚胺、热量、电磁辐射、x-射线辐射、γ辐射、紫外线辐射(UV辐射)、UV-A辐射、UV-B辐射、UV-C辐射、亚甲基蓝、补骨脂素、羧酸富勒烯(C60)以及其任何组合。
用于化学灭活的试剂和化学灭活的方法是为本领域已熟知的并且在本文中进行描述。在一些实施方案中，肠病毒A使用BPL、福尔马林或BEI中的一种或多种化学灭活。在肠病毒A使用BPL化学灭活的某些实施方案中，病毒可含有一种或多种修饰。在一些实施方案中，一种或多种修饰可包括修饰的核酸。在一些实施方案中，修饰的核酸是烷基化的核酸。在其他实施方案中，一种或多种修饰可包括修饰的多肽。在一些实施方案中，修饰的多肽含有修饰的氨基酸残基，包括修饰的半胱氨酸、甲硫氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、酪氨酸、赖氨酸、丝氨酸以及苏氨酸中的一种或多种。在肠病毒A使用福尔马林化学灭活的某些实施方案中，病毒可含有一种或多种修饰。在一些实施方案中，一种或多种修饰可包括修饰的多肽。在一些实施方案中，一种或多种修饰可包括交联的多肽。在肠病毒A使用福尔马林化学灭活的一些实施方案中后，疫苗或免疫原性组合物还包含福尔马林。在本公开的某些实施方案中，肠病毒A使用BEI灭活。在肠病毒A使用BEI灭活的某些实施方案中，病毒含有一种或多种修饰。在一些实施方案中，一种或多种修饰包括修饰的核酸。在一些实施方案中，修饰的核酸是烷基化的核酸。
在肠病毒A使用BEI或BPL化学灭活的一些实施方案中，任何残余的未反应BEI或BPL可用硫代硫酸钠中和(即水解)。通常，过量添加硫代硫酸钠。在一些实施方案中，硫代硫酸钠可以下述范围的浓度添加：约25mM至约100mM、约25mM至约75mM或约25mM至约50mM。在某些实施方案中，硫代硫酸钠可以下述浓度添加：约25mM、约26mM、约27mM、约28mM、约29mM、约30mM、约31mM、约32mM、约33mM、约34mM、约35mM、约36mM、约37mM、约38mM、约39mM、或约40mM，比率为1份浓硫代硫酸钠比20份BEI。在一些实施方案中，溶液可使用混合器诸如内联静态混合器混合，并且随后进行过滤(例如变得澄清)。通常，泵送两种溶液通过混合器引起完全混合和硫代硫酸钠对BEI的中和。
本公开的某些实施方案涉及一种用于灭活肠病毒A的方法。在一些实施方案中，所述方法涉及用有效量的BEI处理病毒制备物。在某些实施方案中，用有效量的BEI处理包括但不限于用约0.25％v/v至约3.0％v/v范围的量的BEI处理。在某些实施方案中，分离且处理的病毒选自以下各项中的一种或多种：EV71、CA6和CA16。在所述方法的某些实施方案中，病毒制备物在约25℃至约42℃范围的温度下用BEI处理。在所述方法的某些实施方案中，病毒制备物用BEI处理约1小时至约10小时范围内的时间段。在某些实施方案中，所述方法还涉及用有效量的硫代硫酸钠灭活(即水解)未反应的BEI。在一些实施方案中，硫代硫酸钠的有效量范围为约25mM至约100mM、约25mM至约75mM或约25mM至约50mM。
在一些实施方案中，所述方法涉及用有效量的β-丙内酯(BPL)处理病毒制备物；以及任选地在用有效量的β-丙内酯(BPL)处理病毒制备物的同时或者之后用有效量的福尔马林处理病毒制备物。可选地，在一些实施方案中，所述方法涉及用有效量的β-丙内酯(BPL)处理病毒制备物第一时间段；以及用有效量的BPL处理病毒制备物第二时间段以完全灭活病毒制备物。在一些实施方案中，第一时间段和/或第二时间段的范围为约12小时至约36小时。在某些实施方案中，第一时间段和/或第二时间段为约24小时。在某些实施方案中，用有效量的BPL处理包括但不限于用以下范围的量的BPL处理：约0.05％v/v至约3.0％v/v、0.1％v/v至约2％v/v或约0.1％v/v至约1％v/v。在某些实施方案中，用有效量的BPL处理包括但不限于用0.05％v/v、0.06％v/v、0.07％v/v、0.08％v/v、0.09％v/v、0.1％v/v、0.2％v/v、0.3％v/v、0.4％v/v、0.5％v/v、0.6％v/v、0.7％v/v、0.8％v/v、0.9％v/v或1％v/vBPL处理。在某些实施方案中，分离且处理的病毒选自以下各项中的一种或多种：EV71、CA6和CA16。在所述方法的某些实施方案中，病毒制备物在约2℃至约8℃范围的温度下用BEI处理。在某些实施方案中，所述方法涉及在37℃的温度下将病毒制备物加热足以水解BPL的时间段。在某些实施方案中，所述时间段的范围为约1小时至约6小时。可选地，在一些实施方案中，所述方法还涉及用有效量的硫代硫酸钠灭活(即水解)未反应的BPL。在一些实施方案中，硫代硫酸钠的有效量范围为约25mM至约100mM、约25mM至约75mM或约25mM至约50mM。
在一些实施方案中，所述方法涉及用有效量的福尔马林处理病毒制备物；以及从福尔马林中纯化病毒制备物。在某些实施方案中，用有效量的福尔马林处理包括但不限于用约0.05％v/v至约3.0％v/v、0.1％v/v至约2％v/v或约0.1％v/v至约1％v/v范围的量的福尔马林处理。在某些实施方案中，分离且福尔马林处理的病毒选自以下各项中的一种或多种：EV71、CA6和CA16。在某些实施方案中，病毒制备物从福尔马林中纯化到以下量的程度：约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更大。
疫苗和/或免疫原性组合物的制剂
本公开的其他方面涉及含有通过本公开的方法产生的病毒(例如本公开的肠病毒A)的组合物、免疫原性组合物和/或疫苗。此类组合物、疫苗和/或免疫原性组合物可用于在有需要的受试者中治疗或预防手足口病和/或在有需要的受试者中诱导针对手足口病的免疫应答，诸如保护性免疫应答。
通常，本公开的疫苗和/或免疫原性组合物制备为液体溶液或悬浮液形式的可注射物；还可制备适用于在注射前溶解于或悬浮于液体中的固体形式。此类制备物还可作为干粉乳化或产生。活性免疫原性成分通常与药学上可接受的且与活性成分相容的赋形剂混合。适合赋形剂是例如水、盐水、右旋糖、蔗糖、甘油、乙醇或类似物以及其组合。另外，需要时，疫苗或免疫原性组合物可含有辅助物质，诸如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂或增强疫苗或免疫原性组合物的有效性的助剂。
疫苗或免疫原性组合物可常规地胃肠外、通过注射施用，例如皮下地、经皮地、皮内地、真皮下地或肌内地。适用于其他施用模式的其他制剂包括栓剂，并且在一些情况下包括口服、经口、鼻内、经颊、舌下、腹膜内、阴道内、肛门以及颅内制剂。对于栓剂，传统粘合剂和载体可包括例如聚亚烷二醇或甘油三酸酯；此类栓剂可由含有0.5％至10％或甚至1％-2％范围的活性成分的混合物形成。在某些实施方案中，首先使低熔点蜡诸如脂肪酸甘油酯或可可脂的混合物熔融，并且例如通过搅拌均质分散本文所述的手足口病疫苗或免疫原性组合物抗原。随后，将熔融的均质混合物注入合宜大小的模中，使其冷却并固化。
适用于鼻内递送的制剂包括液体(例如作为气雾剂或滴鼻剂施用的水溶液)和干粉(例如用于在鼻通道内快速沉积)。制剂包含此类通常采用的赋形剂，例如像药用级甘露醇、乳糖、蔗糖、海藻糖、木糖醇以及壳聚糖。粘膜粘附剂诸如壳聚糖可用于液体或粉末制剂中以延迟鼻内施用的制剂的粘膜纤毛清除。糖类诸如甘露醇和蔗糖可用作液体制剂中的稳定剂并用作干粉制剂中的稳定剂、填充剂或粉末流动剂和粒度剂。另外，助剂诸如单磷酰脂质A(MLA)或其衍生物或CpG寡核苷酸可在液体制剂和干粉制剂中用作免疫刺激助剂。
适用于口服递送的制剂包括液体、固体、半固体、凝胶、片剂、胶囊、锭剂以及类似物。适用于口服递送的制剂包括片剂、锭剂、胶囊、凝胶、液体、食物产品、饮料、营养制品以及类似物。制剂包括此类通常采用的赋形剂，例如像药用级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁以及类似物。其他手足口病疫苗和免疫原性组合物可采用溶液、悬浮液、丸剂、持续释放制剂或粉末形式并且含有10％-95％或25％-70％的活性成分。对于口服制剂，霍乱毒素是感兴趣的制剂伴侣(并且也是可能的缀合伴侣)。
手足口病疫苗和/或免疫原性组合物当配制用于阴道施用时可以是呈阴道栓剂、棉栓、膏剂、凝胶、糊剂、泡沫或喷雾剂的形式。任何前述制剂可含有除手足口病疫苗和免疫原性组合物抗原以外的本领域中已知的适当的试剂，诸如载体。
在一些实施方案中，本公开的手足口病疫苗和/或免疫原性组合物可配制用于全身性或局部递送。此类制剂是本领域已熟知的。胃肠外媒介物包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸化林格氏或固定油。静脉内媒介物包括流体和营养素补充剂、电解质补充剂(诸如基于林格氏葡萄糖的那些补充剂)以及类似物。全身性和局部施用路径包括例如皮肤内、局部应用、静脉内、肌肉内等。
本公开的疫苗和/或免疫原性组合物可以与剂量制剂相容的方式并以将具有治疗有效且免疫原性的量施用。待施用的量取决于待治疗的受试者，包括例如个体免疫系统引起免疫应答的能力和所需保护程度。适合的剂量范围具有每次疫苗接种几百微克活性成分的数量级，其示例性范围为约0.1μg至10μg(但是涵盖1-10mg范围的较高量)，诸如范围为约0.1μg至5μg，或甚至范围为0.6μg至3μg或甚至范围为约1μg至3μg，或甚至范围为0.1μg至1μg。在某些实施方案中，剂量可以是每次给药约0.1μg、约0.2μg、约0.3μg、约0.4μg、约0.5μg、约0.6μg、约0.7μg、约0.8μg、约0.9μg、约1μg、约1.1μg、约1.2μg、约1.3μg、约1.4μg、约1.5μg、约1.6μg、约1.7μg、约1.8μg、约1.9μg、约2μg、约2.1μg、约2.2μg、约2.3μg、约2.4μg、约2.5μg、约2.6μg、约2.7μg、约2.8μg、约2.9μg、或约3μg。在某些实施方案中，本公开的疫苗和/或免疫原性组合物可以每次给药1μg的量施用。在本公开的多价疫苗和/或免疫原性组合物，例如含有来自EV71、CA6和CA16中的两种或更多种的抗原的二价或三价疫苗和/或免疫原性组合物中，每种组分的剂量以当量剂量比率施用(即对于二价疫苗和/或免疫原性组合物为1:1并且对于三价疫苗和/或免疫原性组合物为1:1:1)。
用于初始施用和加强注射的适合方案也是可变的，但是典型的是初始施用，接着进行随后的接种或其他施用。
应用方式可广泛改变。用于施用疫苗或免疫原性组合物的任何常规方法是适用的。这些方法包括在固体生理学可接受基质上或在生理学可接受分散体中的口服应用、通过注射或类似方式进行的胃肠外施用。疫苗或免疫原性组合物的剂量将取决于施用路径并且将根据待疫苗接种的个人的年龄和抗原的制剂而改变。疫苗或免疫原性组合物可具有下述单位剂量体积：超过0.5mL、0.5mL或小于0.5mL，如本文所述的。例如，其可以0.25mL体积施用。
改进粘膜粘附的递送试剂也可以用于改进递送和免疫原性，特别是对于基于鼻内、口服或肺的递送的制剂。在许多药物制剂中使用一种这样的化合物壳聚糖，其为壳质的N-去乙酰化形式。壳聚糖是一种用于鼻内疫苗递送的有吸引力粘膜粘附剂，这是由于其延迟粘膜纤毛清除并允许粘膜抗原摄取和加工更长时间的能力。另外，它可以暂时打开紧密连接，从而可增强抗原到NALT的跨上皮运输。在最近的人类试验中，使用壳聚糖但不使用任何另外的佐剂鼻内施用的三价灭活流感疫苗产生血清转化和HI滴度，所述滴度仅略低于在肌内接种之后获得的滴度。
壳聚糖也可以与在鼻内作用良好的佐剂一起配制，诸如遗传解毒的大肠杆菌热不稳定性肠毒素突变体LTK63。这在由壳聚糖赋予的递送和粘附益处的上面增加了免疫刺激作用，从而使得粘膜和全身性应答增强。
最后，应注意壳聚糖制剂还可以干粉形式制备，所述干粉形式已显示提高疫苗稳定性并且使得对液体制剂的粘膜纤毛清除进一步延迟。这在最近人类临床试验中可见，所述临床试验涉及用壳聚糖配制的鼻内干粉白喉类毒素疫苗，其中鼻内路径与具有增加的分泌性IgA应答益处的传统肌内路径一样有效。疫苗耐受性也非常好。含有壳聚糖和MLA或其衍生物的炭疽的鼻内干粉疫苗在兔内比肌内接种诱导更强的应答并且针对气雾剂孢子激发也是保护性的。
鼻内疫苗表示示例性制剂，因为它们可影响上呼吸道和下呼吸道，这与更好地影响下呼吸道的胃肠外施用的疫苗不同。这可有利于诱导对基于过敏原的疫苗的耐受性并诱导对基于病原体的疫苗的免疫力。
除了提供上呼吸道和下呼吸道中的保护之外，鼻内疫苗避免针接种的并发症并提供经由微粒和/或可溶性抗原与鼻咽相关淋巴组织(NALT)的相互作用诱导粘膜和全身性体液应答和细胞应答的方式。
本公开的疫苗和/或免疫原性组合物是药学上可接受的。它们可包含除抗原和佐剂之外的组分，例如它们将通常包含一种或多种药物载体和/或赋形剂。此类组分的充分讨论可见于Gennaro(2000)Remington:The Science and Practice of Pharmacy.第20版，ISBN:0683306472。
为了控制张力，优选地包含生理盐，诸如钠盐。优选氯化钠(NaCl)，其可以存在于1与20mg/ml之间。可存在的其他盐包括氯化钾、磷酸二氢钾、无水磷酸二钠、氯化镁、氯化钙等等。
疫苗和/或免疫原性组合物可包含一种或多种缓冲剂。典型缓冲剂包括：磷酸盐缓冲剂；Tris缓冲剂；硼酸盐缓冲剂；琥珀酸盐缓冲剂；组氨酸缓冲剂(具体地具有氢氧化铝佐剂)；或柠檬酸盐缓冲剂。缓冲剂通常将以5-20mM范围包含。
疫苗或免疫原性组合物的pH将通常是在5.0与8.1之间，并且更通常地在6.0与8.0之间，例如6.5与7.5之间或在7.0与7.8之间。本公开的制造方法可因此包括在包装之前调节原液疫苗的pH。
疫苗或免疫原性组合物优选地为无菌的。优选地为无热源的，例如含有<1EU(内毒素单位，标准量度)/剂量，并且优选地<0.1EU/剂量。它优选为不含谷蛋白。
在某些实施方案中，本公开的疫苗和/或免疫原性组合物可包含有效浓度的洗涤剂。在一些实施方案中，洗涤剂的有效量可包括但不限于约0.00005％v/v至约5％v/v或约0.0001％v/v至约1％v/v。在某些实施方案中，洗涤剂的有效量为约0.001％v/v、约0.002％v/v、约0.003％v/v、约0.004％v/v、约0.005％v/v、约0.006％v/v、约0.007％v/v、约0.008％v/v、约0.009％v/v或约0.01％v/v。不希望受到理论约束，洗涤剂有助于将本公开的疫苗和/或免疫原性组合物保持在溶液中并且有助于防止疫苗和/或免疫原性组合物聚集。
适合洗涤剂包括例如聚氧乙烯脱水山梨醇酯表面活性剂(称为‘Tween’)、辛苯聚醇(诸如辛苯聚醇-9(Triton×100)或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)、鲸蜡基三甲基溴化铵(‘CTAB’)以及脱氧胆酸钠，其特别用于片段或表面抗原疫苗。洗涤剂可仅以痕量存在。痕量的其他剩余组分可以是抗生素(例如新霉素、卡那霉素、多粘菌素B)。在一些实施方案中，洗涤剂含有聚山梨醇酯。在一些实施方案中，洗涤剂的有效浓度包括约0.00005％v/v至约5％v/v的范围。
疫苗和/或免疫原性组合物优选地保存在2℃与8℃之间。它们不应被冷冻。它们理想地应不暴露于直射光。抗原和乳液通常将是混合物，尽管它们初始可以单独组分的试剂盒的形式呈现以用于临时混合。疫苗和/或免疫原性组合物当施用于受试者时将通常为水溶液形式。
佐剂
本公开的组合物、免疫原性组合物和/或疫苗可与一种或多种佐剂组合使用。本公开的此类佐剂疫苗和/或免疫原性组合物可用于在有需要的受试者中治疗或预防手足口病和/或在有需要的受试者中诱导针对手足口病的免疫应答，诸如保护性免疫应答。
对疫苗实现佐剂作用的各种方法为已知的并且可与本文所公开的手足口病疫苗和/或免疫原性组合物结合使用。一般理论和方法详述于"The Theory and PracticalApplication of Adjuvants",1995,Duncan E.S.Stewart-Tull(编辑),John Wiley&SonsLtd,ISBN 0-471-95170-6，并且还详述于"Vaccines:New Generation ImmunologicalAdjuvants",1995,Gregoriadis G等人(编辑),Plenum Press,New York,ISBN 0-306-45283-9。
在一些实施方案中，手足口病疫苗或免疫原性组合物包含抗原和佐剂。抗原可以下述的基于重量的比率与至少一种佐剂混合：约10:1至约1010:1抗原:佐剂，例如约10:1至约100:1、约100:1至约103:1、约103:1至约104:1、约104:1至约105:1、约105:1至约106:1、约106:1至约107:1、约107:1至约108:1、约108:1至约109:1或约109:1至约1010:1抗原:佐剂。本领域技术人员可容易地通过关于确定最佳比率的佐剂和常规实验的信息来确定适当比率。
示例性佐剂可包括但不限于铝盐、toll样受体(TLR)激动剂、单磷酰脂A(MLA)、MLA衍生物、合成脂质A、脂质A模拟物或类似物、细胞因子、皂苷、胞壁酰二肽(MDP)衍生物、CpG寡聚物、革兰阴性细菌的脂多糖(LPS)、聚磷腈、乳剂、病毒小体、螺旋体、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLG)微粒、泊洛沙姆颗粒、微粒、脂质体、完全福氏佐剂(CFA)以及不完全福氏佐剂(IFA)。在一些实施方案中，佐剂为MLA或其衍生物。
在一些实施方案中，佐剂为铝盐。在一些实施方案中，佐剂包括以下各项中的至少一种：明矾、磷酸铝、氢氧化铝、硫酸铝钾以及铝胶85。在一些实施方案中，已发现本公开的铝盐佐剂增加本公开的HFMD疫苗和/或免疫原性组合物的抗原的吸收。因此，在一些实施方案中，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的抗原被吸附至铝盐佐剂。
本公开的某些实施方案包括一种用于制备佐剂化手足口病疫苗或免疫原性组合物的方法，其涉及(a)将疫苗或免疫原性组合物与铝盐佐剂混合，其中所述疫苗或免疫原性组合物包含来自引起口足手病的至少一种病毒的一种或多种抗原；以及(b)在适合条件下将混合物孵育约16小时至约24小时范围的时间段，其中至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的抗原被吸附至铝盐佐剂。在所述方法的某些实施方案中，引起手足口病的至少一种病毒选自以下各项中的一种或多种：EV71、CA6和CA16。在所述方法的一些实施方案中，混合物在约2℃至约8℃范围的温度下孵育。在所述方法的一些实施方案中，混合物使用本领域已知的任何适合的混合器在恒定混合下孵育。在所述方法的一些实施方案中，混合物在以下值范围的pH下孵育：约6.5至约8、约6.8至约7 8、约6.9至约7.6或约7至约7.5。在某些优选的实施方案中，混合物在中性pH下孵育。在所述方法的一些实施方案中，铝盐佐剂选自明矾、磷酸铝、氢氧化铝、硫酸铝钾以及铝胶85。
来自沙门氏菌的脂质A无毒衍生物M单磷酰脂A(MLA)是已开发为疫苗佐剂的强效TLR-4激动剂(Evans等人2003)。在临床前鼠类研究中，鼻内MLA已显示增强分泌性以及全身性体液应答(Baldridge等人2000；Yang等人2002)。它已在多于120,000位患者的临床研究中证明作为疫苗佐剂是安全且有效的(Baldrick等人,2002；2004)。MLA通过TLR-4受体刺激先天免疫力的诱导并且因此能够引发针对广泛范围的感染性病原体的非特异性免疫应答，所述病原体包括革兰阴性细菌和革兰阳性细菌、病毒以及寄生虫(Baldrick等人2004；Persing等人2002)。在鼻内制剂中包含MLA应提供对先天性应答的快速诱导，从而由病毒激发引发非特异性免疫应答，同时增强由疫苗的抗原组分生成的特异性应答。
因此，在一个实施方案中，本公开提供一种组合物，其包含单磷酰脂A(MLA)、3脱-O-乙酰化单磷酰脂A(3D-MLA)或其衍生物作为适应性免疫力和先天性免疫力的增强剂。在化学上，3D-MLA为具有4个、5个或6个乙酰化链的3脱-O-乙酰化单磷酰脂A。在欧洲专利0689 454 B1(SmithKline Beecham Biologicals SA)中公开了3脱-O-乙酰化单磷酰脂A的优选形式。在另一个实施方案中，本公开提供一种组合物，其包含被设计来像TLR-4激动剂一样起作用的合成脂质A、脂质A模拟物或类似物(诸如BioMira的PET脂质A)或合成衍生物。
另外的示例性佐剂包括但不限于可容易通过与多肽组分共同表达或与多肽组分融合来添加到本文所述的抗原中以产生嵌合多肽的多肽佐剂。鞭毛的主要蛋白质组分细菌鞭毛蛋白是由于先天性免疫系统通过toll-样受体TLR5(65)对它的识别而受到了作为佐剂蛋白质的逐渐增加的注意力的佐剂。通过TLR5进行的鞭毛蛋白信号传导通过诱导DC成熟和迁移以及巨噬细胞、嗜中性粒细胞和肠上皮细胞的活化产生促炎性介质，而对先天性免疫和适应性免疫功能具有影响(66-72)。
TLR5识别鞭毛蛋白单体内对此蛋白质而言独特的且为鞭毛功能所需要的保守性结构，排除了响应于免疫压力而产生的突变(73)。受体对100fM浓度敏感但并不识别完整丝状体。鞭毛分解成单体是为结合和刺激所需要的。
作为佐剂，鞭毛蛋白具有用于诱导针对胃肠外或鼻内施用的异源抗原的保护性应答的强效活性并且还已报道了用于DNA疫苗的佐剂作用。当采用适于呼吸道病毒诸如流感病毒的鞭毛蛋白时观察到Th2偏倚，但是未观察到小鼠或猴中的IgE诱导的证据。另外，未报道在猴内在鼻内或全身性施用之后的局部或全身性免疫应答。在使用鞭毛蛋白之后引发的Th2应答特性是有些出乎意料的，因为通过TLR5以MyD88-依赖性方式进行的鞭毛蛋白信号并且通过TLR进行所有其他MyD88依赖性信号已显示导致Th1偏倚。重要的是，针对鞭毛蛋白预先存在的抗体对佐剂功效不具有可感知的影响，使得它作为多用途佐剂是有吸引力的。
在许多最近鼻内疫苗试验中的常见主旨是使用佐剂和/或递送系统提高疫苗功效。在一种这样的研究中，含有遗传解毒的大肠杆菌热不稳定性肠毒素佐剂(LT R192G)的流感H3疫苗导致针对H5激发的异源亚型保护，但仅在鼻内递送之后。保护是基于对交叉中和抗体的诱导并且在新疫苗开发中展示了对鼻内路径的重要含义。
还可以使用细胞因子、集落刺激因子(例如GM-CSF、CSF以及类似物)；肿瘤坏死因子；白介素-2、-7、-12、干扰素以及其他类似生长因子作为佐剂，因为它们可容易地通过与多肽组分混合或融合来包含在手足口疫苗或免疫原性组合物中。
在一些实施方案中，本文所公开的手足口病疫苗和免疫原性组合物可包含通过Toll样受体起作用的其他佐剂，诸如包含5'-TCG-3'序列的核酸TLR9配体；咪唑喹啉TLR7配体；取代的鸟嘌呤TLR7/8配体；其他TLR7配体，诸如洛索立宾、7-脱氮脱氧鸟苷、7-硫杂-8-氧代脱氧鸟苷、咪喹莫特(R-837)以及瑞喹莫德(R-848)。
某些佐剂有利于APC诸如树突细胞对疫苗分子的摄取，并且活化这些分子。非限制性实例选自由以下组成的组：免疫靶向佐剂；免疫调节佐剂，诸如毒素、细胞因子和分枝杆菌衍生物；油制剂；聚合物；胶束形成佐剂；皂苷；免疫刺激复合物基质(ISCOM基质)；颗粒；DDA；铝佐剂；DNA佐剂；MLA；以及包封佐剂。
佐剂的另外的实例包括试剂诸如铝盐诸如氢氧化物或磷酸盐(明矾)，通常在缓冲盐水中以0.05％至0.1％溶液使用(参见例如，Nicklas(1992)Res.Immunol.143:489-493)，与以0.25％溶液使用的糖合成聚合物(例如
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)的混合，通过使用范围为70℃至101℃的温度分别进行30秒至2分钟时间段的热处理在疫苗中产生蛋白质聚集并且通过交联剂产生聚集也是可能的。还可以采用通过胃蛋白酶处理的抗白蛋白抗体(Fab片段)进行再活化而聚集、与细菌细胞诸如微细隐孢球虫菌(C.parvum)或革兰阴性细菌的内毒素或脂多糖组分的混合、在生理学上可接受的油媒介物诸如二缩甘露醇单油酸酯(Aracel A)中乳化或用20％全氟化碳(Fluosol-DA)溶液作为嵌段取代物进行乳化。还可以使用与油类诸如鲨烯和IFA的混合。
DDA(二甲基双十八烷基溴化铵)是用于佐剂的感兴趣的候选物，而且福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂以及皂树皂苷诸如QuilA和QS21也是感兴趣的。其他可能性包括脂多糖的聚[二(羧基苯氧基)磷腈(poly[di(earboxylatophenoxy)phosphazene)(PCPP)衍生物，诸如单磷酰脂A(MLA)、胞壁酰二肽(MDP)和苏氨酰胞壁酰二肽(tMDP)。基于脂多糖的佐剂也可用于产生主要的Th1-型应答，包括例如单磷酰脂A诸如3-脱-O-乙酰化单磷酰脂A与铝盐的组合。
也已知脂质体制剂赋予佐剂作用，并且因此脂质体佐剂可与手足口病疫苗和/或免疫原性组合物结合使用。
免疫刺激复合物基质型(
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基质)佐剂也可与手足口病疫苗抗原和免疫原性组合物一起使用，尤其是因为已显示这种类型的佐剂能够上调APC所进行的MHC类型II表达。ISCOM基质由来自皂皮树(Quillaja saponaria)的(任选分级分离的)皂苷(三萜类化合物)、胆固醇和磷脂组成。当与免疫原性蛋白质诸如手足口病疫苗或免疫原性组合物抗原混合时，所得微粒制剂称为ISCOM颗粒，其中皂苷可占60％-70％w/w，胆固醇和磷脂占10％-15％w/w，并且蛋白质占10％-15％w/w。与免疫刺激复合物的组成和用途相关的细节例如可见于以上提及的使用佐剂处理的教科书，而且Morein B等人,1995,Clin.Immunother.3:461-475以及Barr I G和Mitchell G F,1996,Immunol.and Cell Biol.74:8-25也提供关于完全免疫刺激复合物的制备的有用说明。
可以用于本文所公开的手足口病疫苗抗原和免疫原性组合物的佐剂组合中的皂苷(无论是否是iscom形式)包括来源于南美皂皮树的树皮的那些皂苷(称为Quil A)以及其级分，如美国专利号5,057,540和"Saponins as vaccine adjuvants",Kensil,C.R.,CritRev Ther Drug Carrier Syst,1996,12(1-2):1-55；以及EP 0 362 279B1所述的。Quil A的示例性馏分为QS21、QS7和QS17。
ββ-七叶皂苷是用于手足口病疫苗和/或免疫原性组合物的佐剂组合物中的另一种溶血性皂苷。七叶皂苷在Merck索引(第12版：条目3737)中描述为马栗树欧洲七叶树(Lat:Aesculus hippocastanum)的种子中出现的皂苷混合物。描述了通过色谱法和纯化(Fiedler,Arzneimittel-Forsch.4,213(1953))并通过离子交换树脂(Erbring等人，美国专利号3,238,190)将其描述。七叶皂苷的级分已被纯化并显示为具有生物活性的(Yoshikawa M等人(Chem Pharm Bull(Tokyo)1996年8月；44(8):1454-1464))。ββ-七叶皂苷也称为七叶树皂苷。
用于手足口病疫苗和/或免疫原性组合物中的另一种溶血性皂苷为毛地黄皂苷。毛地黄皂苷在Merck索引(第12版，条目3204)中描述为一种皂苷，其来源于毛地黄(Digitalis purpurea)的种子并且根据以下所述的程序进行纯化：Gisvold等人,J.Am.Pharm.Assoc.,1934,23,664；以及Ruhenstroth-Bauer,Physiol.Chem.,1955,301,621。其用途描述为用于胆固醇测定的临床试剂。
实现佐剂作用的另一种感兴趣的可能性为采用Gosselin等人,1992中所述的技术。简言之，相关抗原诸如本公开的手足口病疫苗和/或免疫原性组合物中的抗原的呈递可以通过将抗原缀合至针对单核细胞/巨噬细胞上的FC受体的抗体(或抗原结合抗体片段)来增强。确切地说，已证实对于疫苗接种目抗原与抗-FCRI之间的缀合物增强了免疫原性。抗体可在生成之后或者作为生成的一部分缀合至手足口病疫苗或免疫原性组合物抗原，包括通过表达为手足口病疫苗和免疫原性组合物抗原的任一种多肽组分的融合物。
其他可能性涉及使用靶向和免疫调节物质(即细胞因子)。另外，还可使用细胞因子的合成诱导物诸如聚I:C。
适合分枝杆菌衍生物可以选自由以下组成的组：胞壁酰二肽、完全福氏佐剂、RIBI(Ribi ImmunoChem Research Inc.,Hamilton,Mont.)以及海藻糖二酯诸如TDM和TDE。
适合的免疫靶向佐剂的实例包括CD40配体和CD40抗体或其特异性结合片段(参考以上论述)、甘露糖、Fab片段以及CTLA-4。
适合聚合物佐剂的实例包括碳水化合物诸如右旋糖酐、PEG、淀粉、甘露聚糖以及甘露糖；塑料聚合物；以及乳胶诸如乳胶微珠。
调节免疫应答的另一种感兴趣的方式是在“虚拟淋巴结”(VLN)(由ImmunoTherapy公司开发的专利医疗设备，360Lexington Avenue,New York,N.Y.10017-6501)中包括免疫原(任选地连同佐剂和药学上可接受的载体和媒介物)。VLN(细管状设备)模拟淋巴结的结构和功能。在皮肤下方插入VLN产生无菌炎症位点，同时细胞因子和趋化因子高涨。T细胞和B细胞以及APC快速响应于危险信号，返回到炎症部位并且在VLN的多孔基质内部累积。已显示当使用VLN时引起对抗原的免疫应答所需要的必需抗原剂量减少，并且由使用VLN进行疫苗接种而赋予的免疫保护超过了使用Ribi作为佐剂的常规免疫。所述技术简单描述于Gelber C等人,1998,"Elicitation of Robust Cellular and Humoral ImmuneResponses to Small Amounts of Immunogens Using a Novel Medical DeviceDesignated the Virtual Lymph Node"，于："From the Laboratory to the Clinic,Bookof Abstracts,Oct.12-15,1998,Seascape Resort,Aptos,Calif"中。
寡核苷酸可作为佐剂与手足口病疫苗和免疫原性组合物结合使用并且可含有由至少三个或更多个或甚至至少六个或更多个核苷酸分开的两个或更多个二核苷酸CpG基序。含CpG寡核苷酸(其中CpG二核苷酸为未甲基化的)诱导主要的Th1应答。此类寡核苷酸为已熟知的并且描述于例如WO 96/02555、WO 99/33488和美国专利号6,008,200和5,856,462中。
此类寡核苷酸佐剂可以是脱氧核苷酸。在某些实施方案中，寡核苷酸的核苷酸主链为二硫代磷酸酯或硫代磷酸酯键，但是也可以使用磷酸二酯和其他核苷酸主链，诸如PNA，包括具有混合主链键合的寡核苷酸。用于产生硫代磷酸酯寡核苷酸或二硫代磷酸酯的方法描述于美国专利号5,666,153、美国专利号5,278,302和W095/26204中。
示例性寡核苷酸具有以下序列。所述序列可含有硫代磷酸酯修饰的核苷酸主链：
(SEQ ID NO:10)OLIGO 1：TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT(CpG 1826)；
(SEQ ID NO:11)OLIGO 2：TCT CCC AGC GTG CGC CAT(CpG 1758)；
(SEQ ID NO:12)OLIGO 3：ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG；
(SEQ ID NO:13)OLIGO 4：TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT(CpG 2006)；以及
(SEQ ID NO:14)OLIGO 5：TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT(CpG 1668)
替代性CpG寡核苷酸包括其上具有无关紧要的缺失或添加的以上序列。作为佐剂的CpG寡核苷酸可以通过本领域已知的任何方法合成(例如EP 468520)。例如，此类寡核苷酸可以利用自动合成仪来合成。此类寡核苷酸佐剂的长度可以是10-50个之间的碱基。另一种佐剂体系涉及含CpG寡核苷酸与皂苷衍生物的组合，具体地CpG与QS21的组合公开于WO00/09159中。
已描述许多单相或多相乳液体系。本领域技术人员可容易地使此类乳液体系适于手足口病疫苗和免疫原性组合物抗原，以使得所述溶液不会破坏抗原的结构。水包油乳液佐剂本身已表明可用作佐剂组合物(EPO 399 843B)，而且水包油乳液与其他活性剂的组合已描述为用于疫苗的佐剂(WO 95/17210；WO 98/56414；WO 99/12565；WO 99/11241)。已描述于其他油乳液佐剂，诸如油包水乳液(美国专利号5,422,109；EP 0 480 982B2)和水包油包水乳液(美国专利号5,424,067；EP 0 480 981B)。
用于本文所述的手足口病疫苗和/或免疫原性组合物中的油乳液佐剂可以是天然的或合成的，并且可以是无机的或有机的。无机油和有机油的实例对于本领域技术人员而言将为显而易见的。
为了使任何水包油组合物适用于人类施用，乳液体系的油相可包含可代谢油。术语可代谢油的含义是为本领域所熟知的。可代谢可定义为“能够通过代谢转化”(Dorland'sIllustrated Medical Dictionary,W.B.Sanders Company,第25版(1974))。油可以是任何植物油、鱼油、动物油或合成油，所述油对于接受者而言为无毒的并且能够通过代谢转化。坚果(诸如花生油)、种子和谷物为常见植物油来源。合成油也可以使用并且可包括可商购获得的油诸如
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和其他合成油。鲨烯(2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-二十四烷六烯)为大量见于鲨鱼肝油中而少量见于橄榄油、麦胚油、米糠油和酵母中的不饱和油，并且可用于手足口病疫苗和免疫原性组合物抗原中。鲨烯凭借以下事实而为可代谢油：鲨烯为胆固醇生物合成中的中间体(Merck索引，第10版，条目号8619)。
示例性油乳液为水包油乳液，并且具体地为水包鲨烯乳液。
另外，用于手足口病疫苗和免疫原性组合物抗原中的油乳液佐剂可包括抗氧化剂，诸如油α-生育酚(维生素E，EP 0 382 271B1)。
WO 95/17210和WO 99/11241公开了基于鲨烯、α-生育酚和TWEEN 80(TM)的乳液佐剂，其任选地与免疫刺激剂QS21和/或3D-MLA一起配制。WO 99/12565公开了通过将甾醇添加到油相中来对这些鲨烯乳液进行改进。另外，甘油三酯诸如三辛酸甘油酯(C27H50O6)可以添加到油相中，以便使乳液稳定(WO 98/56414)。
稳定的水包油乳液中可见的油滴的大小可以小于1微米，可以是在基本上30-600nm的范围内，直径基本上为约30-500nm，或者直径基本上为150-500nm，并且具体地直径为约150nm，如通过光子相联光谱测量的。就这一点而言，按数量计80％油滴可以是处于这些范围内，按数量计超过90％或超过95％的油滴是处于限定的大小范围内。油乳液中存在的组分的量通常是在以下范围内：2％至10％油，诸如鲨烯；并且当存在时2％至10％α生育酚；以及0.3％至3％表面活性剂，诸如聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯。油:α生育酚的比率可以等于或小于1，因为这提供更稳定的乳液。SPAN 85(TM)也可以约1％的水平存在。在一些情况下，可以有利的是本文所公开的手足口病疫苗和/或免疫原性组合物还将含有稳定剂。
产生水包油乳液的方法是为本领域技术人员已熟知的。通常，所述方法包括将油相与表面活性剂诸如
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溶液混合、接着使用均质器进行均质化的步骤，本领域技术人员将清楚的是包括使混合物两次穿过注射器针的方法将适用于使小体积的液体均质化。同样地，在微流化器中的乳化法(M110S微流体机，最多50道，在6巴最大压力输入(约850巴输出压力)下持续2分钟的时间段)可由本领域技术人员所改进以产生更小或更大体积的乳液。此改进可通过常规实验来实现，所述常规实验包括测量所得乳液直到获得具有所需直径的油滴的制备物。
可选地，手足口病疫苗和/或免疫原性组合物可以与以下各项组合：由壳聚糖(如以上所述)或其他聚阳离子聚合物组成的疫苗媒介物、聚丙交酯和聚丙交酯-共乙交酯颗粒、聚-N-乙酰基葡萄糖胺基聚合物基质、由多糖或化学修饰的多糖组成的颗粒、脂质体和基于脂质的颗粒、由甘油单酯组成的颗粒等等。皂苷也可以在胆固醇存在下配制以形成微粒结构诸如脂质体或ISCOM。此外，皂苷可以与聚氧乙烯醚或酯一起配制为非微粒溶液或悬浮液或微粒结构诸如少层(paucilamelar)脂质体或ISCOM。
用于如本文所述的手足口病疫苗和/或免疫原性组合物中的另外的说明性佐剂包括SAF(Chiron，美国加利福尼亚州)、MF-59(Chiron，参见例如Granoff等人(1997)InfectImmun.65(5):1710-1715)、SBAS系列的佐剂(例如，SB-AS2(含有MLA和QS21的水包油乳液)；SBAS-4(含有明矾和MLA的佐剂体系，可获自SmithKline Beecham,Rixensart,Belgium)；Detox
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(GlaxoSmithKline)、RC-512、RC-522、RC-527、RC-529、RC-544和RC-560(GlaxoSmithKline)以及其他氨基烷基氨基葡糖苷4-磷酸酯(AGP)，诸如待决美国专利申请序列号08/853,826和09/074,720中所述的那些。
佐剂的其他实例包括但不限于Hunter's
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佐剂(CytRx Corp.,Norcross,Ga.)；Gerbu佐剂(Gerbu Biotechnik GmbH,Gaiberg,Germany)；硝基纤维素(Nilsson和Larsson(1992)Res.Immunol.143:553-557)；明矾(例如氢氧化铝、磷酸铝)；基于乳液的制剂，包括矿物油、非矿物油、油包水或水包油乳液，诸如Seppic ISA系列的Montamide佐剂(例如ISA-51、ISA-57、ISA-720、ISA-151等等；Seppic,Paris,France)；以及
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(IDEC Pharmaceuticals)；OM-174(与脂质A相关的葡糖胺二糖)；利什曼原虫延长因子；形成胶束的非离子型嵌段共聚物诸如CRL 1005；以及Syntex佐剂制剂。参见例如，O'Hagan等人(2001)Biomol Eng.18(3):69-85；以及"Vaccine Adjuvants:PreparationMethods and Research Protocols"D.O'Hagan编辑(2000)Humana Press。
其他示例性佐剂包括具有以下通式的佐剂分子：
HO(CH 2CH2O)n-A-R，(I)
其中n为1-50，A为键或--C(O)--，R为C1-50烷基或苯基C1-50烷基。
一个实施方案由包含具有通式(I)的聚氧乙烯醚的疫苗制剂组成，其中n在1与50之间、4-24或9；R组分为C1-50、C4-C20烷基或C12烷基，并且A为键。聚氧乙烯醚的浓度的范围应为0.1％-20％、0.1％-10％或范围为0.1％-1％。示例性聚氧乙烯醚选自下组：聚氧乙烯-9-月桂醚、聚氧乙烯-9-硬脂酰(steoryl)醚、聚氧乙烯-8-硬脂酰醚、聚氧乙烯-4-月桂醚、聚氧乙烯-35-月桂醚以及聚氧乙烯-23-月桂醚。聚氧乙烯醚诸如聚氧乙烯月桂醚描述于Merck索引(第12版：条目7717)。这些佐剂分子描述于WO 99/52549中。
根据以上通式(I)的聚氧乙烯醚可按需要与另一种佐剂组合。例如，佐剂组合可包含如以上所述的CpG。
用于本文所公开的手足口病疫苗和/或免疫原性组合物中的适合药学上可接受的赋形剂的其他实例包括水、磷酸盐缓冲盐水、等渗缓冲溶液。
本公开的其他方面涉及用于使用本公开的疫苗和/或免疫原性组合物的方法，所述疫苗和/或免疫原性组合物含有来自引起手足口病的至少一种病毒的一种或多种抗原，以在有需要的受试者中治疗或预防手足口病和/或以在有需要的受试者中诱导针对手足口病的免疫应答。在一些实施方案中，本公开涉及用于在有需要的受试者中治疗或预防手足口病的方法，其通过向受试者施用治疗有效量的本公开的疫苗和/或免疫原性组合物，所述疫苗和/或免疫原性组合物含有来自引起手足口病的至少一种病毒的一种或多种抗原。在一些实施方案中，本公开涉及用于在有需要的受试者中诱导针对手足口病的免疫应答的方法，其通过向受试者施用治疗有效量的本公开的疫苗和/或免疫原性组合物，所述疫苗和/或免疫原性组合物含有来自引起手足口病的至少一种病毒的一种或多种抗原。
在一些实施方案中，保护性免疫应答包括针对EV71、CA6和CA16中的一种或多种的免疫应答。在一些实施方案中，保护性免疫应答包括针对一种或多种EV71病毒表型诸如B4、C2、C4和C5的免疫应答。
本文所公开的手足口病疫苗和/或免疫原性组合物可用于保护或治疗易患或罹患病毒感染的哺乳动物或鸟类，其方式是通过鼻内、经口、口服、经颊、舌下、肌内、腹膜内、皮内、经皮、皮下、阴道内、肛门、颅内、静脉内、经皮或皮下施用来施用疫苗。全身性施用本公开的疫苗和/或免疫原性组合物的方法可包括常规注射器和针、或者设计用于射击递送固体疫苗的设备(WO 99/27961)、或者无针压力液体喷射设备(美国专利号4,596,556；美国专利号5,993,412)、或者透皮贴剂(WO 97/48440；WO 98/28037)。本公开的手足口病疫苗和/或免疫原性组合物也可以应用于皮肤(透皮或皮下递送WO 98/20734；WO 98/28037)。本公开的手足口病疫苗和/或免疫原性组合物因此可包括用于全身性施用的递送设备，其预先填充有手足口病疫苗或免疫原性组合物。因此，提供用于在受试者诸如哺乳动物或鸟类中治疗或预防手足口病的方法和用于在所述受试者中诱导免疫应答的方法，其包括向所述受试者施用本公开的且任选地包含佐剂和/或载体的疫苗或免疫原性组合物的步骤，其中所述疫苗或免疫原性组合物经由胃肠外或全身性路径施用。
本公开的疫苗和/或免疫原性组合物可用于保护或治疗易患或罹患病毒感染的哺乳动物或鸟类，其方式是经由粘膜路径诸如口服/消化道或鼻路径施用疫苗或免疫原性组合物。替代性粘膜路径是阴道内或直肠内。粘膜施用路径可以是经由鼻施用，称为鼻内疫苗接种。鼻内疫苗接种的方法是为本领域中已熟知的，包括将液滴、喷雾剂或干粉形式的疫苗施用到待免疫个体的鼻咽中。喷雾化或气雾化疫苗制剂为本文所公开的手足口病疫苗和/或免疫原性组合物的潜在形式。肠溶制剂诸如胃耐受胶囊和用于口服施用的颗粒剂、用于直肠或阴道施用的栓剂也是本公开的疫苗和/或免疫原性组合物的制剂。
本公开的手足口病疫苗和/或免疫原性组合物也可经由口服路径施用。在此类情况下，药学上可接受的赋形剂也可包括碱性缓冲液、或肠溶胶囊或微颗粒。本公开的手足口病疫苗和/或免疫原性组合物也可通过阴道路径施用。在此类情况下，药学上可接受的赋形剂也可包括乳化剂、聚合物诸如
Figure BDA0003343729380000561
以及阴道膏剂和栓剂的其他已知稳定剂。手足口病疫苗和/或免疫原性组合物也可通过直肠路径施用。在此类情况下，赋形剂也可包括蜡类和本领域中已知用于形成直肠栓剂的聚合物。
在一些实施方案中，施用步骤包括一种或多种施用。施用可以是通过单剂量方案或多剂量(初免-加强)方案。在多剂量方案中，不同剂量可以通过相同或不同路径给予，例如胃肠外初免和粘膜加强、粘膜初免和胃肠外加强等等。通常它们将通过相同路径给予。多个剂量将通常间隔至少1周来施用(例如约2周、约3周、约4周、约6周、约8周、约12周、约16周等等)。间隔25-30天(例如28天)给予两个剂量是特别有用的。
本公开的方法包括施用治疗有效量的或免疫原性量的本公开的疫苗和/或免疫原性组合物。治疗有效量或免疫原性量可以是本公开的疫苗和/或免疫原性组合物将在它所施用的未感染、感染或未暴露的受试者中诱导保护性免疫应答的量。此应答将通常使得在受试者中产生针对疫苗的分泌性、细胞的和/或抗体介导的免疫应答。通常，此应答包括但不限于以下作用中的一种或多种：产生来自任何免疫学类别的抗体，诸如免疫球蛋白A、D、E、G或M；使B淋巴细胞和T淋巴细胞增殖；向免疫细胞提供活化、生长和分化信号；使辅助性T细胞、抑制性T细胞和/或细胞毒性T细胞扩增。
优选地，治疗有效量或免疫原性量足以引起对疾病症状的治疗或预防。需要的精确量将根据以下各项而改变：所治疗的受试者；待治疗受试者的年龄和一般状况；受试者的免疫系统合成抗体的能力；所需保护程度；所治疗病状的严重性；所选择的具体手足口病抗原多肽及其施用方式；以及其他因素。适当的治疗有效量或免疫原性量可容易地通过本领域技术人员来确定。治疗有效量或免疫原性量将落入相对广泛的范围，所述范围可通过常规试验来确定。
本公开将参考以下实施例来更充分地理解。然而，所述实施例不应被理解为以任何方式限制本公开的任何方面或范围。
实施例
实施例1：iCELLis NANO中的细胞生长评价
评价iCELLis NANO生物反应器中的Vero细胞系生长。
方法
细胞和核计数
对于iCELLis NANO，使用核计数方法计数细胞，而对于Cell-Stacks，使用台盼蓝方法计数细胞。
葡萄糖/乳酸盐测量
使用ScoutTM乳比重计测量乳酸盐。使用ACCU-CHEK Aviva Plus系统测量葡萄糖。
Vero复苏
进行Vero细胞复苏。将1-ml小瓶的Vero细胞快速解冻(小于3分钟)，使用IsaSept擦拭，并将其与19mL预先升温的补充有10％FBS和2mM谷氨酰胺的DMEM D1145混合在T-75烧瓶中。取出等分试样(0.4ml)进行细胞计数和细胞活力测定并且将T-75烧瓶置于37℃的CO2(5％)培养箱中。次日，将用过的培养基丢弃并且用新鲜培养基(20ml)替换并继续培养。
在T-175烧瓶中的培养和传代
进行Vero细胞培养和传代。用2.6E6个细胞(以0.015E6个细胞/cm2)接种T-175，工作体积为55mL(体积/表面＝0.31mL/cm2)，并且在37℃下在CO2(5％)培养箱中培养直到达到融合为止。对于传代，将T-175用25ml DPBS冲洗两次并且将细胞在37℃下在CO2(5％)培养箱中用4ml TrypLE胰蛋白酶处理5分钟。添加21mL完全培养基并且取出等分试样进行细胞计数。
在Cell Stack中的培养和传代
进行Vero细胞培养和传代。用9.5E6个细胞/板(以0.015E6个细胞/cm2)接种Cell-Stack，工作体积为200mL/坪(体积/表面＝0.31mL/cm2)，并且在37℃下在CO2(5％)培养箱中培养直到达到融合为止。对于传代，将Cell-Stack用100ml DPBS/坪冲洗两次并且将细胞在37℃下在CO2(5％)培养箱中用10ml TrypLE/坪胰蛋白酶处理5分钟。添加50mL/坪的完全培养基，收集细胞并且取出等分试样进行细胞计数。
对照Cell Stack的感染
去除培养基并且将Cell Stack(CS)用100ml DPBS/坪冲洗两次。在CS中填充感染培养基(200mL/坪；含有病毒)，并且在5％CO2下在37℃下继续感染。
NANO中的培养
组装NANO并且将其用600ml培养基预先填充并开始调节。一旦达到设定值温度(37℃)和pH(7.2-7.4)，就接种NANO。对于接种，将所需数量的细胞重新悬浮在1L瓶中的200ml培养基中并且使用取样环将种子装载到生物反应器中。通过在瓶中前后循环培养基来冲洗取样环。在接种后将再循环回路启动4小时至16小时(过夜)，以使得细胞最佳地连接至载体。在每日基础上进行对NANO的监测(测量葡萄糖和乳酸盐、检查培养参数)。
在感染之前，将生物反应器用DPBS冲洗两次。停止再循环泵和所有调节并且从NANO中去除培养基(800mL)。然后将800ml DPBS装入到生物反应器中，开始加热和搅拌并且进行冲洗5min。丢弃DPBS并且重复冲洗。对于感染，将所需量的病毒颗粒与800mL感染培养基混合。将感染培养基(含有病毒)装入在生物反应器中并且开始调节。将含有剩余感染培养基(无病毒)的再循环瓶连接至循环回路并且次日开始。在NANO培养期间利用的控制器设定值汇总于以下表1中。
表1：在iCELLis NANO培养期间的控制器设定值
Figure BDA0003343729380000581
TCID50测试
进行TCID50测试。
评价iCELLis NANO中的Vero细胞生长
使用40mL固定床(2-cm床高度)Compaction 1×NANO进行生物反应器中的培养。用0.015E6个细胞/cm2的细胞密度接种生物反应器，运行体积为800mL。将含有剩余850mL的瓶通过循环回路连接至生物反应器，以达到1,650mL的总培养体积。对Advanced控制器进行编程，以维持37℃的T°、7.4的pH(通过CO2或NaOH注射)、50％之上的DO(通过空气/O2注射)和600rpm的搅拌(对应于2cm/s的降膜速度)。将安装有EasyLoad头部的MasterFlex泵用于NANO与再循环瓶之间的培养基再循环，速度为20rpm(图1)。使用Advanced控制器记录温度、pH和DO。在第3天和第6天，进行完全培养基替换并且在第8天停止培养。在不同时间点对载体取样并用结晶紫染色(图2A至图2C)。作为对照，将Cell-Stack 10(CS-10)和Cell-Stack2(CS-2)分别培养(使用相同的接种细胞密度和培养基体积与表面比率)3天和4天，而无培养基替换，并且对细胞进行胰蛋白酶处理和计数。
结果
在整个培养中观察到连续葡萄糖消耗和乳酸盐产生。在第3天和第6天进行培养基替换以避免葡萄糖短缺和乳酸盐浓度超过20-25mM的临界浓度。氧消耗随着时间推移而增加并且溶解氧(DO)通过自动注射空气/氧气来维持在50％的设定值之上。温度和pH保持稳定(图3)。
在第8天达到的最大细胞密度为～0.8E6个细胞/cm2。在对照Cell-Stack中，0.13和0.26E6/cm2的细胞密度分别在第3天和第4天达到(图4)。这些结果指示在iCELLis NANO中，Vero细胞实现与Cell Stack相比高3倍以上的密度。一个NANO 40mL固定床压实1X产生像三个CS-10一样多的细胞。
对于培养基消耗，在iCELLis NANO中，使用总计约5升产生4.2E9个细胞，这指示1ml允许产生0.85E6个细胞。通过比较，在Cell-Stack板中，1ml培养基产生0.42至0.82E6个细胞。因此，使用类似的培养基体积消耗/每个细胞在NANO中获得观察到更高细胞密度。
实施例2：在iCELLis NANO中在0.52E6个细胞/cm2的细胞密度下进行的EV71感染评价
评价在iCELLis NANO中生长的Vero细胞产生EV71病毒的动力学和产率。使用40ml固定床压实1X生物反应器并且在0.52E6个细胞/cm2的细胞密度下进行EV71感染。
方法
如实施例1所述地接种NANO并且所使用的总培养体积为1,650mL。在第3天完全替换培养基。在第6天，细胞密度达到0.52E6个细胞/cm。使用先前表征的Vero适应性EV71病毒株。在第8次传代(P8)的Vero适应性EV71毒株中的氨基酸突变示出在表2中。
表2：Vero适应性EV71中的氨基酸突变。
Figure BDA0003343729380000591
将生物反应器用DPBS冲洗两次并且如实施例1所述地使用补充有2mM谷氨酰胺但没有FBS的DMEM D1145开始利用EV71进行的感染。鉴于生物反应器中的细胞密度为对照Cell-Stack的细胞密度的两倍这一事实，使用两倍感染培养基体积(3,300mL，即体积/表面比率为0.62mL/cm2)。
作为对照，使用相同接种密度接种Cell-Stack 10(6360cm2)并且允许细胞在37℃下在CO2(5％)培养箱中生长。在4天(即在第3天)之后，丢弃培养基并且将Cell-Stack用DPBS冲洗两次并且使用0.024MOI进行EV71感染。所使用的感染培养基与所述培养基相同但没有FBS。用于Vero细胞生长和感染的培养基的组成汇总于表3中。将恒定体积/表面比率0.31mL/cm2用于对照实验。EV71 iCELLis NANO和对照Cell-Stack培养的示意图分别示出于图5和图6中。
表3：在Vero细胞生长和EV71感染期间所使用的培养基的组成。
Figure BDA0003343729380000601
结果
在预培养阶段期间(即在病毒感染之前)，在整个培养过程中观察到连续的葡萄糖消耗和乳酸盐产生(图7和图8)。在第3天进行培养基替换以避免葡萄糖短缺和乳酸盐浓度超过20-25mM的临界浓度。氧消耗随着时间推移而增加并且溶解氧(DO)通过自动注射空气/氧气来维持在50％的设定值之上。温度和pH保持稳定。
细胞密度在感染那天即第6天达到0.55E6个细胞/cm2。在感染之后，葡萄糖消耗和乳酸盐产生是极低的(对于葡萄糖：不可测量，对于乳酸盐：小于1g/L-1/天)。一致地，氧消耗降低，如由显著的DO增加所指示的(图7)。漂浮的细胞碎片自2DPI开始是可见的并且数目随着时间推移而增加。
在对照Cell-Stack中，细胞病变效应(CPE)自2DPI起是可见的并且随着时间推移而增加(图9)。在4DPI下，少于～5％的Cell-Stack仍被粘附细胞覆盖。
样品在感染后的指定天数(DPI)时的TCID50测试结果示出在表4和表5中。TCID50结果在新加坡和布鲁塞尔所进行的测试之间是类似的。
表4.在新加坡进行的TCID50测试。
样品 iCELLis NANO(TCID50/mL)
1DPI 1.00E7
2DPI 1.00E7
3DPI(AM) 1.00E7
3DPI(PM) 1.00E7
4DPI(AM) 1.78E7
4DPI(PM) 3.16E7
阳性对照 1.00E7
表5.在布鲁塞尔进行的TCID50测试。
Figure BDA0003343729380000611
实施例3：在iCELLis NANO中在0.25 E6个细胞/cm2的细胞密度下进行的EV71感染评价
评价在iCELLis NANO中生长的Vero细胞产生EV71病毒的动力学和产率。使用40ml固定床压实1.5 X生物反应器并且在0.25 E6个细胞/cm2的细胞密度下进行EV71感染。
方法
如实施例1所述地接种NANO并且所使用的总培养体积为2,500mL。在预培养阶段期间未进行培养基替换。在第3天，细胞密度达到0.25 E6个细胞/cm2。将生物反应器用DPBS冲洗并且使用0.024 MOI开始利用EV71进行的感染。所使用的感染培养基与所述培养基相同但没有FBS，如实施例2所述的。在感染期间所使用的培养体积为2,500mL(即体积/表面比率为0.31 mL/cm2)。作为对照，如实施例2所述地培养和感染Cell-Stack 5(CS-5)。用于Vero细胞生长和感染的培养基的组成汇总于实施例2的表3中。EV71 iCELLis NANO培养的示意图示出在图10中。
结果
在预培养阶段期间(即在病毒感染之前)，在整个培养过程中观察到葡萄糖消耗和乳酸盐产生(图11和图12)。氧消耗增加，如DO降低所指示的，所述DO通过自动注射空气/氧气来维持在50％的设定值之上。温度和pH保持稳定。在第4天细胞的总量为2.0 E9，相比之下，使用iCELLis NANO 40压实1X为～1.5E9个细胞。此增加(～35％)与使用压实1.5X产生的更高表面一致。
在第4天，细胞密度达到0.25E6个细胞/cm2并且启动感染。在感染之后，葡萄糖、氧消耗和乳酸盐产生是极低的。漂浮的细胞碎片自2DPI开始是可见的并且数目随着时间推移而增加。对照Cell-Stack 5表现与实验2的对照相同，其中CPE自2DPI开始可见。
样品在感染后的指定天数(DPI)时的TCID50测试结果示出在表6和表7中。最高滴度(3.16E7 TCID50/mL，表6)在NANO中是在4DPI之后获得并且稍微高于对照Cell-Stack中获得的最高滴度(1.0E7 TCID50/mL，表6)。对相同样品进行的二次TCID50分析证实在NANO中获得的病毒滴度稍微高于对照Cell-Stack中的(表7)。
表6：在布鲁塞尔进行的TCID50。
Figure BDA0003343729380000621
表7：在布鲁塞尔进行的二次TCID50。
Figure BDA0003343729380000622
实施例4：在iCELLis NANO中在0.52E6个细胞/cm2的细胞密度下进行的Polio S2感染评价
评价在iCELLis NANO生物反应器中生长的Vero细胞所进行的Polio S2病毒产生。使用40ml固定床压实1X生物反应器并且在0.52E6个细胞/cm2的细胞密度下进行Polio感染。
方法
使用Cytodex生物反应器培养Polio S2。用于生长阶段的培养基为含有1g/L葡萄糖并补充有果糖(1g/L)和5％FBS的DME。pH设定值为7.15，接种密度为0.002-0.0045E6个细胞/cm2，培养体积与表面比率为0.045mL/cm2，并且感染时的密度为0.055E6个细胞/cm2。图13汇总了Polio S2Cytodex过程。
正如所述的，使用1,650mL总培养体积接种iCELLis NANO并且允许细胞生长。在第3天替换培养基。在第6天，细胞密度达到1.55E6个细胞/cm2。将生物反应器用DPBS冲洗并且使用0.002MOI、使用M199作为感染培养基启动利用Polio S2进行的感染。由于生物反应器中的细胞密度为对照Cell-Stack的细胞密度的两倍，使用两倍感染培养基体积(3,300mL，即体积/表面比率为0.62mL/cm2)。将浴温度设为34℃。
作为对照，使用相同接种密度接种Cell-Stack 10(6300cm2)并且允许细胞在37℃下在CO2(5％)培养箱中生长。在4天后，丢弃培养基并且将Cell-Stack用DPBS冲洗两次。使用没有FBS的相同培养基进行Polio S2感染。在对照实验期间使用恒定体积/表面比率0.31mL/cm2。用于Vero细胞生长和Polio感染的培养基的组成汇总于表8中。Polio iCELLisNANO和对照Cell-Stack培养的示意图分别示出于图14和图15中。在NANO培养期间利用的控制器设定值汇总于表9中。
表8：在Vero细胞生长和Polio感染期间所使用的培养基的组成。
Figure BDA0003343729380000631
表9：在Polio S2 iCELLis NANO培养期间的控制器设定值
Figure BDA0003343729380000632
结果
在预培养期间，观察到葡萄糖消耗和乳酸盐产生(图16)。在第3天，细胞密度达到0.135E6个细胞/cm2并且进行培养基替换。在第6天，细胞密度达到0.55E6个细胞/cm2，并且使用M199培养基(葡萄糖浓度：1g/L)进行感染。在感染之后，葡萄糖消耗和乳酸盐产生是极低的(对于葡萄糖：低于检测限，对于乳酸盐：小于1g.L-1/天)。漂浮的细胞碎片自3DPI开始是可见的并且随着时间推移而增加。
在对照Cell-Stack中，观察到连续的葡萄糖降低并且其在第8天(4DPI)降低至检测限(图17)。自4DPI观察到上清液中的浊度，并且随着时间推移而增加，这指示了细胞病变效应(CPE)(图18)。
样品在感染后的指定天数(DPI)时的TCID50测试结果示出在表10中。在NANO中获得的最高滴度(107.9)类似于对照Cell Stack中获得的最高滴度(108.3TCID50/mL)。通过ELISA进行D-抗原含量测试并且结果与TCID50值一致。
表10：TCID50测试结果。
Figure BDA0003343729380000641
实施例5：在iCELLis NANO中在0.25E6个细胞/cm2的细胞密度下进行的Polio S2感染评价
评价在iCELLis NANO生物反应器中生长的Vero细胞所进行的Polio S2病毒产生。使用40ml固定床压实1.5X生物反应器并且在0.25E6个细胞/cm2的细胞密度下进行感染。
方法
如实施例1所述地接种NANO并且所使用的总培养体积为2,500mL。在预培养阶段期间未进行培养基替换。在第4天，细胞密度达到0.23E6个细胞/cm2。将生物反应器用DPBS冲洗并且使用0.02MOI、使用M199作为感染培养基开始利用Polio S2进行的感染。在感染期间所使用的培养体积为2,500mL(即体积/表面比率为0.31mL/cm2)。
作为对照，如实验2所述地培养和感染Cell-Stack 5。在第6天，葡萄糖浓度降低至0.28g/L。将0.72g葡萄糖溶解于25ml DPBS中，在0.22微米上过滤，并且进行添加以达到1g/L的最终浓度。用于Vero细胞生长和Polio感染的培养基的组成汇总于实施例4的表8中。Polio iCELLis NANO培养的示意图示出在图19中。在NANO培养期间利用的控制器设定值汇总于实施例4的表9中。
结果
在预培养阶段期间，观察到乳酸盐增加。氧消耗增加，如溶解氧(DO)降低所指示的，所述溶解氧通过自动注射空气/氧气来维持在50％的设定值之上。温度和pH保持稳定(图20)。
在第4天，细胞密度达到0.23E6个细胞/cm2并且启动感染。在Polio S2感染之后，葡萄糖、氧消耗和乳酸盐产生是极低的(图20)。漂浮的细胞碎片自2DPI开始是可见的并且数目随着时间推移而增加。
在对照Cell-Stack中，在第6天观察到连续的葡萄糖降低，降低至0.28g/L。添加1.72g葡萄糖并继续培养(图21)。自4DPI观察到上清液中的浊度，并且随着时间推移而增加，这指示了细胞病变效应(CPE)(图22)。
样品在感染后的指定天数(DPI)时的TCID50测试结果示出在表11中。在NANO中获得的最高滴度(107.8TCID50/mL)类似于对照Cell Stack中获得的最高滴度(108.3TCID50/mL)。通过ELISA进行D-抗原含量测试并且结果与TCID50值一致。
表11：TCID50测试结果
Figure BDA0003343729380000651
实施例6：实验参数的汇总
在iCELLis NANO和Cell Stack中进行的实验1-5的关键性参数的汇总示出在以下表12和表13中。
表12：iCELLis NANO中进行的实验的关键性参数的汇总。
Figure BDA0003343729380000652
Figure BDA0003343729380000661
表13：Cell Stack中进行的实验的关键性参数的汇总。
Figure BDA0003343729380000662
实施例7：优化研究：将iCELLis NANO培养中的EV71 MOI降低20倍的影响
评价将iCELLis NANO培养中的EV71 MOI减小20倍，即自0.02降低至0.001的影响。减小MOI会降低对应的病毒种子库的体积和成本。
方法
为了评价将接种时的细胞密度降低20倍的影响，进行两次iCELLis NANO培养并且使用0.001MOI以0.25或0.5×10E6个细胞/cm2的密度感染。然后将这些培养与在类似条件下进行但使用0.02MOI感染的iCELLis NANO培养相比较。使用TCID50方法评价病毒生产率。
结果
TCID50结果呈现在表14中。在0.25×10E6个细胞/cm2的低细胞密度下，高MOI产生5倍高的生产率。在0.5×10E6个细胞/cm2的细胞密度下，在高MOI与低MOI之间没有观察到显著差异。另外，在Cell-Stack中进行的实验指示MOI(0.02至0.0001)并未显著影响生产率。基于这些结果，选择低MOI(0.001)进行随后的研究。
表14：MOI对最大病毒生产率的影响
Figure BDA0003343729380000671
实施例8：优化研究：对在EV71感染时的最佳细胞密度和生产率峰值的确定
感染时的细胞密度严重影响病毒生产率。评价在EV71感染时的最佳细胞密度和病毒释放动力学，以便确定生产率峰值。
方法
将一系列五次iCELLis NANO培养用不同细胞密度的EV71(0.001MOI)感染。使用以下培养条件：接种时的细胞密度：15,000个细胞/cm2，生长培养基：Sigma D1145+10％FBS+4mM谷氨酰胺，感染培养基：没有FBS的生长培养基，体积/表面比率：0.3mL/cm2。在生长阶段期间进行完全培养基替换，以达到以下密度：0.55、0.7和0.86×10E6个细胞/cm2。完全监测培养物(葡萄糖消耗、乳酸盐产生、细胞密度、DO、pH)并且在感染之后的每一天通过TCID50方法测量病毒生产率。
结果
比(每个细胞)生产率随着细胞密度增加而降低(图23A至图23D)。使用最低细胞密度时观察到最高体积生产率，这指示较高细胞密度不能补偿较低比生产率。
总体上，在0.2和0.35×10E6个细胞/cm2密度下获得类似最大生产率，这指示总生产率独立于此范围内的细胞密度。在感染后(感染那天是第0天)的3天之后在较低细胞密度下实现最大生产率并且保持稳定至少4天或更多天。在较高细胞密度下，在感染后4-5天之后达到生产率峰值并且然后生产率降低。
总之，在不希望受到理论约束下，数据指示低细胞密度(例如0.2-0.35×105个细胞/cm2)出于以下原因可以是有利的，所述原因包括但不限于：比生产率(每个细胞)、体积生产率(每mL收获物)、随着时间推移的稳定性、较少培养基消耗以及源自低密度细胞的HCP和DNA污染物较少。相反，在不希望受到理论约束下，数据指示高细胞密度(例如>0.5×105个细胞/cm2)可导致较低生产率、随着时间推移的较差稳定性、较高培养基消耗以及更多的源自较高细胞密度的HCP和DNA污染物。
实施例9：优化研究：降低EV71接种时的细胞密度的影响
减小接种体的体积的潜在益处包括：(i)较少劳动时间和(ii)较少污染风险。评价将接种时的细胞密度减小3倍的影响。
方法
用5,000个细胞/cm2的低密度接种iCELLis NANO并且将其与使用15,000个细胞/cm2的细胞密度接种的iCELLis NANO相比较。两个iCELLis NANO均使用0.001MOI以350,000个细胞/cm2的细胞密度感染。在生长和感染阶段期间的体积/表面比率为0.3mL/cm2。
结果
在生长阶段期间，葡萄糖消耗和乳酸盐产生在两种条件下是类似的(图24)。当接种时使用低细胞密度时对于达到感染时的靶细胞密度观察到～48小时延迟。两个培养物之间未观察到病毒生产率的显著差异(表15)。
表15：病毒生产率
Figure BDA0003343729380000681
数据指示将接种时的细胞密度减小至5,000个细胞/cm2(i)对病毒生产率不具有影响，(ii)并未增加培养基/代谢物消耗，并且(iii)将生长阶段延长至48小时。总之，在不希望受到理论约束下，数据指示减小接种时的细胞密度出于以下原因可以是有利的，所述原因包括但不限于：接种体大小、劳动时间、预培养步骤中的足迹、培养箱的数目以及污染风险。
实施例10：优化研究：降低生长阶段期间的FBS浓度和体积/表面比率的影响。
评价减小所使用的培养体积(减小体积/表面比率)或减小FBS浓度对细胞生长或病毒生产率的影响。
方法
在T-烧瓶中进行一系列实验并且监测细胞密度以及葡萄糖消耗和乳酸盐产生。还在iCELLis NANO中进行了培养，在生长阶段时使用5％FBS并且使用5,000个细胞/cm2的低接种密度。使细胞生长至～0.25×10E6个细胞/cm2的密度并且然后感染EV71(MOI＝0.001)。测定病毒生产率。
结果
在T-烧瓶培养中的两种条件均达到200,000个细胞/cm2的靶细胞密度：(1)10％FBS和0.2的体积/表面比率，以及(2)5％FBS和0.3的体积/表面比率(图25)。在iCELLisNANO培养中，FBS浓度的2倍减小对生长阶段或病毒生产率不具有显著影响(表16)。
表16：病毒生产率
Figure BDA0003343729380000691
数据指示在生长阶段期间将FBS浓度从10％减小至5％对生长阶段持续时间或病毒生产率不具有显著影响。
实施例11：优化的EV71 iCELLis NANO培养条件的汇总
优化实验之前和之后(实施例7-10)EV71在iCELLis NANO中的培养参数示出于表17中。所得iCELLis NANO实验装置也汇总于图26中。在优化的实验装置中，用5,000个细胞/cm2的细胞密度接种iCELLis NANO并且使细胞在补充有4mM谷氨酰胺和5％FBS的DMEM培养基(Sigma D1145，含有4.5g/L葡萄糖)中在37℃和pH 7.4下生长6天(无需培养基更换)，直到它们达到0.2×106个细胞/cm2的密度。体积/表面比率为0.3mL/cm2。对于感染，进行两个冲洗步骤以去除白蛋白和其他含FBS蛋白质。在补充有4mM谷氨酰胺而无FBS的DMEM(SigmaD1145)培养基中使用相同体积/表面比率0.3mL/cm2和0.001MOI进行感染。在感染之后3-4天进行收获。
表17：iCELLis优化过程的关键性培养参数。
Figure BDA0003343729380000692
实施例12：优化：EV71过程稳健性
iCELLis NANO实验的最大EV71生产率的汇编呈现在图27中。使用范围为0.001至0.02的MOI、5,000至15,000个细胞/cm2的接种体密度、范围为0.2至～0.8×106个细胞/cm2的感染时的密度以及各种FBS浓度进行这些实验中的每一个实验。病毒生产率改变小于一个log并且范围在107-108TCID50/mL收获物之间。
实施例13：iCELLis500/100中的EV71过程
评价放大EV71生产，即从iCELLis NANO(2cm床高度)至iCELLis500/100(2cm床高度)的能力。利用实施例11中呈现的优化后细胞培养参数，不同的是在生长阶段期间使用10％FBS浓度。
方法
使用装备有单次使用生物质探头并由iCELLis Skid引导的iCELLis500/100生物反应器(2cm床高，5L固定床，产生100m2的表面)进行运行。培养过程的总体综述描绘于图28中，并且iCELLis500/100运行的实验装置示出于图29中。作为对照，使用与iCELLis500/100培养所用的材料相同的原材料进行iCELLis NANO和Cell-Stack培养。
接种体
使用50亿个Vero细胞(5×109)以5,000个细胞/cm2的密度接种iCELLis500/100。通过一系列扩增步骤制备接种体。使用4个Cell-Stack 10产生所需量的接种体以用于iCELLis 100m2。
生长阶段
使用补充有4mM谷氨酰胺和10％FBS(未添加抗生素)的0.3mL/cm2DMEM培养基(4.5g/L葡萄糖)进行生长阶段持续6天，直到细胞密度达到0.2×106个细胞/cm2的最佳密度。未进行培养基替换。温度为37℃并且pH通过自动注射CO2和NaOH来维持在7.4下。通过自动注射空气和/或氧来将氧密度维持在50％之上。
在再循环间歇模式中使用总计300L进行培养，所述体积分开如下：生物反应器中的65L和palletank的500L袋中的235L。使用Skid蠕动泵以0.25L/min的速率进行生物反应器与袋之间的再循环，这使得培养基能够每20小时进行一次完整再循环。在接种后40小时启动再循环，以(i)使细胞最佳固定到载体并且(ii)减少对分泌的生长因子的稀释。
通过Skid控制器自动地进行对以下参数的连续监测：在固定床之前和之后的T°、pH、DO、电导率和生物质(电容)。使用生物质探头评价细胞密度(并因此评价感染时间)并追踪细胞病变效应，其引起生物质信号的进行性且大量的降低(图30A至图30C)。还记录在培养期间消耗的空气、氧、CO2和NaOH的量。进行每日取样以测量pH(偏离读数)、葡萄糖和乳酸盐浓度。
感染阶段
在使用补充有4mM谷氨酰胺的0.3mL/cm2 DMEM(4.5g/L葡萄糖)的无血清感染培养基中，在与生长阶段相同的T°、pH和DO条件下进行感染阶段。
在感染之前，将生物反应器的固定床用65L感染培养基冲洗两次以去除FBS和其他血清蛋白质。通过在生物反应器中混合适当量的病毒种子以达到0.001MOI来进行感染。在此步骤期间，生物反应器与袋之间的再循环停止4小时，以防止袋中的病毒损失，并再次开始。
与生长阶段期间相同地进行细胞培养监测。另外，在反应器和再循环袋中取出样品以进行QC分析(TCID50、HCP、DNA定量)。
收获和澄清
为了在延长的时间段内进行病毒动力学研究，进行感染直到感染后6天(6DPI)。在3DPI时进行中间收获(40L)并且在6DPI时进行最终收获。两次收获均在Bio-20(PALL)深层过滤器上澄清以用于随后的DSP研究。
iCELLis500处理
在无菌条件下在未使用抗生素的情况下进行iCELLis500/100运行。使用Bio-Welder或无菌连接器无菌地进行所有连接。在层流下使用适当岐管取出培养物样品。
结果
就细胞生长、代谢物消耗(葡萄糖、溶解氧)和代谢物产生(乳酸盐)而言，CELLis500/100培养以与iCELLis NANO对照类似的方式进行i(图30A至图30E)。
iCELLis500/100中的病毒生产率在3DPI时达到5.0×107TCID50/mL的最大滴度，从而产生总计1.5×1013TCID50(图31A至图31C和图32)。在6DPI时生产率保持稳定。HCP和DNA分别在4和5DPI时达到最大值。
这些结果证明了在iCELLis NANO中以小规模开发和优化的EV71培养过程的成功放大。在iCELLis500/100中获得的病毒滴度和总产率类似于以小规模获得的那些。
实施例14：在生长阶段期间使用5％FBS的iCELLis500/100
如实施例13所述地在iCELLis500/100中产生EV71，不同的是使用减小的5％FBS浓度。
实施例15：在无血清培养基(SFM)中的EV71过程
在T-烧瓶中使用无血清(SFM,OptiPro)或10％FBS(M199)培养基进行EV71感染(图33)。评价在逐渐适应性Vero细胞系和在永久性无血清培养基适应性细胞系中的病毒产生。当在病毒感染阶段期间使用无血清或10％FBS培养基时细胞生长和病毒生产率(TCID50)是类似的(表18)。随后在iCELLis NANO中使用GMP Vero SFM-适应性细胞系评价无血清条件下的EV71产生。
表18：最大病毒生产率(TCID50/mL)
Figure BDA0003343729380000721
实施例16：过程发展策略
用于iCELLis EV71产生产的总体过程发展策略示出于图34中。在实施例1-3中证实了第一步骤(可行性研究)。在实施例7-10中证实了第二步骤(在iCELLis NANO 2cm床高度中的过程优化)。第三步骤放大分为‘水平’放大(生物反应器的固定床高度保持不变并且其直径增加)和‘垂直’放大(固定床高度增加并且直径保持不变)。在实施例13中证实了水平放大(iCELLis500/100，2cm床高度)。在iCELLis NANO 10cm床高度(200mL,4m2)中使用利用5％FBS的优化过程进行垂直放大。在iCELLis500/500(10cm床高度)中进行工厂规模的EV71培养(图35)。
实施例17：在iCELLis NANO中在0.52E6个细胞/cm2的细胞密度下进行的CA6和CA16感染评价
评价在iCELLis NANO中生长的Vero细胞对CA6和CA16病毒产生的动力学和产率。使用40ml固定床压实1X生物反应器并且在0.52E6个细胞/cm2的细胞密度下进行CA6和CA16感染。
方法
如实施例1所述地接种NANO并且所使用的总培养体积为1,650mL。在第3天完全替换培养基。使用先前表征的Vero-适应性CA6和CA16病毒株。在第11次传代(P11)CA6和第3次传代(P3)CA16 Vero-适应性毒株中的核酸和氨基酸突变示出于表19和表20中。
表19：Vero-适应性CA6中的核酸和氨基酸突变。
Figure BDA0003343729380000731
表20：Vero-适应性CA16中的核酸和氨基酸突变。
Figure BDA0003343729380000732
将生物反应器用DPBS冲洗两次并且如实施例1所述地使用补充有2mM谷氨酰胺但没有FBS的DMEM D1145开始利用CA6和CA16进行的感染。鉴于生物反应器中的细胞密度为对照Cell-Stack的细胞密度的两倍这一事实，使用两倍感染培养基体积(3,300mL，即体积/表面比率为0.62mL/cm2)。
作为对照，使用相同接种密度接种Cell-Stack 10(6360cm2)并且允许细胞在37℃下在CO2(5％)培养箱中生长。在4天(即在第3天)之后，丢弃培养基并且将Cell-Stack用DPBS冲洗两次并且使用0.024MOI进行CA6和CA16感染。所使用的感染培养基与所述培养基相同但没有FBS。用于Vero细胞生长和感染的培养基的组成汇总于表21中。将恒定体积/表面比率0.31mL/cm2用于对照实验。
表21：在Vero细胞生长和CA6和CA16感染期间所使用的培养基的组成。
Figure BDA0003343729380000741
实施例18：在iCELLis NANO中在0.25E6个细胞/cm2的细胞密度下进行的CA6和CA16感染评价
评价在iCELLis NANO中生长的Vero细胞对CA6和CA16病毒产生的动力学和产率。使用40ml固定床压实1.5X生物反应器并且在0.25E6个细胞/cm2的细胞密度下进行CA6和CA16感染。
方法
如实施例1所述地接种NANO并且所使用的总培养体积为2,500mL。在预培养阶段期间未进行培养基替换.将生物反应器用DPBS冲洗并且使用0.024MOI开始利用CA6和CA16进行的感染。所使用的感染培养基与所述培养基相同但没有FBS，如实施例17所述的。在感染期间所使用的培养体积为2,500mL(即体积/表面比率为0.31mL/cm2)。作为对照，如实施例17所述地培养和感染Cell-Stack 5(CS-5)。用于Vero细胞生长和感染的培养基的组成汇总于实施例17的表21中。
实施例19：优化研究：将iCELLis NANO培养中的CA6和CA16 MOI降低20倍的影响
评价将iCELLis NANO培养中的CA6和CA16 MOI减小20倍，即自0.02降低至0.001的影响。减小MOI会降低对应的病毒种子库的体积和成本。
方法
为了评价将接种时的细胞密度降低20倍的影响，进行两次iCELLis NANO培养并且使用0.001MOI以0.25或0.5×10E6个细胞/cm2的密度感染。然后将这些培养与在类似条件下进行但使用0.02MOI感染的iCELLis NANO培养相比较。使用TCID50方法评价病毒生产率。
实施例20：优化研究：对在CA6和CA16感染时的最佳细胞密度和生产率峰值的确定
感染时的细胞密度严重影响病毒生产率。评价在CA6和CA16感染时的最佳细胞密度和病毒释放动力学，以便确定生产率峰值。
方法
将一系列五次iCELLis NANO培养用不同细胞密度的CA6和CA16(0.001MOI)感染。使用以下培养条件：接种时的细胞密度：15,000个细胞/cm2，生长培养基：Sigma D1145+10％FBS+4mM谷氨酰胺，感染培养基：没有FBS的生长培养基，体积/表面比率：0.3mL/cm2。在生长阶段期间进行完全培养基替换，以达到以下密度：0.55、0.7和0.86×10E6个细胞/cm2。完全监测培养物(葡萄糖消耗、乳酸盐产生、细胞密度、DO、pH)并且在感染之后的每一天通过TCID50方法测量病毒生产率。
实施例21：优化研究：降低CA6和CA16接种时的细胞密度的影响
减小接种体的体积的潜在益处包括：(i)较少劳动时间和(ii)较少污染风险。评价将接种时的细胞密度减小3倍的影响。
方法
用5,000个细胞/cm2的低密度接种iCELLis NANO并且将其与使用15,000个细胞/cm2的细胞密度接种的iCELLis NANO相比较。两个iCELLis NANO均使用0.001MOI以350,000个细胞/cm2的细胞密度的CA6和CA16感染。在生长和感染阶段期间的体积/表面比率为0.3mL/cm2。
实施例22：优化研究：降低生长阶段期间的FBS浓度和体积/表面比率的影响。
评价减小所使用的培养体积(减小体积/表面比率)或减小FBS浓度对细胞生长或CA6和CA16病毒生产率的影响。
方法
在T-烧瓶中进行一系列实验并且监测细胞密度以及葡萄糖消耗和乳酸盐产生。还在iCELLis NANO中进行了培养，在生长阶段使用5％FBS并且使用5,000个细胞/cm2的低接种密度。使细胞生长至～0.25×10E6个细胞/cm2的密度并且然后感染CA6和CA16(MOI＝0.001)。测定CA6和CA16病毒生产率。
实施例23：iCELLis500/100中的CA6和CA16过程
评价放大CA6和CA16生产，即从iCELLis NANO(2cm床高度)至iCELLis500/100(2cm床高度)的能力。利用优化后细胞培养参数，不同的是在生长阶段期间使用10％FBS浓度。
方法
使用装备有单次使用生物质探头并由iCELLis Skid引导的iCELLis500/100生物反应器(2cm床高，5L固定床，产生100m2的表面)进行运行。作为对照，使用与iCELLis500/100培养所用的材料相同的原材料进行iCELLis NANO和Cell-Stack培养。
接种体
使用50亿个Vero细胞(5×109)以5,000个细胞/cm2的密度接种iCELLis500/100。通过一系列扩增步骤制备接种体。使用4个Cell-Stack 10产生所需量的接种体以用于iCELLis 100m2。
生长阶段
使用补充有4mM谷氨酰胺和10％FBS(未添加抗生素)的0.3mL/cm2DMEM培养基(4.5g/L葡萄糖)进行生长阶段持续6天，直到细胞密度达到0.2×106个细胞/cm2的最佳密度。未进行培养基替换。温度为37℃并且pH通过自动注射CO2和NaOH来维持在7.4下。通过自动注射空气和/或氧来将氧密度维持在50％之上。
在再循环间歇模式中使用总计300L进行培养，所述体积分开如下：生物反应器中的65L和palletank的500L袋中的235L。使用Skid蠕动泵以0.25L/min的速率进行生物反应器与袋之间的再循环，这使得培养基能够每20小时进行一次完整再循环。在接种后40小时启动再循环，以(i)使细胞最佳固定到载体并且(ii)减少对分泌的生长因子的稀释。
通过Skid控制器自动地进行对以下参数的连续监测：在固定床之前和之后的T°、pH、DO、电导率和生物质(电容)。使用生物质探头评价细胞密度(并因此评价感染时间)并追踪细胞病变效应。还记录在培养期间消耗的空气、氧、CO2和NaOH的量。进行每日取样以测量pH(偏离读数)、葡萄糖和乳酸盐浓度。
感染阶段
在使用补充有4mM谷氨酰胺的0.3mL/cm2DMEM(4.5g/L葡萄糖)的无血清感染培养基中，在与生长阶段相同的T°、pH和DO条件下进行感染阶段。
在感染之前，将生物反应器的固定床用65L感染培养基冲洗两次以去除FBS和其他血清蛋白质。通过在生物反应器中混合适当量的病毒种子以达到0.001MOI来进行感染。在此步骤期间，生物反应器与袋之间的再循环停止4小时，以防止袋中的病毒损失，并再次开始。
与生长阶段期间相同地进行细胞培养监测。另外，在反应器和再循环袋中取出样品以进行QC分析(TCID50、HCP、DNA定量)。
收获和澄清
为了在延长的时间段内进行病毒动力学研究，进行感染直到感染后6天(6DPI)。在3DPI时进行中间收获(40L)并且在6DPI时进行最终收获。两次收获均在Bio-20(PALL)深层过滤器上澄清以用于随后的DSP研究。
iCELLis500处理
在无菌条件下在未使用抗生素的情况下进行iCELLis500/100运行。使用Bio-Welder或无菌连接器无菌地进行所有连接。在层流下使用适当岐管取出培养物样品。
实施例24：在生长阶段期间使用5％FBS的iCELLis500/100
如实施例23所述地在iCELLis500/100中产生CA6和CA16，不同的是使用减小的5％FBS浓度。
实施例25：无血清培养基(SFM)中的CA6和CA16过程
使用完全无血清过程产生CA6和CA16。在无血清培养基(SFM，OptiPro)或生长阶段使用的10％FBS培养基之间比较细胞生长和病毒生产率(TCID50)。在iCELLis NANO中使用GMP Vero SFM-适应性细胞系评价无血清条件下的CA6和CA16产生。
更具体地，本申请提供下列各项：
1.一种用于产生肠病毒A病毒的方法，其包括：
(a)在包括巨载体的固定床中培养粘附细胞，其中所述细胞在第一细胞培养基中培养；
(b)在所述肠病毒A病毒感染所述细胞的条件下用所述肠病毒A病毒接种所述细胞；
(c)在所述固定床中在第二细胞培养基中在所述感染细胞产生所述肠病毒A病毒的条件下培养所述感染细胞；以及
(d)收获由所述细胞产生的所述肠病毒A病毒。
2.根据项1所述的方法，其中所述细胞为哺乳动物细胞。
3.根据项1所述的方法，其中所述细胞为Vero细胞。
4.根据项3所述的方法，其中所述Vero细胞系选自由以下各项组成的组：WHO Vero10-87、ATCC CCL-81、Vero 76(ATCC登录号CRL-1587)以及Vero C1008(ATCC登录号CRL-1586)。
5.根据项1-4中任一项所述的方法，其中所述肠病毒A病毒选自由以下各项组成的组：EV71、CA6和CA16。
6.根据项5所述的方法，其中所述肠病毒A病毒包含至少一种非人类细胞适应性突变。
7.根据项6所述的方法，其中所述肠病毒A病毒为EV71，并且其中所述至少一种非人类细胞适应性突变包括VP1多肽突变。
8.根据项6所述的方法，其中所述肠病毒A病毒为CA6，并且其中所述至少一种非人类细胞适应性突变包括选自由以下各项组成的组的突变：VP1多肽突变、VP2多肽突变、VP3多肽突变以及5’非翻译区(UTR)突变。
9.根据项6所述的方法，其中所述肠病毒A病毒为CA16，并且其中所述至少一种非人类细胞适应性突变包括选自由以下各项组成的组的突变：2A多肽突变、VP1多肽突变、VP2多肽突变以及5’非翻译区(UTR)突变。
10.根据项1-9中任一项所述的方法，其中约4,000个细胞/cm2-约16,000个细胞/cm2在步骤(a)中培养。
11.根据项10所述的方法，其中约5,000个细胞/cm2在步骤(a)中培养。
12.根据项1-9中任一项所述的方法，其中约100,000个细胞/cm2-约800,000个细胞/cm2在步骤(b)中接种。
13.根据项12所述的方法，其中约200,000个细胞/cm2-约350,000个细胞/cm2在步骤(b)中接种。
14.根据项1-13中任一项所述的方法，其中所述第一细胞培养基包含血清。
15.根据项14所述的方法，其中所述第一细胞培养基包含小于10％的胎牛血清，并且所述细胞不适于无血清培养基。
16.根据项14所述的方法，其中所述第一细胞培养基包含5％胎牛血清。
17.根据项1-16中任一项所述的方法，其中所述第一细胞培养基和所述第二细胞培养基是不同的。
18.根据项17所述的方法，其还包括在步骤(a)与(b)之间去除所述第一细胞培养基并用所述第二培养基冲洗所述细胞。
19.根据项1-18中任一项所述的方法，其中所述第二细胞培养基为无血清培养基。
20.根据项1-19中任一项所述的方法，其中所述细胞用所述肠病毒A病毒以约0.025与约0.0009之间的MOI接种。
21.根据项20所述的方法，其中所述细胞用所述肠病毒A病毒以约0.001的MOI接种。
22.根据项1-21中任一项所述的方法，其中所述细胞在步骤(a)、(b)和/或(c)期间以约0.3mL/cm2的体积/表面比率进行培养。
23.根据项1-22中任一项所述的方法，其中在步骤(a)和/或(b)期间所述第一细胞培养基中的乳酸盐浓度不超过约25mM。
24.根据项1-23中任一项所述的方法，其中在步骤(c)期间所述第二细胞培养基中的乳酸盐浓度不超过约25mM。
25.根据项1-24中任一项所述的方法，其中在步骤(a)和/或(b)期间所述第一细胞培养基中的氧密度(DO)维持在约50％之上。
26.根据项1-25中任一项所述的方法，其中在步骤(c)期间所述第二细胞培养基中的氧密度(DO)维持在约50％之上。
27.根据项1-26中任一项所述的方法，其中所述固定床具有约2cm的床高度。
28.根据项1-26中任一项所述的方法，其中所述固定床具有约10cm的床高度。
29.根据项1-28中任一项所述的方法，其中所述巨载体为微纤维基质。
30.根据项1-29中任一项所述的方法，其中所述巨载体具有约60％与99％之间的孔隙率。
31.根据项30所述的方法，其中所述孔隙率在约80％与约90％之间。
32.根据项30或项31所述的方法，其中所述巨载体具有细胞易接近的约150cm2/cm3与约1000cm2/cm3之间的表面积。
33.根据项1-32中任一项所述的方法，其中在步骤(d)中收获至少5.0×107TCID50/mL的所述肠病毒A病毒。
34.根据项1-33中任一项所述的方法，其还包括使用以下各项中的一种或多种灭活所述肠病毒A：β-丙内酯(BPL)、福尔马林或二乙烯亚胺(BEI)。
35.根据项1-34中任一项所述的方法，其中所述肠病毒A病毒为减毒病毒。
36.一种通过根据项1-35中任一项所述的方法产生的肠病毒A病毒。
37.根据项36所述的肠病毒A病毒，其中所述病毒包含一种或多种抗原。
38.根据项36或37所述的肠病毒A病毒，其中所述病毒已使用以下各项中的一种或多种灭活：β-丙内酯(BPL)、福尔马林或二乙烯亚胺(BEI)。
39.根据项36或37所述的肠病毒A病毒，其中所述病毒为减毒病毒。
40.一种组合物，其包含根据项36-39中任一项所述的病毒。
41.一种免疫原性组合物，其包含根据项36-39中任一项所述的病毒。
42.一种疫苗，其包含根据项36-39中任一项所述的病毒。
序列表
<110> 武田疫苗股份有限公司
<120>用于产生制备疫苗的病毒的方法
<130> 606772001140
<140>尚未转让
<141>与此同时提交
<150> 62/116,361
<151> 2015-02-13
<160> 14
<170> FastSEQ的Windows 4.0版
<210> 1
<211> 297
<212> PRT
<213> 肠病毒A
<400> 1
Gly Asp Arg Val Ala Asp Val Ile Glu Ser Ser Ile Gly Asp Ser Val
1 5 10 15
Ser Arg Ala Leu Thr Gln Ala Leu Pro Ala Pro Thr Gly Gln Asn Thr
20 25 30
Gln Val Ser Ser His Arg Leu Asp Thr Gly Glu Val Pro Ala Leu Gln
35 40 45
Ala Ala Glu Ile Gly Ala Ser Ser Asn Thr Ser Asp Glu Ser Met Ile
50 55 60
Glu Thr Arg Cys Val Leu Asn Ser His Ser Thr Ala Glu Thr Thr Leu
65 70 75 80
Asp Ser Phe Phe Ser Arg Ala Gly Leu Val Gly Glu Ile Asp Leu Pro
85 90 95
Leu Glu Gly Thr Thr Asn Pro Asn Gly Tyr Ala Asn Trp Asp Ile Asp
100 105 110
Ile Thr Gly Tyr Ala Gln Met Arg Arg Lys Val Glu Leu Phe Thr Tyr
115 120 125
Met Arg Phe Asp Ala Glu Phe Thr Phe Val Ala Cys Thr Pro Thr Gly
130 135 140
Glu Val Val Pro Gln Leu Leu Gln Tyr Met Phe Val Pro Pro Gly Ala
145 150 155 160
Pro Lys Pro Glu Ser Arg Glu Ser Leu Ala Trp Gln Thr Ala Thr Asn
165 170 175
Pro Ser Val Phe Val Lys Leu Thr Asp Pro Pro Ala Gln Val Ser Val
180 185 190
Pro Phe Met Ser Pro Ala Ser Ala Tyr Gln Trp Phe Tyr Asp Gly Tyr
195 200 205
Pro Thr Phe Gly Glu His Lys Gln Glu Lys Asp Leu Glu Tyr Gly Ala
210 215 220
Cys Pro Asn Asn Met Met Gly Thr Phe Ser Val Arg Thr Val Gly Ser
225 230 235 240
Ser Lys Ser Lys Tyr Pro Leu Val Val Arg Ile Tyr Met Arg Met Lys
245 250 255
His Val Arg Ala Trp Ile Pro Arg Pro Met Arg Asn Gln Asn Tyr Leu
260 265 270
Phe Lys Ala Asn Pro Asn Tyr Ala Gly Asn Ser Ile Lys Pro Thr Gly
275 280 285
Thr Ser Arg Asn Ala Ile Thr Thr Leu
290 295
<210> 2
<211> 305
<212> PRT
<213>柯萨奇病毒A6
<400> 2
Asn Asp Pro Ile Ser Asn Ala Ile Glu Asn Ala Val Ser Thr Leu Ala
1 5 10 15
Asp Thr Thr Ile Ser Arg Val Thr Ala Ala Asn Thr Ala Ala Ser Ser
20 25 30
His Ser Leu Gly Thr Gly Arg Val Pro Ala Leu Gln Ala Ala Glu Thr
35 40 45
Gly Ala Ser Ser Asn Ala Ser Asp Glu Asn Leu Ile Glu Thr Arg Cys
50 55 60
Val Met Asn Arg Asn Gly Val Asn Glu Ala Ser Val Glu His Phe Tyr
65 70 75 80
Ser Arg Ala Gly Leu Val Gly Val Val Glu Val Lys Asp Ser Gly Thr
85 90 95
Ser Gln Asp Gly Tyr Thr Val Trp Pro Ile Asp Val Met Gly Phe Val
100 105 110
Gln Gln Arg Arg Lys Leu Glu Leu Ser Thr Tyr Met Arg Phe Asp Ala
115 120 125
Glu Phe Thr Phe Val Ser Asn Leu Asn Asp Ser Thr Thr Pro Gly Met
130 135 140
Leu Leu Gln Tyr Met Tyr Val Pro Pro Gly Ala Pro Lys Pro Asp Gly
145 150 155 160
Arg Lys Ser Tyr Gln Trp Gln Thr Ala Thr Asn Pro Ser Ile Phe Ala
165 170 175
Lys Leu Ser Asp Pro Pro Pro Gln Val Ser Val Pro Phe Met Ser Pro
180 185 190
Ala Ser Ala Tyr Gln Trp Phe Tyr Asp Gly Tyr Pro Thr Phe Gly Glu
195 200 205
His Lys Gln Ala Thr Asn Leu Gln Tyr Gly Gln Cys Pro Asn Asn Met
210 215 220
Met Gly His Phe Ala Ile Arg Thr Val Ser Glu Ser Thr Thr Gly Lys
225 230 235 240
Asn Val His Val Arg Val Tyr Met Arg Ile Lys His Val Arg Ala Trp
245 250 255
Val Pro Arg Pro Phe Arg Ser Gln Ala Tyr Met Val Lys Asn Tyr Pro
260 265 270
Thr Tyr Ser Gln Thr Ile Ser Asn Thr Ala Ala Asp Arg Ala Ser Ile
275 280 285
Thr Thr Thr Asp Tyr Glu Gly Gly Val Pro Ala Asn Pro Gln Arg Thr
290 295 300
Phe
305
<210> 3
<211> 256
<212> PRT
<213>柯萨奇病毒A6
<400> 3
Ser Pro Ser Val Glu Ala Cys Gly Tyr Ser Asp Arg Val Ala Gln Leu
1 5 10 15
Thr Val Gly Asn Ser Thr Ile Thr Thr Gln Glu Ala Ala Asn Ile Val
20 25 30
Leu Ser Tyr Gly Glu Trp Pro Gly Tyr Cys Pro Ser Thr Asp Ala Thr
35 40 45
Ala Val Asp Lys Pro Thr Arg Pro Asp Val Ser Val Asn Arg Phe Tyr
50 55 60
Thr Leu Ser Thr Lys Ser Trp Lys Thr Glu Ser Thr Gly Trp Tyr Trp
65 70 75 80
Lys Phe Pro Asp Val Leu Asn Asp Thr Gly Val Phe Gly Gln Asn Ala
85 90 95
Gln Phe His Tyr Leu Tyr Arg Ser Gly Phe Cys Met His Val Gln Cys
100 105 110
Asn Ala Ser Lys Phe His Gln Gly Ala Leu Leu Val Val Val Ile Pro
115 120 125
Glu Phe Val Val Ala Ala Ser Ser Pro Ala Met Lys Pro Asn Gly Gln
130 135 140
Gly Leu Tyr Pro Asp Phe Ala His Thr Asn Pro Gly Lys Glu Gly Gln
145 150 155 160
Val Phe Arg Asp Pro Tyr Val Leu Asp Ala Gly Ile Pro Leu Ser Gln
165 170 175
Ala Leu Val Phe Pro His Gln Trp Ile Asn Leu Arg Thr Asn Asn Cys
180 185 190
Ala Thr Ile Ile Met Pro Tyr Val Asn Ala Leu Pro Phe Asp Ser Ala
195 200 205
Leu Asn His Ser Asn Phe Gly Leu Ala Val Ile Pro Ile Ser Pro Leu
210 215 220
Lys Tyr Cys Asn Gly Ala Thr Thr Glu Val Pro Ile Thr Leu Thr Ile
225 230 235 240
Ala Pro Leu Asn Ser Glu Phe Ser Gly Leu Arg Gln Ala Ile Lys Gln
245 250 255
<210> 4
<211> 240
<212> PRT
<213>柯萨奇病毒A6
<400> 4
Gly Leu Pro Thr Glu Leu Lys Pro Gly Thr Asn Gln Phe Leu Thr Thr
1 5 10 15
Asp Asp Gly Thr Ser Pro Pro Ile Leu Pro Gly Phe Glu Pro Thr Pro
20 25 30
Leu Ile His Ile Pro Gly Glu Phe Thr Ser Leu Leu Asp Leu Cys Arg
35 40 45
Ile Glu Thr Ile Leu Glu Val Asn Asn Thr Thr Gly Thr Thr Gly Val
50 55 60
Asn Arg Leu Leu Ile Pro Val Arg Ala Gln Asn Asn Val Asp Gln Leu
65 70 75 80
Cys Ala Ser Phe Gln Val Asp Pro Gly Arg Asn Gly Pro Trp Gln Ser
85 90 95
Thr Met Val Gly Gln Ile Cys Arg Tyr Tyr Thr Gln Trp Ser Gly Ser
100 105 110
Leu Lys Val Thr Phe Met Phe Thr Gly Ser Phe Met Ala Thr Gly Lys
115 120 125
Met Leu Ile Ala Tyr Thr Pro Pro Gly Ser Ala Gln Pro Thr Thr Arg
130 135 140
Glu Ala Ala Met Leu Gly Thr His Ile Val Trp Asp Phe Gly Leu Gln
145 150 155 160
Ser Ser Val Thr Leu Val Ile Pro Trp Ile Ser Asn Thr His Phe Arg
165 170 175
Ala Val Lys Thr Gly Gly Val Tyr Asp Tyr Tyr Ala Thr Gly Ile Val
180 185 190
Thr Ile Trp Tyr Gln Thr Asn Phe Val Val Pro Pro Asp Thr Pro Ser
195 200 205
Glu Ala Asn Ile Ile Ala Leu Gly Ala Ala Gln Glu Asn Phe Thr Leu
210 215 220
Lys Leu Cys Lys Asp Thr Asp Glu Ile Arg Gln Thr Ala Glu Tyr Gln
225 230 235 240
<210> 5
<211> 150
<212> PRT
<213>柯萨奇病毒A16
<400> 5
Gly Lys Phe Gly Gln Gln Ser Gly Ala Ile Tyr Val Gly Asn Tyr Arg
1 5 10 15
Val Val Asn Arg His Leu Ala Thr His Asn Asp Trp Ala Asn Leu Val
20 25 30
Trp Glu Asp Ser Ser Arg Asp Leu Leu Val Ser Ser Thr Thr Ala Gln
35 40 45
Gly Cys Asp Thr Ile Ala Arg Cys Asp Cys Gln Thr Gly Ile Tyr Tyr
50 55 60
Cys Ser Ser Lys Arg Lys His Tyr Pro Val Ser Phe Thr Lys Pro Ser
65 70 75 80
Leu Ile Phe Val Glu Ala Ser Glu Tyr Tyr Pro Ala Arg Tyr Gln Ser
85 90 95
His Leu Met Leu Ala Val Gly His Ser Glu Pro Gly Asp Cys Gly Gly
100 105 110
Ile Leu Arg Cys Gln His Gly Val Val Gly Ile Val Ser Thr Gly Gly
115 120 125
Asn Gly Leu Val Gly Phe Ala Asp Val Arg Asp Leu Leu Trp Leu Asp
130 135 140
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145 150
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<400> 6
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1 5 10 15
Thr Ile Gly Asn Ser Thr Ile Thr Thr Gln Glu Ala Ala Asn Ile Val
20 25 30
Ile Ala Tyr Gly Glu Trp Pro Glu Tyr Cys Pro Asp Thr Asp Ala Thr
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Ala Val Asp Lys Pro Thr Arg Pro Asp Val Ser Val Asn Arg Phe Phe
50 55 60
Thr Leu Asp Thr Lys Ser Trp Ala Lys Asp Ser Lys Gly Trp Tyr Trp
65 70 75 80
Lys Phe Pro Asp Val Leu Thr Glu Val Gly Val Phe Gly Gln Asn Ala
85 90 95
Gln Phe His Tyr Leu Tyr Arg Ser Gly Phe Cys Val His Val Gln Cys
100 105 110
Asn Ala Ser Lys Phe His Gln Gly Ala Leu Leu Val Ala Val Leu Pro
115 120 125
Glu Tyr Val Leu Gly Thr Ile Ala Gly Gly Thr Gly Asn Glu Asn Ser
130 135 140
His Pro Pro Tyr Ala Thr Thr Gln Pro Gly Gln Val Gly Ala Val Leu
145 150 155 160
Met His Pro Tyr Val Leu Asp Ala Gly Ile Pro Leu Ser Gln Leu Thr
165 170 175
Val Cys Pro His Gln Trp Ile Asn Leu Arg Thr Asn Asn Cys Ala Thr
180 185 190
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195 200 205
His Cys Asn Phe Gly Leu Leu Val Ile Pro Val Val Pro Leu Asp Phe
210 215 220
Asn Ala Gly Ala Thr Ser Glu Ile Pro Ile Thr Val Thr Ile Ala Pro
225 230 235 240
Met Cys Ala Glu Phe Ala Gly Leu Arg Gln Ala Val Lys Gln
245 250
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<211> 297
<212> PRT
<213>柯萨奇病毒A16
<400> 7
Gly Asp Pro Ile Ala Asp Met Ile Asp Gln Thr Val Asn Asn Gln Val
1 5 10 15
Asn Arg Ser Leu Thr Ala Leu Gln Val Leu Pro Thr Ala Ala Asn Thr
20 25 30
Glu Ala Ser Ser His Arg Leu Gly Thr Gly Val Val Pro Ala Leu Gln
35 40 45
Ala Ala Glu Thr Gly Ala Ser Ser Asn Ala Ser Asp Lys Asn Leu Ile
50 55 60
Glu Thr Arg Cys Val Leu Asn His His Ser Thr Gln Glu Thr Ala Ile
65 70 75 80
Gly Asn Phe Phe Ser Arg Ala Gly Leu Val Ser Ile Ile Thr Met Pro
85 90 95
Thr Thr Asp Thr Gln Asn Thr Asp Gly Tyr Val Asn Trp Asp Ile Asp
100 105 110
Leu Met Gly Tyr Ala Gln Leu Arg Arg Lys Cys Glu Leu Phe Thr Tyr
115 120 125
Met Arg Phe Asp Ala Glu Phe Thr Phe Val Val Ala Lys Pro Asn Gly
130 135 140
Val Leu Val Pro Gln Leu Leu Gln Tyr Met Tyr Val Pro Pro Gly Ala
145 150 155 160
Pro Lys Pro Thr Ser Arg Asp Ser Phe Ala Trp Gln Thr Ala Thr Asn
165 170 175
Pro Ser Val Phe Val Lys Met Thr Asp Pro Pro Ala Gln Val Ser Val
180 185 190
Pro Phe Met Ser Pro Ala Ser Ala Tyr Gln Trp Phe Tyr Asp Gly Tyr
195 200 205
Pro Thr Phe Gly Glu His Leu Gln Ala Asn Asp Leu Asp Tyr Gly Gln
210 215 220
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225 230 235 240
Glu Lys Ser Pro His Ser Ile Thr Leu Arg Val Tyr Met Arg Ile Lys
245 250 255
His Val Arg Ala Trp Ile Pro Arg Pro Leu Arg Asn Gln Pro Tyr Leu
260 265 270
Phe Lys Thr Asn Pro Asn Tyr Lys Gly Asn Asp Ile Lys Cys Thr Ser
275 280 285
Thr Ser Arg Asp Lys Ile Thr Thr Leu
290 295
<210> 8
<211> 739
<212> PRT
<213>柯萨奇病毒A6
<400> 8
Thr Thr Ala Ala Ala Ala Cys Ala Gly Cys Thr Ala Gly Thr Gly Gly
1 5 10 15
Gly Thr Thr Gly Cys Ala Cys Cys Cys Ala Cys Thr Cys Ala Cys Ala
20 25 30
Gly Gly Gly Cys Cys Cys Ala Cys Thr Gly Gly Gly Cys Gly Cys Thr
35 40 45
Ala Gly Cys Ala Cys Ala Cys Thr Gly Ala Thr Thr Thr Cys Cys Cys
50 55 60
Gly Gly Ala Ala Thr Cys Cys Thr Thr Gly Thr Gly Cys Gly Cys Cys
65 70 75 80
Thr Gly Thr Thr Thr Thr Ala Thr Ala Thr Cys Cys Cys Cys Thr Cys
85 90 95
Cys Cys Cys Cys Ala Thr Gly Cys Gly Cys Ala Ala Cys Thr Thr Ala
100 105 110
Gly Ala Ala Gly Cys Ala Ala Thr Cys Thr Ala Cys Ala Cys Cys Thr
115 120 125
Thr Cys Gly Ala Thr Cys Ala Ala Thr Ala Gly Cys Ala Gly Gly Cys
130 135 140
Gly Thr Gly Gly Cys Gly Cys Gly Cys Cys Ala Gly Cys Cys Ala Thr
145 150 155 160
Gly Thr Cys Thr Ala Gly Ala Thr Cys Ala Ala Gly Cys Ala Cys Thr
165 170 175
Thr Cys Thr Gly Thr Thr Thr Cys Cys Cys Cys Gly Gly Ala Cys Thr
180 185 190
Gly Ala Gly Thr Ala Thr Cys Ala Ala Thr Ala Ala Ala Cys Thr Gly
195 200 205
Cys Thr Cys Ala Cys Gly Cys Gly Gly Thr Thr Gly Ala Ala Gly Gly
210 215 220
Ala Gly Ala Ala Ala Ala Thr Gly Thr Thr Cys Gly Thr Thr Ala Cys
225 230 235 240
Cys Cys Gly Gly Cys Thr Ala Ala Cys Thr Ala Cys Thr Thr Cys Gly
245 250 255
Ala Gly Ala Ala Ala Cys Cys Thr Ala Gly Thr Ala Gly Cys Ala Cys
260 265 270
Cys Ala Thr Gly Ala Ala Ala Ala Thr Thr Gly Cys Ala Gly Ala Gly
275 280 285
Cys Gly Thr Thr Cys Gly Thr Cys Ala Gly Cys Gly Thr Cys Cys Cys
290 295 300
Cys Gly Cys Gly Ala Gly Ala Thr Cys Ala Gly Gly Cys Thr Gly Ala
305 310 315 320
Thr Gly Ala Gly Thr Cys Ala Cys Thr Gly Cys Ala Thr Thr Cys Cys
325 330 335
Thr Cys Ala Cys Gly Gly Gly Cys Gly Ala Cys Cys Gly Thr Gly Gly
340 345 350
Cys Ala Gly Thr Gly Gly Cys Thr Gly Cys Gly Thr Thr Gly Gly Cys
355 360 365
Gly Gly Cys Cys Thr Gly Cys Cys Cys Ala Thr Gly Gly Gly Gly Thr
370 375 380
Ala Ala Cys Cys Cys Ala Thr Gly Gly Gly Ala Cys Gly Cys Thr Cys
385 390 395 400
Thr Ala Ala Thr Ala Thr Gly Gly Ala Cys Ala Thr Gly Gly Thr Gly
405 410 415
Thr Gly Ala Ala Gly Ala Gly Thr Cys Thr Ala Thr Thr Gly Ala Gly
420 425 430
Cys Thr Ala Gly Thr Thr Ala Gly Thr Ala Gly Thr Cys Cys Thr Cys
435 440 445
Cys Gly Gly Cys Cys Cys Cys Thr Gly Ala Ala Thr Gly Cys Gly Gly
450 455 460
Cys Thr Ala Ala Thr Cys Cys Thr Ala Ala Cys Thr Gly Cys Gly Gly
465 470 475 480
Ala Gly Cys Ala Cys Ala Thr Ala Cys Cys Cys Cys Cys Ala Ala Ala
485 490 495
Cys Cys Ala Gly Gly Gly Gly Gly Cys Gly Gly Thr Gly Thr Gly Thr
500 505 510
Cys Gly Thr Ala Ala Cys Gly Gly Gly Cys Ala Ala Cys Thr Cys Thr
515 520 525
Gly Cys Ala Gly Cys Gly Gly Ala Ala Cys Cys Gly Ala Cys Thr Ala
530 535 540
Cys Thr Thr Thr Gly Gly Gly Thr Gly Thr Cys Cys Gly Thr Gly Thr
545 550 555 560
Thr Thr Cys Cys Thr Thr Thr Thr Ala Thr Thr Cys Thr Thr Ala Thr
565 570 575
Ala Thr Thr Gly Gly Cys Thr Gly Cys Thr Thr Ala Thr Gly Gly Thr
580 585 590
Gly Ala Cys Ala Ala Thr Thr Gly Ala Ala Ala Gly Ala Thr Thr Gly
595 600 605
Thr Thr Ala Cys Cys Ala Thr Ala Thr Ala Gly Cys Thr Ala Thr Thr
610 615 620
Gly Gly Ala Thr Thr Gly Gly Cys Cys Ala Thr Cys Cys Gly Gly Thr
625 630 635 640
Gly Ala Ala Thr Ala Ala Cys Ala Gly Ala Gly Cys Cys Thr Thr Gly
645 650 655
Ala Thr Ala Thr Ala Cys Cys Thr Thr Thr Thr Thr Gly Thr Ala Gly
660 665 670
Gly Gly Thr Thr Thr Ala Thr Ala Cys Cys Ala Cys Thr Thr Ala Cys
675 680 685
Thr Cys Thr Thr Cys Gly Cys Gly Thr Thr Gly Thr Thr Gly Ala Gly
690 695 700
Ala Cys Thr Cys Thr Ala Ala Ala Gly Thr Ala Cys Ala Thr Thr Cys
705 710 715 720
Thr Ala Ala Thr Cys Thr Thr Gly Ala Ala Cys Ala Cys Thr Ala Gly
725 730 735
Ala Ala Ala
<210> 9
<211> 735
<212> PRT
<213>柯萨奇病毒A16
<400> 9
Ala Gly Cys Cys Thr Gly Thr Gly Gly Gly Thr Thr Gly Thr Thr Cys
1 5 10 15
Cys Cys Ala Cys Cys Cys Ala Cys Ala Gly Gly Gly Cys Cys Cys Ala
20 25 30
Gly Thr Gly Gly Gly Cys Gly Cys Thr Ala Gly Cys Ala Cys Ala Cys
35 40 45
Thr Gly Ala Thr Thr Cys Thr Gly Cys Gly Gly Gly Ala Thr Cys Thr
50 55 60
Thr Thr Gly Thr Gly Cys Gly Cys Cys Thr Gly Thr Thr Thr Thr Ala
65 70 75 80
Thr Ala Ala Cys Cys Cys Cys Thr Thr Cys Cys Cys Thr Ala Ala Gly
85 90 95
Cys Ala Gly Cys Ala Ala Cys Thr Thr Ala Gly Ala Ala Gly Thr Thr
100 105 110
Thr Cys Ala Cys Ala Cys Ala Ala Thr Cys Ala Cys Gly Ala Cys Cys
115 120 125
Ala Gly Thr Ala Gly Thr Gly Gly Gly Cys Gly Thr Gly Gly Cys Gly
130 135 140
Cys Gly Cys Cys Ala Gly Thr Cys Ala Cys Gly Thr Cys Thr Thr Gly
145 150 155 160
Gly Thr Cys Ala Ala Gly Cys Ala Cys Thr Thr Cys Thr Gly Thr Thr
165 170 175
Cys Cys Cys Cys Cys Gly Gly Ala Cys Thr Gly Ala Gly Thr Ala Thr
180 185 190
Cys Ala Ala Thr Ala Gly Ala Cys Thr Gly Cys Thr Cys Ala Cys Gly
195 200 205
Cys Gly Gly Thr Thr Gly Ala Ala Gly Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala
210 215 220
Cys Gly Thr Thr Cys Gly Thr Thr Ala Thr Cys Cys Gly Gly Cys Thr
225 230 235 240
Ala Ala Cys Thr Ala Cys Thr Thr Cys Gly Ala Gly Ala Ala Ala Cys
245 250 255
Cys Thr Ala Gly Ala Gly Cys Ala Cys Cys Gly Thr Gly Ala Ala Ala
260 265 270
Gly Thr Thr Gly Cys Gly Gly Ala Gly Gly Thr Cys Gly Cys Thr Cys
275 280 285
Ala Gly Cys Ala Cys Thr Thr Cys Cys Cys Cys Cys Gly Thr Gly Thr
290 295 300
Ala Gly Ala Thr Cys Ala Gly Gly Thr Cys Gly Ala Thr Gly Ala Gly
305 310 315 320
Thr Cys Ala Cys Thr Gly Thr Ala Ala Ala Cys Cys Cys Cys Ala Cys
325 330 335
Gly Gly Gly Cys Gly Ala Cys Cys Gly Thr Gly Ala Cys Ala Gly Thr
340 345 350
Gly Gly Cys Thr Gly Cys Gly Thr Thr Gly Gly Cys Gly Gly Cys Cys
355 360 365
Thr Gly Cys Cys Cys Ala Thr Gly Gly Gly Gly Thr Ala Ala Cys Cys
370 375 380
Cys Ala Thr Gly Gly Gly Ala Cys Gly Cys Thr Cys Thr Ala Ala Thr
385 390 395 400
Ala Cys Ala Gly Ala Cys Ala Thr Gly Gly Thr Gly Thr Gly Ala Ala
405 410 415
Gly Ala Gly Thr Cys Thr Ala Thr Thr Gly Ala Gly Cys Thr Ala Gly
420 425 430
Thr Thr Ala Gly Thr Ala Gly Thr Cys Cys Thr Cys Cys Gly Gly Cys
435 440 445
Cys Cys Cys Thr Gly Ala Ala Thr Gly Cys Gly Gly Cys Thr Ala Ala
450 455 460
Thr Cys Cys Thr Ala Ala Cys Thr Gly Cys Gly Gly Ala Gly Cys Ala
465 470 475 480
Cys Gly Cys Ala Cys Cys Cys Thr Cys Ala Ala Cys Cys Cys Ala Gly
485 490 495
Gly Gly Gly Gly Cys Gly Gly Cys Gly Thr Gly Thr Cys Gly Thr Ala
500 505 510
Ala Thr Gly Gly Gly Thr Ala Ala Cys Thr Cys Thr Gly Cys Ala Gly
515 520 525
Cys Gly Gly Ala Ala Cys Cys Gly Ala Cys Thr Ala Cys Thr Thr Thr
530 535 540
Gly Gly Gly Thr Gly Thr Cys Cys Gly Thr Gly Thr Thr Thr Cys Cys
545 550 555 560
Thr Thr Thr Thr Ala Thr Thr Cys Cys Thr Thr Ala Thr Thr Gly Gly
565 570 575
Cys Thr Gly Cys Thr Thr Ala Thr Gly Gly Thr Gly Ala Cys Ala Ala
580 585 590
Thr Thr Gly Ala Ala Ala Ala Gly Thr Thr Gly Thr Thr Ala Cys Cys
595 600 605
Ala Thr Ala Thr Ala Gly Cys Thr Ala Thr Thr Gly Gly Ala Thr Thr
610 615 620
Gly Gly Cys Cys Ala Thr Cys Cys Gly Gly Thr Gly Thr Cys Thr Ala
625 630 635 640
Ala Cys Ala Gly Ala Gly Cys Thr Ala Thr Thr Gly Thr Thr Thr Ala
645 650 655
Cys Cys Thr Ala Thr Thr Thr Ala Thr Thr Gly Gly Ala Thr Ala Cys
660 665 670
Gly Thr Cys Cys Cys Thr Cys Thr Thr Ala Ala Thr Cys Thr Cys Ala
675 680 685
Ala Gly Gly Cys Cys Ala Thr Thr Cys Ala Ala Ala Cys Thr Cys Thr
690 695 700
Thr Gly Ala Thr Thr Ala Thr Ala Thr Ala Thr Thr Gly Cys Thr Cys
705 710 715 720
Cys Thr Thr Ala Ala Cys Thr Gly Thr Ala Ala Gly Ala Ala Ala
725 730 735
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 10
tccatgacgt tcctgacgtt 20
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 11
tctcccagcg tgcgccat 18
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 12
accgatgacg tcgccggtga cggcaccacg 30
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 13
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 14
tccatgacgt tcctgatgct 20

Claims (10)

1.一种用于产生肠病毒A病毒的方法，其包括：
(a)在包括巨载体的固定床中培养粘附细胞，其中所述细胞在第一细胞培养基中培养；
(b)在所述肠病毒A病毒感染所述细胞的条件下用所述肠病毒A病毒接种所述细胞；
(c)在所述固定床中在第二细胞培养基中在所述感染细胞产生所述肠病毒A病毒的条件下培养所述感染细胞；以及
(d)收获由所述细胞产生的所述肠病毒A病毒。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞为Vero细胞。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述肠病毒A病毒选自由以下各项组成的组：EV71、CA6和CA16。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中约4,000个细胞/cm2-约16,000个细胞/cm2在步骤(a)中培养。
5.根据权利要求4所述的方法，其中约5,000个细胞/cm2在步骤(a)中培养。
6.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中约100,000个细胞/cm2-约800,000个细胞/cm2在步骤(b)中接种。
7.根据权利要求6所述的方法，其中约200,000个细胞/cm2-约350,000个细胞/cm2在步骤(b)中接种。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述细胞用所述肠病毒A病毒以约0.025与约0.0009之间的MOI接种。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述细胞用所述肠病毒A病毒以约0.001的MOI接种。
10.一种通过根据权利要求1-9中任一项所述的方法产生的肠病毒A病毒。
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