CN117838690A - 一种治疗以ampk激活为治疗靶点的疾病的复方药物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种治疗以AMPK激活为治疗靶点的疾病的复方药物及其应用。本发明通过研究发现硝唑尼特和/或替唑尼特与MK8722组成复方药物，不但可以利用硝唑尼特和/或替唑尼特抑制MK8722诱导的心肌细胞肥大、心肌糖原蓄积、心脏功能下降，抑制其不良反应，还可以通过硝唑尼特和/或替唑尼特与MK8722合用增强AMPK激活作用，增强对以AMPK激活为治疗靶点的疾病的治疗作用，同时，可以降低二者使用剂量，进一步减少可能的副作用。因此，硝唑尼特和/或替唑尼特与MK8722组成的复方可以用于以AMPK激活为治疗靶点的疾病的治疗，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及复方药物的应用，特别涉及一种治疗以AMPK激活为治疗靶点的疾病的复方药物及其应用。
背景技术
AMPK(Adenosine 5’-monophosphate(AMP)-activated protein kinase，AMP依赖的蛋白激酶)是一种蛋白激酶，AMPK激活是多种疾病治疗的靶点，包括糖尿病、脂代谢异常、代谢综合症、脂肪肝、肥胖、胰岛素抵抗、高血压、炎症、炎症性肠病、心肌肥厚和心衰、动脉粥样硬化、衰老、神经肌肉性疾病、肾病、疼痛等疾病的治疗，因此能增强AMPK激活作用即增加以上疾病的治疗作用。MK8722是一种AMPK直接激活剂，但其缺陷是诱发心肌肥厚和心肌糖原蓄积的严重不良反应，限制其进一步开发使用，例如现有文献(Myers RW,etal.Science.2017；357(6350):507-511)中报道MK8722在治疗糖尿病时出现心肌肥大和心脏糖原蓄积，而且给药一个月后就会出现，严重制约了MK8722在治疗糖尿病、脂肪肝等疾病中应用以及临床推进。硝唑尼特是一种抗寄生虫药，临床用于隐孢子虫和肠贾第鞭毛虫引起的腹泻。
发明内容
发明目的：针对MK8722作为AMPK激活剂在治疗糖尿病、脂肪肝或者代谢综合症时存在心肌肥厚和心脏糖原蓄积的缺陷，本发明提供硝唑尼特和/或替唑尼特与MK8722的组合复方药物在制备治疗以AMPK激活为治疗靶点的疾病药物中的应用，本发明中复方药物不仅可以抑制MK8722诱发的心肌肥厚、心脏糖原蓄积和心脏功能下降，同时增强AMPK激活作用，可以联合用于治疗糖尿病、脂肪肝、代谢综合症等疾病，体现了复方药物减毒增效的目的。
本发明还提供一种治疗以AMPK激活为治疗靶点的疾病的组合复方药物。
技术方案：为了实现以上技术目的，本发明提供硝唑尼特和/或替唑尼特与MK8722组成复方药物在制备治疗以AMPK激活为治疗靶点的疾病的药物中的应用，其中硝唑尼特的化学结构式如式I所示：
替唑尼特的化学结构式如式II所示：
MK8722的化学结构式如式III所示：
其中，所述硝唑尼特和/或替唑尼特与MK8722组成复方药物及其药学上可接受的盐或者溶剂化物在制备以AMPK激活为治疗靶点的疾病的药物中的应用。
其中，所述药学上可接受的盐为化合物与金属离子或药学上可接受的胺或铵离子形成的盐。
其中，所述金属离子包括钠、钾或钙离子，所述胺离子包括乙二胺或氨丁三醇。
其中，所述以AMPK激活为治疗靶点的疾病包括糖、脂代谢异常、代谢综合症、糖尿病、脂肪肝、肥胖、胰岛素抵抗、高血压、炎症、炎症性肠病、心肌肥厚和心衰、动脉粥样硬化、衰老、神经肌肉性疾病、肾病、疼痛。
其中，所述硝唑尼特和/或替唑尼特和MK8722组合复方药物中硝唑尼特和MK8722的质量比为75～150:1～10。
作为优选，所述硝唑尼特和/或替唑尼特和MK8722组合复方药物中硝唑尼特和MK8722的质量比为75～150:5～10。
本发明所述硝唑尼特和/或替唑尼特与MK8722组成复方药物在制备治疗糖尿病、脂肪肝或者代谢综合症，并且同时避免MK8722诱导的心肌细胞肥大、心肌糖原蓄积的药物中的应用。
具体例如在硝唑尼特和/或替唑尼特与MK8722组成复方药物在治疗糖尿病时避免MK8722诱导的心肌细胞肥大、心肌糖原蓄积；在治疗脂肪肝时避免MK8722诱导的心肌细胞肥大、心肌糖原蓄积；在治疗代谢综合症时避免MK8722诱导的心肌细胞肥大、心肌糖原蓄积。
本发明所述硝唑尼特和/或替唑尼特可用于制备治疗糖原蓄积性心肌病药物中的应用。
本发明所述治疗以AMPK激活为治疗靶点的疾病的组合复方药物，包括硝唑尼特和/或替唑尼特与MK8722。
作为优选，所述硝唑尼特与MK8722组合复方药物中硝唑尼特与MK8722的质量比为包括：150:10，100:10，75:10，150:5，100:5，75:5。
作为优选，所述硝唑尼特与MK8722以质量比为150:10。
其中，所述硝唑尼特和/或替唑尼特与MK8722的组合复方药物或其药学上可接受的盐或溶剂化物作为活性成分和药学上可接受的载体。
其中，所述复方药物的剂型为胶囊剂、散剂、片剂、颗粒剂、丸剂、注射剂、糖浆剂、口服液、吸入剂、软膏剂、栓剂或贴剂。
本发明通过研究发现，在细胞水平上，硝唑尼特的代谢物替唑尼特可抑制MK8722诱导的心肌细胞肥大和心肌糖原蓄积；同时，替唑尼特合用MK8722的AMPK激活作用显著强于替唑尼特和MK8722单用。而在动物水平，口服给予硝唑尼特可显著抑制MK8722诱发的小鼠心肌肥厚、心肌糖原增加、心脏功能下降，并增强心肌组织MK8722诱导的AMPK的激活。进一步地，采用db/db肥胖小鼠模型，证明口服给予硝唑尼特、MK8722可改善db/db小鼠的肝脏脂肪沉积，而联合给予硝唑尼特和MK8722的改善肝脏脂质蓄积和病理变化的作用显著优于硝唑尼特、MK8722单独给药，几乎完全纠正db/db小鼠肝脏脂质蓄积和病理变化；并且，在db/db小鼠中，单独给与MK8722组小鼠出现明显心脏肥大，而MK8722联合使用硝唑尼特则无心脏肥大表现。因此本发明提出硝唑尼特和/或替唑尼特与MK8722组成复方药物，一方面，硝唑尼特和/或替唑尼特抑制MK8722在治疗糖尿病等疾病时诱导的心肌细胞肥大、心肌糖原蓄积、心脏功能下降，抑制其不良反应；另一方面，硝唑尼特和/或替唑尼特与MK8722合用增强AMPK激活作用，增强对以AMPK激活为治疗靶点的疾病如糖尿病、高血脂、脂肪肝、代谢综合症等疾病的治疗作用，更为重要的是：二者的联用可以降低二者使用剂量，进一步减少可能的副作用。因此，硝唑尼特和/或替唑尼特与MK8722组成的复方可以用于以AMPK激活为治疗靶点的疾病的治疗，具有广阔的应用前景。
本发明实验发现MK8722和硝唑尼特或其代谢物替唑尼特联用可显著协同增强AMPK激活，同时硝唑尼特和/或替唑尼特又可以抑制MK8722诱发的心肌肥大、心肌糖原蓄积、心脏功能下降等心脏不良反应，因此本发明提出硝唑尼特和/或替唑尼特与MK8722组成复方药物用于以AMPK激活为治疗靶点的疾病的治疗的应用。
本发明首先通过小鼠原代心肌细胞培养，给与MK8722处理，发现MK8722诱导心肌细胞肥大和心肌细胞糖原蓄积，硝唑尼特体内代谢物替唑尼特联合MK8722处理后，发现替唑尼特抑制MK8722诱导的心肌细胞肥大(图1)和心肌细胞糖原蓄积(图2)；同时发现，替唑尼特合用MK8722显著激活AMPK，其作用显著强于替唑尼特和MK8722同剂量单独使用(图3)。进而进行体内实验，灌胃给予小鼠MK8722(10mg/kg)40天，可见小鼠心肌肥大、心肌糖原蓄积、心脏功能下降；而同时灌胃给予硝唑尼特(150mg/kg)可显著抑制MK8722诱导的心肌肥大(图4)、心肌糖原蓄积(图5)和心脏功能下降(图6)；进而测定心肌组织AMPK活性，可见硝唑尼特合用MK8722组的心肌组织AMPK活性显著高于MK8722组(图7)。进一步测定了骨骼肌和肝脏组织中AMPK活性。MK8722组小鼠骨骼肌组织AMPK活性增加，MK8722+硝唑尼特组中，硝唑尼特(150mg/kg)显著增强MK8722诱导的小鼠骨骼肌组织AMPK激活作用，且合用显著强于硝唑尼特和MK8722单独给药(图8)。MK8722组小鼠肝脏组织AMPK活性增加，MK8722+硝唑尼特组中，硝唑尼特(150mg/kg)显著增强MK8722诱导的小鼠肝脏组织AMPK激活作用，且合用强于硝唑尼特和MK8722单独给药(图9)。
同时，采用db/db肥胖小鼠模型，分为db/db模型组，db/db+MK8722组(灌胃给予小鼠MK8722(10mg/kg))，db/db+硝唑尼特组(灌胃给予硝唑尼特(150mg/kg))，db/db+硝唑尼特+MK8722组(灌胃给予硝唑尼特(150mg/kg)和MK8722(10mg/kg))，同时以同周龄野生型小鼠为对照。给药20天后，取肝脏进行HE染色和油红O染色。HE染色可见db/db模型组小鼠肝脏存在大量圆形脂滴空泡(病理处理过程中脂滴溶解，显示空白)，此外肝细胞表现水性样变；单独给予硝唑尼特、MK8722的db/db小鼠肝脏空泡有一定的改善，而联合给予硝唑尼特和MK8722的db/db小鼠肝脏空泡和肝细胞水性样变更加显著改善，明显优于硝唑尼特、MK8722单独给药(图10)。油红O染色显示db/db模型组小鼠肝脏存在大量红染脂滴，单独给予硝唑尼特、MK8722的db/db小鼠肝脏红染脂滴可以有效减少，而联合给予硝唑尼特和MK8722可进一步显著减少肝脏脂质蓄积，几乎完全纠正肝脏脂质蓄积(图11)。在db/db小鼠中，单独给与MK8722组小鼠出现明显心脏肥大，而MK8722联合使用硝唑尼特则无心脏肥大表现(图12)，同时在db/db小鼠中，MK8722联合使用硝唑尼特则无心脏肥大表现，也不会导致心脏糖原水平增加。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明首次提出了硝唑尼特和/或替唑尼特可抑制MK8722诱发的心肌肥大、心肌糖原蓄积、心脏功能下降等心脏不良反应；首次提出硝唑尼特和/或替唑尼特与MK8722组成复方可增强AMPK激活作用，提高以AMPK激活为治疗靶点的疾病如糖尿病、脂代谢异常、代谢综合症、糖尿病、脂肪肝、肥胖、胰岛素抵抗、高血压、炎症、炎症性肠病、心肌肥厚和心衰、动脉粥样硬化、衰老、神经肌肉性疾病、肾病、疼痛等的治疗作用同时有效避免了MK8722治疗时出现的心肌肥大和心脏糖原蓄积等副作用；充分体现了复方药物减毒增效的目的。此外，本发明还提出硝唑尼特和/或替唑尼特可用于制备治疗糖原蓄积性心肌病药物中的应用，并且效果显著。
附图说明：
图1为硝唑尼特体内代谢物替唑尼特抑制MK8722诱导的原代小鼠心肌细胞肥大，(A)心肌细胞鬼笔环肽染色代表照片，采用鬼笔环肽(phalloidin)染色心肌细胞肌动蛋白观察心肌细胞大小；图中方框部分做了放大，可见MK8722处理后心肌细胞肌丝变得稀疏、面积增大；(B)心肌细胞面积统计结果；可见MK8722诱导细胞面积增大，MK8722诱导的细胞面积增大可被替唑尼特所抑制。n＝12，12个面积值/组，每个值是每组1张照片的细胞面积平均值；**P<0.01vs.CTL；##P<0.01vs.MK8722.；(C)心肌肥厚标志蛋白ANP,BNP,β-MHC的western blot代表图；(D)心肌肥厚标志蛋白ANP,BNP,β-MHC的统计结果；n＝6.*P<0.05,**P<0.01vs.CTL；#P<0.05,##P<0.01vs.MK8722.Tiz,tizoxanide,替唑尼特。
图2为硝唑尼特体内代谢物替唑尼特抑制MK8722诱导的原代小鼠心肌细胞糖原蓄积；(A)药物作用原代培养心肌细胞24小时后，采用PAS染色法(Periodic Acid-Schiffstain)染色糖原，各组代表染色照片；(B)PAS染色的统计结果，n＝6,**P<0.01,vs CTL；##P<0.01 vs MK8722，Tiz,tizoxanide,替唑尼特；(C)药物作用乳鼠原代心肌细胞24小时后采用糖原检测试剂盒检测糖原含量并通过细胞计数校正，n＝6,**P<0.01,vs CTL；##P<0.01vs MK8722，Tiz,tizoxanide,替唑尼特。
图3为硝唑尼特体内代谢物替唑尼特联合MK8722对小鼠原代心肌细胞AMPK激活具有增强作用；(A)MK8722(1-5μM)剂量依赖性激活小鼠原代心肌细胞AMPK，n＝6*P<0.05,**P<0.01 vs CTL；(B)替唑尼特(2-10μM)剂量依赖性激活小鼠原代心肌细胞AMPK，n＝6**P<0.01 vs CTL；(C)MK8722(1μM)和替唑尼特(2μM)单独无AMPK激活作用，但MK8722(1μM)联合替唑尼特(2μM)显著激活小鼠原代心肌细胞AMPK，n＝12**P<0.01；(D)MK8722(3μM)联合替唑尼特(5μM)显著激活小鼠原代心肌细胞AMPK，联合作用显著强于各药单独使用，n＝12**P<0.01；##P<0.01，Tiz,tizoxanide(替唑尼特)。
图4为硝唑尼特(150mg/kg)灌胃给药抑制MK8722(10mg/kg,p.o)诱导的小鼠心肌肥厚；(A)各组小鼠体重和胫骨长度结果，n＝15.(B)各组小鼠心脏重量，心脏重量系数(HW/BW)和心脏胫骨系数(HW/TL)结果，n＝15,**P<0.01,vs CTL；##P<0.01 vs MK8722；(C,D)心肌组织心肌细胞横截面积代表图片及统计结果，采用麦胚凝集素(WGA,Triticum vulgarislectin)染色测定心肌细胞横截面积，n＝15,**P<0.01,vs CTL；##P<0.01 vs MK8722；(E,F)心脏肥厚标志物ANP，BNP蛋白表达结果，n＝15,*P<0.05,**P<0.01,vs CTL；##P<0.01 vsMK8722。
图5为硝唑尼特(150mg/kg)灌胃给药抑制MK8722(10mg/kg,p.o)诱导的小鼠心脏组织糖原蓄积；各组小鼠心肌组织中糖原含量统计结果，每组n＝10,**P<0.01 vs CTL；##P<0.01 vs MK8722(10mg/kg)；Nit(nitazoxanide)，硝唑尼特。
图6为硝唑尼特(150mg/kg)灌胃给药抑制MK8722(10mg/kg,p.o)诱导的小鼠心脏射血分数(EF％)和短轴缩短率(FS％)下降；每组n＝15,**P<0.01 vs CTL；##P<0.01 vsMK8722(10mg/kg)；Nit(nitazoxanide)，硝唑尼特。
图7为硝唑尼特(150mg/kg)合用MK8722(10mg/kg,p.o)增强MK8722诱导的小鼠心脏组织AMPK激活作用，n＝15.*P<0.05，**P<0.01；Nit(nitazoxanide)，硝唑尼特。
图8为硝唑尼特(150mg/kg)合用MK8722(10mg/kg,p.o)增强MK8722诱导的小鼠骨骼肌组织AMPK激活作用，n＝15.*P<0.05，**P<0.01；Nit(nitazoxanide)，硝唑尼特。
图9为硝唑尼特(150mg/kg)合用MK8722(10mg/kg,p.o)增强MK8722诱导的小鼠肝脏组织AMPK激活作用，n＝15.*P<0.05，**P<0.01；Nit(nitazoxanide)，硝唑尼特。
图10肝脏HE染色代表照片(A)及HE染色空泡面积比的统计结果(B)。**P<0.01；Nit(nitazoxanide)，硝唑尼特。对照组，db/db模型组，db/db+MK8722组，db/db+硝唑尼特+MK8722组，db/db+硝唑尼特组，n分别为12，10，8，10，6。
图11肝脏油红O染色表照片(A)及油红染色阳性面积比统计结果(B)。*P<0.05，**P<0.01；Nit(nitazoxanide)，硝唑尼特。对照组，db/db模型组，db/db+MK8722组，db/db+硝唑尼特+MK8722组，db/db+硝唑尼特组，n分别为12，10，8，10，6。
图12心脏重量及心脏重量指数统计结果。(A)体重统计结果。(B)心脏重量统计结果。(C)心脏重量指数(心脏重量/体重)统计结果。*P<0.05，**P<0.01；Nit(nitazoxanide)，硝唑尼特。对照组，db/db模型组，db/db+MK8722组，db/db+硝唑尼特+MK8722组，db/db+硝唑尼特组，n分别为12，10，8，10，6。具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
本发明实施例中的验证方法均为通用方法。
实施例1
替唑尼特对MK8722诱导的小鼠原代乳鼠心肌细胞AMPK活性，心肌细胞肥大指标和糖原蓄积的作用
1材料和方法
1.1实验动物：
昆明小鼠乳鼠：出生1-2天；购自江苏华创信诺医药科技有限公司。
1.2试剂：
替唑尼特：购于MedChemExpress(HY-12687)；
MK8722：美国Med Chem Express生物科技公司，CAS号：1394371-71-1
1.3实验方法：
新生2天内的昆明鼠乳鼠，按六孔板每孔2只计算所需乳鼠数量。将乳鼠浸于75％酒精中进行表面消毒，随后用无菌剪刀剪开其皮肤及胸骨，用弯镊夹取心脏后置于盛有PBS的平皿中，重复以上步骤将所有乳鼠的心脏取出。清理心脏周围血凝块及结缔组织，将培养皿中的心脏及液体吸入15ml离心管中，稍等沉降后吸去大部分液体，重复加入PBS清洗2-3次直至清洗干净。将心脏用D-hanks缓冲液清洗1-3次，随后加入3ml D-hanks缓冲液和2ml预冷的胰酶，放于4℃摇床。12h后，在装有心脏的15ml离心管中加入含10％胎牛血清的高糖培养基和胰酶，随后小心吸去液体。在装有心脏的离心管中加入7ml二型胶原酶溶液，置于恒温摇床中，37℃，180转振摇8-10min后观察上清变化，待上清略浑浊后，将上清吸至含有10％血清的高糖培养液中止消化，将以上过程重复4-5次，反复消化直至组织块消化完全。将上述步骤获得的细胞悬液过200目筛网后，1000转离心5min，弃去上层液体，加入含10％血清的完全培养基重悬细胞，并接种至细胞培养瓶中。将细胞置于细胞培养箱中培养60min后，将上层细胞小心吹下至离心管中，加入适量完全培养基重悬后接种于4个六孔板中。将分离获得的心肌细胞在细胞培养箱中培养48h，无血清饥饿处理12h后，分别给3μM MK-8722，再立即加入不同浓度的替唑尼特(2，5，10μM)处理24h，以上组别具体包括空白对照组(千分之一的DMSO)、MK8722(3μM)模型组、MK8722(3μM)+替唑尼特(2μM)组、MK8722(3μM)+替唑尼特(5μM)组、MK8722(3μM)+替唑尼特(10μM)组，上述模型组和实验组药物均用等量DMSO溶解。随后进行相关检测，采用鬼笔环肽荧光染色测定细胞大小；采用糖原PAS染色法(Periodic Acid-Schiff stain)染色糖原，采用糖原检测试剂盒检测心肌细胞糖原含量。
采用Western Blot技术测定p-AMPK,AMPK蛋白表达水平。
2、结果：
首先培养小鼠乳鼠原代心肌细胞，测定硝唑尼特体内代谢物替唑尼特、MK8722以及替唑尼特联合MK8722对小鼠原代心肌细胞AMPK活性的作用。由于硝唑尼特体内吸收后完全转化为代谢物替唑尼特，因此在细胞体外实验中采用替唑尼特。
研究替唑尼特对MK8722诱导的原代小鼠心肌细胞肥大的影响。组别具体包括对照组(CTL)、MK8722(3μM)模型组、MK8722(3μM)+替唑尼特(2μM)组、MK8722(3μM)+替唑尼特(5μM)组、MK8722(3μM)+替唑尼特(10μM)组。采用鬼笔环肽(phalloidin)染色心肌细胞肌动蛋白观察心肌细胞大小，如图1A所示，MK8722处理后心肌细胞面积显著增大，且肌丝稀疏，密度减小；而给与替唑尼特处理后，显著抑制MK8722诱导的心肌细胞肥大，统计结果见图1B。进而测定心肌肥厚标志蛋白ANP,BNP,β-MHC的蛋白表达，可见MK8722处理显著增加心肌肥厚标志蛋白ANP,BNP,β-MHC的表达，该增加可被替唑尼特处理显著抑制(图1C和图1D)。
进一步研究替唑尼特对MK8722诱导的原代小鼠心肌细胞糖原蓄积的影响。组别具体包括对照组(CTL)、MK8722(3μM)模型组、MK8722(3μM)+替唑尼特(2μM)组、MK8722(3μM)+替唑尼特(5μM)组、MK8722(3μM)+替唑尼特(10μM)组。药物作用于原代培养心肌细胞24小时后，采用PAS染色法(Periodic Acid-Schiff stain)染色糖原。如图2A所示为各组代表PAS染色照片，图2B为PAS染色的统计结果，结果显示MK8722诱导原代小鼠心肌细胞糖原显著增加，该增加可被替唑尼特处理显著抑制。进而药物作用乳鼠原代心肌细胞24小时后采用糖原检测试剂盒检测糖原含量并通过细胞计数校正。结果显示MK8722诱导原代小鼠心肌细胞糖原显著增加，该增加可被替唑尼特处理显著抑制(图2C)。
MK8722(1-5μM)单独应用剂量依赖性激活小鼠原代心肌细胞AMPK(图3A)，替唑尼特(2-10μM)单独应用也剂量依赖性激活小鼠原代心肌细胞AMPK(图3B)。MK8722(1μM)和替唑尼特(2μM)单独应用无明显AMPK激活作用，但MK8722(1μM)联合替唑尼特(2μM)显著激活小鼠原代心肌细胞AMPK(图3C)，说明二者联用和二者单用之间均具有显著性差异。进一步，MK8722(3μM)，替唑尼特(5μM)单独应用可激活AMPK，而MK8722(3μM)联合替唑尼特(5μM)显著激活小鼠原代心肌细胞AMPK，且其作用显著强于MK8722和替唑尼特单独使用(图3D)。以上结果说明替唑尼特和MK8722联合使用可以显著增强AMPK激活作用，而且可以减少二者的联用可以降低二者使用剂量，在MK8722(1μM)和替唑尼特(2μM)时即可以产生显著的效果，进一步减少可能的副作用。
实施例2
硝唑尼特口服灌胃途径给药对MK8722诱导的小鼠心肌肥大和糖原蓄积的作用
1材料和方法
1.1实验动物：
雄性C57BL/6J小鼠，8周龄，体重：22-24g；购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
1.2.试剂：
硝唑尼特(Nitazoxanide)：上海阿达马斯贝塔化学试剂有限公司，CAS号：55981-09-4；
羧甲基纤维素钠(CMC-Na)：上海沪试化学试剂，CAS号：9004-32-4；
MK8722：美国Med Chem Express生物科技公司，CAS号：1394371-71-11.3。
实验方法:
采用7周龄雄性C57BL/6N小鼠按照标准饲养环境，饲养室内相对湿度55％～60％，温度维持在24±1℃，12小时昼夜交替，自由采食。
小鼠适应性喂养7天后，随机分为4组，正常对照组(CTL，灌胃给予CMC-Na溶剂，0.005g/ml，按小鼠体重每10g灌0.1ml)，MK8722组(灌胃给予10mg/kg,i.g.),MK8722+硝唑尼特组(灌胃给予MK8722+Nit,MK8722,10mg/kg,i.g；Nit150mg/kg，i.g)，硝唑尼特组(灌胃给予Nit,150mg/kg,i.g)，上述三组实验组药物均用等量CMC-Na混悬。各组连续给药40天后，测定心脏功能，然后收集样本进行检测。测定指标包括小鼠体重，胫骨长度，心肌组织病理切片的麦胚凝集素(WGA,Triticum vulgaris lectin)染色测定心肌细胞横截面积，心肌组织心脏肥厚标志物ANP，BNP，β-MHC蛋白表达，测定心肌、骨骼肌、肝脏p-AMPK,AMPK蛋白水平。
2、结果
MK8722(10mg/kg)灌胃40天诱导小鼠心肌肥厚和心肌糖原蓄积模型，观察硝唑尼特的对抗作用。各组小鼠体重和胫骨长度无差异(图4A)，但心脏重量系数(HW/BW)和心脏胫骨系数(HW/TL)结果显示，MK8722组小鼠心脏重量显著增加，MK8722+硝唑尼特组中，硝唑尼特(150mg/kg)给药可显著抑制MK8722诱导的小鼠心脏重量增加(图4B)。进一步采用麦胚凝集素(WGA,Triticum vulgaris lectin)染色测定各组小鼠心脏组织心肌细胞横截面积，结果显示MK8722组小鼠心肌细胞横截面积显著增加，MK8722+硝唑尼特组中，硝唑尼特(150mg/kg)给药可显著抑制MK8722诱导的小鼠心脏组织心肌细胞横截面积增加(图4C和图4D)；进一步测定各组小鼠心脏肥厚标志物ANP，BNP，β-MHC蛋白表达，结果显示MK8722组小鼠心肌组织ANP,BNP，β-MHC蛋白表达显著增加，MK8722+硝唑尼特组中，硝唑尼特(150mg/kg)给药可显著抑制MK8722诱导的小鼠心肌组织ANP,BNP，β-MHC蛋白增加(图4E和图4F)。以上结果说明硝唑尼特体内给药可抑制MK8722诱导的心肌肥大。
进一步测定心肌组织中糖原含量，MK8722组小鼠心脏糖原含量显著增加，MK8722+硝唑尼特组中，硝唑尼特(150mg/kg)灌胃给药显著抑制MK8722(10mg/kg)诱导的小鼠心脏糖原水平增加，说明硝唑尼特对MK8722诱导的小鼠心脏糖原水平蓄积有抑制作用(图5)。
进一步测定心脏功能，MK8722(10mg/kg,p.o)诱导小鼠心脏射血分数(EF％)和短轴缩短率(FS％)显著下降，MK8722+硝唑尼特组中，硝唑尼特(150mg/kg)灌胃给药显著抑制MK8722(10mg/kg,p.o)诱导的小鼠心脏射血分数(EF％)和短轴缩短率(FS％)下降(图6)。
进一步测定心肌组织中AMPK活性，MK8722组小鼠心肌组织AMPK活性增加，MK8722+硝唑尼特组中，硝唑尼特(150mg/kg)显著增强MK8722诱导的小鼠心脏组织AMPK激活作用(图7)。
骨骼肌和肝脏AMPK激活可抑制胆固醇和脂肪酸合成，促进葡萄糖摄取、对抗骨骼肌和肝脏的胰岛素抵抗，增强骨骼肌和肝脏AMPK激活在临床上一般认为具有增强抗糖尿病和代谢综合症的作用。进一步测定了骨骼肌和肝脏组织中AMPK活性。MK8722组小鼠骨骼肌组织AMPK活性增加，MK8722+硝唑尼特组中，硝唑尼特(150mg/kg)显著增强MK8722诱导的小鼠骨骼肌组织AMPK激活作用，且合用显著强于硝唑尼特和MK8722单独给药(图8)。MK8722组小鼠肝脏组织AMPK活性增加，MK8722+硝唑尼特组中，硝唑尼特(150mg/kg)显著增强MK8722诱导的小鼠肝脏组织AMPK激活作用，且合用强于硝唑尼特和MK8722单独给药(图9)。
以上结果说明硝唑尼特和MK8722可协同增加心肌组织、骨骼肌、肝脏AMPK活性，同时硝唑尼特又可抑制MK8722诱导的心肌肥大、心肌糖原蓄积、心脏功能下降，因此二者合用即可显著增加糖尿病、脂肪肝和代谢综合症等疾病的治疗作用，又可抑制MK8722在治疗上述疾病中的不良反应，可以组成理想的复方药物，体现优异的减毒增效的效果，同时二者的联用可以降低二者使用剂量，进一步减少可能的副作用，证明硝唑尼特和MK8722复方组合物可以用于治疗糖尿病、脂肪肝或者代谢综合症，同时有效避免了心肌肥大和心脏糖原蓄积等。此外，上述实验中MK8722会诱导心肌糖原蓄积和肥大，而硝唑尼特和/或替唑尼特可显著抑制，因此硝唑尼特和/或替唑尼特可用于治疗糖原蓄积性心肌病。
实施例3
硝唑尼特、MK8722及硝唑尼特与MK8722联合给药对db/db小鼠脂肪肝的改善作用
1材料和方法
1.1实验动物：
雄性db/db小鼠及野生型对照鼠，6周龄，购自南京集萃药康生物科技股份有限公司。
实验方法:
小鼠按照标准饲养环境，饲养室内相对湿度55％～60％，温度维持在24±1℃，12小时昼夜交替，自由采食。
小鼠适应性喂养7天后，db/db肥胖小鼠随机分为db/db模型组，db/db+MK8722组(灌胃给予小鼠MK8722(10mg/kg))，db/db+硝唑尼特组(灌胃给予硝唑尼特(150mg/kg))，db/db+硝唑尼特+MK8722组(灌胃给予硝唑尼特(150mg/kg)和MK8722(10mg/kg))，同时以同周龄野生型小鼠为对照(WT，灌胃给予CMC-Na溶剂，0.005g/ml，按小鼠体重每10g灌0.1ml)，上述三组实验组药物均用等量CMC-Na混悬。各组连续给药20天后，取肝脏进行HE染色和油红O染色，取心脏测定心脏重量指数。
2、结果
HE染色可见db/db模型组小鼠肝脏存在大量圆形脂滴空泡(病理处理过程中脂滴溶解，显示空白)，此外肝细胞表现水性样变；单独给予硝唑尼特、MK8722的db/db小鼠肝脏空泡均有一定改善，而联合给予硝唑尼特和MK8722的db/db小鼠肝脏空泡和肝细胞水性样变得到了显著改善，显著优于硝唑尼特、MK8722单独给药(图10)。油红O染色显示db/db模型组小鼠肝脏存在大量红染脂滴，单独给予硝唑尼特、MK8722的db/db小鼠肝脏红染脂滴发生减少，而联合给予硝唑尼特和MK8722可进一步显著减少肝脏脂质蓄积，几乎完全纠正肝脏脂质蓄积(图11)。同时，观察到硝唑尼特+MK8722组小鼠无心脏肥大表现，而单独给与MK8722组小鼠出现明显心脏肥大(图12)，进一步地单独给MK8722组诱导的小鼠心脏糖原水平明显增加，而硝唑尼特+MK8722组小鼠没有发生明显的心脏糖原水平增加。
以上结果说明硝唑尼特和MK8722可协同抑制肝细胞表现水性样变以及肝脏脂质蓄积，同时硝唑尼特又可抑制MK8722诱导的心肌肥大、心肌糖原蓄积、心脏功能下降，因此二者合用即可显著增加脂肪肝的治疗作用，又可抑制MK8722在治疗上述疾病中的不良反应，可以组成理想的复方药物，体现优异的减毒增效的效果，同时二者的联用可以降低二者使用剂量，进一步减少可能的副作用，证明硝唑尼特和MK8722复方组合物可以用于治疗脂肪肝，同时有效避免了心肌肥大和心脏糖原蓄积等。
Claims (10)
1.硝唑尼特和/或替唑尼特与MK8722组成复方药物在制备治疗以AMPK激活为治疗靶点的疾病的药物中的应用，其中硝唑尼特的化学结构式如式I所示，
替唑尼特的化学结构式如式II所示：
所述MK8722的化学结构式如式III所示：
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述硝唑尼特和/或替唑尼特与MK8722组成复方药物及其药学上可接受的盐或者溶剂化物在制备以AMPK激活为治疗靶点的疾病的药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药学上可接受的盐为化合物与金属离子或药学上可接受的胺或铵离子形成的盐，所述胺离子包括乙二胺或氨丁三醇。
4.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述以AMPK激活为治疗靶点的疾病优选包括糖、脂代谢异常、代谢综合症、糖尿病、脂肪肝、肥胖、胰岛素抵抗、高血压、炎症、炎症性肠病、心肌肥厚和心衰、动脉粥样硬化、衰老、神经肌肉性疾病、肾病、疼痛。
5.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述硝唑尼特与MK8722组合复方药物中硝唑尼特与MK8722的质量比为75～150:1～10。
6.硝唑尼特和/或替唑尼特与MK8722组成复方药物在制备治疗糖、脂代谢异常、代谢综合症、糖尿病、脂肪肝、肥胖、胰岛素抵抗、高血压、炎症、炎症性肠病、心肌肥厚和心衰、动脉粥样硬化、衰老、神经肌肉性疾病、肾病、疼痛的药物中的应用。
7.硝唑尼特和/或替唑尼特与MK8722组成复方药物在制备治疗糖尿病、脂肪肝或者代谢综合症，并且同时避免心肌细胞肥大、心肌糖原蓄积、心脏功能下降的药物中的应用。
8.一种治疗以AMPK激活为治疗靶点的疾病的组合复方药物，其特征在于，包括硝唑尼特和/或替唑尼特与MK8722。
9.根据权利要求8所述的组合复方药物，其特征在于，所述硝唑尼特和/或替唑尼特与MK8722的组合复方药物或其药学上可接受的盐或溶剂化物作为活性成分和药学上可接受的载体。
10.硝唑尼特和/或替唑尼特在制备治疗糖原蓄积性心肌病药物中的应用。
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