CN109055560A - Aldh2基因rs671多态性的检测试剂盒及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种ALDH2基因RS671多态性的检测试剂盒，包括针对ALDH2基因RS671的引物和探针；所述引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述探针的5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团；并控制上下游引物的合理比例，结合PCR扩增及熔解曲线的方法对待测样本DNA中ALDH2基因RS671多态性进行检测分析，对于RS671位点的G/A差异性分析分别率高，且成本合理、操作简单方便。

Description

ALDH2基因RS671多态性的检测试剂盒及方法
技术领域
本发明涉及基因检测领域，具体涉及一种ALDH2基因RS671多态性的检测试剂盒及方法。
背景技术
乙醛脱氢酶(acetaldehyde dehydrogenase，缩写ALDH)(EC1.2.1.10)(CAS[9028-91-5])，醛脱氢酶的一种，负责催化乙醛氧化为乙酸的反应。
肝中的乙醇脱氢酶负责将乙醇(酒的成分)氧化为乙醛，生成的乙醛作为底物进一步在乙醛脱氢酶催化下转变为无害的乙酸(即醋的成分)。乙醛毒性高于乙醇，是造成宿醉的主要原因之一。而且乙醛被怀疑具有致癌性，它与人类肿瘤的发生存在一定的关系。负责人体内乙醛转化的主要是肝中的乙醛脱氢酶(ALDH)，ALDH1与ALDH2在催化速率上有很明显的差异，ALDH2对乙醛的K_M低于ALDH1，约后者的1/10，是主要负责乙醛转化的同工酶。
乙醛脱氢酶是随机组合的四聚体，一个突变型的亚基影响了四聚体的稳定性，进而影响酶的正常表达。有ALDH2*2突变(ALDH2基因的RS671位点G＞A型突变)表达出的亚基的酶无法正常代谢乙醇的氧化产物乙醛，血液乙醛浓度增高，造成一系列饮酒后的不良反应，如脸红、头晕、心跳加快等。研究发现无论携带ALDH2*2的是纯合子(AA)还是杂合子(GA)，四聚的ALDH2均无活性，即ALDH2*2是显性遗传。杂合子GA的ALDH2四个亚基都稳定的概率是(0.5)^4＝6％，因而即使杂合子的野生型与突变等位基因等量表达，其正常的ALDH2的表达量也仅有6％。而纯合子AA的ALDH2活性近乎为零，最好是滴酒不沾。有ALDH2*2者更易产生饮酒的不良反应，酗酒的可能性也较小。由于ALDH2*2携带者对乙醛代谢较差，有人认为乙醛对肝的损伤是酒精肝在亚洲人群中常见的原因。基于类似机理，有人还研究了食管癌、咽喉癌与肝癌的易感基因与ALDH2*2的关系，发现有一定的关联。
专利CN201710186172使用了荧光双标探针以taqman-终点分析法，本方法需要合成两种针对不同单核苷酸多态性(SNP)位点结合的MGB探针，此方法的成本较高，且对仪器的要求相对较高；专利CN201510275428使用了FRET荧光能量共振转移的方法对ALDH2的SNP位点进行检测，荧光能量共振转移是距离很近的两个荧光分子间产生的一种能量转移现象。当供体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子的吸收光谱重叠，并且两个分子的距离在10nm范围以内时，就会发生一种非放射性的能量转移，即FRET现象，使得供体的荧光强度比它单独存在时要低的多(荧光猝灭)，而受体发射的荧光却大大增强(敏化荧光)。所以在实验设计的时候必须完全要注意几个环节1)受体、供体的激发光要足够分得开，2)供体的发光光谱与受体的激发光谱要有重叠，3)供体与受体荧光修饰基团的距离要在10nm以内。以上三点需要同时满足就给实验的设计带来了很大的挑战；专利CN201710153613，使用第二代测序技术对RS671位点进行的检测，NGS技术是近年来发展起来的一种高通量的检测技术，对多个样品可以进行混样测序，降低成本，但是对于单个样品的检测而言，整个检测流程包括1)基因组DNA提取2)建库加接头3)文库的质控以及测序4)下机数据的分析，并且或者Ion(PGM)的测序仪器都非常的昂贵，成本极高，该方法并不适合单个基因的SNP检测。
因此，有必要提供一种成本合理、操作简单方便，且特异性、准确度高的ALDH2基因RS671多态性检测方法。
发明内容
基于此，针对上述问题，本发明的目的在于提供一种成本合理、操作简单方便，且特异性好、准确度高的ALDH2基因RS671多态性检测方法。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
一种ALDH2基因RS671多态性的检测试剂盒，包括针对ALDH2基因RS671的引物和探针；
所述引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；
所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述探针的5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团。
在其中一些实施例中，所述试剂盒中还包括有对照DNA；所述对照DNA包括ALDH2基因RS671位点AA纯合子、GG纯合子和GA杂合子，所述ALDH2基因RS671位点序列如SEQ IDNO.10所示。
在其中一些实施例中，所述试剂盒中还包括有：缓冲液、HS taq DNA聚合酶、dNTPs。
在其中一些实施例中，所述荧光基团为HEX，所述淬灭基团为BHQ1。
在其中一些实施例中，在反应体系中，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的浓度比为(5～10)：1。
在其中一些实施例中，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的浓度比为10：1。
本发明的另一个目的是提供一种ALDH2基因RS671多态性的检测方法，具体技术方案如下：
一种ALDH2基因RS671多态性的检测方法，包括以下步骤：
(1)配制1×master mix：在缓冲液中加入dNTPs、核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQID NO.2所示的引物，和核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的探针；
(2)配制反应体系：将待测DNA或对照DNA与1×master mix、HS taq DNA聚合酶、超纯水混合均匀；
(3)置于荧光定量PCR仪中进行PCR反应、制作熔解曲线；
(4)收集、分析数据。
在其中一些实施例中，所述反应体系中，引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的浓度比为(5～10)：1。
在其中一些实施例中，所述反应体系中，引物SEQ ID NO.1和探针SEQ ID NO.7的浓度比为(1.5～2.5)：1。
在其中一些实施例中，所述PCR反应的条件为：预变性95℃15min；变性、退火、延伸95℃15s、60℃1min，45个循环后，60℃延伸结束采集荧光；
所述制作熔解曲线的条件为：95℃1min，45℃5min后，按照1℃/5sec的速度由45℃升温至90℃，做熔解曲线。
基于上述技术方案，本发明具有以下有益效果：
本发明经发明人大量的创造性劳动，针对ALDH2基因设计的得到引物对和单一探针，在此基础上，使用PCR扩增及熔解曲线的方法对待测样本DNA中ALDH2基因RS671多态性进行检测分析，对于RS671位点的G/A差异性分析分别率高，且成本合理、操作简单方便。
本发明发现上游引物和下游引物的浓度比例对检测结果的影响，设计合适的引物并设置合理的上游引物浓度与下游引物浓度的差值，并结合合适的探针，对ALDH2基因RS671进行扩增，并通过制作溶解曲线和熔解峰曲线对RS671位点的G/A进行差异性分析，能够很好的区分RS671位点AA纯合子、GG纯合子和GA杂合子，灵敏度高。
而且，本发明的检测试剂盒的设计可适用于由唾液样本中提取的DNA，使用方便，临床使用时顺应性强。
附图说明
图1为唾液的采集与DNA提取流程图；
图2为实施例1中采用ALDH2基因RS671多态性的检测试剂盒对AA纯合子、GG纯合子和GA杂合子对照DNA的检测结果；
图3为不同引物、探针的PCR扩增结果对比；
图4为不同浓度比的上下游引物的PCR检测结果对比。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例1乙醛脱氢酶ALDH2基因RS671多态性检测
本实施例所述的ALDH2基因RS671多态性检测试剂盒，试剂盒中包括用于乙醛脱氢酶ALDH2基因突变检测的引物、探针，如表1所示：
表1乙醛脱氢酶ALDH2基因突变检测的引物、探针
试剂盒中还包括有对照DNA；所述对照DNA包括ALDH2基因RS671位点AA纯合子、GG纯合子和GA杂合子，ALDH2基因RS671位点的核苷酸序列(SEQ ID NO.10)如下：
其中，AA纯合子R为A(A:T)；GG纯合子R为G(G:C)；GA杂合子R：为G/A(等位基因G:C/A:T)。
样本获取：
使用唾液收集器，放在嘴边收集2ml唾液，加入细胞保存液，盖好盖子，上下或左右迅速摇动采集管30秒，使得细胞保存液与唾液样本充分混匀，标记，准备运输或保存。流程如图1所示。
按照艾基生物技术有限公司的唾液DNA提取试剂盒的使用操作说明书进行唾液DNA提取。得到的DNA储存-20℃。
采用荧光定量PCR的方法进行检测，步骤如下：
(1)按实施例1方法提采集唾液并提取DNA；
(2)用1×TE(10mM tris-HCl\1mM EDTA)将引物、探针进行稀释，至浓度为10μM；
(3)配制扩增反应体系：1×master mix 20μl，DNA 5μl，HS taq DNA聚合酶1U；其中，1×master mix由以下组分配制而成：
组成成分 用量(体积)
5×PCR buffer 5μl
dNTPs(2.5μM each) 0.6μl
上游引物(10μM) 0.2μl
下游引物(10μM) 0.02μl
探针(10μM) 0.1μl
去离子水 14.08μl
总体积 20μl
(4)扩增反应条件：
预变性：95℃15min；
变性、退火、延伸95℃15s 60℃1min，45循环，60℃延伸结束采集荧光(HEX)；
熔解曲线：95℃1min，45℃5min，接着45℃～95℃按照1℃/5sec的速度升温，做熔解曲线。
另外，采用上述方法，采用ALDH2基因RS671多态性的检测试剂盒对AA纯合子、GG纯合子和GA杂合子对照DNA进行检测，结果如图2所示。
实施例2不同引物对或探针用于检测RS671的差异
以乙醛脱氢酶ALDH2基因RS671位点，设计特异性的引物序列，以该突变位点所在目标序列的正向或反向互补序列为模板，针对该位点设计探针序列，包括本发明实施例2中的SEQ ID NO.1与SEQ ID NO.2的序列，所有设计得到备选引物对如表2所示，探针如表3所示。
表3引物序列
表4探针序列
根据实施例2所述的步骤获取DNA样本、配制反应液，并进行乙醛脱氢酶ALDH2基因RS671检测。
其中，引物组合为：RS671-1的SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2为一组，RS671-2的SEQID NO.3和SEQ ID NO.4为一组，RS671-3的SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6为一组，比较各组引物的扩增效率。结果如图3，可见，RS671-1的扩增效率最好。
以RS671-1引物扩增，在相同条件下比较各探针对突变检测的影响。结果如图3，可见RS671-P1探针的效果最好。
实施例4 PCR扩增的上下游引物的浓度比对检测RS671的差异
根据实施例2所述的步骤获取DNA样本后，分别配制不同浓度的上下游引物PCR的扩增反应体系。
PCR的扩增反应体系一(上游引物：下游引物＝1:1)：
1×master mix 23μl，DNA 2μl，HS taq DNA聚合酶1U；其中，1×master mix由以下组分配制而成：
PCR的扩增反应体系二(上游引物：下游引物＝2:1)：
1×master mix 23μl，DNA 2μl，HS taq DNA聚合酶1U；其中，1×master mix由以下组分配制而成：
PCR的扩增反应体系三(上游引物：下游引物＝10:1)：
1×master mix 23μl，DNA 2μl，HS taq DNA聚合酶1U；其中，1×master mix由以下组分配制而成：
扩增反应条件与实施例1相同。反应完成后，制作扩增曲线图、溶解曲线图、溶解峰曲线图，分析样品的扩增Ct值以及溶解曲线TM值，溶解峰曲线。结果如图4所示。
其中，对RS671荧光定量检测，扩增结束后同时做溶解曲线分析，A为平引物用量F/R为1:1，B为引物用量F/R为2:1，C为引物用量F/R为10:1。图中从左至右依次为扩增曲线、熔解曲线和熔解峰曲线。
从结果中看出，当引物用量F/R为1:1、2:1和10:1都能对RS671进行扩增，且Ct值相当，但从图A～C看出，引物用量F/R为1:1、2:1时的熔解曲线和熔解峰曲线不能够对G/A进行差异性分析，无熔解曲线和熔解峰曲线；而从图C中看出，当引物用量F/R为10:1时就能够很好的对单个位点差异的基因进行分析，有熔解曲线和熔解峰曲线，通过不同的熔解曲线TM值来区分纯合子GG、AA，杂合子GA。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以下实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种ALDH2基因RS671多态性的检测试剂盒，其特征在于，包括针对ALDH2基因RS671的引物和探针；
所述引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；
所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述探针的5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团。
2.根据权利要求1所述的ALDH2基因RS671多态性的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括有对照DNA；所述对照DNA包括ALDH2基因RS671位点AA纯合子、GG纯合子和GA杂合子，所述ALDH2基因RS671位点序列如SEQ ID NO.10所示。
3.根据权利要求2所述的ALDH2基因RS671多态性的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括有：PCR缓冲液、HS taq DNA聚合酶、dNTPs。
4.根据权利要求1所述的ALDH2基因RS671多态性的检测试剂盒，其特征在于，所述荧光基团为HEX，所述淬灭基团为BHQ1。
5.根据权利要求1～4任一项所述的ALDH2基因RS671多态性的检测试剂盒，其特征在于，在反应体系中，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的浓度比为(7～11):1。
6.根据权利要求5所述的ALDH2基因RS671多态性的检测试剂盒，其特征在于，在反应体系中，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的浓度比为(10±0.5):1。
7.一种ALDH2基因RS671多态性的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)配制1×master mix：在PCR缓冲液中加入dNTPs、核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQID NO.2所示的引物，和核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的探针；
(2)配制反应体系：将待测DNA或对照DNA与1×master mix、HS taq DNA聚合酶、超纯水混合均匀；
(3)置于荧光定量PCR仪中进行PCR反应、制作熔解曲线；
(4)收集、分析数据。
8.根据权利要求7所述的ALDH2基因RS671多态性的检测方法，其特征在于，所述反应体系中，引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的浓度比为(5～10)：1。
9.根据权利要求8所述的ALDH2基因RS671多态性的检测方法，其特征在于，所述反应体系中，引物SEQ ID NO.1和探针SEQ ID NO.7的浓度比为(1.5～2.5):1。
10.根据权利要求7～9任一项所述的ALDH2基因RS671多态性的检测方法，其特征在于，所述PCR反应的条件为：预变性95℃15min；变性、退火、延伸95℃15s、60℃1min，45个循环后，60℃延伸结束采集荧光；
所述制作熔解曲线的条件为：95℃1min，45℃5min后，按照1℃/5sec的速度由45℃升温至90℃，做熔解曲线。
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