CN109054824B

CN109054824B - 特异性识别Cr6+和维生素C的荧光碳点的制备方法及其应用

Info

Publication number: CN109054824B
Application number: CN201810958922.1A
Authority: CN
Inventors: 李朝辉; 孙远强; 郭硕
Original assignee: Zhengzhou University
Current assignee: Zhengzhou University
Priority date: 2018-08-22
Filing date: 2018-08-22
Publication date: 2021-03-16
Anticipated expiration: 2038-08-22
Also published as: CN109054824A

Abstract

本发明提供了一种特异性识别Cr⁶⁺和维生素C的荧光碳点的制备方法及其应用，将无水柠檬酸加入到水中溶解，溶解后加入N，N‑二甲基苯胺，混合液移入微波管中，微波加热反应，反应液经超滤，柱层析分离，得到碳点。本发明探针合成十分简单，便于操作；本发明能实现Cr⁶⁺和维生素C的特异性检测和快速识别，本发明可在活细胞中实现内源性和外源性的Cr⁶⁺和维生素C的检测。

Description

特异性识别Cr6+和维生素C的荧光碳点的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及有机小分子荧光碳点和生物传感技术领域，具体涉及一种特异性识别Cr⁶⁺和维生素C的荧光碳点的制备方法及其应用。

背景技术

由于Cr(VI)的剧毒和致癌特性，被认为是一种严重的环境污染物。六价铬很容易被人体吸收，它可通过消化、呼吸道、皮肤及粘膜侵入人体。皮肤接触可能导致敏感，更可能造成遗传性基因缺陷，Cr(VI)能穿过细胞膜，在还原剂存在的条件下，诱导染色体畸变，姐妹染色单体的交换，DNA链的断裂和非常规DNA合成，能影响人体代谢过程，使蛋白质变性，干扰某些酶系统功能，有强致突变和致癌作用。过量的（超过10ppm）六价铬对水生物有致死作用，体内Cr(VI)超标的鱼类同样可对人体造成伤害。因此，开发新型、快速且特异性识别Cr(VI)的荧光碳点具有重要意义。

维生素C(ʟ-AA)，在许多水果和蔬菜中含量丰富，是一种高效抗氧化剂，为抗体及胶原形成，组织修补（包括某些氧化还原作用），苯丙氨酸、酪氨酸、叶酸的代谢，铁、碳水化合物的利用，脂肪、蛋白质的合成，维持免疫功能，羟化与羟色胺，保持血管的完整，促进非血红素铁吸收等所必需，在食品、动物饲料、饮料、化妆品等领域皆有应用。同时维生素C还具备有抗氧化，抗自由基，抑制酪氨酸酶的形成，缺乏AA会引起各种各样的疾病，如：感冒、坏血病、精神疾病、不孕、和癌症，然而，作为一种外源性化学物质，AA在人体不能合成，只能从食物摄取。因此，AA的测定无疑对疾病的诊断和日常生活中的食品安全具有重要的意义。

碳点作为碳家族一种新型的纳米材料，因其原材料资源丰富、廉价易得，本身毒性低、抗光漂白能力强、水溶性好、且具有良好的生物相容性等优点，引起了人们的广泛关注。目前，已有许多碳点应用于生物标记、药物靶向、细胞成像等众多领域，因此，开发出一种新型荧光碳点应用于Cr(VI)和维生素C的检测将是非常有意义的。

发明内容

本发明提出了一种特异性识别Cr(VI)和维生素C的荧光碳点的制备方法和应用，当其他吸光物质与荧光体共存时，由于吸光物质对激发光或发射光的吸收而导致荧光减弱，这种现象通常被称作内滤效应。如图1所示，Cr(VI)的吸收峰与CDs的激发光有很大程度的重叠，而Cr(III)在CDs的激发光与发射光波长范围内均无吸收，所以当Cr(VI)存在时，CDs的荧光减弱，再加入维生素C时，Cr(VI)被还原为Cr(III)，CDs的荧光也随之恢复。

实现本发明的技术方案是：一种特异性识别Cr⁶⁺和维生素C的荧光碳点的制备方法，将无水柠檬酸加入到水中溶解，溶解后加入N，N-二甲基苯胺，混合液移入微波管中，微波加热反应，反应液经超滤，柱层析分离，得到碳点。

所述N，N-二甲基苯胺和无水柠檬酸的物质的量之比为1:（0.5-4）。

所述N，N-二甲基苯胺和水的体积比为1:（10-40）。

所述微波加热的温度为160℃，反应时间为4-16h。

所述超滤分子量为3000Da。

荧光碳点在检测活细胞、水环境或生物样品中Cr⁶⁺和维生素C的应用。

以激发波长为405nm光源激发，测定荧光强度变化。

利用N，N-二甲基苯胺和无水柠檬酸制备荧光碳点的合成路线如下：

得到的物质经超滤、柱层析分离，得到最终的可特异性识别Cr(VI)和维生素C的荧光碳点。

本发明的上述用于检测Cr(VI)和维生素C的荧光碳点，包括检测水环境和生物样品中的Cr(VI)和维生素C。

上述应用具体的，包括：

分别测试碳点储存液加入Cr（VI）前后的紫外可见吸收光谱和荧光光谱的变化，荧光的激发波长为405 nm；观察碳点孵育的细胞及其加入Cr（VI）和维生素C前后荧光成像图的变化。

荧光光谱的变化为：以405 nm光激发时，在520nm处的荧光迅速减弱，立即达到响应平台。

荧光成像图的变化为：用碳点母液孵育细胞，并用共聚焦显微镜，以激发波长为405 nm光源激发，观察细胞成像图，加入Cr（VI）孵育，观察荧光强度变化，再加入维生素C，观察荧光强度变化。

上述应用，具体的，包括以下步骤：

（1）配制pH 7.4的PBS (10 mM)缓冲溶液；称取碳点，用超纯水溶解，准确配制62mg/ml的碳点储存液；配制100 mM的离子、氨基酸溶液；

（2）向比色皿中加入1970µL的PBS缓冲溶液后，加入8µL 62mg/ml的碳点储存液，以405 nm进行激发，探针具有很强的荧光发射；再加入20 µL浓度为100 mM的Cr（VI），520 nm的荧光迅速减弱，立即达到响应平台。该碳点与Cr（VI）反应迅速，更好地适用于样品的实时分析与检测；

（3）向比色皿中加入1970µL的PBS缓冲溶液后，加入8µL 62mg/ml的碳点储存液后，再加入当量的Ni²⁺、 K⁺、In³⁺、Zn²⁺、Cu²⁺、Ba²⁺、Cr³⁺、 Al³⁺、Mn²⁺、Ca²⁺、Na⁺、Mg²⁺、Fe²⁺等离子，以及Thr、Gly、Pro、Lys、Val、Arg、Ala、Leu、Asp、Let、Ile、Phe、Trp、Ser、Glu、His、Hcy、GSH、AA、Cys、H₂O₂等物质，405 nm光源照射下，收集520 nm的荧光发射光谱，进行选择性研究。相比于干扰物，该探针能特异性识别Cr⁶⁺；

（4）向比色皿中加入1870µL的PB缓冲溶液后，加入8µL 62mg/ml的碳点储存液，以405 nm进行激发，探针具有很强的荧光发射；再加入20 µL浓度为100 mM的Cr（VI），随后加入100µL 100 mM 的Ser、Thr、Pro、Gly、Lys、Ala、Arg、Val、His、Trp、Glu、Met、Leu、Phe、Asp、Ieu、GSH、Hcy、Cys、NaHSO₃、UA、AA、K⁺、Ca²⁺、Na⁺、Mg²⁺、Al³⁺、Fe³⁺、Fe²⁺、Cu²⁺、Ag⁺、Ni²⁺、Cr³⁺、Mn²⁺等干扰物质3min后，于520 nm处的荧光强度的变化图

（5）通过共聚焦显微镜对孵育好荧光碳点和Cr（VI）及维生素C的活细胞进行荧光成像。

本发明的有益效果是：（1）探针合成十分简单，便于操作；（2）本发明能实现Cr⁶⁺和维生素C的特异性检测和快速识别，（3）本发明可在活细胞中实现内源性和外源性的Cr⁶⁺和维生素C的检测。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例1 Cr⁶⁺的吸收，碳点的吸收、激发、发射图谱。

图2是在2mLPBS缓冲（10 mM，pH = 7.4）体系中，8 µL 62mg/ml碳点分别与1mM Cr⁶ ⁺、Ni²⁺、 K⁺、In³⁺、Zn²⁺、Cu²⁺、Ba²⁺、Cr³⁺、Al³⁺、Mn²⁺、Ca²⁺、Na⁺、Mg²⁺、Fe²⁺等离子反应后于520nm处的荧光强度变化图。

图3是在2mL PBS缓冲（10 mM，pH = 7.4）体系中，8 µL 62mg/ml碳点分别与1mMThr、Gly、Pro、Lys、Val、Arg、Ala、Leu、Asp、Let、Ile、Phe、Trp、Ser、Glu、His等氨基酸后于520 nm处的荧光强度随时间的变化图。

图4是在2mL PBS缓冲（10 mM，pH = 7.4）体系中，8 µL 62mg/ml碳点分别与1mMHcy、GSH、AA、Cys、H₂O₂反应后于520nm处的荧光强度变化图。

图5是在2mL是在BR缓冲体系中，8 µL 62mg/ml碳点在不同的pH值下520nm处的荧光强度变化图。

图6是在2mL PBS缓冲（10 mM，pH = 7.4）体系中，8 µL 62mg/ml碳点与Cr⁶⁺（0µM -1000µM）荧光变化图，及在0µM-90µM Cr⁶⁺的变化范围内520nm处的荧光强度变化的线性关系图。

图7是在2mL PBS缓冲（10 mM，pH = 7.4）体系中，8 µL 62mg/ml碳点在1mM Cr⁶⁺存在下分别与5mM Ser、Thr、Pro、Gly、Lys、Ala、Arg、Val、His、Trp、Glu、Met、Leu、Phe、Asp、Ieu等氨基酸后于520 nm处的荧光强度的变化图。

图8是在2mL PBS缓冲（10 mM，pH = 7.4）体系中，8 µL 62mg/ml碳点在1mM Cr⁶⁺存在下分别与5mM GSH、Hcy、Cys、NaHSO₃、UA、AA等后于520 nm处的荧光强度的变化图。

图9是在2mL PBS缓冲（10 mM，pH = 7.4）体系中，8 µL 62mg/ml碳点在1mM Cr⁶⁺存在下分别加入5mM金属离子K⁺、Ca²⁺、Na⁺、Mg²⁺、Al³⁺、Fe³⁺、Fe²⁺、Cu²⁺、Ag⁺、Ni²⁺、Cr³⁺、Mn²⁺、3min后于520 nm处的荧光强度的变化图。

图10是在2mL PBS缓冲（10 mM，pH = 7.4）体系中，8 µL 62mg/ml碳点在1mM Cr⁶⁺存在下分别加入（0-5mM）维生素C的荧光变化图，及在0mM-3mM 维生素C的变化范围内520nm处的荧光强度变化的线性关系图。

图11是碳点特异性靶向溶酶体实验研究图。选用405 nm激发波长，收集430-550nm的波长。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

碳点合成，步骤如下：

将2.4g无水柠檬酸溶解在16mL超纯水中，再加入800µL N，N-二甲基苯胺液体，将混合液用微波反应仪加热至160^oC，持续反应10h，反应液经超滤，柱层析分离，得到该碳点。

实施例2

碳点合成，步骤如下：

将0.6g无水柠檬酸溶解在16mL超纯水中，再加入800µL N，N-二甲基苯胺液体，将混合液用微波反应仪加热至160^oC，持续反应10h，反应液经超滤，柱层析分离，得到该碳点。

实施例3

碳点合成，步骤如下：

将4.8g无水柠檬酸溶解在16mL超纯水中，再加入800µL N，N-二甲基苯胺液体，将混合液用微波反应仪加热至160^oC，持续反应10h，反应液经超滤，柱层析分离，得到该碳点。

实施例4

碳点合成，步骤如下：

将2.4g无水柠檬酸溶解在8mL超纯水中，再加入800µL N，N-二甲基苯胺液体，将混合液用微波反应仪加热至160^oC，持续反应10h，反应液经超滤，柱层析分离，得到该碳点。

实施例5

碳点合成，步骤如下：

将2.4g无水柠檬酸溶解在32mL超纯水中，再加入800µL N，N-二甲基苯胺液体，将混合液用微波反应仪加热至160^oC，持续反应10h，反应液经超滤，柱层析分离，得到该碳点。

实施例6

碳点合成，步骤如下：

将2.4g无水柠檬酸溶解在16mL超纯水中，再加入800µL N，N-二甲基苯胺液体，将混合液用微波反应仪加热至160^oC，持续反应4h，反应液经超滤，柱层析分离，得到该碳点。

实施例7

碳点合成，步骤如下：

将2.4g无水柠檬酸溶解在16mL超纯水中，再加入800µL N，N-二甲基苯胺液体，将混合液用微波反应仪加热至160^oC，持续反应16h，反应液经超滤，柱层析分离，得到该碳点。

1.不同的物质对碳点的干扰

配制pH = 7.4的PBS (10 mM)缓冲溶液；称取实施例1制备的碳点，用超纯水溶解，准确配制62mg/ml的碳点存液；配制100 mM的离子、H₂O₂、氨基酸溶液，向比色皿中加入1970µL的PBS缓冲溶液后，加入8µL 62mg/ml的碳点储存液后，加入20 µL浓度为100 mM的Cr（VI），再加入当量的Ni²⁺、 K⁺、In³⁺、Zn²⁺、Cu²⁺、Ba²⁺、Cr³⁺、Al³⁺、Mn²⁺、Ca²⁺、Na⁺、Mg²⁺、Fe²⁺等离子，Thr、Gly、Pro、Lys、Val、Arg、Ala、Leu、Asp、Let、Ile、Phe、Trp、Ser、Glu、His、Hcy、GSH、AA、Cys、H₂O₂立即进行荧光光谱测定，如图2、3、4所示，碳点对Cr（VI）具有选择性很高，且能特异性识别Cr（VI）。

2. 碳点的荧光强度随Cr（VI）浓度的变化。

向PBS缓冲（10 mM，pH=7.4）体系中，加入8µL浓度为62mg/ml的探针储存液，再加入不同浓度Cr（VI）（0-1000µM），总体积为2mL，以405 nm光激发，进行荧光光谱测定。如图6所示，随着Cr（VI）浓度的增加，荧光强度逐渐减弱。对荧光强度与Cr（VI）的浓度进行线性拟合，发现Cr（VI）的浓度范围为0-100µM时，荧光强度与浓度呈现很好的线性关系，具有很高的灵敏度，可以应用于水溶液和活细胞中Cr（VI）的检测。

3. 不同的物质对碳点+ Cr（VI）体系的干扰

配制pH = 7.4的PBS (10 mM)缓冲溶液；称取实施例1制备的碳点，用超纯水溶解，准确配制62mg/ml的碳点存液；配制100 mM的Cr（VI）离子溶液、100mM 的金属离子，20 mMNaHSO₃、UA、氨基酸溶液，向比色皿中加入PB缓冲溶液后，加入8µL 62mg/ml的碳点储存液后，加入20 µL浓度为100 mM的Cr（VI），再分别加入当量的100 µL K⁺、Ca²⁺、Na⁺、Mg²⁺、Al³⁺、Fe³⁺、Fe²⁺、Cu²⁺、Ag⁺、Ni²⁺、Cr³⁺、Mn²⁺、500 µL Ser、Thr、Pro、Gly、Lys、Ala、Arg、Val、His、Trp、Glu、Met、Leu、Phe、Asp、Ieu、GSH、Hcy、Cys、NaHSO₃、UA、AA等溶液，终体积皆为2mL，等待5min后进行荧光光谱测定，如图7、8、9所示，碳点+ Cr（VI）体系对AA具有选择性很高，且能特异性识别AA。

4. 碳点+ Cr（VI）体系的荧光强度随维生素C浓度的变化。

向PBS缓冲（10 mM，pH=7.4）体系中，加入8µL浓度为62mg/ml的探针储存液，再加入不同浓度维生素C（0-5mM），总体积为2mL，以405 nm光激发，进行荧光光谱测定。如图10所示，随着维生素C浓度的增加，荧光强度逐渐增强。对荧光强度与维生素C的浓度进行线性拟合，发现维生素C的浓度范围为0-3mM时，荧光强度与浓度呈现很好的线性关系，具有很高的灵敏度，可以应用于活细胞中维生素C的检测。

5. 碳点在细胞成像中的应用

在37 ℃，95 %空气，5 %二氧化碳培养箱中，将Hela细胞接种到含有10 %胎牛血清的激光共聚焦专用培养皿中进行培养。如图11所示，碳点在溶酶体内聚集。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种特异性识别Cr⁶⁺和维生素C的荧光碳点的制备方法，其特征在于：将无水柠檬酸加入到水中溶解，溶解后加入N，N-二甲基苯胺，混合液移入微波管中，微波加热反应，反应液经超滤，柱层析分离，得到碳点；所述碳点应用于检测活细胞、水环境或生物样品中Cr⁶⁺和维生素C。

2.根据权利要求1所述的特异性识别Cr⁶⁺和维生素C的荧光碳点的制备方法，其特征在于：所述N，N-二甲基苯胺和无水柠檬酸的物质的量之比为1:（0.5-4）。

3.根据权利要求1所述的特异性识别Cr⁶⁺和维生素C的荧光碳点的制备方法，其特征在于：所述N，N-二甲基苯胺和水的体积比为1:(10-40)。

4.根据权利要求1所述的特异性识别Cr⁶⁺和维生素C的荧光碳点的制备方法，其特征在于：所述微波加热的温度为160 ^oC，反应时间为4-16 h。

5.根据权利要求1所述的特异性识别Cr⁶⁺和维生素C的荧光碳点的制备方法，其特征在于：荧光碳点在检测活细胞、水环境或生物样品中Cr⁶⁺和维生素C时，以激发波长为405 nm光源激发，测定荧光强度变化。