CN112683861B - 短波处荧光内滤技术在检测半胱氨酸中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种短波处荧光内滤技术（SWIFT）在检测半胱氨酸中的应用，短波的激发波长为254 nm。在短波处，将罗丹明6G溶解于DMSO中得到罗丹明6G储备液，2‑甲酰基苯硼酸溶于乙腈溶液中得到2‑FPBA储备液，将罗丹明6G储备液和2‑FPBA储备液分别加入到PBS缓冲溶液中混合均匀，在混合液中加入半胱氨酸，在激发波长为254 nm下进行光谱测试。本发明以罗丹明6G作为荧光团，具有光稳定好，量子产率高，较宽的波长范围等优点，在微摩尔级的Cys的存在下，2FPBA可以与Cys很好的反应，本发明可以实时监测荧光团的稳定性以及可回收利用。这为检测Cys的存在提供了一种新的思路和方法。

Description

短波处荧光内滤技术在检测半胱氨酸中的应用

技术领域

本发明涉及检测半胱氨酸的应用领域，具体涉及一种短波处荧光内滤技术在检测半胱氨酸中的应用。

背景技术

生物硫醇，如谷胱甘肽(GSH)、半胱氨酸(Cys)和同型半胱氨酸(Hcy)，在许多生理和病理过程中发挥重要作用。例如，Cys在氨基酸运输、蛋白质合成、抗氧化损伤、提高胚胎发育速率等多种生理过程中发挥关键作用。谷胱甘肽是细胞中最丰富的硫醇，在细胞抵御毒素和自由基等生物过程中发挥着重要作用。在许多疾病中，Hcy作为生物标志物发挥着特殊的作用。一般来说，细胞内生物硫醇的水平与有毒物质和疾病有关。例如，Cys水平异常与生长迟缓、水肿、嗜睡、肝损伤等有关。血浆中Hcy升高是心血管疾病、阿尔茨海默病、骨质疏松症的危险因素，而GSH水平高则与白细胞减少、癌症、HIV感染等密切相关。因此，硫醇的检测对评估疾病发生发展水平非常重要。

许多技术被用于检测这些生物硫醇，如高效液相色谱(HPLC)、傅里叶变换红外(FTIR)光谱、质谱(MS)、电化学分析、紫外/可见光谱和荧光光谱。荧光传感因其简单、成本低、选择性和灵敏度高而受到广泛关注。因此，近年来许多荧光探针被应用于检测生物硫醇。大部分荧光探针是有共价连接的荧光基团和反应基团组成，生物硫醇与反应基团发生反应导致荧光基团的荧光强度的变化。然而，化学连接增加了探针的成本，并限制了探针的发展，使其只具有适合这种化学连接的化学基团。所以，本发明提供了一种荧光基团和分析物反应基团分离的设计方案，并应用于检测半胱氨酸。

发明内容

本发明提出了一种短波处荧光内滤技术（SWIFT）在检测半胱氨酸中的应用，主要采用商业荧光团罗丹明6G和简单的化合物2-FPBA组合检测半胱氨酸（Cys）。2-FPBA与Cys的巯基和氨基反应，引起在激发波长下（254 nm）的荧光内滤效应的减弱，从而使荧光团在激发波长下(254 nm)的荧光增强。

实现本发明的技术方案是：

短波处荧光内滤技术（SWIFT）在检测半胱氨酸中的应用，短波的激发波长为254nm。

在短波处，利用罗丹明6G和2-甲酰基苯硼酸检测半胱氨酸，其中商业荧光团罗丹明6G的结构式如下：

，简单的化合物2-FPBA（2-甲酰基苯硼酸）的结构式如下：

。

将罗丹明6G溶解于DMSO中得到罗丹明6G储备液，2-甲酰基苯硼酸溶于乙腈溶液中得到2-FPBA储备液，将罗丹明6G储备液和2-FPBA储备液分别加入到PBS缓冲溶液中混合均匀，在混合液中加入半胱氨酸，在激发波长为254 nm下进行光谱测试。

所述罗丹明6G储备液的浓度为2 mM，2-FPBA储备液的浓度为40 mM，PBS缓冲溶液的浓度为10 mM、pH为7.4，分别向2 mL PBS溶液中加入罗丹明6G储备液2 μL和2-FPBA储备液5 μL作为检测体系。

分别测试检测体系加入Cys前后的紫外可见光谱和荧光光谱的变化，荧光的激发波长为254 nm；观察紫外及荧光图谱变化及其加入Cys前后荧光的变化。

荧光光谱的变化为：以254 nm光激发时，逐渐加入不同浓度的Cys后在564 nm处的荧光逐渐增强，并在某一浓度时达到最大值且保持不变。

本发明的有益效果是：（1）以罗丹明6G作为荧光团，具有光稳定好，量子产率高，较宽的波长范围等优点；（2）在微摩尔级的Cys的存在下，2FPBA可以与Cys很好的反应；（3）本发明可以实时监测荧光团的稳定性以及可回收利用。这为检测Cys的存在提供了一种新的思路和方法。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是在PBS缓冲（10 mM，pH = 7.4）体系中，2 μM罗丹明6G和100 μM 2-FPBA与100μM Cys反应的荧光光谱图。

图2是在PBS缓冲（10 mM，pH = 7.4）体系中，2 μM罗丹明6G和100 μM 2-FPBA与不同浓度Cys（0-140 μM）反应的荧光光谱图。

图3是在PBS缓冲（10 mM，pH = 7.4）体系中，2 μM罗丹明6G和100 μM 2-FPBA与不同浓度Hcy（0-140 μM）反应的荧光光谱图。

图4是在PBS缓冲（10 mM，pH = 7.4）体系中。2 μM罗丹明6G和100 μM 2-FPBA与不同浓度Cys（0-140 μM）反应时，在Ex=254 nm处的荧光强度与Cys浓度的变化趋势图。

图5是在PBS缓冲（10 mM，pH = 7.4）体系中。2 μM罗丹明6G和100 μM 2-FPBA与不同浓度Hcy（0-140 μM）反应时，在Ex=254 nm处的荧光强度与Hcy浓度的变化趋势图。

图6是在PBS缓冲（10 mM，pH = 7.4）体系中。2 μM罗丹明6G和100 μM 2-FPBA与浓度范围在(0-100 μM)的Cys反应时，在Ex=254 nm处的荧光强度的变化与Cys浓度的线性关系图。

图7是在PBS缓冲（10 mM，pH = 7.4）体系中。2 μM罗丹明6G和100 μM 2-FPBA与浓度范围在(0-60 μM)的Hcy反应时，在Ex=254 nm处的荧光强度的变化与Hcy浓度的线性关系图。

图8是在PBS缓冲（10 mM，pH = 7.4）体系中，2 μM罗丹明6G和100 μM 2-FPBA与不同浓度Cys（0-200 μM）反应的紫外可见吸收光谱。

图9是在PBS缓冲（10 mM，pH = 7.4）体系中。2 μM罗丹明6G和100 μM 2-FPBA与浓度为100 μM的氨基酸或生物硫醇反应时荧光强度的变化值以及添加100 μM Cys之后荧光的变化值。

图10是在pH(2-12）的缓冲液中。2 μM罗丹明6G和100 μM 2-FPBA与浓度为100 μM的Cys反应时荧光强度的变化。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

检测体系与Cys反应的荧光强度的变化

配制pH =7.4的PBS (10 mM)缓冲溶液；称取罗丹明6G 0.0048 g，溶于5 mL DMSO中，准确配制2 mM 的罗丹明6G储存液；称取2-FPBA 0.0300 g，溶于5 mL乙腈溶液中，准确配置40 mM的2-FPBA储存液；准确配制20 mM的Cys。向比色皿中加入2 mL的PBS缓冲溶液后，加入2 μL浓度为2 mM的罗丹明6G储存液和5 μL浓度为40 mM的2-FPBA储存液，再加入10 μL浓度为20 mM的Cys，进行荧光光谱测试。

如图1，荧光强度随加入Cys后显著增强。

检测体系与Cys反应的荧光强度随Cys浓度的变化

向2 mL的PBS缓冲溶液中，加入2 μL浓度为2 mM的罗丹明6G储存液和5 μL浓度为40 mM的2-FPBA储存液，再加入不同浓度的Cys（0-140 μM），如图2所示，在254 nm（a）和535nm（b）激发光下激发，进行荧光光谱测定。

如图2和4所示，在254 nm激发下，随着Cys浓度的增加，荧光强度不断增强。对荧光强度的增强值和Cys的浓度进行线性拟合，发现Cys浓度在（0-100 μM）的范围内，荧光强度的增强值和浓度呈很好的线性关系（如图6）。但是在535 nm 激发下，随着Cys浓度的增加，荧光强度基本保持不变。因此，可以用254 nm 激发下荧光强度的变化来检测Cys，而通过535 nm下荧光强度的分析可以说明罗丹明6G荧光团并没有参与和Cys的反应，可以实时检测罗丹明6G荧光团的稳定性并可以回收利用。

检测体系与Hcy反应的荧光强度随Hcy浓度的变化

2 mL的PBS缓冲溶液中，加入2 μL浓度为2 mM的罗丹明6G储存液和5 μL浓度为40mM的2-FPBA储存液，再加入不同浓度的Hcy（0-140 μM），在254 nm和535 nm激发光下激发，进行荧光光谱测定。如图3和5所示，在254 nm 激发下，随着Hcy浓度的增加，荧光强度不断增强。对荧光强度的增强值和Hcy的浓度进行线性拟合，发现Hcy浓度在（0-60 μM）的范围内，荧光强度的增强值和浓度呈很好的线性关系（如图7）。

检测体系与Cys反应的吸收度随Cys浓度的变化

2 mL的PBS缓冲溶液中，加入2 μL浓度为2 mM的罗丹明6G储存液和5 μL浓度为40mM的2-FPBA储存液，再加入不同浓度的Cys（0-200 μM），进行紫外可见光谱的测试。

如图8所示，分别为加入不同浓度的Cys后，紫外可见光谱的变化（a）和在波长254nm处吸收度的变化（b）。随着加入Cys浓度的增加，混合体系中在254 nm的吸收度不断下降，且在加入140 μM Cys后，吸收度基本保持不变。说明检测体系中的在254 nm有强吸收物质2-FPBA与Cys发生了反应引起了254 nm处吸收度的下降。

检测体系中加入各种氨基酸或生物硫醇后荧光强度的变化

在PBS缓冲（10 mM，pH = 7.4）体系中。加入2 μL浓度为2 mM的罗丹明6G储存液和5μL浓度为40 mM的2-FPBA储存液，然后再分别加入100 μM的氨基酸或生物硫醇之后再添加100 μM Cys之后荧光的变化值。如图9所示，说明了该体系可以选择性的检测Cys或Hcy，生物硫醇GSH和各种氨基酸对其干扰较小。

在不同pH下在检测体系中加入Cys的荧光强度的变化

在pH (2-12）的缓冲液中，分别加入2 μL浓度为2 mM的罗丹明6G储存液和5 μL浓度为40 mM的2-FPBA储存液，然后再加入100 μM的Cys，进行荧光光谱测试。

如图10所示，在pH=7的条件下，荧光强度的增加值较高，因此可以在生理环境（pH=7.4）下进行Cys的检测。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.短波处荧光内滤技术在检测半胱氨酸中的应用，其特征在于：在短波处，利用罗丹明6G和2-甲酰基苯硼酸检测半胱氨酸，其中短波的激发波长为254 nm。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：将罗丹明6G溶解于DMSO中得到罗丹明6G储备液，2-甲酰基苯硼酸溶于乙腈溶液中得到2-FPBA储备液，将罗丹明6G储备液和2-FPBA储备液分别加入到PBS缓冲溶液中混合均匀，在混合液中加入半胱氨酸，在激发波长为254 nm下进行光谱测试。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述罗丹明6G储备液的浓度为2 mM，2-FPBA储备液的浓度为40 mM，PBS缓冲溶液的浓度为10 mM、pH为7.4，分别向2 mL PBS溶液中加入罗丹明6G储备液2 μL和2-FPBA储备液5 μL作为检测体系。

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