CN117398372A - Ostarine在抑制NLRP3炎症小体活化中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了Ostarine在抑制NLRP3炎症小体活化中的应用。本发明通过实验发现Ostarine能够抑制NLRP3炎症小体活化、抑制细胞焦亡，且Ostarine能够促进NLRP3蛋白的降解，从而抑制NLRP3炎症小体的活化。因此，Ostarine可以作为NLRP3炎症小体活化抑制剂、降解NLRP3炎症小体的药物或靶向NLRP3炎症小体的抗炎药物，用于预防或治疗NLRP3炎症小体异常活化相关疾病，如急性全身性炎症、急性腹膜炎等。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，特别涉及Ostarine在抑制NLRP3炎症小体活化中的应用。
背景技术
炎症是机体应对外来刺激时发生的一种具有保护性的重要免疫反应。炎症小体作为固有免疫系统的重要组成成分，是由一类胞内模式识别受体参与组成的多聚蛋白复合物，介导机体对微生物感染和细胞损伤产生免疫响应，从而维持机体的免疫稳态。根据感受器的不同，炎症小体分为NLRP1炎症小体、NLRP3炎症小体、NLRC4炎症小体、IPAF炎症小体和AIM2炎症小体。其中，NLRP3炎症小体的研究最为广泛和深入。NLRP3炎症小体由感受器NLRP3、衔接蛋白ASC以及效应蛋白Pro-caspasse-1组成。激活后的NLRP3炎症小体能够促进Caspase-1自剪切活化，活化的Caspase-1一方面介导炎性因子IL-1β和IL-18的成熟和释放，引发炎症反应；另一方面剪切Gasdermin D引发细胞焦亡。
NLRP3炎症小体的过度激活与多种疾病密切相关，如Cryopyrin相关周期性综合征(CAPS)、家族性寒冷型自身炎症综合征(FCAS)、Muckle-Wells二氏综合征(MWS)、炎症性肠病(IBD)、Ⅱ型糖尿病、肥胖、非酒精性脂肪肝炎、衰老、动脉粥样硬化、痛风、肾脏功能紊乱、阿尔茨海默症(AD)、帕金森综合征、脓毒血症、内毒素血症、腹膜炎、战创伤、心血管应激、心肌肥大，以及多种癌症，如结肠癌、乳腺癌、黑色素瘤、丙型肝炎病毒相关的肝细胞癌和胃肠癌等，因此NLRP3炎症小体的活化需要严格调控。
寻找NLRP3炎症小体的特异性抑制剂是治疗相关疾病的一个重要策略。然而现有NLRP3炎症小体相关疾病的临床治疗药物主要是通过间接抑制NLRP3炎症小体组成成分或相关信号事件而起作用，直接靶向NLRP3炎症小体的临床抗炎药物的研发严重滞后。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供Ostarine在制备NLRP3炎症小体活化抑制剂(或药物)中的应用。
本发明的另一目的在于提供Ostarine在制备降解NLRP3蛋白的药物和/或靶向NLRP3蛋白的抗炎药物中的应用。
本发明的再一目的在于提供Ostarine在制备预防和/或治疗NLRP3炎症小体异常活化相关疾病的药物中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
Ostarine在制备NLRP3炎症小体活化抑制剂(或药物)中的应用。
所述的Ostarine，又名MK-2866，是一种选择性雄激素受体调节剂(SARM)(用于对抗肌肉萎缩和骨质疏松症)，分子式为C19H14F3N3O3，分子量389.33，CAS编号为841205-47-8，其化学结构式如式I所示：
作为优选方案，所述的Ostarine通过促进NLRP3蛋白的降解，从而抑制NLRP3炎症小体的活化以及抑制细胞焦亡。
作为更优选方案，所述的Ostarine通过促进NLRP3蛋白的降解，从而抑制NLRP3炎症小体活化介导的IL-1β的分泌、抑制Gasdermin D蛋白剪切引起的细胞焦亡，最终达到抑制NLRP3炎症小体活化的目的。
作为优选方案，所述的细胞为巨噬细胞。
作为更优选方案，所述的巨噬细胞包括骨髓来源巨噬细胞和/或腹腔来源巨噬细胞。
作为优选方案，所述的Ostarine的使用浓度为0～40μmol/L(不包括0)。
作为更优选方案，所述的Ostarine的使用浓度为5～40μmol/L。
作为优选方案，所述的降解的时间为0～4小时(不包括0)。
作为更优选方案，所述的降解的时间为1～4小时。
Ostarine在制备降解NLRP3蛋白的药物和/或靶向NLRP3蛋白的抗炎药物中的应用。
Ostarine在制备预防和/或治疗NLRP3炎症小体异常活化相关疾病的药物中的应用。
作为优选方案，所述的NLRP3炎症小体异常活化(激活)包括经典的NLRP3炎症小体活化和非经典的NLRP3炎症小体的活化。
作为优选方案，所述的经典的NLRP3炎症小体活化为由NLRP3炎症小体活化激活剂诱导的NLRP3炎症小体活化。
作为优选方案，所述的NLRP3炎症小体活化激活剂包括尼日利亚菌素(Nigericin)、明矾(Alum)、ATP(腺嘌呤核苷三磷酸)、尿酸盐结晶、二氧化硅、咪奎莫特和硫酸葡聚糖钠盐中的至少一种。
作为优选方案，所述的非经典的NLRP3炎症小体的活化由胞内脂多糖(LPS)诱导的NLRP3炎症小体的活化。
作为优选方案，所述的NLRP3炎症小体异常活化相关疾病包括遗传性NLRP3依赖的自发炎症疾病、NLRP3炎症小体异常活化引起的代谢疾病、NLRP3炎症小体异常活化导致晶体和蛋白质聚集而引发的疾病、急性组织损伤和慢性炎症中的任意一种或几种。
作为更优选方案，所述的NLRP3炎症小体异常活化相关疾病包括NLRP3炎症小体异常活化引起的急性全身性炎症、急性腹膜炎、Cryopyrin相关周期性综合征(CAPS)、家族性寒冷型自身炎症综合征(FCAS)、Muckle-Wells二氏综合征(MWS)、炎症性肠病(IBD)、Ⅱ型糖尿病、肥胖、非酒精性脂肪肝炎、衰老、肿瘤、动脉粥样硬化、痛风、肾脏功能紊乱、阿尔茨海默症(AD)、帕金森综合征、脓毒血症、内毒素血症、腹膜炎、战创伤、心血管应激、心肌肥大等中的任意一种或几种。
作为优选方案，所述的药物通过促进NLRP3蛋白的降解，从而抑制NLRP3炎症小体的活化和抑制细胞焦亡，以达到预防或治疗目的。
作为优选方案，所述的药物中除了含有活性成分Ostarine之外，还含有药学上可接受的载体和/或其他不影响活性成分有效性的辅料。
作为更优选方案，所述的辅料包括改善口味的甜味剂、防止氧化的抗氧化剂、以及各种制剂所必要的辅料等。
作为优选方案，所述的药物的剂型不限，只要是能够使活性成分有效地到达体内的剂型均可，例如为片剂、胶囊剂、颗粒剂、粉末、糖浆、溶液、悬浮液、注射剂、酊剂、缓蚀剂、口服液、注射剂气雾剂、口含剂、冲剂、丸剂、滴丸、散剂、吸入粉雾剂等常见剂型，或将其制成纳米制剂等缓释剂型。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明中首次发现作为一种选择性雄激素受体调节剂的Ostarine能够抑制NLRP3炎症小体活化，在NLRP3炎症小体的活化过程中，NLRP3蛋白的表达水平是其中的关键限制步骤，且Ostarine通过时间依赖、浓度依赖地促进NLRP3蛋白的降解，从而抑制NLRP3炎症小体的活化。可见，Ostarine可以作为预防或治疗NLRP3炎症小体异常活化相关疾病的潜在药物，或作为直接靶向NLRP3炎症小体的抗炎药物，用于预防或治疗急性全身性炎症、急性腹膜炎等疾病。
附图说明
图1是Ostarine抑制NLRP3炎症小体活化的结果图；其中，A为WT BMDM细胞中，LPS+Nigericin诱导NLRP3炎症小体活化时，Ostarine浓度依赖地抑制IL-1β的分泌；B为CAPSBMDM细胞中，LPS诱导NLRP3炎症小体活化时，Ostarine浓度依赖地抑制IL-1β的分泌；C为PM细胞中，LPS+Nigericin诱导NLRP3炎症小体活化时，Ostarine浓度依赖地抑制IL-1β的分泌；D为WT BMDM细胞中，LPS+Nigericin诱导NLRP3炎症小体活化时，Ostarine抑制成熟的IL-1β和caspase-1剪切体的生成。
图2是Ostarine抑制细胞焦亡的结果图；其中，A为WT BMDM细胞中，LPS+Nigericin诱导NLRP3炎症小体活化时，Ostarine抑制Gasdermin D蛋白的剪切；B为WT BMDM细胞中，LPS+Nigericin诱导NLRP3炎症小体活化时，Ostarine抑制LDH的释放。
图3是Ostarine促进NLRP3降解的结果图；其中，A为Ostarine在WT BMDM细胞中促进NLRP3降解的浓度效应；B为Ostarine在WT BMDM细胞中促进NLRP3降解的时间效应；C为Ostarine在CAPS BMDM细胞中促进NLRP3降解的浓度效应；D为Ostarine在CAPS BMDM细胞中促进NLRP3降解的时间效应。
图4是Ostarine对LPS诱导的急性全身性炎症的治疗结果图(Ostarine显著抑制LPS急性全身性炎症小鼠血清中的IL-1β水平)。
图5是Ostarine对Alum诱导的急性腹膜炎的治疗结果图；其中，A为腹膜液的流式细胞图及其统计分析图(Ostarine能显著减少腹膜液中性粒细胞的比例)；B为Ostarine抑制腹膜液中IL-1β的水平。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。
实施例1：Ostarine在野生型小鼠骨髓来源巨噬细胞(WT BMDM)中抑制NLRP3炎症小体的活化以及抑制细胞焦亡
(1)WT BMDM的培养和分化：取7～8周龄雄性C57BL/6小鼠(广东省实验动物中心)分离出骨髓细胞，用含20ng/mL巨噬细胞集落刺激因子M-CSF(Abclonal，RP01216)、10％(V/V)胎牛血清FBS(Gibco)的DMEM培养基(Gibco)培养分化5～6天，获得野生型小鼠骨髓来源的巨噬细胞。
(2)种板：将WT BMDM细胞分到24孔板里，每孔3×105个细胞，种板过夜。
(3)预处理：弃去细胞上清，每孔加入500μL含100ng/mL脂多糖LPS(Sigma-Aldrich，L2630)的减血清培养基Opti-MEM(Gibco)处理3小时。
(4)药物处理：分别加入终浓度为0、5μM、10μM、20μM、40μM的Ostarine(MCE公司)处理4小时。
(5)激活：再分别加入终浓度为0、5μM尼日利亚菌素Nigericin(InvivoGen，tlrl-nig)处理30min，显微镜下观察到细胞发生明显的焦亡，收细胞上清。用1×sample loadingbuffer(SDS-PAGE蛋白上样缓冲液)收取细胞沉淀。
(6)ELISA：利用小鼠IL-1βELISA试剂盒(R&D，DY401)测定细胞上清中IL-1β的含量。实验设置三次重复。
(7)WB：利用抗IL-1β抗体(R&D，AF-401-NA)，抗caspase-1抗体(AdipoGen，AG-20B-0042)和抗GSDMD抗体(Abcam，ab219800)通过Western Blot方法，检测细胞沉淀中pro-IL-1β、IL-1β、pro-caspase-1、p20以及Gasdermin D的含量。实验设置三次重复。
(8)结果分析：ELISA结果如图1A(图中，阴性对照组：LPS；阳性对照组：LPS+Nigericin；实验组：LPS+Ostarine+Nigericin)所示，在WT BMDM细胞中，Ostarine能够浓度依赖地抑制IL-1β的分泌。WB结果如图1D所示，40μM Ostarine能够降低成熟IL-1β和caspase-1剪切体的表达；图2A表明Ostarine浓度依赖地抑制Gasdermin D蛋白的剪切。说明在WT BMDM中，Ostarine能够抑制NLRP3炎症小体活化，抑制细胞焦亡。
实施例2：Ostarine在冷吡啉相关周期性综合征小鼠骨髓来源巨噬细胞(CAPSBMDM)中抑制NLRP3炎症小体的活化
(1)CAPS BMDM的培养和分化：取7～8周龄雄性CAPS小鼠(The JacksonLaboratory)分离出骨髓细胞，用含20ng/mL M-CSF、10％(V/V)FBS的DMEM培养基培养分化5～6天，获得冷吡啉相关周期性综合征小鼠骨髓来源的巨噬细胞。
(2)种板：将CAPS BMDM细胞分到24孔板里，每孔3×105个细胞，种板过夜。
(3)激活：弃去细胞上清，每孔加入500μL含100ng/mL LPS的减血清培养基Opti-MEM(Gibco)处理3小时。
(4)药物处理：再分别加入终浓度为0、5μM、10μM、20μM、40μM的Ostarine处理4小时，收细胞上清。
(5)ELISA：利用小鼠IL-1βELISA试剂盒(R&D，DY401)测定细胞上清中IL-1β的含量。实验设置三次重复。
(6)结果分析：如图1B(图中，阴性对照组：无处理；阳性对照组：LPS；实验组：LPS+Ostarine)所示，在CAPS BMDM细胞中，Ostarine能够浓度依赖地抑制IL-1β的分泌。说明在CAPS BMDM中，Ostarine能够抑制NLRP3炎症小体的活化。
实施例3：Ostarine在小鼠腹腔巨噬细胞(PM)中抑制NLRP3炎症小体的活化
(1)PM的培养：取7～8周龄雄性C57BL/6小鼠(广东省实验动物中心)的腹腔灌洗液，分离出腹腔灌洗液细胞，2h后贴壁的为腹腔巨噬细胞。
(2)种板：将PM细胞分到24孔板里，每孔3×105个细胞，种板过夜。
(3)预处理：弃去细胞上清，每孔加入500μL含100ng/mL LPS的Opti-MEM处理3小时。
(4)药物处理：分别加入终浓度为0、5μM、10μM、20μM、40μM的Ostarine处理4小时。
(5)激活：再分别加入终浓度为0、5μM Nigericin处理30min，显微镜下观察到细胞发生明显的焦亡，收细胞上清。
(6)ELISA：利用小鼠IL-1βELISA试剂盒(R&D，DY401)测定细胞上清中IL-1β的含量。实验设置三次重复。
(7)结果分析：如图1C(图中，阴性对照组：LPS；阳性对照组：LPS+Nigericin；实验组：LPS+Ostarine+Nigericin)所示，在PM细胞中，Ostarine能够浓度依赖地抑制IL-1β的分泌。说明在PM中，Ostarine能够抑制NLRP3炎症小体的活化。
实施例4：Ostarine在野生型小鼠骨髓来源巨噬细胞(WT BMDM)中抑制乳酸脱氢酶LDH的释放
(1)WT BMDM的培养和分化：方法同实施例1步骤(1)。
(2)种板：将WT BMDM细胞分至96孔板，检测时细胞密度不超过80％～90％，种板过夜。
(3)预处理：弃去细胞上清，每孔加入200μL含100ng/mL LPS的Opti-MEM处理3小时。
(4)药物处理：分别加入终浓度为0、10μM、20μM、40μM的Ostarine处理4小时。
(5)激活和诱导细胞死亡：向加药孔中加入终浓度为10μM Nigericin，同时向样品最大酶活性对照孔中加入终浓度为10％(V/V)LDH释放试剂(Beyotime，C0016)，处理1h。
(6)LDH释放检测：利用乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒(Beyotime，C0016)检测LDH的释放。实验设置三次重复。
(7)结果分析：如图2B所示，在WT BMDM细胞中，Ostarine能够浓度梯度地抑制LDH的释放。
实施例5：Ostarine在骨髓来源巨噬细胞(BMDM)中促进NLRP3的降解
(1)WT BMDM和CAPS BMDM的培养和分化：方法同实施例1步骤(1)和实施例2步骤(1)。
(2)种板：将WT BMDM和CAPS BMDM细胞分别分到24孔板里，每孔3×105个细胞，种板过夜。
(3)预处理：弃去细胞上清，每孔加入500μL含100ng/mL LPS的Opti-MEM处理3小时。
(4)药物处理：
将实验分为两组：①浓度效应：分别加入终浓度为0、10μM、20μM、40μM的Ostarine处理4小时；②时间效应：加入终浓度为40μM的Ostarine分别处理0、1、2、4小时。再用1×sample loading buffer收取细胞沉淀。
(5)WB：利用抗NLRP3抗体(Adipogen，AG-20B-0014)通过Western Blot方法，检测细胞沉淀中NLRP3的含量。实验设置三次重复。
(6)结果分析：如图3A所示，Ostarine在WT BMDM细胞中浓度依赖地促进NLRP3的降解；如图3B所示，Ostarine在WT BMDM细胞中时间依赖地促进NLRP3的降解；如图3C所示，Ostarine在CAPS BMDM细胞中浓度依赖地促进NLRP3的降解；如图3D所示，Ostarine在CAPSBMDM细胞中时间依赖地促进NLRP3的降解。
实施例6：Ostarine改善LPS诱导的急性全身性炎症实验
(1)样品制备：将Ostarine用二甲基亚砜DMSO溶解成50mg/mL的储存溶液，腹腔注射前用生理盐水稀释成1mg/mL工作溶液，Ostarine的体内实验用量为10mg/kg。
(2)操作步骤：选取6～8周、体重20g左右的C57BL/6J小鼠(n＝6或4/组)；实验组小鼠腹腔注射10mg/kg Ostarine，1h后腹腔注射20mg/kg LPS(该组记为LPS+Ostarine)，空白对照组小鼠腹腔注射等体积PBS(该组记为PBS)，模型组小鼠仅腹腔注射10mg/kg LPS(即LPS组)，4h后杀鼠取血。
(3)ELISA：利用小鼠IL-1βELISA试剂盒(R&D，DY401)测定血清中IL-1β含量。
(4)结果分析：如图4所示，在LPS诱导的急性全身性炎症模型中，Ostarine能够降低血清中IL-1β的含量。说明Ostarine能够用于缓解由LPS诱导的NLRP3炎症小体的活化引起的急性全身性炎症。
实施例7：Ostarine改善明矾(Alum)诱导的急性腹膜炎实验
(1)样品制备：将Ostarine用二甲基亚砜DMSO溶解成50mg/mL的储存溶液，腹腔注射前用生理盐水稀释成1mg/mL工作溶液，Ostarine的体内实验用量为10mg/kg。
(2)操作步骤：选取6～8周、体重20g左右的C57BL/6J小鼠(n＝6或4/组)；实验组小鼠腹腔注射10mg/kg Ostarine，1h后腹腔注射2mg/只小鼠Alum(InvivoGen，tlrl-aloh)(该组记为Alum+Ostarine)，空白对照组小鼠仅腹腔注射等体积PBS(该组记为PBS)，模型组小鼠仅腹腔注射2mg/只小鼠Alum(即Alum组)，6h后杀鼠取腹膜灌洗液。
(3)流式细胞术：采用流式细胞仪检测腹膜液中的中性粒细胞。
(4)ELISA：利用小鼠IL-1βELISA试剂盒(R&D，DY401)测定腹膜液中IL-1β的含量。
(5)实验结果：在诱导的急性腹膜炎模型中，流式细胞术结果如图5A所示，Ostarine显著减少中性粒细胞的占比；ELISA结果如图5B所示，Ostarine能够显著抑制腹膜液中IL-1β的含量。说明Ostarine能够用于缓解由Alum诱导的NLRP3炎症小体的活化引起的急性腹膜炎。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.Ostarine在制备NLRP3炎症小体活化抑制剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的Ostarine通过促进NLRP3蛋白的降解达到抑制NLRP3炎症小体的活化的目的。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的Ostarine通过促进NLRP3蛋白的降解，从而抑制NLRP3炎症小体活化介导的IL-1β的分泌、抑制Gasdermin D蛋白剪切引起的细胞焦亡，最终达到抑制NLRP3炎症小体活化的目的。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的细胞为巨噬细胞。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的巨噬细胞为骨髓来源巨噬细胞和/或腹腔来源巨噬细胞。
6.Ostarine在制备降解NLRP3蛋白的药物和/或靶向NLRP3蛋白的抗炎药物中的应用。
7.Ostarine在制备预防和/或治疗NLRP3炎症小体异常活化相关疾病的药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述的NLRP3炎症小体异常活化相关疾病包括遗传性NLRP3依赖的自发炎症疾病、NLRP3炎症小体异常活化引起的代谢疾病、NLRP3炎症小体异常活化导致晶体和蛋白质聚集而引发的疾病、急性组织损伤和慢性炎症中的任意一种或几种。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述的NLRP3炎症小体异常活化相关疾病包括NLRP3炎症小体异常活化引起的急性全身性炎症、急性腹膜炎、Cryopyrin相关周期性综合征、家族性寒冷型自身炎症综合征、Muckle-Wells二氏综合征、炎症性肠病、Ⅱ型糖尿病、肥胖、非酒精性脂肪肝炎、衰老、肿瘤、动脉粥样硬化、痛风、肾脏功能紊乱、阿尔茨海默症、帕金森综合征、脓毒血症、内毒素血症、腹膜炎、战创伤、心血管应激和心肌肥大中的任意一种或几种。
10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：
所述的NLRP3炎症小体异常活化包括经典的NLRP3炎症小体活化和非经典的NLRP3炎症小体的活化；
所述的经典的NLRP3炎症小体活化为由NLRP3炎症小体活化激活剂诱导的NLRP3炎症小体活化；
所述的NLRP3炎症小体活化激活剂包括尼日利亚菌素、明矾、ATP、尿酸盐结晶、二氧化硅、咪奎莫特和硫酸葡聚糖钠盐中的至少一种；
所述的非经典的NLRP3炎症小体的活化由胞内脂多糖诱导的NLRP3炎症小体的活化。
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