CN109069648B - 胆汁淤积性和纤维化疾病的治疗方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于治疗胆汁淤积性和纤维化疾病的化合物[2‑[(5‑硝基‑1,3‑噻唑‑2‑基)氨甲酰基]苯基]乙酸酯(硝唑尼特)或2‑羟基‑N‑(5‑硝基‑2‑噻唑基)苯甲酰胺(替唑尼特)。
Description
技术领域
本发明涉及医学领域,具体来说涉及胆汁淤积性或纤维化疾病的治疗。
背景技术
细胞外基质的异常且夸张的沉积是所有纤维化疾病(包括肝、肺、肾或心脏纤维化)的标志。在治疗纤维化疾病时,受影响的器官范围、纤维化过程的进行性本质、受影响人群的庞大数量和有效治疗的缺乏造成了巨大挑战。
在为纤维化疾病的治疗提出新的治疗策略的尝试中,本发明人发现化合物2-[(5-硝基-1,3-噻唑-2-基)氨甲酰基]苯基]乙酸酯(硝唑尼特或NTZ)这种合成的抗原生动物剂,也显示出有效的抗纤维化性质。此外,在肝损伤模型中NTZ的评估揭示出它降低循环胆汁酸浓度的能力,从而反映了它治疗胆汁淤积性(例如PBC和PSC)和纤维化疾病两者的潜力。
首次描述于1975年(Rossignol和Cavier,1975)的NTZ对厌氧原生动物、蠕虫和广谱的微生物(包括厌氧和好氧细菌两者)显示出高度有效(Rossignol和Maisonneuve,1984;Dubreuil,Houcke等,1996;Megraudd,Occhialini等,1998;Fox和Saravolatz,2005;Pankuch和Appelbaum,2006;Finegold,Molitoris等,2009)。它首先在人类中被研究用于肠道绦虫的治疗(Rossignol和Maisonneuve,1984),并且现在在美国被批准(Romark laboratories)用于治疗由原生动物寄生虫Crystosporidium parvum和肠贾第虫(Giardia intestinalis)引起的腹泻。在拉丁美洲和印度,NTZ也已被广泛商业化,在那里它被指示用于治疗广谱的肠内寄生虫感染(Hemphill,Mueller等,2006)。提出的NTZ发挥其抗寄生虫活性的作用机制是通过抑制厌氧代谢所必需的丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶(PFOR)依赖性电子传递反应(Hoffman,Sisson等,2007)。NTZ对不具有PFOR的同源物的结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)也表现出活性,从而提出了可选的作用机制。事实上,已显示NTZ也可充当破坏膜电位和生物体内pH稳态的解偶联剂(de Carvalho,Darby等,2011)。
NTZ的药理效应不限于它的抗寄生虫活性,并且近年中,几项研究揭示出NTZ也可提供抗病毒活性(Di Santo和Ehrisman,2014;Rossignol,2014)。NTZ通过多种多样的方式干扰病毒复制,包括阻断红细胞凝集素(流感)或VP7(轮状病毒)蛋白的成熟或激活参与先天性免疫应答的蛋白质PKR(对于综述,参见(Rossignol,2014))。也已显示,NTZ通过干扰关键的代谢和促死亡信号转导途径而具有广泛的抗癌性质(Di Santo和Ehrisman,2014)。
在本发明中,使用表型筛选测定法鉴定潜在的抗纤维化剂,发现了NTZ或其活性代谢物替唑尼特(或TZ)干扰在肝纤维化的发生中发挥重要作用的肝星状细胞(HSC)的活化。有鉴于以前为这些分子报道的性质,这种效应是完全出人意料的。此外,NTZ和TZ显示出干扰源自于其他器官例如心脏、肺和肠的刺激的成纤维细胞的活化。在肝脏疾病的临床前模型(CDAAc饮食诱导的NASH)中,通过显示出肝胶原蛋白和纤维化水平的显著降低,NTZ的抗纤维化性质得到进一步证实。除了它的抗纤维化活性之外,NTZ在CCl4诱导的肝损伤模型中也显示出降低循环胆汁酸浓度。因此,NTZ和TZ似乎是用于治疗胆汁淤积性疾病和多种多样类型的纤维化疾病的令人感兴趣的化合物。
发明内容
本发明涉及化合物[2-[(5-硝基-1,3-噻唑-2-基)氨甲酰基]苯基]乙酸酯(硝唑尼特)或其活性代谢物2-羟基-N-(5-硝基-2-噻唑基)苯甲酰胺(替唑尼特)或替唑尼特葡萄糖醛酸苷(TZG)或它们的可药用盐,其用于治疗胆汁淤积性或纤维化疾病的方法中。
在特定实施方式中,所述纤维化障碍选自肝、内脏、肾、皮肤、表皮、内皮、肌肉、肌腱、软骨、心脏、胰腺、肺、子宫、神经系统、睾丸、阴茎、卵巢、肾上腺、动脉、静脉、结肠、肠(例如小肠)、胆道、软组织(例如纵隔或腹膜后腔)、骨髓、关节、眼和胃的纤维化。在另一个特定实施方式中,所述纤维化障碍选自肝、肾、皮肤、表皮、内皮、肌肉、肌腱、软骨、心脏、胰腺、肺、子宫、神经系统、睾丸、卵巢、肾上腺、动脉、静脉、结肠、肠(例如小肠)、胆道、软组织(例如纵隔或腹膜后腔)、骨髓、关节和胃的纤维化。在另一个特定实施方式中,所述纤维化障碍选自肝、内脏、肺、心脏、肾、肌肉、皮肤、软组织、骨髓、肠和关节的纤维化。在又一个实施方式中,所述纤维化障碍选自非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肺纤维化、特发性肺纤维化、皮肤纤维化、眼纤维化(例如囊纤维化)、心内膜心肌纤维化、纵隔纤维化、骨髓纤维化、腹膜后纤维化、进行性大块纤维化(煤矿工人尘肺的并发症)、增殖性纤维化、肿瘤性纤维化、慢性炎性气道疾病(COPD、哮喘、肺气肿、吸烟者的肺、肺结核)后继发的肺纤维化、酒精或药物诱导的肝纤维化、肝硬化、感染诱导的肝纤维化、辐射或化疗诱导的纤维化、肾源性系统性纤维化、克罗恩病、溃疡性结肠炎、瘢痕疙瘩、陈旧性心肌梗塞、硬皮病/系统性硬化症、关节纤维化、某些形式的粘连性囊炎、慢性纤维化胆管病变例如原发性硬化性胆管炎(PSC)、原发性胆汁性胆管炎(PBC)、胆管闭锁、3型家族性肝内胆汁淤积症(PFIC3)、植入物周围纤维化和石棉沉着病。
根据本发明的特定实施方式,所述胆汁淤积性疾病选自原发性胆汁性胆管炎(PBC)、原发性硬化性胆管炎(PSC)、妊娠期肝内胆汁淤积症、进行性家族性肝内胆汁淤积症、胆管闭锁、胆石症、感染性胆管炎、与朗格汉斯细胞组织细胞增多症相关的胆管炎、阿拉吉欧综合症(Alagille syndrome)、非综合征型胆管缺乏、药物诱导的胆汁淤积症和与全肠胃外营养相关的胆汁淤积症。在特定实施方式中,所述胆汁淤积性疾病是PBC。
根据另一方面,本发明涉及一种药物组合物,其包含选自NTZ或TZ(G)或者NTZ或TZ(G)的可药用盐的化合物,用于治疗胆汁淤积性或纤维化障碍的方法中,其中所述化合物是所述组合物中唯一的活性成分。
根据另一方面,本发明涉及如上所定义的化合物或药物组合物,其与具有已知抗纤维化活性的至少一种治疗活性剂相组合用于治疗纤维化障碍,所述治疗活性剂选自吡非尼酮或受体酪氨酸激酶抑制剂(RTKI)例如尼达尼布、索拉非尼和其他RTKI,或血管紧张素II(AT1)受体阻断剂,或CTGF抑制剂,或对干扰TGFβ和BMP激活的途径易感的任何抗纤维化化合物,包括潜伏性TGFβ复合体的激活剂例如MMP2、MMP9、THBS1或细胞表面整合蛋白,I型TGFβ受体(TGFBRI)或II型TGFβ受体(TGFBRII)以及它们的配体例如TGFβ,激活素(Activin),抑制素(inhibin),Nodal,抗苗勒氏管激素,GDF或BMP,辅助性共受体(也被称为III型受体),或SMAD依赖性经典途径的组分,包括调节性或抑制性SMAD蛋白,或SMAD不依赖性或非经典途径的成员,包括MAPK信号转导的各种不同分支、TAK1、Rho样GTP酶信号转导途径、磷脂酰肌醇-3激酶/AKT途径、TGFβ诱导的EMT过程或经典和非经典Hedgehog信号转导途径的成员,包括Hh配体或靶基因,或对影响TGFβ信号转导易感的WNT或Notch途径的任何成员。
本发明还涉及如上所定义的化合物或药物组合物,其与选自JAK/STAT抑制剂、其他抗炎剂和/或免疫抑制剂的至少一种治疗活性剂相组合使用。
根据特定实施方式,所述治疗活性剂选自糖皮质激素、NSAIDS、环磷酰胺、亚硝基脲、叶酸类似物、嘌呤类似物、嘧啶类似物、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤、巯基嘌呤、环孢菌素、多球壳菌素、他克莫司、西罗莫司、霉酚酸衍生物、芬戈莫德和其他鞘氨醇-1-磷酸酯受体调节剂、针对靶例如促炎性细胞因子和促炎性细胞因子受体、T细胞受体、整合蛋白的单克隆和/或多克隆抗体。
本发明还涉及一种药物组合物,其包含:
-NTZ或NTZ的可药用盐;和
-TZ(G)或TZ(G)的可药用盐。
本发明还涉及一种试剂盒(kit-of-parts),其包含:
-NTZ或NTZ的可药用盐;和
-TZ(G)或TZ(G)的可药用盐。
根据特定实施方式,在本文中描述的每种情况和实施方式中,使用NTZ或TZ或者NTZ或TZ的可药用盐。
图表说明
在图、表和文本中使用的缩写:
α-SMA:α平滑肌肌动蛋白
BMP:骨形态发生蛋白
cDNA:互补的脱氧核糖核苷酸
COL1A1:胶原蛋白,1型,α1
CDAA:缺乏胆碱的限定L-氨基酸的饮食
CDAAc:增补有胆固醇的缺乏胆碱的限定L-氨基酸的饮食
CHOL:胆固醇
CSAA:增补胆碱的限定L-氨基酸的饮食
CYPA:亲环蛋白A
DDC:3,5-二乙氧基羰基-1,4-二氢三甲基吡啶
DMSO:二甲基亚砜
ELISA:酶联免疫吸附测定法
EMT:上皮-间质转化
DTT:二硫苏糖醇
FBS:胎牛血清
FDA:食品和药品监督管理局
GDF:生长分化因子
Hh:Hedgehog
hHSC:人类肝星状细胞
HSC:肝星状细胞
IC50:半最大抑制浓度
InMyoFib:肠肌成纤维细胞
MMP2:基质金属肽酶2
MMP9:基质金属肽酶9
μl:微升
NHLF:正常人肺成纤维细胞
NTZ:硝唑尼特
PBC:原发性胆汁性胆管炎
PBS:磷酸盐缓冲盐水
PSC:原发性硬化性胆管炎
qPCR:定量聚合酶链反应
pMol:皮摩尔
rhFGF:重组人碱性成纤维细胞生长因子RNA:核糖核酸
RT:反转录酶
SmBM:平滑肌细胞基础培养基
SteCGS:星状细胞生长增补剂
STeCM:星状细胞培养基
TBA:总胆汁酸
TGFβ1:肿瘤生长因子β1
TGFBRI:I型TGFb受体
TGFBRII:II型TGFb受体
THBS1:血小板反应蛋白1
TMB:四甲基联苯胺
TZ:替唑尼特
TZG:替唑尼特葡萄糖醛酸苷
TZ(G):TZ或TZG
图1.硝唑尼特及其代谢物替唑尼特在人类HSC中抑制TGFβ1诱导的α-SMA蛋白的表
达
将剥夺血清的HSC与NTZ(A)或TZ(B)预温育1小时,然后用促纤维发生的细胞因子TGFβ1(1ng/ml)活化。在温育48小时后,通过ELISA测量α-SMA的表达。将获得的值转换成与TGFβ1对照相比的抑制百分率。数据被呈现为平均值(三份平行样)±标准偏差(SD)。使用Sigma Plot 11.0软件,通过单向ANOVA,随后通过Bonferroni事后检验来进行统计分析。[*:p<0.05;**:p<0.01;***:p<0.001(相对于TGFβ11ng/mL组进行比较)]。使用XLFit软件5.3.1.3进行曲线拟合和半最大抑制浓度(IC50)的计算。
图2.硝唑尼特及其代谢物替唑尼特在TGFβ1诱导的人类HSC中减少COL1A1转录本
将剥夺血清的HSC与NTZ(A)或TZ(B)预温育1小时,然后用TGFβ1(1ng/ml)活化。在温育24小时后,通过RT-qPCR测量COL1A1的表达。将表达值转换成与TGFβ1对照相比的诱导倍数。数据被呈现为平均值(三份平行样)±标准偏差(SD)。使用Sigma Plot 11.0软件,通过单向ANOVA,随后通过Bonferroni事后检验来进行统计分析。[*:p<0.05;**:p<0.01;***:p<0.001(相对于TGFβ11ng/mL组进行比较)]。
图3:NTZ(A)或TZ(B)在大鼠HSC中抑制TFGβ1诱导的α-SMA蛋白的表达
向剥夺血清的大鼠HSC(rHSC)添加NTZ(A)或TZ(B),1小时后用TGFβ1(3ng/ml)活化。在温育48小时后,通过ELISA测量α-SMA的表达。将获得的值转换成与TGFβ1对照相比的抑制百分率。数据被呈现为平均值(三份平行样)±标准偏差(SD)。使用Sigma Plot 11.0软件,通过单向ANOVA,随后通过Bonferroni事后检验来进行统计分析。[*:p<0.05;**:p<0.01;***:p<0.001(相对于TGFβ13ng/mL组进行比较)]。
图4:NTZ(A)或TZ(B)在人类肺成纤维细胞中抑制TFGβ1诱导的α-SMA蛋白的表达
向剥夺血清的肺成纤维细胞(NHLF)添加NTZ(A)或TZ(B),1小时后用TGFβ1(1ng/ml)活化。在温育48小时后,通过ELISA测量α-SMA的表达。将获得的值转换成与TGFβ1对照相比的抑制百分率。数据被呈现为平均值(三份平行样)±标准偏差(SD)。使用Sigma Plot11.0软件,通过单向ANOVA,随后通过Bonferroni事后检验来进行统计分析。[*:p<0.05;**:p<0.01;***:p<0.001(相对于TGFβ1 1ng/mL组进行比较)]。
图5:NTZ(A)或TZ(B)在人类心脏成纤维细胞中抑制TFGβ1诱导的α-SMA蛋白的表达
向剥夺血清的心脏成纤维细胞(NHCF)添加NTZ(A)或TZ(B),1小时后用TGFβ1(3ng/ml)活化。在温育48小时后,通过ELISA测量α-SMA的表达。将获得的值转换成与TGFβ1对照相比的抑制百分率。数据被呈现为平均值(三份平行样)±标准偏差(SD)。使用Sigma Plot11.0软件,通过单向ANOVA,随后通过Bonferroni事后检验来进行统计分析。[*:p<0.05;**:p<0.01;***:p<0.001(相对于TGFβ13ng/mL组进行比较)]。
图6:NTZ(A)或TZ(B)在人类肠成纤维细胞中抑制TFGβ1诱导的α-SMA蛋白的表达
向剥夺血清的肠成纤维细胞(InMyoFib)添加NTZ(A)或TZ(B),1小时后用TGFβ1(3ng/ml)活化。在温育48小时后,通过ELISA测量α-SMA的表达。将获得的值转换成与TGFβ1对照相比的抑制百分率。数据被呈现为平均值(三份平行样)±标准偏差(SD)。使用SigmaPlot 11.0软件,通过单向ANOVA,随后通过Bonferroni事后检验来进行统计分析。[*:p<0.05;**:p<0.01;***:p<0.001(相对于TGFβ13ng/mL组进行比较)]。
图7:硝唑尼特的长期口服给药(10mg/kg/天)在C57Bl/6J小鼠的肝中预防CDAA诱
导的胶原蛋白贮积
将6周龄C57BL/6小鼠喂食对照(CSAA)饮食、CDAA+1%CHOL(CDAAc)饮食或增补有NTZ 10mg/kg/天的CDAAc饮食12周。在处死后,确定肝胶原蛋白含量。数据被呈现为平均值±标准偏差(SD)。使用Sigma Plot 11.0软件,通过student t-检验来进行统计分析:CSAA相比于CDAAc(#:p<0.05;##:p<0.01;###:p<0.001)和CDAAc相比于NTZ 10mg/kg/天(*:p<0.05;**:p<0.01;***:p<0.001)。
图8:硝唑尼特的长期口服给药(10mg/kg/天)在C57Bl/6J小鼠的肝中预防CDAAc饮
食诱导的纤维化
将6周龄C57BL/6小鼠喂食对照(CSAA)饮食、CDAAc饮食或增补有NTZ 10mg/kg/天的CDAAc饮食12周。在处死后,确定肝纤维化面积。数据被呈现为平均值±标准偏差(SD)。使用Sigma Plot 11.0软件,通过student t-检验来进行统计分析:CSAA相比于CDAAc(#:p<0.05;##:p<0.01;###:p<0.001)和CDAAc相比于NTZ 10mg/kg/天(*:p<0.05;**:p<0.01;***:p<0.001)。
图9:硝唑尼特的长期口服给药防止CCl4诱导的循环TBA浓度水平
将250-275g大鼠每周两次用橄榄油(对照组)或用在橄榄油中乳化的CCl4(CCl4:橄榄油1:2v/v,CCl4终浓度:2ml/kg)腹膜内注射共3周。同时,将橄榄油注射组置于对照饮食下,而将CCl4注射组置于对照饮食或增补有NTZ 10mg/kg/天或30mg/kg/天的饮食下。在处死后,确定循环TBA浓度。数据被呈现为平均值±标准偏差(SD)。使用Sigma Plot 11.0软件,通过student t-检验来进行统计分析:橄榄油相比于CCl4(#:p<0.05;##:p<0.01;###:p<0.001)和CCl4相比于NTZ(*:p<0.05;**:p<0.01;***:p<0.001)。
发明详述
在本申请的实验部分中,显示了化合物[2-[(5-硝基-1,3-噻唑-2-基)氨甲酰基]苯基]乙酸酯(硝唑尼特)和2-羟基-N-(5-硝基-2-噻唑基)苯甲酰胺(替唑尼特)在几种纤维化模型中具有抗纤维化性质。此外,显示了NTZ或其活性代谢物TZ在肝损伤模型中具有防止循环胆汁酸水平发生改变的能力,显示出NTZ和TZ治疗胆汁淤积性疾病的能力。因此,本发明涉及化合物NTZ或其活性代谢物例如TZ或TZG的新的治疗用途。
具体来说,本发明涉及化合物NTZ或TZ(G)或者NTZ或TZ(G)的可药用盐,其用于治疗胆汁淤积性或纤维化障碍的方法中。本发明还涉及包含NTZ或TZ(G)或其可药用盐的药物组合物,其用于治疗胆汁淤积性或纤维化障碍的方法中。此外,本发明涉及NTZ或TZ(G)或其可药用盐在制造可用于治疗胆汁淤积性或纤维化障碍的药物中的用途。本发明还涉及包含NTZ或TZ(G)或其可药用盐的药物组合物。本发明的药物组合物可用于治疗胆汁淤积性或纤维化障碍。
尽管纤维化障碍的致病物或初始事件相当多样并且它们的发病机理可变,但受影响的组织中的共同特点是存在大量被称为肌成纤维细胞的活化的成纤维细胞(Rosenbloom,Mendoza等,2013)。纤维化刺激物例如TGFβ可以诱导成纤维细胞分化成肌成纤维细胞(Leask和Abraham,2004;Leask,2007)。肌成纤维细胞是在代谢和形态上与众不同的成纤维细胞,所述成纤维细胞的活化和增殖在纤维化应答的发生中发挥关键作用。此外,这些肌成纤维细胞展现出独特的生物功能,包括参与细胞外基质形成的蛋白质例如不同形式的胶原蛋白、纤连蛋白和其他ECM蛋白的表达。α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达的诱导是休眠的成纤维细胞向活化的肌成纤维细胞分化的公认的标志,并且可用作生理读数来评估药物干扰纤维化过程的效力。肿瘤生长因子β、特别是肿瘤生长因子β1(TGFβ1),是诱导成纤维细胞表型转化成促纤维化的肌成纤维细胞的公认的生理信号,所述肌成纤维细胞表达高水平的α-SMA和高水平的细胞外基质蛋白,然后它们被分泌并形成纤维化瘢痕组织。
此外,已知成纤维细胞的增殖和活化造成几种构成细胞外基质的结缔组织组分(例如胶原蛋白、弹性蛋白、蛋白聚糖和透明质酸)的产生(Kendall和Feghali-Bostwick,2014)。
出人意料的是,NTZ及其活性代谢物TZ揭示出抗纤维化性质,因为这些化合物在TGFβ诱导的肝星状细胞和来自于其他器官的原代成纤维细胞中剂量依赖性地降低α-SMA水平。此外,使用NTZ或TZ处理也在TGFβ激活的大鼠HSC中阻遏胶原蛋白(Col1a1)表达,这证实了两种分子的抗纤维化性质。还使用CDAAc诱导的肝纤维化模型在体内证实了NTZ或其代谢物TZ的抗纤维化活性,其中的例证是肝胶原蛋白含量降低和纤维化面积减小。此外,在CCl4诱导的肝损伤模型中,显示了NTZ或其活性代谢物TZ可以阻止代表了胆汁淤积性疾病的标志物的循环胆汁酸水平的诱导。
按照本发明使用的NTZ、TZ和TZG分别具有下述式(I)、(II)和(III):
NTZ和TZ以它们的抗寄生虫和抗病毒活性著称,但现有技术没有教导NTZ、TZ和TZG具有抗胆汁淤积和抗纤维化效果。
本发明人以新的和创造性方式证实了这些化合物在胆汁淤积症或纤维化的治疗中具有治疗效果。
因此,本发明涉及化合物NTZ或TZ(G)或者NTZ或TZ(G)的可药用盐,其用于治疗胆汁淤积性或纤维化障碍的方法中。
另一方面,本发明涉及NTZ或TZ(G)或者NTZ或TZ(G)的可药用盐,其用于抑制成纤维细胞的增殖和/或活化。正如本领域中已知的,成纤维细胞负责细胞外基质的胶原蛋白纤维或其他结缔组织组分的生产。
根据本发明,术语“纤维化”、“纤维化疾病”、“纤维化障碍”及其衍生词表示纤维状结缔组织在器官或组织中过度沉积的病理状况。更具体来说,纤维化是一种病理过程,其包括作为对组织损伤的响应,持久性纤维化瘢痕形成和结缔组织过量生产细胞外基质。在生理上,结缔组织的沉积物可以毁灭下方器官或组织的结构体系和功能。
根据本发明,所述纤维化或纤维化障碍可以与任何器官或组织纤维化相关。特定器官纤维化的说明性而非限制性实例包括肝、内脏、肾、皮肤、表皮、内皮、肌肉、肌腱、软骨、心脏、胰腺、肺、子宫、神经系统、睾丸、阴茎、卵巢、肾上腺、动脉、静脉、结肠、肠(例如小肠)、胆道、软组织(例如纵隔或腹膜后腔)、骨髓、关节或胃的纤维化,特别是肝、肾、皮肤、表皮、内皮、肌肉、肌腱、软骨、心脏、胰腺、肺、子宫、神经系统、睾丸、卵巢、肾上腺、动脉、静脉、结肠、肠(例如小肠)、胆道、软组织(例如纵隔或腹膜后腔)、骨髓、关节或胃的纤维化。
根据本发明,术语“胆汁淤积症”或“胆汁淤积性疾病”或“胆汁淤积性障碍”及其衍生词表示由于肝细胞的分泌受损或通过肝内或肝外胆管的胆汁流动的堵塞造成的胆汁流量下降所定义的病理状况。因此,胆汁淤积症的临床定义是其中正常分泌到胆汁中的物质被潴留的任何病症。
在特定实施方式中,所述纤维化障碍选自肝、内脏、肺、心脏、肾、肌肉、皮肤、软组织(例如纵隔或腹膜后腔)、骨髓、肠和关节(例如膝、肩或其他关节)的纤维化。
在优选实施方式中,所述纤维化障碍选自肝、肺、皮肤、肾和肠的纤维化。
在本发明的更优选实施方式中,所治疗的纤维化障碍选自下述纤维化障碍的非穷举性名单:非酒精性脂肪性肝炎(NASH),肺纤维化,特发性肺纤维化,皮肤纤维化,眼纤维化,心内膜心肌纤维化,纵隔纤维化,骨髓纤维化,腹膜后纤维化,进行性大块纤维化(煤矿工人尘肺的并发症),增殖性纤维化,肿瘤性纤维化,慢性炎性气道疾病(COPD、哮喘、肺气肿、吸烟者的肺、肺结核)后继发的肺纤维化,酒精或药物诱导的肝纤维化,肝硬化,感染诱导的肝纤维化,辐射或化疗诱导的纤维化,肾源性系统性纤维化,克罗恩病,溃疡性结肠炎,瘢痕疙瘩,陈旧性心肌梗塞,硬皮病/系统性硬化症,关节纤维化,某些形式的粘连性囊炎,慢性纤维化胆管病变例如原发性硬化性胆管炎(PSC)和原发性胆汁性胆管炎(PBC),胆管闭锁,3型家族性肝内胆汁淤积症(PFIC3),植入物周围纤维化和石棉沉着病。
根据本发明的特定实施方式,所述胆汁淤积性疾病选自原发性胆汁性胆管炎(PBC)、原发性硬化性胆管炎(PSC)、妊娠期肝内胆汁淤积症、进行性家族性肝内胆汁淤积症、胆管闭锁、胆石症、感染性胆管炎、与朗格汉斯细胞组织细胞增多症相关的胆管炎、阿拉吉欧综合症、非综合征型胆管缺乏、药物诱导的胆汁淤积症和与全肠胃外营养相关的胆汁淤积症。在优选实施方式中,所述胆汁淤积性疾病是PBC或PSC,特别是PBC。
术语“治疗”是指在需要的对象中胆汁淤积性或纤维化障碍的治愈性或预防性治疗。所述治疗包括向具有所宣称的障碍的对象即患者给药所述化合物,特别是包含在药物组合物中的所述化合物,以治愈、延迟、逆转或减缓所述障碍的进展,由此改善所述对象的状况。治疗也可以被施用于健康或处于发生胆汁淤积性或纤维化障碍的风险中的对象,以预防或延迟所述障碍。
因此,根据本发明,纤维化障碍的治疗包括将NTZ或TZ(G)或其可药用盐或包含它们的药物组合物给药于具有所宣称的障碍的对象以治愈、延迟、逆转或减缓所述障碍的进展,由此改善所述患者的状况,或给药于健康对象,特别是处于发生胆汁淤积性或纤维化障碍的风险中的对象。
待治疗的对象是哺乳动物,优选为人类。可以在与胆汁淤积性或纤维化疾病相关的几种判据例如以前的药物治疗、相关病理、基因型、向风险因子的暴露、病毒感染的基础上,以及在可以利用成像方法和免疫学、生物化学、酶、化学或核酸检测方法来评估的任何相关生物标志物的检测的基础上选择本发明的待治疗对象。
NTZ或TZ的合成可以例如如Rossignol和Cavier,1975所述,或通过本领域技术人员已知的任何其他合成方式来进行。TZG可以例如按照本领域中已知的,例如下述文献中的合成方式来合成:Wadouachi 2011.S'agit-il de A Wadouachi,J Kovensky,“葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸和甘露糖醛酸的糖苷的合成:概述”(Synthesis of Glycosides ofGlucuronic,Galacturonic and Mannuronic Acids:An Overview),Molecules,2011,16(5),3933-3968。
在特定实施方式中,胆汁淤积性或纤维化障碍的治疗可以包括给药NTZ和TZ(G)两者或NTZ和TZ(G)的可药用盐的组合。根据这个实施方式的变化形式,NTZ和TZ(G)两者被一起包含在单一组合物中。
在这个实施方式的另一种变化形式中,NTZ和TZ(G)在疗法中用于同时、顺序或分开给药,因此可能被包含在不同组合物中。在顺序给药的情况下,NTZ可以在TZ(G)的给药之前给药,或者TZ(G)可以在NTZ给药之前给药。因此,本发明还涉及一种试剂盒,其包含(i)NTZ或其可药用盐或包含NTZ或其可药用盐的药物组合物;以及(ii)TZ(G)或其可药用盐或包含TZ(G)或其可药用盐的药物组合物,用于同时、顺序或分开给药。
NTZ或TZ(G)可以被配制成可药用盐,特别是与制药用途相容的酸或碱盐。NTZ和TZ(G)的盐包括可药用酸加成盐、可药用碱加成盐、可药用金属盐、铵盐和烷基化铵盐。这些盐可以在所述化合物的最终纯化步骤中获得,或通过将所述盐并入到以前纯化的化合物中获得。
另一方面,本发明涉及一种药物组合物,其包含选自NTZ或TZ(G)或者NTZ或TZ(G)的可药用盐的化合物,用于治疗胆汁淤积性或纤维化疾病的方法中。
所述包含NTZ或TZ(G)、特别是用于治疗胆汁淤积性或纤维化障碍的方法中的药物组合物,也可以包含一种或几种可药用赋形剂或介质(例如与制药用途相容并且本领域普通技术人员公知的盐水溶液、生理溶液、等渗溶液等)。
这些组合物也可以进一步包含选自分散剂、增溶剂、稳定剂、防腐剂等的一种或几种试剂或介质。可用于这些制剂(液体和/或注射剂和/或固体)的试剂或介质具体来说是甲基纤维素、羟甲基纤维素、羧甲基纤维素、聚山梨醇酯80、甘露糖醇、明胶、乳糖、植物油、阿拉伯树胶、脂质体等。
这些组合物可以被配制成可注射悬液、糖浆、凝胶、油、软膏、丸剂、片剂、栓剂、粉剂、凝胶帽、胶囊、气溶胶等的形式,最终利用盖伦剂型或装置,确保延长和/或缓慢释放。对于这种制剂来说,可以有利地使用试剂例如纤维素、碳酸盐或淀粉。
NTZ或TZ(G)可以通过不同途径并以不同形式给药。例如,所述化合物可以通过全身性方式、经口、肠胃外、通过吸入、通过鼻喷雾、通过鼻滴注或通过注射例如静脉内注射、通过肌肉内途径、通过皮下途径、通过透皮途径、通过表面途径、通过动脉内途径等给药。
当然,给药途径将按照本领域技术人员公知的程序改变以适应于NTZ或TZ(G)的形式。
在特定实施方式中,所述化合物被配制成片剂。在另一个特定实施方式中,所述化合物口服给药。
NTZ或TZ(G)或其可药用盐以治疗有效量给药。在本发明的情形中,术语“有效量”是指所述化合物的足以产生所需治疗效果的量。
与所述给药相关的频率和剂量可以由本领域普通技术人员根据患者、病理、给药形式等进行调整。通常,NTZ或TZ(G)可以以0.01mg/天至4000mg/天、例如50mg/天至2000mg/天、例如100mg/天至2000mg/天、特别是100mg/天至1000mg/天之间的剂量给药,用于治疗胆汁淤积性或纤维化疾病。在特定实施方式中,所述NTZ、TZ(G)或其可药用盐以约1000mg/天(即900至1100mg/天的剂量)、特别是以1000mg/天的剂量给药。在特定实施方式中,NTZ、TZ(G)或其可药用盐以约1000mg/天、特别是以1000mg/天的剂量口服给药,特别是作为片剂。给药可以每天进行,或者如有必要,甚至可以每天几次。在一个实施方式中,所述化合物每天给药至少一次,例如每天一次、每天两次或每天三次。在特定实施方式中,所述化合物每天给药一次或两次。具体来说,口服给药可以每天一次,在进餐期间,例如在早餐、午餐或晚餐期间,以约1000mg的剂量、特别是以1000mg的剂量通过服用包含所述化合物的片剂来进行。在另一个实施方式中,片剂被每天口服给药两次,例如在一次进餐期间以约500mg的剂量(即450至550mg的剂量)、特别是以500mg的剂量给药包含所述化合物的第一片剂,并在同一天的另一次进餐期间以约500mg的剂量、特别是以500mg的剂量给药包含所述化合物的第二片剂。
适合情况下,使用NTZ、TZ(G)或其可药用盐的治疗过程为期至少1周,特别是至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或24周或更长时间。具体来说,使用NTZ、TZ(G)或其可药用盐的治疗过程为期至少1年、2年、3年、4年或至少5年。
在特定实施方式中,本发明涉及在需要的患者中治疗胆汁淤积性或纤维化疾病,特别是肝纤维化,更特别是NASH后继发的肝纤维化,其包括向所述患者给药治疗有效量的NTZ或TZ(G)或者NTZ或TZ(G)的可药用盐,特别是以1000mg/天的剂量给药NTZ,特别是通过每天两次,特别是在两次不同进餐期间给药含有500mg NTZ的片剂。
在特定实施方式中,本发明涉及NTZ或TZ(G)或者NTZ或TZ(G)的可药用盐的用途,其用于与具有已知抗纤维化活性的至少一种其他治疗活性剂相组合来治疗胆汁淤积性或纤维化疾病。根据这个实施方式的变化形式,NTZ或TZ(G)可以与任何抗纤维化化合物相组合,例如吡非尼酮或受体酪氨酸激酶抑制剂(RTKI)例如尼达尼布、索拉非尼和其他RTKI,或血管紧张素II(AT1)受体阻断剂,或CTGF抑制剂,或对干扰TGFβ和BMP激活的途径易感的任何抗纤维化化合物,包括潜伏性TGFβ复合体的激活剂例如MMP2、MMP9、THBS1或细胞表面整合蛋白,I型TGFβ受体(TGFBRI)或II型TGFβ受体(TGFBRII)以及它们的配体例如TGFβ,激活素,抑制素,Nodal,抗苗勒氏管激素,GDF或BMP,辅助性共受体(也被称为III型受体),或SMAD依赖性经典途径的组分,包括调节性或抑制性SMAD蛋白,或SMAD不依赖性或非经典途径的成员,包括MAPK信号转导的各种不同分支、TAK1、Rho样GTP酶信号转导途径、磷脂酰肌醇-3激酶/AKT途径、TGFβ诱导的EMT过程或经典和非经典Hedgehog信号转导途径的成员,包括Hh配体或靶基因,或对影响TGFβ信号转导易感的WNT或Notch途径的任何成员。
因此,本发明还涉及一种药物组合物,其包含选自NTZ或TZ(G)或者NTZ或TZ(G)的可药用盐的化合物与具有已知抗纤维化活性的至少一种治疗活性剂的组合,所述治疗活性剂选自吡非尼酮或受体酪氨酸激酶抑制剂(RTKI)例如尼达尼布、索拉非尼和其他RTKI,或血管紧张素II(AT1)受体阻断剂,或CTGF抑制剂,或对干扰TGFβ和BMP激活的途径易感的任何抗纤维化化合物,包括潜伏性TGFβ复合体的激活剂例如MMP2、MMP9、THBS1或细胞表面整合蛋白,I型TGFβ受体(TGFBRI)或II型TGFβ受体(TGFBRII)以及它们的配体例如TGFβ,激活素,抑制素,Nodal,抗苗勒氏管激素,GDF或BMP,辅助性共受体(也被称为III型受体),或SMAD依赖性经典途径的组分,包括调节性或抑制性SMAD蛋白,或SMAD不依赖性或非经典途径的成员,包括MAPK信号转导的各种不同分支、TAK1、Rho样GTP酶信号转导途径、磷脂酰肌醇-3激酶/AKT途径、TGFβ诱导的EMT过程或经典和非经典Hedgehog信号转导途径的成员,包括Hh配体或靶基因,或对影响TGFβ信号转导易感的WNT或Notch途径的任何成员,用于治疗纤维化障碍的方法中。
在另一个特定实施方式中,也可以与NTZ或TZ(G)组合的其他类型的分子包括JAK/STAT抑制剂或其他抗炎和/或免疫抑制剂。这些药剂的非穷举性名单包括但不限于糖皮质激素、NSAIDS、环磷酰胺、亚硝基脲、叶酸类似物、嘌呤类似物、嘧啶类似物、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤、巯基嘌呤、环孢菌素、多球壳菌素、他克莫司、西罗莫司、霉酚酸衍生物、芬戈莫德和其他鞘氨醇-1-磷酸酯受体调节剂、针对靶例如促炎性细胞因子和促炎性细胞因子受体、T细胞受体、整合蛋白的单克隆和/或多克隆抗体。也可以与NTZ或TZ(G)组合的其他类型的分子包括可以潜在地增强NTZ或TZ(G)的暴露或效果的分子。
在另一个特定实施方式中,本发明涉及NTZ、TZ(G)或其可药用盐与具有已知抗纤维化活性的至少一种其他治疗活性剂、或与JAK/STAT抑制剂或其他抗炎和/或免疫抑制剂的组合。所述组合可以为单一药物组合物的形式,所述组合物包含所述不同的活性成分,包括NTZ、TZ(G)或其可药用盐。在一种变化形式中,所述组合是一种试剂盒,其包含NTZ、TZ(G)或其可药用盐和另一种活性成分例如另一种抗纤维化剂、JAK/STAT抑制剂或另一种抗炎或免疫抑制剂。所述试剂盒可用于同时、分开或顺序给药,用于治疗胆汁淤积性或纤维化障碍。
在另一个实施方式中,化合物NTZ或TZ(G)或者NTZ与TZ(G)的组合作为唯一活性成分给药。因此,本发明还涉及一种药物组合物,其包含选自NTZ或TZ(G)或者NTZ或TZ(G)的可药用盐或其混合物的化合物,用于治疗胆汁淤积性或纤维化障碍的方法中,其中所述化合物是所述组合物中仅有的活性成分。
在另一个实施方式中,本发明提供了治疗胆汁淤积性或纤维化疾病的方法,所述方法包括给药NTZ或TZ(G)或者NTZ或TZ(G)的可药用盐,特别是以含有NTZ或TZ的药物组合物的形式。
另一方面,本发明涉及一种试剂盒,其包含:
-硝唑尼特或硝唑尼特的可药用盐;以及
-替唑尼特或替唑尼特的可药用盐。
本发明的试剂盒的化合物被同时、分开或顺序给药,用于治疗纤维化障碍。
在另一个实施方式中,本发明提供了一种治疗胆汁淤积性和/或纤维化疾病的方法,所述方法包括每天两次向具有胆汁淤积性或纤维化疾病的有需要的患者(特别是NASH患者或具有肝纤维化的患者)给药含有500mg NTZ的片剂,特别是在进餐期间(例如在早餐、午餐或晚餐期间)。
参考下面的非限制性实施例进一步描述本发明。
实施例
材料和方法
化合物被溶解在二甲基亚砜(DMSO,Fluka cat#41640)中。硝唑尼特(INTERCHIMcat#RQ550U)和替唑尼特(INTERCHIM cat#RP253)商购获得。
hHSC培养
将人类原代肝星状细胞(hHSC)(Innoprot)在增补有2%胎牛血清(FBS,ScienCellcat#0010)、1%青霉素/链霉素(ScienCell cat#0503)和星状细胞生长增补剂(SteCGS;ScienCell cat#5352)的STeCM培养基(ScienCell cat#5301)中培养。细胞培养瓶用聚L-赖氨酸(Sigma cat#P4707)包被以获得更好的粘附。
使用TGF-β1活化hHSC
将人类原代肝星状细胞(hHSC)(Innoprot)在如上所述的标准条件下培养。随后将细胞以7x 104个细胞/孔的密度铺于24孔板中用于基因表达研究,并以2x 104个细胞/孔的密度铺于96孔板中用于通过ELISA测量α-SMA。第二天,将细胞培养基移除,并将细胞用PBS(Invitrogen cat#14190)洗涤。将hHSC在无血清且无SteCGS的培养基中剥夺24小时。对于使用NTZ或TZ的处理来说,将所述剥夺血清的hHSC与化合物预温育1小时,然后添加在无血清且无SteCGS的培养基中的促纤维生成刺激物TGFβ1(PeproTech cat#100-21,1ng/mL),另外温育24或48小时时长(时间点在图例中注明)。在处理结束时,将细胞用PBS(Invitrogen,cat#14190)洗涤,然后添加50μl裂解缓冲液(CelLyticTM MT试剂;Sigma#C3228)。然后使用板振荡仪将板在冰上温育30分钟,然后在-20℃下储存。
使用TGFβ1活化大鼠HSC:
将大鼠原代肝星状细胞(rHSC)(Innoprot)在增补有2%胎牛血清(FBS,ScienCellcat#0010)、1%青霉素/链霉素(ScienCell cat#0503)和星状细胞生长增补物(SteCGS;ScienCell cat#5352)的STeCM培养基(ScienCell cat#5301)中培养。对于使用TGFβ1的激活实验来说,将rHSC以10x103个细胞/孔的密度铺于96孔板中。第二天,将细胞培养基移除,并将细胞用PBS(Invitrogen cat#14190)洗涤。将rHSC在无血清且无SteCGS的培养基中剥夺24小时。对于使用NTZ或TZ的处理来说,将所述剥夺血清的rHSC与化合物预温育1小时,然后添加在无血清且无SteCGS的培养基中的促纤维生成刺激物TGFβ1(PeproTech cat#100-21,3ng/mL),另外温育48小时时长。在处理结束时,将细胞用PBS(Invitrogen,cat#14190)洗涤,然后添加50μl裂解缓冲液(CelLyticTM MT试剂;Sigma#C3228)。然后使用板振荡仪将板在冰上温育30分钟,然后在-20℃下储存。
使用TGFβ1活化NHLF
将正常人类肺成纤维细胞(NHLF)(Lonza)在增补有FGM-2SingleQuotsTM试剂盒(Lonza cat#CC-3132)的成纤维细胞基础培养基(FBM)(Lonza cat#CC-3131)中培养。所述完整的培养基含有2%胎牛血清。对于使用TGFβ1的激活实验来说,将NHLF以5x103个细胞/孔的密度铺于96孔板中。第二天,将细胞培养基移除,并将细胞用PBS(Invitrogen cat#14190)洗涤。将NHLF在无血清、无胰岛素且无rhFGF-B的培养基中剥夺24小时。对于使用NTZ或TZ的处理来说,将所述剥夺血清的NHLF与化合物预温育1小时,然后添加在无血清、无胰岛素且无rhFGF-B的培养基中的促纤维生成刺激物TGFβ1(PeproTech cat#100-21,1ng/mL),另外温育48小时时长。在处理结束时,将细胞用PBS(Invitrogen,cat#14190)洗涤,然后添加50μl裂解缓冲液(CelLyticTM MT试剂;Sigma#C3228)。然后使用板振荡仪将板在冰上温育30分钟,然后在-20℃下储存。
使用TGFβ1活化NHCF-V:
正常人类心脏成纤维细胞(心室)(NHCF-V)(Lonza)从正常成年人心脏组织分离。将细胞在增补有FGMTM-3 BulletKitTM 试剂盒(Lonza cat#CC-4525)的成纤维细胞基础培养基(FBM)(Lonza cat#CC-3131)中培养。所述完整的培养基含有10%胎牛血清。对于使用TGFβ1的激活实验来说,将NHCF-V以6x103个细胞/孔的密度铺于96孔板中。第二天,将细胞培养基移除,并将细胞用PBS(Invitrogen cat#14190)洗涤。将NHCF在无血清、无胰岛素且无rhFGF-B的培养基中剥夺24小时。对于使用NTZ或TZ的处理来说,将所述剥夺血清的NHCF与化合物预温育1小时,然后添加在无血清、无胰岛素且无rhFGF-B的培养基中的促纤维生成刺激物TGFβ1(PeproTech cat#100-21,3ng/mL),另外温育48小时时长。在处理结束时,将细胞用PBS(Invitrogen,cat#14190)洗涤,然后添加50μl裂解缓冲液(CelLyticTM MT试剂;Sigma#C3228)。然后使用板振荡仪将板在冰上温育30分钟,然后在-20℃下储存。
使用TGFβ1活化InMyoFib:
将人类肠肌成纤维细胞(InMyoFib)(Lonza)在增补有SmGMTM-2BulletKit TM(Lonza cat#CC-4149)的平滑肌细胞基础培养基(SmBM-2TM)(Lonza cat#CC-3181)中培养。所述完整的培养基含有5%胎牛血清。对于使用TGFβ1的激活实验来说,将inMyoFib以10x103个细胞/孔的密度铺于96孔板中。第二天,将细胞培养基移除,并将细胞用PBS(Invitrogen cat#14190)洗涤。将InMyoFib在无血清、无胰岛素且无rhFGF-B的培养基中剥夺24小时。对于使用NTZ或TZ的处理来说,将所述剥夺血清的InMyoFib与化合物预温育1小时,然后添加在无血清、无胰岛素且无rhFGF-B的培养基中的促纤维生成刺激物TGFβ1(PeproTech cat#100-21,3ng/mL),另外温育48小时时长。在处理结束时,将细胞用PBS(Invitrogen,cat#14190)洗涤,然后添加50μl裂解缓冲液(CelLyticTM MT试剂;Sigma#C3228)。然后使用板振荡仪将板在冰上温育30分钟,然后在-20℃下储存。
α-SMA ELISA
使用夹心ELISA来测量α-SMA的水平。简单来说,首先将ELISA板的孔用捕获抗体(小鼠抗ACTA2单克隆抗体,Abnova)在4℃下包被过夜。在PBS+0,2%Tween 20中洗涤3次后,添加由PBS+0.2%BSA构成的阻断溶液1小时,随后进行另一个洗涤循环。将细胞裂解物转移到孔中,用于在室温下与捕获抗体结合2h时长。在所述洗涤程序后,添加检测抗体(生物素化的小鼠抗ACTA2单克隆抗体,Abnova),在室温下2小时,然后进行3次洗涤。为了进行检测,首先施加HRP偶联的链亲和素(R&D Systems cat#DY998),在室温下30min。在洗涤后,添加HRP底物TMB(BD,#555214),并在暗处在室温下温育7min。一旦氧化后,TMB形成水溶性蓝色反应产物,其在添加硫酸(终止溶液)后变成黄色,能够使用分光光度计在450nm处准确测量强度。显出的颜色与所述裂解物中存在的α-SMA的量成正比。
基因表达
使用96RNA(Macherey Nagel),按照制造商的说明书分离总RNA。使用M-MLV RT(莫洛尼鼠类白血病病毒反转录酶)(Invitrogen cat#28025),在1X RT缓冲液(Invitrogen)、1mM DTT(Invitrogen)、0.18mM dNTP(Promega)、200ng pdN6(Amersham)和30U RNase抑制剂(Promega)中将总RNA(对于体外样品来说500ng)反转录成cDNA。
然后使用MyiQ单色实时PCR检测系统(Biorad)进行定量PCR。简单来说,PCR反应以96孔板格式,在含有1μL反转录反应、0.5μL反向和正向引物(各10pmol)和12,5μl 2X iQSYBR Green Supermix(BioRad,1725006CUST)的25ul总体积中进行。表1中示出了引物的序列。
表1:人类引物
在人类样品中,使用36B4基因的表达作为参比对表达水平进行归一化。
对于每种基因来说,通过选择最佳点(至少3个点)绘制标准曲线,以便具有接近100%的PCR反应效率和接近1的相关系数。使用管家基因和靶基因两者的标准曲线方程来确定表达水平(将每种靶基因的特异性PCR效率考虑在内)。
在长期CDAAc饮食诱导的肝纤维化模型中评估NTZ
在CDAAc饮食诱导的实验性肝纤维化的鼠类模型中评估NTZ的抗纤维化效果。将6周龄C57BL/6小鼠喂食对照(CSAA)饮食、CDAA饮食或增补有NTZ 10mg/kg/天的CDAAc饮食共12周。
每周两次监测体重和食物摄入量。在处理的最后一天,在6h禁食期后将小鼠处死。将肝快速切下用于生物化学和组织学研究。
所有动物程序按照标准流程进行,并符合实验室动物正确护理和使用的标准推荐方案。
在CCl4诱导的肝损伤模型中评估NTZ
在CCl4诱导的肝损伤的大鼠模型中评估NTZ的抗纤维化效果。
将OFA S;Dawley大鼠(初始体重250-275g)按照它们的体重随机分成4组并处理3周。大鼠每周两次用橄榄油(对照组)或用在橄榄油中乳化的CCl4(CCl4:橄榄油1:2v/v,CCl4终浓度:2ml/kg)进行腹膜内注射。同时,将橄榄油注射组置于对照饮食下,而将CCl4注射组置于对照饮食或增补有NTZ的饮食下。准备2种含有NTZ的方案,分别对应于10或30mg/kg/天的暴露量。在处理的最后一天,在6h禁食期后将大鼠处死。收集血液样品并分离血清用于生物化学分析。
在胆汁淤积症的DDC模型中评估NTZ:
对C57BL/6小鼠喂食增补有0,1%DDC的饮食或含有NTZ 100mg/kg/天的增补有0.1%DDC的饮食或标准小鼠饮食(Ssniff)共8周。在处理的最后一天,在6h禁食期后将小鼠处死。获取血液样品用于生物化学分析,并将肝快速切下用于生物化学和组织学研究。
在长期CCl4诱导的肝纤维化模型中评估NTZ
将9周龄C57BL/6小鼠置于对照饮食或增补有NTZ的饮食下共6周。准备2种含有NTZ的方案,分别对应于NTZ 30或100mg/kg/天的暴露量。同时,并且对于6周的总持续时间来说,通过口服管饲法将小鼠每周3次用溶解在橄榄油中的CCl4或介质进行处理。CCl4的量从0.875ml/kg逐渐提高到2.5ml/kg。在处理的最后一天,在6h禁食期后将小鼠处死。收集血液样品用于血清的生物化学分析。将肝快速切下用于生物化学、组织学和表达研究。
组织学
组织包埋和切片:
将肝切片首先在4%甲醛溶液中固定12小时。然后将所述肝片在PBS中洗涤30分钟,并在乙醇溶液中脱水(在70、80、95和100%乙醇中相继浸泡)。将所述肝片在三个不同的二甲苯浴(Sigma-Aldrich cat#534056)中温育,然后在两个液体石蜡浴中温育(56℃)。然后将肝片置于架子中,用轻柔填充以完全覆盖所述组织。
从架子中取出含有所述组织片的石蜡块并在室温下储存。将所述肝块切成3μm切片。
天狼猩红染色
将肝切片脱石蜡、重新水合并在Fast Green FCF 0.1%(Sigma-Aldrich,cat#F7258)溶液中温育15分钟,然后在0.5%乙酸(Panreac,cat#131008.1611)溶液中漂洗。将所述肝切片在水中漂洗,并在含0.1%天狼猩红(Direct Red 80,Fluka cat#43665)的饱和苦味酸(Sigma-Aldrich cat#P6744)水溶液中温育30分钟。最后将所述肝切片脱水,并使用CV固定介质(Leica,cat#14046430011)固定。
组织学检查
肝样本的身份对于检查者来说是不知情的。使用来自于3D Histech的Pannoramic250扫描仪产生虚拟切片。使用Quant Center软件(3D Histech,包括Pattern Quant和Histo Quant模块)来定量胶原蛋白染色面积。简单来说,使用Pattern Quant来检测相关组织结构并测量表面。然后,使用Histo Quant在颜色阈值方法的基础上检测染色的胶原蛋白含量,并用于总面积和百分率的测量。纤维化面积被表示为胶原蛋白表面在整个组织上的百分率。
肝胶原蛋白含量的测量
使用适合的QuickZyme试剂盒(总胶原蛋白测定法,cat#QZB-totcol2)来确定肝胶原蛋白含量。所述测定法是基于羟脯氨酸的检测,所述羟脯氨酸是一种非蛋白质氨基酸,主要存在于胶原蛋白的三螺旋中。因此,组织水解物中的羟脯氨酸可用作组织中存在的胶原蛋白的量的直接度量(不在前胶原蛋白、成熟胶原蛋白和胶原蛋白降解产物之间作出区分)。
在对羟脯氨酸进行定量之前,需要在95℃下在6M HCl中将组织样品完全水解。所述测定法导致在570nm处具有最大吸光度的发色体的生成。结果被表示成mg胶原蛋白/g肝。
在BDL模型中评估NTZ
对大鼠进行手术胆管结扎,以便诱导肝外胆汁淤积症并随后诱导肝纤维化。在2周的恢复期后,将动物用NTZ以30或100mg/kg/天的剂量处理1或2周。在处理的最后一天,将小鼠在6h禁食期后处死。收集血液样品,用于血清的生物化学分析。将肝快速切下,用于生物化学、组织学和表达研究。
血浆的总胆汁酸浓度的测量
使用用于Daytona自动分析仪的适合的Randox试剂盒(Randox,cat#BI 3863)来确定血浆的总胆汁酸(TBA)浓度。在硫代NAD存在下,3-α-羟基类固醇脱氢酶(3-αHSD)将胆汁酸转变成3-酮基类固醇和硫代NADH。所述反应是可逆的,并且3-αHSD可以将3-酮基类固醇和硫代NADFH转变成胆汁酸和硫代NAD。在过量NADH存在下,酶的循环高效发生,并通过测量在405nm处的吸光度的具体变化来确定硫代NADH的形成速率。结果以μmol/L为单位表示。
结果和结论:
分化的肌成纤维细胞的异常存留是许多纤维化疾病的特征。在肝损伤后,休眠的HSC经历活化的过程,其以分化成α-SMA阳性的肌成纤维细胞为特征。在寻找新的抗纤维化分子的尝试中,在用促纤维发生的细胞因子TGFβ1活化的人类HSC的模型中对FDA批准药物的文库进行表型筛选。作为纤维化病变的标志的α-SMA的水平被用于评估所述药物干扰纤维化过程的效力。所述筛选活动导致鉴定了硝唑尼特(NTZ),其在TGFβ诱导的HSC中剂量依赖性地降低α-SMA的水平。总的来说,NTZ表现出包含在0.1至3μM之间的IC50(图1A)。由于已知NTZ被快速水解成活性代谢物替唑尼特(TZ)(Broekhuysen,Stockis等,2000),因此也在HSC中评估了这种代谢物的抗纤维化活性。TZ显示出与母体药物相似的概貌,其中IC50在0.1至3μM之间(图1B)。TGFβ刺激的其他标志物被两种化合物降低,包括细胞外基质胶原蛋白1A1(COL1A1)(图2)。毒性测定证实了α-SMA水平的降低不是由毒性或HSC的凋亡造成的(数据未示出)。
NTZ和TZ也在TGFβ激活的源自于大鼠的HSC中降低α-SMA水平(图3)。此外,NTZ和TZ的抗纤维化潜力被扩展到源自于其他组织的成纤维细胞,包括正常人类肺成纤维细胞(NHLF)(图4)、正常人类心脏成纤维细胞(图5)和人类肠肌成纤维细胞(InMyoFib)(图6)。在所有这些纤维化模型中,NTZ和TZ在1μM浓度下显示出显著的抗纤维化效果。
在CDAA胆固醇饮食诱导的实验性肝纤维化模型中评估了NTZ的体内功效。10mg/kg/天的硝唑尼特的长期口服给药证实了抗纤维化性质,这是由显著较低的肝胶原蛋白含量(图7)和组织学检查所发现的减小的肝纤维化面积(图8)所反映的。
在CCl4诱导的肝损伤的体内模型中,NTZ阻止与胆汁淤积症相关的标志物(Chang2013)、即循环TBA浓度的病理性提高(图9)。
总而言之,本申请人发现了抗寄生虫剂NTZ的出人意料的抗纤维化和抗胆汁淤积活性。这些结果证实了NTZ和/或其活性代谢物TZ可以在胆汁淤积性疾病和多种类型的纤维化疾病中提供治疗益处。
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序列表
<110> 基恩菲特公司(GENFIT)
<120> 胆汁淤积性和纤维化疾病的治疗方法
<130> B2223PC00
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 1
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<210> 2
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<211> 19
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gccaggagaa ccagcagag 19
Claims (16)
1.选自硝唑尼特、替唑尼特和替唑尼特葡萄糖醛酸苷以及硝唑尼特、替唑尼特或替唑尼特葡萄糖醛酸苷的可药用盐的化合物在制备用于治疗原发性胆汁性胆管炎、原发性硬化性胆管炎、或者选自肺纤维化、肠纤维化、肝纤维化和心脏纤维化的纤维化障碍的药物中的用途。
2.权利要求1的用途,其中所述化合物选自硝唑尼特和替唑尼特以及硝唑尼特或替唑尼特的可药用盐。
3.权利要求1的用途,其中所述化合物被包含在药物组合物中。
4.权利要求1的用途,其中所述肺纤维化为特发性肺纤维化。
5.选自硝唑尼特、替唑尼特和替唑尼特葡萄糖醛酸苷以及硝唑尼特、替唑尼特或替唑尼特葡萄糖醛酸苷的可药用盐的化合物在制备用于治疗非酒精性脂肪性肝炎、心内膜心肌纤维化、骨髓纤维化、腹膜后纤维化、进行性大块纤维化、慢性炎性气道疾病后继发的肺纤维化、酒精或药物诱导的肝纤维化、肝硬化、感染诱导的肝纤维化、克罗恩病、溃疡性结肠炎、陈旧性心肌梗塞或石棉沉着病的药物中的用途。
6.权利要求5的用途,其中所述慢性炎性气道疾病选自COPD、哮喘、肺气肿、吸烟者的肺和肺结核。
7.权利要求1至6任一项的用途,其中所述化合物与具有已知抗纤维化活性的至少一种治疗活性剂相组合使用,所述治疗活性剂选自吡非尼酮或受体酪氨酸激酶抑制剂,或血管紧张素II受体阻断剂,或结缔组织生长因子抑制剂,或对干扰TGFβ和骨形态发生蛋白激活的途径易感的任何抗纤维化化合物,I型TGFβ受体或II型TGFβ受体以及它们的配体,激活素,抑制素,Nodal蛋白,抗苗勒氏管激素,生长分化因子或骨形态发生蛋白,辅助性共受体,或SMAD依赖性经典途径的组分,或SMAD不依赖性或非经典途径的成员。
8.权利要求7的用途,其中所述治疗活性剂选自尼达尼布、索拉非尼和其他受体酪氨酸激酶抑制剂,以及潜伏性TGFβ复合体的激活剂。
9.权利要求8的用途,其中所述潜伏性TGFβ复合体的激活剂为MMP2、MMP9、THBS1或细胞表面整合蛋白。
10.权利要求7的用途,其中I型TGFβ受体或II型TGFβ受体的配体为TGFβ。
11.权利要求7的用途,其中所述SMAD依赖性经典途径的组分为调节性或抑制性SMAD蛋白。
12.权利要求7的用途,其中所述SMAD不依赖性或非经典途径的成员选自MAPK信号转导的各种不同分支、TAK1、Rho样GTP酶信号转导途径、磷脂酰肌醇-3激酶/AKT途径、TGFβ诱导的EMT过程或经典和非经典Hedgehog信号转导途径的成员,或对影响TGFβ信号转导易感的WNT或Notch途径的任何成员。
13.权利要求12的用途,其中所述经典和非经典Hedgehog信号转导途径的成员包括Hh配体或靶基因。
14.权利要求1至6任一项的用途,其中所述化合物与选自JAK/STAT抑制剂、其他抗炎和/或免疫抑制剂的至少一种治疗活性剂相组合使用。
15.权利要求14的用途,其中所述治疗活性剂选自糖皮质激素、NSAIDS、环磷酰胺、亚硝基脲、环孢菌素、多球壳菌素、他克莫司、西罗莫司、芬戈莫德和其他鞘氨醇-1-磷酸酯受体调节剂、针对促炎性细胞因子和促炎性细胞因子受体、T细胞受体、整合蛋白的单克隆和/或多克隆抗体。
16.权利要求14的用途,其中所述治疗活性剂选自甲氨蝶呤、硫唑嘌呤和巯基嘌呤。
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